CN108157179B - 一种黄瓜大孢子培养过程中黄化胚状体转化正常植株的方法 - Google Patents

一种黄瓜大孢子培养过程中黄化胚状体转化正常植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄瓜大孢子培养过程中黄化胚状体转化正常植株的方法。本发明公开的黄化胚状体转化正常植株的方法，包括：将黄瓜黄化胚状体在转化培养基上进行培养，实现黄化胚状体的去黄化并生长为正常植株；转化培养基含有赤霉素和萘乙酸，赤霉素在转化培养基中的浓度为0.5‑2mg·L‑1，萘乙酸在转化培养基中的浓度为0.05‑0.2mg·L‑1。实验证明，利用本发明的方法可使黄化胚状体成功转绿并得到正常植株，转化比率可达68.6％，本发明的方法可以大大提高黄瓜大孢子培养的植株再生率，具有很高的实用价值。

Description

一种黄瓜大孢子培养过程中黄化胚状体转化正常植株的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种黄瓜大孢子培养过程中黄化胚状体转化正常植株的方法。
背景技术
黄瓜大孢子培养通过诱导黄瓜未授粉子房产生胚状体，再经过染色体加倍成二倍体,可以快速产生纯合的育种新材料(纯系)，提高育种效率，还可用作遗传转化的优良受体材料。通过黄瓜大孢子培养获得的健康胚状体要转移到再生培养基中进行植株的再生，而在胚状体的发生过程中由于自身的单倍体倍性、培养基的成份和外界培养环境条件等因素导致很大比例的胚状体发生黄化现象(胚状体的胚芽为黄色，培根介于黄色和白色之间，整个胚状体失去绿色)，使得胚状体不能发育成健康的植株，严重影响黄瓜大孢子培养的再生植株比率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何将黄瓜大孢子培养过程中的黄化胚状体去黄化。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了黄瓜黄化胚状体去黄化的方法，所述方法包括：将黄瓜黄化胚状体在转化培养基上进行培养，实现所述黄化胚状体的去黄化；
所述转化培养基含有赤霉素和萘乙酸，赤霉素在所述转化培养基中的浓度为0.5-2mg·L-1，萘乙酸在所述转化培养基中的浓度为0.05-0.2mg·L-1。
上述方法中，赤霉素在所述转化培养基中的浓度可为1mg·L-1。萘乙酸在所述转化培养基中的浓度可为0.1mg·L-1。
所述转化培养基具体可为向MS培养基中添加赤霉素和萘乙酸得到的培养基。
上述方法中，在进行所述培养时，所述黄化胚状体的胚根在所述转化培养基表面以下。即在进行所述培养时，需将所述黄化胚状体的胚根插到所述转化培养基中，此处对胚根插入至培养基中的深度没有特殊要求，只需将胚根插入至培养基中即可。
上述方法中，所述培养的光周期可为：光照/黑暗时间为12-18h/12-6h，如16h/8h。
上述方法中，所述培养时，光照时的光照强度可为3000LUX-8000LUX，如5000LUX。
上述方法中，所述培养的温度可为20-28℃。具体的，在进行所述培养时，光照时的温度可为24-28℃，如26℃；黑暗时的温度可为20-25℃，如22℃。
所述培养时间可为15-25天，如20天。
上述方法中，所述胚状体可为由黄瓜大孢子培养得到的胚状体。
本发明还提供了利用黄瓜黄化胚状体培养黄瓜植株的方法，所述方法包括：利用所述黄瓜黄化胚状体去黄化的方法将黄瓜黄化胚状体去黄化，然后培养得到黄瓜植株。
所述转化培养基，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了下述任一应用：
X1、所述转化培养基在黄瓜育种中的应用；
X2、所述转化培养基在黄瓜单倍体育种的应用；
X3、所述转化培养基在制备黄瓜单倍体中的应用；
X4、所述方法在黄瓜育种中的应用；
X5、所述方法在黄瓜单倍体育种的应用；
X6、所述方法在制备黄瓜单倍体中的应用。
本发明中，所述黄化胚状体去黄化可体现为所述黄化胚状体的非胚根部分转绿。进一步，所述黄化胚状体去黄化可体现为所述黄化胚状体在培养过程中逐渐生长为植株且个体非根部分转为绿色。
实验证明，利用本发明的黄瓜黄化胚状体去黄化的方法可使黄化胚状体成功转绿并得到正常植株，转化比率可达68.6％，而未利用本发明的方法培养的黄化胚状体在培养过程中绝大部分停滞发育、褐化或者凋亡。本发明的黄瓜黄化胚状体去黄化的方法可以大大提高黄瓜大孢子培养的植株再生率，具有很高的实用价值。
附图说明
图1为黄化胚状体外观。
图2为在转化培养基中得到的正常绿色植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、黄瓜黄化胚状体的去黄化
本实施例通过对培养条件的优化，得到了将黄瓜大孢子培养过程中出现的黄化胚状体去黄化的方法，具体如下：
一、培养基的优化
所用培养基为转化培养基，培养基优化过程中共用到了三个转化培养基，分别为转化培养基1、转化培养基2和转化培养基3，这三个转化培养基均为向MS培养基中添加赤霉素(GA)和萘乙酸(NAA)得到的培养基，其中，转化培养基1中GA和NAA的浓度分别为0.5mg·L-1和0.05mg·L-1，转化培养基2中GA和NAA的浓度分别为1.0mg·L-1和0.1mg·L-1，转化培养基3中GA和NAA的浓度分别为2.0mg·L-1和0.2mg·L-1。
在无菌条件下，将黄瓜大孢子培养过程中出现的黄化胚状体(图1)转移至含有上述各转化培养基或MS培养基的培养瓶中，每种培养基转移50个胚状体，在转移过程中，需人工划开培养基，使胚状体的胚根在培养基平面下，胚状体的胚根不能直接平放在培养基上。
将培养瓶放置于智能人工气候箱(宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为：PRX-450C-30)中进行培养，培养20天后统计黄化胚状体转化为正常绿色植株(即胚状体的非胚根部分转为绿色)的比率。气候箱中的光周期为：光照/黑暗为16h/8h，光照时的光照强度设定为5000LUX。气候箱中的温度为：光照时26℃，黑暗下22℃。
实验重复三次，各培养基的结果如表1所示。
表1、不同培养基中黄化胚状体的转化结果
结果显示，不同的转化培养基中均有黄化胚状体生长为正常绿色植株(图2)，而在MS培养基上的黄化胚状体很大一部分发生停滞发育、褐化或者凋亡。其中，转化培养基2中胚状体转化为正常绿色植株的比率最高，为68.6％，其余两种培养基的转化比率均有所下降，转化培养基3和转化培养基1中胚状体转化为正常绿色植株的比率分别为48.0％和18.6％，MS培养基中胚状体转化为正常绿色植株的比率为6％。表明，转化培养基1-3均可用于黄化胚状体转化为正常绿色植株的培养。
二、培养光照条件和温度的优化
按照步骤一的方法，将黄瓜大孢子培养过程中出现的黄化胚状体转移至转化培养基2中进行培养，按照下述分组设置培养过程中的光照条件和温度，每组50个黄化胚状体，培养20天，统计转化为正常绿色植株的胚状体的比率，实验重复三次：
组1：光周期为光照/黑暗为12h/12h，光照时的光照强度为3000LUX，光照时的温度为26℃，黑暗下的温度为22℃；
组2：光周期为光照/黑暗为16h/8h，光照时的光照强度为5000LUX，光照时的温度为26℃，黑暗下的温度为22℃；
组3：光周期为光照/黑暗为18h/6h，光照时的光照强度为8000LUX，光照时的温度为26℃，黑暗下的温度为22℃；
组4：光周期为光照/黑暗为16h/8h，光照时的光照强度为5000LUX，光照时的温度为24℃，黑暗下的温度为20℃；
组5：光周期为光照/黑暗为16h/8h，光照时的光照强度为5000LUX，光照时的温度为28℃，黑暗下的温度为25℃。
结果显示，组1-5中胚状体转化为正常绿色植株的平均比率分别为42％、68.6％、45.3％、55.3％和62％。表明，黄瓜大孢子培养过程中出现的黄化胚状体转化为正常绿色植株的最佳光照条件为：光照/黑暗为16h/8h，光照时的光照强度为5000LUX，最佳温度条件为：光照下温度26℃，黑暗下的温度为22℃。

Claims (10)

1.黄瓜黄化胚状体去黄化方法，包括：将黄瓜黄化胚状体在转化培养基上进行培养，实现所述黄化胚状体的去黄化；
所述转化培养基含有赤霉素和萘乙酸，赤霉素在所述转化培养基中的浓度为1mg·L-1，萘乙酸在所述转化培养基中的浓度为0.1mg·L-1；
所述转化培养基为向MS培养基中添加赤霉素和萘乙酸得到的培养基；
所述培养的光周期为：光照/黑暗时间为16h/8h；
所述培养的光照强度为5000LUX；
在进行所述培养时，光照时的温度为26℃；黑暗时的温度为22℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在进行所述培养时，所述黄化胚状体的胚根在所述转化培养基表面以下。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述胚状体为由黄瓜大孢子培养得到的胚状体。
4.利用黄瓜黄化胚状体培养黄瓜植株的方法，包括：利用权利要求1-3中任一所述的方法将黄瓜黄化胚状体去黄化，然后培养得到黄瓜植株。
5.转化培养基在黄瓜育种中的应用， 所述转化培养基含有赤霉素和萘乙酸，赤霉素在所述转化培养基中的浓度为1mg·L-1，萘乙酸在所述转化培养基中的浓度为0.1mg·L-1；所述转化培养基为向MS培养基中添加赤霉素和萘乙酸得到的培养基。
6.转化培养基在黄瓜单倍体育种的应用， 所述转化培养基含有赤霉素和萘乙酸，赤霉素在所述转化培养基中的浓度为1mg·L-1，萘乙酸在所述转化培养基中的浓度为0.1mg·L-1；所述转化培养基为向MS培养基中添加赤霉素和萘乙酸得到的培养基。
7.转化培养基在制备黄瓜单倍体中的应用， 所述转化培养基含有赤霉素和萘乙酸，赤霉素在所述转化培养基中的浓度为1mg·L-1，萘乙酸在所述转化培养基中的浓度为0.1mg·L-1；所述转化培养基为向MS培养基中添加赤霉素和萘乙酸得到的培养基。
8.权利要求1-3中任一所述的方法在黄瓜育种中的应用。
9.权利要求1-3中任一所述的方法在黄瓜单倍体育种的应用。
10.权利要求1-3中任一所述的方法在制备黄瓜单倍体中的应用。
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The use of plant growth regulators in micropropagation of slow-growing potato cultivars;P.R.MILLER等;《Potato Research》;19851231;第28卷;第479-486页，尤其是第479页摘要 *
蓝光与赤霉素在调节植物幼苗去黄化过程中相互作用的研究进展;张丽丽等;《天水师范学院学报》;20110331;第31卷(第2期);第36-39页，尤其是第36页左栏第1段 *
黄瓜未授粉子房诱导出胚和再生植株的研究;刘立功等;《中国蔬菜》;20151231(第6期);第48-53页，尤其是第48页摘要，第49页第1.2节，第50页第2.5节 *

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