CN108148742A - 一种用于生物样本检测的质谱基片靶托 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在MALDI‑TOF质谱检测中承载质谱基片的靶托，包括矩形或正方形的靶托主体，主体上分别设置多个基因基片卡槽和蛋白基片卡槽，各个卡槽对应的靶托依次重叠设有质谱基片卡槽第一台阶、质谱基片卡槽第二台阶、质谱基片卡槽第三台阶。本发明方法能够同时进行基因、蛋白以及微生物鉴定，具有高通量、基片选择灵活、平面度高、检测质量精度高。本发明还提供了所述靶托用于生物样品的BIOMARK检测的用途。

Description

一种用于生物样本检测的质谱基片靶托

技术领域

本发明涉及一种用于BIOMARK检测的质谱基片靶托，通过质谱基片靶托的特种工艺与超高精度，提高MALDI-TOF质谱检测质量精度，从而提高基因检测、微生物蛋白鉴定的准确度，属于质谱检测领域。

背景技术

飞行时间质谱始于20世纪40年代，局限于当时电子技术和仪器设备的落后，仪器分辨率不到100，很难推广应用。随着时间的推移和科学技术的进步，到80年代末，Hillenkamp等发明了基质辅助激光解吸电离的新方法之后，将这种软电离方法与飞行时间质谱组合，形成一种新型仪器：基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱，即MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MassSpectrometry)，它是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，是分析难挥发的有机物质的重要手段之一。

MALDI-TOF MS的原理：当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，根据离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来检测不同离子。

MALDI TOF近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具，并广泛应用于生物技术和制药企业的药物开发、科研领域的生物分析和化学检测以及安全部门的核辐射、化学物质和生物病原体的监测等。

MALDI-TOF MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品，而且在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。如应用MALDI-TOF MS测定蛋白质酶解的肽质量指纹图谱(PMF)、源后裂解(PSD)碎片离子图谱、并结合质谱网络数据库检索，可获得多肽、蛋白质的序列。应用MALDI-TOF对基因组单核苷酸多态性(SNPs)进行分析检测，可区分和鉴别相对分子质量达7,000左右(含20多个碱基)、仅存在1个碱基差别的不同DNA。特别值得指出的是，MALDI-TOF已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技术之一。

MALDI-TOF可以解决当前蛋白组学中以下几种潜在的挑战，即生物标记物的发现、分子诊断研发、蛋白质高通量分析和蛋白质组图谱，但绝不局限于此，MALDI-TOF MS应用于生物标记物的发现和在分子层次上对疾病机理进行揭示，从而被应用于分子诊断、目标治疗以及个性化用药，将为人们更完整地提示生长、发育和代谢调控等生命活动的规律和严重疾病的发生机理，为人类进行疾病的诊断防治和新药开发提供重要的理论基础。

传统的MALDI-TOF MS靶板应用领域单一，如SHIMADZU生产的MALDI-TOF Axima，靶板只用于蛋白微生物鉴定；AGENA生产的MALDI-TOF MASSARRY，靶板只用于基因检测；还没有一种覆盖基因检测、蛋白微生物鉴定三种应用的MALDI-TOF质谱靶板。

另外，MALDI-TOF传统靶板，通量固定，蛋白微生物基片通量有384well,48well，基因基片通量有384well，96well,24well，不能多种应用选择搭配，且不能多个靶板同时进样，多个实验员无法同时进行实验，质谱检测质量精度低，鉴定准确度低等。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种用于BIOMARK检测的质谱基片靶托，其他特征在于：

该靶托正面为矩形或正方形主体，其中在主体一角设置斜角的方向导角1，并在主体的上端和下端各设置延伸至主体左右两端的定位卡槽2，用于真空室进样卡槽定位；

主体左部平行设有多个基因基片卡槽3，右部平行设有多个蛋白微生物基片卡槽4，并且每个质谱基片卡槽四角均贯穿通孔，以便夹取基片；

基片位置对应的靶托主体自上而下依次重叠设有质谱基片卡槽第一台阶5、质谱基片卡槽第二台阶6、质谱基片卡槽第三台阶7，其中质谱基片卡槽第一台阶5，放置质谱基片；质谱基片卡槽第二台阶6，放置附着或粘附在质谱基片背面的非磁性铁片；质谱基片卡槽第三台阶7，嵌入圆片状磁铁。这种设置，作用在于吸附质谱基片背面的铁片，使质谱基片放置在靶托内达到固定质谱基片的目的。

在一个实施方案中，所述方向导角1用于标识主体方向，其具有45°或其他适合角度。

在另一实施方案中，所述定位卡槽2为平行于主体的定位卡槽，其宽度范围2mm-10mm，高度范围1mm-5mm，加工精度±0.01mm。

在另一实施方案中，基因基片卡槽3和蛋白微生物基片卡槽4的数量可根据生物样本的检测需求设置，如：4+2、2+3、6+1等数量组合；

在其他实施方案中，所述质谱基片卡槽第一台阶5，台阶深度范围0.5mm-1.5mm，加工精度0.01mm，台阶平面的平面度＜10μm，质谱检测质量精度＜350ppm，放置质谱基片；

在其他实施方案中，所述质谱基片卡槽第二台阶6，台阶深度范围1mm-2mm，加工精度0.01mm，台阶平面的平面度＜20μm，放置质谱基片背后圆形片状铁片；

在其他实施方案中，所述质谱基片卡槽第三台阶7，台阶深度范围0.3mm-1mm，加工精度0.01mm，台阶平面的平面度＜30μm，放置圆形片状磁铁，固定吸附质谱基片；

还在其他实施方案中，所述质谱基片卡槽通孔8，直径3-10mm，以方便夹取基片。

在上述所有实施方案中，所述质谱基片靶托，其材料特征是质地坚韧、平面度佳，可选择金属，硅片，石墨烯。

在上述所有实施方案中，其中检测蛋白的质谱基片相应的主体底面，可以设置或不设置第三台阶7。这是由于蛋白质谱基片材质较重，放入质谱基片卡槽内由自身重力作用，无需磁片吸附，故只需第一、二台阶结构。在一个具体实施方案中，所述三种台阶的面积可以根据需要进行设置调整。在一个优选实施方案中，所述三种台阶的面积大小依次是第一台阶、第二台阶、第三台阶。在一个更优选的实施方案中，所述三种台阶为中心重叠设置。

在上述所有实施方案中，所述质谱基片靶托是适用于CLIN-TOF-II临床飞行时间质谱仪器。

本发明第二个目的是提供上述质谱基片靶托作为生物样品的基片载体，用于BIOMARK检测生物样品的用途，包括质谱基片靶托作为生物样品的基片载体，置于激光质谱检测仪器中进行检测。

在一个实施方案中，其中所述生物样品种类是核酸样品、蛋白样品、微生物样品、血液纯化样品。

在另一实施方案中，其中所述检测是检测同种或不同种类的生物样品。

技术效果

1、本发明可以同时放置基因基片与蛋白微生物基片，一次进样可以同时进行基因检测与蛋白微生物鉴定，避免不同的检测分别进样，节省时间，一次进样可节省15分钟，一天检测5次，一天节省时间60分钟，适合高通量检测。

2、本发明通量灵活，一个靶托可放置基因基片4张，蛋白微生物基片2张，即4+2模式，也可以2+3、6+1等模式，通量可根据生物样本的检测需求设置；

3、本发明可以多人同时制样操作，一个靶托分为4个基因基片+2个蛋白微生物基片为例，共分为6个单元基片，可以6个实验员同时制备样品，点样操作，6个单元可以一次进样。

4、本发明准确度高，靶托卡槽的平面度直接影响质谱检测质量精度，从而影响准确度，此靶托卡槽平面度＜10um，质谱检测质量精度＜350ppm，大大提高质谱鉴定准确度。

5、本发明靶托通用性好，适合多种质谱仪器上使用。尤其适用于北京毅新博创生物科技有限公司生产CLIN-TOF-II临床飞行时间质谱仪器，注册证编号：京械注准20162401065。

附图说明

图1质谱基片靶托平面示意图

图2质谱基片靶托剖面示意图

图3耳聋标准品谱图

图4微生物检测大肠杆菌谱图

图5基因检测耳聋质粒谱图

具体实施方案

以下结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

实施例1、靶托的制备

1、加工原料

靶托加工的板材原料，优选不锈钢为例，核对原料规格、材质、批号，钢材表面无明显的凹面和损伤，表面划痕深度不得大于0.5mm，且不应大于该钢材厚度负允许偏差的1/2。

2、平面划线

利用CAD机械制图程序，加工制作图、样杆、样板及钢卷尺进行划线。当进行下料部分划线时要考虑剪切余量、切削余量。

3、板材切割

通过等离子切割技术，对板材按照预定图样进行铣边，得到靶托主体钢片结构。

4、靶托主体的车工

先粗车，按照图纸设定的台阶尺寸，粗车各台阶宽度及长度，留精车余量；

后精车，按照图纸设定的台阶尺寸，精车各台阶宽度及长度，表面粗糙度Ra3.2μm。

5、抛光

对制备的靶托初品，通过CMP法对卡槽第一、二、三台阶进行两次抛光，即粗抛与细抛。粗抛目的是去除台阶表面残留的机械损伤，一般从表面除去30um范围内的厚度。细抛目的是去除第一次抛光在台阶表面留下的轻微损伤和云雾状缺陷，一般从表面除去2～3um。经过两次抛光的芯片表面具有镜面效应，在质谱检测过程中，通过照明、光路反射及摄像头实时显示，可以直接观测芯片表面样本被轰击的情况，改变激光轰击的位置，得到最佳图谱。在一个更具体实施方案中，所述芯片是单面抛光的硅芯片或石英芯片。

6、检测

检测加工件机械尺寸，符合图纸加工要求后，并通过照明、光路反射法检测台阶平面度和加工精度，确定合格品，可交付使用。

实施例2、靶托平面度对鉴定结果准确度影响

以耳聋基因标准品(北京毅新博创生物科技有限公司的耳聋试剂盒，产品编号：1010109)为例，

1、材料和方法

(a)准备工作：

配制好的基质溶液，前处理完成的耳聋UEP标准品，清洗干净的微阵列质谱检测芯片。

(b)点样：

取3张微阵列质谱检测芯片，每个芯片的样品孔，点0.75μL基质溶液，自然会干后，再点0.5μL耳聋UEP标准品，12个重复，自然挥干后，待用

(c)三种平面度卡槽：

选择质谱基片靶托三种平面度卡槽，卡槽1平面度＜10μm，卡槽2平面度＜20μm，卡槽3平面度＜30μm，对应在三个卡槽内放入三张点好的微阵列质谱检测芯片，进样，放入CLIN-TOF-II飞行时间质谱样品室。

(d)设置CLIN-TOF-II飞行时间质谱参数：

Turing mode:linear；

Mass Range:3000-9000；

Max Laser Rep Rate:10.0；

Power:105；

Profiles:40；

Shots:10。

(e)真空阈值：

当真空度＜5E-6，开始检测；

2、结果与分析

如表1所示，卡槽1平面度＜10μm，12个重复，每一位点峰偏差：(深色绿色为最大偏差)

表1

结果如表1所示，最大偏差在8214.4Da位置，偏差2.78Da，质量准确度：(M-M0)*106/M0＝(8214.4-8211.62)*106/8214.4＝338.4ppm＜350ppm。

其中，质量准确度越低，峰位置越精准，检测结果正确率越高。

如表2所示，卡槽2平面度＜20μm，12个重复，每一位点峰偏差：(深色绿色为最大偏差)

表2

结果如表2所示，最大偏差在8214.4Da位置，偏差3.89Da，质量准确度

(M-M0)*106/M0＝(8218.29-8214.4)*106/8214.4＝473.5ppm＜500ppm。

如表3所示，卡槽3平面度＜30μm，12个重复，每一位点峰偏差：(深色绿色为最大偏差)

表3

结果如表3所示，最大偏差在8214.4Da位置，偏差4.26Da，质量准确度

(M-M0)*106/M0＝(8214.4-8210.14)*106/8214.4＝518.6ppm＜550ppm。

以上质谱谱图结果参见图3耳聋标准品谱图。

结论：靶托平面度对谱图质量准确度影响较大，因此，本发明最佳的质量指标是：靶托平面度＜10μm，质量准确度＜350ppm，能够提高核酸检测准确率。

实施例3、微生物鉴定

选择5种临床微生物样本(北京毅新博创生物科技有限公司微生物实验室保存)，每个离心管(200μl)中加入20μl-30μl组分I，用1μl无菌接种环或枪头挑取单菌落于上管中，混匀，震荡混匀5min。

每种菌株3个重复，质量范围2000-20000Da，采集数据在BE3.0软件打分，查看置信度结果。

参数设置：

Turing mode:linear

Mass Range:2000-20000

Max Laser Rep Rate:30.0

Power:60

Profiles:100

Shots:5

表4

上述质谱结果谱图产见图4微生物检测大肠杆菌谱图。

选择5种微生物临床样本分别为大肠埃希氏菌、白色念珠菌复合体、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、摩氏摩根氏菌，通过质谱检测，能够正确鉴定出菌种名称，置信度均在100分以上，置信度越高越可信，其中，置信度＞25分，为鉴定结果可信，15组数据鉴定结果均正确，正确率100％。

实施例4、基因检测

选择耳聋质粒产物(北京毅新博创生物科技有限公司的耳聋试剂盒，产品编号：1010109)为例

1、材料和方法

(a)准备工作：

配制好的基质溶液，前处理完成的耳聋质粒产物，清洗干净的微阵列质谱检测芯片。

(b)点标准品

取1张微阵列质谱检测芯片，选择芯片中间区域的一个样品孔，每个孔点0.75μL基质溶液，自然挥干后，再点0.5μL耳聋标准品，挥干后待用

(c)点样品：

在标准品样品点周围区域，选择芯片的5个样品孔，每个孔点0.75μL基质溶液，自然会干后，再点0.5μL耳聋阳性质粒产物，5个重复，选择芯片的5个样品孔，每个孔点0.75μL基质溶液，自然会干后，再点0.5μL耳聋阴性质粒产物，5个重复，自然挥干后，待用

(d)进样：

选择质谱基片靶托，对应在卡槽内放入点好的微阵列质谱检测芯片，进样，放入CLIN-TOF-II飞行时间质谱样品室。

(e)设置CLIN-TOF-II飞行时间质谱参数：

Turing mode:linear；

Mass Range:3000-9000；

Max Laser Rep Rate:10.0；

Power:105；

Profiles:40；

Shots:10。

(f)真空阈值：

当真空度＜5E-6，开始检测；

2、耳聋质粒样本鉴定结果：

表5

具体质谱结果谱图，参见图5基因检测耳聋质粒谱图。

如表5和图5所示，表中第一列为序号，第二列为样本号，第三列为位点信息，第四列为分型结果，第五列为置信等级，其中第五列置信等级分为A,B,C,D四种，A为最可信。其中第四列分型结果信息，代表检测结果，共检测10个耳聋质粒样本，每个耳聋质粒20个位点，共200个位点，分型结果与理论分型结果一致，检测结果正确率100％，因此基于平面度＜10μm的质谱基片靶托，进行耳聋样本检测，200个位点正确率位100％，此质谱基片靶托有益效果显著。

Claims (10)

1.一种用于BIOMARK检测的质谱基片靶托，其他特征在于：

该靶托正面为矩形或正方形主体，其中在主体一角设置斜角的方向导角1，并在主体的上端和下端各设置延伸至主体左右两端的定位卡槽2，用于真空室进样卡槽定位；

主体左部平行设有多个基因基片卡槽3，右部平行设有多个蛋白微生物基片卡槽4，并且每个质谱基片卡槽四角均贯穿通孔，以便夹取基片；

基片位置对应的靶托主体自上而下依次重叠设有质谱基片卡槽第一台阶5、质谱基片卡槽第二台阶6、质谱基片卡槽第三台阶7，其中质谱基片卡槽第一台阶5，放置质谱基片；质谱基片卡槽第二台阶6，放置附着或粘附在质谱基片背面的非磁性铁片；质谱基片卡槽第三台阶7，嵌入圆片状磁铁。

2.权利要求1的靶托，其中所述方向导角1用于标识主体方向，其具有45°或其他适合角度，并且所述定位卡槽2为平行于主体的定位卡槽，其宽度范围2mm-10mm，高度范围1mm-5mm，加工精度±0.01mm。

3.权利要求1-2的靶托，其中基因基片卡槽3和蛋白微生物基片卡槽4的数量可根据生物样本的检测需求设置，如：4+2、2+3、6+1等数量组合。

4.权利要求1-3的靶托，其中所述质谱基片卡槽第一台阶5，台阶深度范围0.5mm-1.5mm，加工精度0.01mm，台阶平面的平面度＜10μm，质谱检测质量精度＜350ppm，放置质谱基片。

5.权利要求1-4的靶托，其中所述质谱基片卡槽第二台阶6，台阶深度范围1mm-2mm，加工精度0.01mm，台阶平面的平面度＜20μm，放置质谱基片背后圆形片状铁片。

6.权利要求1-5的靶托，其中所述质谱基片卡槽第三台阶7，台阶深度范围0.3mm-1mm，加工精度0.01mm，台阶平面的平面度＜30μm，放置圆形片状磁铁，固定吸附质谱基片。

7.权利要求1-6的靶托，其中所述质谱基片卡槽通孔8，直径3-10mm，以方便夹取基片。

8.权利要求1-7的靶托，其中检测蛋白的质谱基片相应的主体底面，可以设置或不设置第三台阶7。

9.权利要求1-8的靶托，其中所述三种台阶的面积可以根据需要进行设置调整，优选所述三种台阶的面积大小依次是第一台阶、第二台阶、第三台阶。

10.权利要求1-9的靶托，其中所述质谱基片靶托是适用于CLIN-TOF-II临床飞行时间质谱仪器。