CN108138224A - 用于snp基因分型的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用侧流试验装置对单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的方法。本发明还涉及包含所述侧流试验装置的试剂盒及其用于对单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的用途。
Description
本发明涉及一种用于单核苷酸多态性(SNP)基因分型的新方法。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是在同一物种的个体之间的基因组中或同一对染色体之间的单一碱基对变异。SNP占所有人类遗传变异的90%。它们在人类基因组中约每1000个碱基存在一个,并且到目前为止有超过180万个SNP在专门数据库中列出并可用。这些数据库的使用显示,这些SNP不仅可用于法医学目的以鉴别个体,而且可用于诊断或确定某些疾病的易感性,预测病症的严重性或患者对治疗的响应,或确定个体的血型。
有许多方法可用于检测SNP,例如DNA微阵列、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交、DNA测序和单链构象多态性(SSCP)分析、质谱术、引物延伸、限制性片段长度多态性分析和等位基因特异性寡核苷酸连接。然而,这些技术大多昂贵,建立起来复杂,并且不能使用易于使用的过程进行一次性分析。
因此,近年中已开发了新的简化的技术,其中使用简单的试条试验(或侧流测定法)来检测SNP,这允许通过目测检查获得结果(Litos等,2009;Sapountzi等,2015)。这些新技术本质上基于使用目标等位基因特异性引物对靶DNA进行PCR扩增。这意味着所述扩增反应只有在所述引物的3’区与靶序列完全互补时才会发生。因此,用于等位基因的每个特异性引物包含与所述SNP位点相邻的序列和与所述等位基因变体互补的3’核苷酸、间隔臂和5’标志物,所述5’标志物允许它与固定化在所述试条上的探针杂交。Litos等提出了一种可以在同一试条上对几个SNP同时进行基因分型的技术。为此目的,每种等位基因特异性引物包含不同的5’标记物,其将与固定化在所述试条上的探针之一特异性杂交。然而,尽管已取得进展,但这些技术仍然执行起来复杂,特别是因为两个连续的扩增技术(PCR,然后是是引物延伸反应)的使用和/或偶联到待检测的每个等位基因的特异性序列的微球的生产和这些微球在硝酸纤维素膜上的沉积。
发明内容
现在,本发明人显示,可以使用侧流测定装置从单一扩增产物区分同一SNP的不同等位基因变体。
因此,根据第一方面,本发明涉及一种对核酸样品中的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的体外方法,所述方法包括:
a)扩增含有待基因分型的SNP的所述核酸的一个或多个区域,扩增产物包含能够直接或间接地产生可检测信号的标记物,以及
b)使用侧流测定装置分析在步骤(a)中获得的扩增产物,所述侧流测定装置包含优选地由硝酸纤维素制成的反应区,所述反应区包含固定化在不同位点上的一种或多种核苷酸探针、优选地至少两种核苷酸探针,每种探针具有与待基因分型的SNP的等位基因变体互补的序列,
在所述探针固定化位点处检测到信号指示所述核酸包含所述探针的特异性等位基因变体。
所述扩增优选地通过不对称PCR来进行,更特别优选地通过LATE–PCR来进行。
所述核酸的几个区域的同时扩增可以通过多重PCR来进行。
所述扩增产物可以是5’–标记的,优选地通过在所述扩增期间使用5’–标记的引物进行5’–标记。
所述扩增产物可以用有色、发光、荧光、磷光或放射活性化合物,用酶或配体/抗配体对的第一个成员,优选地用生物素来标记。
优选地,所述可检测信号是肉眼可见的有色信号,并且所述检测通过简单的目测检查来进行。优选地,所述信号通过使用有色粒子例如胶体金粒子来获得。
优选地,在本发明的方法期间使用的侧流测定装置包含:
多孔基质,其包含:
(i)迁移缓冲液施加区,
(ii)扩增产物施加区,其位于所述迁移缓冲液施加区下游,和
(iii)反应区,其位于所述扩增产物施加区下游,以及
(iv)任选的试剂迁移监测区,其位于所述反应区下游,和/或
(v)任选的标记区,其包含对能够直接或间接地产生可检测信号的扩增产物标记物特异的底物或结合配偶体,所述标记区位于所述迁移缓冲液施加区下游和所述扩增产物施加区上游,和/或
(vi)任选的吸收垫,其位于所述反应区下游或如果存在监测区的话就位于所述监测区下游,
所述多孔基质的各个不同区与相邻的区流体连通,并且所述吸收垫与所述多孔基质流体连通。
所述扩增产物可以不需初步的纯化或变性步骤,使用所述侧流测定装置直接分析。
所述扩增产物的分析通常包括:
(i)将在步骤(a)中获得的扩增产物装载到所述侧流测定装置上,
ii)在所述装置上施加迁移缓冲液,
iii)将所述装置温育,直至在所述反应区中检测到由所述扩增产物标记物直接或间接地产生的信号,和/或当存在所述迁移监测区时在所述迁移监测区中检测到信号,以及
iv)读取并解释结果。
所述侧流测定装置的基质可以由硝酸纤维素、聚酯、玻璃纤维、纤维素纤维、聚醚砜(PES)和/或纤维素酯制成。优选地,所述基质是或包含硝酸纤维素膜。
优选地,所述基质的反应区由硝酸纤维素制成。特别优选地,所述基质的扩增产物施加区和/或监测区、优选地所述基质的扩增产物施加区和监测区,也由硝酸纤维素制成。这意味着根据某些实施方式,所述基质包含硝酸纤维素膜,其包含所述基质的扩增产物施加区、反应区和监测区。可替选地,所述基质的反应区和监测区可以由硝酸纤维素制成,并且所述扩增产物施加区由纤维素纤维制成。
所述基质的迁移缓冲液施加区和/或所述吸收垫优选地由纤维素纤维制成,并且所述基质的标记区优选地由玻璃纤维制成。
所述迁移缓冲液优选地包含用于维持中性pH的缓冲系统、一种或多种表面活性剂和/或使氢键和非特异性相互作用去稳定化的一种或多种变性剂。
所述样品中包含的待基因分型的核酸优选为基因组DNA,更特别优选为人类基因组DNA。
具体来说,所述核酸样品可以是全血、血清或血浆样品。在这种情况下,扩增含有待基因分型的SNP的所述核酸的一个或多个区域的步骤可以在所述全血、血清或血浆样品上进行,不需所述核酸的部分或完全纯化的初步步骤。
根据优选实施方式,所述扩增产物标记物是生物素,并且所述迁移缓冲液或标记区包含与可检测标记物偶联、优选地与金粒子偶联的抗生物素抗体。
根据第二方面,本发明还涉及一种试剂盒,其包含如上所定义的侧流测定装置和用于扩增含有SNP的基因组区域的至少一个引物对。任选地,所述试剂盒还可以包含迁移缓冲液,扩增试剂,优选为dNTP、聚合酶和/或缓冲液,和/或解释所述试剂盒的使用的说明书散页。
根据优选实施方式,所述试剂盒包含用于扩增一个或多个基因组区域的一个或多个引物对,所述基因组区域含有与血型抗原系统、优选为Duffy、MNS和/或Kidd系统相关的一个或多个SNP。具体来说,所述试剂盒可以包含选自SEQ ID NO:1至8的一个或多个引物,更特别地是一个或多个下述引物对:(1)SEQ ID NO:1和2,(2)SEQ ID NO:3和4,(3)SEQ IDNO:5和6,以及(4)SEQ ID NO:7和8。
本发明还涉及本发明的试剂盒的用途,其用于按照本发明的方法对一个或多个SNP、优选为与血型抗原系统相关的一个或多个SNP进行基因分型。
附图说明
图1:在将通过单重和多重LATE–PCR流程从具有不同基因型的基因组DNA样品扩增的生物素化的靶在硝酸纤维素膜上迁移后,获得的基因分型结果。从来自于各种不同LATE–PCR流程的样品的扩增后获得的结果:(i)单重,(A)FY(样品#1至#6)和(B)JK(样品#7至#12)血型系统,和(ii)多重(C)(样品#13、#14和#15)和(D)(样品#16和#17)。符号-和+分别是指不存在和存在所述等位基因。
图2:对于图1A的样品#1至#6来说,通过血清学技术(参比技术)为FY系统获得的表型和从通过两种基因分型方法获得的基因型预测的表型的列表:(i)DNA微阵列(参比基因分型技术)和(ii)按照本发明的方法通过在硝酸纤维素膜上迁移。
图3:对于图1B的样品#7至#12来说,通过血清学技术(参比技术)为JK系统获得的表型和从通过两种基因分型方法获得的基因型预测的表型的列表:(i)DNA微阵列(参比基因分型技术)和(ii)按照本发明的方法通过在硝酸纤维素膜上迁移。
图4:对于图1C和1D的样品#13至#17来说,通过血清学技术(参比技术)为JK、FY和MNS系统获得的表型和从通过两种基因分型方法获得的基因型预测的表型的列表:(i)DNA微阵列(参比基因分型技术)和(ii)按照本发明的方法通过在硝酸纤维素膜上迁移。
图5:在将从具有不同基因型的基因组DNA样品通过用于JK和FY系统的双重LATE–PCR流程扩增的生物素化的靶在30℃下在硝酸纤维素膜上迁移后,获得的基因分型结果(样品#19、#20和#21)。
图6:对于图5的样品#19至#21来说,通过血清学技术(参比技术)为JK和FY系统获得的表型和从通过两种基因分型方法获得的基因型预测的表型的列表:(i)DNA微阵列(参比基因分型技术)和(ii)按照本发明的方法通过在硝酸纤维素膜上迁移。
图7:通过用于JK和FY系统的单重LATE–PCR扩增的产物在2%琼脂糖凝胶上的验证。
图8:对于样品#22至#25来说,通过血清学技术(参比技术)为JK、FY和MNS系统获得的表型和从通过两种基因分型方法获得的基因型预测的表型的列表:(i)DNA微阵列(参比基因分型技术)和(ii)按照本发明的方法通过在硝酸纤维素膜上迁移。
具体实施方式
血型鉴定对于评估输血期间供体与受体的血液之间的相容性和限制输血反应或同种异体免疫的风险来说是极为重要的。到目前为止,已鉴定到35种血型系统,含有超过300种血清抗原。根据现行实践,常规的血袋分型只关注少量血型抗原,例如ABO、RH和Kell(KEL)系统的抗原。然而,其他抗原、尤其是Duffy(FY)、MNS(MNS)或Kidd(JK)系统的抗原,由于由相应抗体引起的频繁的输血反应,被证明是临床上重要的。
尽管对ABO、RH和Kell系统的抗原有效,但利用常规血清学技术对血液单位进行广泛分型具有几个缺点。事实上,它们是昂贵的单参数试验,其限制因素之一是难以获得对各种不同系统有效的单克隆抗体。此外,在某些临床情况下,例如对于免疫接种或长期输血的患者来说,常规的凝集反应技术不能使用,因此使输血管理复杂化。
多亏了对血液抗原的分子基础的更好的理解,现在可以通过鉴定基因组DNA中的SNP来确定个体或血袋的血型。例如,Kidd系统包含源自于838G>A SNP的JK1和JK2抗原对,其产生在Kidd糖蛋白的280位置处分别编码天冬氨酸和天冬酰胺残基的共显性等位基因JK*1和JK*2。
在本文中,本发明人开发了一种通过对与各种不同血型系统相关的SNP进行基因分型,来确定个体或血样的血型表型的简单、快速且廉价的技术。这种技术可以被容易地调整以适应于任何多态性位点的基因分型。
因此,根据第一方面,本发明涉及一种用于检测核酸中的一个或多个多态性位点的等位基因变体,更优选地用于对一个或多个单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的体外方法。
SNP是同一物种(原核、真核或病毒物种)的个体之间基因组DNA中的单一位置处的变异。SNP可以存在于外显子或内含子内或基因间区域中。编码区中存在的SNP可能修改或不修改所编码的蛋白质的氨基酸序列。非编码区中包含的SNP可以对例如剪接或转录因子具有影响。尽管理论上可以具有4种等位基因(A、T、C和G),但大多数SNP仅具有两种等位基因。SNP可以通过所述多态性所涉及的核苷酸的位置(例如“125G>A”意味着给定基因组序列的125位置处的核苷酸可以是G或A)、所涉及的氨基酸残基的位置(例如“Gly42Asp”意味着给定蛋白质序列的42位置处的氨基酸可以是甘氨酸或天冬氨酸)或通过它在列出各种不同SNP的数据库例如“NCBI SNP数据库”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中的标识号来识别。
当在本文中使用时,术语“对SNP进行基因分型”意味着确定样品中包含的核酸中存在的SNP的等位基因变体。这使得可以例如确定个体对于给定SNP来说是纯合的(具有两个一致的等位基因)还是杂合的(具有两个不同等位基因)。
样品中包含的待基因分型的核酸可以是DNA、RNA、单链或双链核酸或其混合物。所述核酸优选为DNA,特别优选为双链DNA。所述核酸可以是任何来源的,特别是人类、动物、细菌、病毒或真菌来源的。所述核酸优选为人类或动物来源的,更特别优选为人类来源的。
根据优选实施方式,样品中包含的核酸是基因组DNA或RNA,优选为基因组DNA。
所述样品可以是含有核酸的任何生物样品,优选为含有基因组DNA的任何生物样品,例如从对象(动物或人类,优选为人类)获得的血液、血浆、血清、唾液、尿液、精液样品或组织或器官样品。根据特定实施方式,所述样品是从动物或人类对象、优选为人类获得的全血、血浆或血清样品。
所述样品可以任选地在使用之前进行化学、酶、热和/或机械处理。特别地,当所述样品是全血样品时,可以将所述样品与抗凝剂混合,所述抗凝剂优选地选自EDTA和柠檬酸钠。优选地避免使用已知抑制扩增反应的肝素。
所述样品可以在收集后立即使用,也可以在4℃或–20℃下储存后使用。
所述样品也可以利用本领域普通技术人员公知的任何技术,通过从生物样品部分或完全纯化基因组DNA或RNA来获得。
根据优选实施方式,所述样品是全血、血浆或血清样品,优选为全血样品,并且如下所述的样品中包含的核酸的基因扩增步骤,优选地在不需所述核酸的部分或完全纯化的初步步骤的情况下进行。
本发明的方法可用于单个SNP或几个SNP的基因分型。根据优选实施方式,所述方法用于对几个SNP、优选地2至20个、15或10个SNP、特别优选地2至5个SNP同时进行基因分型。
所述待基因分型的SNP可以是任何目标SNP。具体来说,所述SNP可以具体是人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒的SNP。优选地,所述待基因分型的SNP是人类或动物的SNP。所述SNP可以是例如与疾病、疾病的易感性、治疗响应相关的SNP,用于鉴定个体、尤其是法医学中的目标SNP,或用于血型抗原分型的SNP。
根据优选实施方式,所述待基因分型的SNP与一种或多种血型系统相关。例如,所述SNP包括但不限于造成多态性JK*1/JK*2的SNP rs1058396(NCBI SNP数据库);造成多态性的FY*1/FY*2的SNP rs12075(NCBI SNP数据库);造成多态性FY*wt/FY*Fy的SNPrs2814778(NCBI SNP数据库);以及造成多态性MNS*3/MNS*4的编码血型糖蛋白B(GYPB)的基因(GeneID:2994)中的SNP 143T>C。
本发明的方法包括对所述样品中包含的核酸进行基因扩增,然后使用侧流测定装置分析所述扩增产物的步骤。
因此,本发明的方法包括:
a)扩增含有待基因分型的SNP的所述核酸的一个或多个区域,扩增产物包含能够直接或间接地产生可检测信号的标记物,以及
b)使用侧流测定装置分析在步骤(a)中获得的扩增产物,所述侧流测定装置包含反应区,所述反应区包含固定化在不同位点上的一种或多种核苷酸探针,每种探针具有与待基因分型的SNP的等位基因变体互补的序列,
在所述探针固定化位点处检测到信号指示所述核酸包含所述探针特异的等位基因变体。
与现有技术中描述的方法不同,本发明的方法的基因扩增步骤a)不使用对待检测的等位基因特异的引物来进行。所述引物被选择成侧接在待基因分型的多态性位点。优选地,所述引物都不与待分析的多态性位点重叠。因此,单个扩增产物足以用于对所述被扩增的区域中包含的SNP进行基因分型并用于检测同一SNP的不同等位基因变体。
在这个扩增步骤期间使用的技术取决于所述样品中包含的待分析的核酸的本质。所述基因扩增可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来进行,尤其是通过PCR、RT–PCR、滚环扩增(RCA)、通过Qβ–复制酶的扩增、连接酶链反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增、环介导的等温扩增、超分支滚环扩增(HRCA)或转录介导的扩增(TMA)。
根据特定实施方式,所述样品中包含的核酸是DNA,优选为基因组DNA,并且所述扩增通过PCR,优选地通过不对称PCR来进行。所述不对称PCR技术允许偏好性地扩增双链DNA基质中的一条DNA链。所述PCR按照标准流程进行,但使用的引物之一相对于另一条引物大大过量。在前20至25个循环期间产生双链DNA,直至限制性引物被耗尽。在最后的循环期间只产生单链DNA。所述不对称PCR具体地可以是指数后线性(LATE)–PCR(参见WO 03/054233)或改进的LATE(imLATE)–PCR(Song等,2013)。
优选地,所述不对称PCR是LATE–PCR。LATE–PCR是一种使用的限制性引物的熔点(Tm)比过量引物的熔点高至少5℃的技术。这使得当限制性引物的浓度降低时可以维持令人满意的反应效率(Pierce和Wangh,2007)。根据特定实施方式,所述扩增通过LATE–PCR来进行,其中限制性引物具有比过量引物高6至8℃、优选地6.7至7.7℃的熔点(Tm)。
当必须扩增所述核酸的几个区域时,所述扩增优选地利用多重PCR来进行,所述多重PCR允许利用各种不同的引物对在同一反应容器中同时扩增几个不同区域。特别优选地,所述扩增利用多重不对称PCR、尤其是多重LATE–PCR来进行。多重PCR技术对于本领域普通技术人员来说是公知的,并且在例如Pariset等,2014的文章中或国际专利申请WO 03/054233中有说明。
所述引物可以由本领域普通技术人员根据待扩增的核酸的区域和所使用的技术容易地设计。正如上文提到的,所述引物侧接于待分析的多态性位点并且不与它们交叠。所述引物限定了扩增产物的尺寸。优选地,后者具有25至500个核苷酸,优选地50至250、200、180、150或100个核苷酸。
在本发明的方法中,所述扩增产物(或扩增子)包含能够直接或间接地产生可检测信号的标记物。所述扩增子的标记可以在扩增期间进行,尤其是利用标记的引物或标记的核苷酸,或者在紧随扩增的步骤期间进行。
根据一种实施方式,所述扩增子在扩增反应期间被标记。所述扩增子可以是5’–标记的、3’–标记的,或者在一个或多个内部位点处被标记。用于产生经标记的扩增子的大量酶或化学技术对于本领域普通技术人员来说是已知的,并且可以商购。
根据特定实施方式,所述扩增产物包含5’标记。所述标记优选地在扩增期间通过使用5’–标记的引物来获得。当所述扩增通过LATE–PCR来进行时,所述标记的引物是过量引物。
当在本文件中使用时,术语“可检测信号”是指可以直接被人眼或利用检测系统感知的信号。所述信号的本质根据所使用的标记物的本质而不同。具体来说,所述信号可以是有色、发光、荧光、磷光、放射活性或磁信号。优选地,所述信号是有色信号。
所述扩增子可以使用能够直接地产生可检测信号的标记物进行标记,例如荧光化合物如罗丹明、荧光素、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明(TMR)、磺酰罗丹明101、德克萨斯红(Texas Red)、罗丹明红、Alexa、DyLight和藻青蛋白,或放射活性元素例如32P。
可替选地,所述扩增子可以用能够间接地产生可检测信号的标记物进行标记。当在本文中使用时,术语“间接地”意味着所述标记物只有在与另一种化合物例如底物或结合配偶体相互作用后才能产生可检测信号。能够间接地产生可检测信号的标记物可以是例如配体/抗配体对的第一个成员或在底物存在下产生可检测信号的酶。在本发明的方法中考虑的配体/抗配体对的实例包括但不限于下述对:生物素/链亲合素,抗原/抗体尤其是生物素/抗生物素抗体或地高辛(digoxygenin)/抗地高辛抗体,分子/受体或糖/凝集素。可用作标记物的酶可以是例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β–半乳糖苷酶。
根据更特定的实施方式,所述扩增产物用生物素标记,优选地5’–标记。优选地,这种标记在使用5’–标记的引物进行的扩增期间获得。
在扩增后,利用侧流测定装置对由此获得的扩增子进行分析,以辨别所述待基因分型的SNP的等位基因变体。
侧流测定法已在文献中充分描述,并且常用于临床、制药、食品或化学分析目的。它们可用于检测许多类型的被分析物的存在,例如抗体、抗原、蛋白质、化学分子或最近的核酸(例如Ang等,2012)。
现有技术中描述的使用试条试验来检测SNP的方法,是基于使用对目标等位基因特异的引物的PCR技术。这意味着只有在引物的3’区与靶序列完全匹配时才能发生扩增反应。因此,每个等位基因特异性引物包含允许它与固定化在试条上的探针杂交的5’标记物。所述标记物的长度一般为约24个核苷酸(Litos等,2009;Sapountzi等,2015),使得容易鉴别不同的扩增子。
在本发明的方法中使用的侧流测定装置的特点在于包含反应区,所述反应区包含固定化在不同位点上的一种或多种核苷酸探针,每种探针具有与待基因分型的SNP的等位基因变体互补的序列。这意味着对同一SNP的两个等位基因特异的两种探针的差异仅为1个核苷酸,即所述多态性位点的核苷酸(不计入在特异性引物序列的3’或5’末端处可能添加的核苷酸)。
术语“侧流”是指其中所有被溶解或分散的化合物通过毛细管作用,优选地以等同的速度和稳定的流速,通过基质侧向运输的液流。该术语与“优先保留”相反,在后者中待分析或检测的一种或多种化合物通过与基质的优先相互作用被保留或减缓。术语“侧流”在本文中用于描述性而非限制性目的。所述装置事实上可以采用使它可以应用本发明的原理的任何构造。因此,所述装置可以具有线性(试条试验)、放射状、T–型、L–型、十字型构造等。
通常,在本发明的方法中使用的侧流测定装置包含多孔基质,其包含:
(i)迁移缓冲液施加区,
(ii)扩增产物施加区,其位于所述迁移缓冲液施加区下游,和
(iii)反应区,其位于所述扩增产物施加区下游(并包含固定化在不同位点上的一种或多种探针,每种探针对待基因分型的SNP的等位基因变体具有特异性)。
术语“下游”和“上游”在本文中以其通常意义使用。它们规定了按照流动方向,所述装置的一个元件相对于另一个元件的位置。如果元件A在元件B的下游,则意味着液流首先经过元件B,然后经过元件A。相反,如果元件A在元件B的上游,则意味着液流首先经过元件A,然后经过元件B。
所述反应区的第一种探针被放置在距所述扩增产物施加区优选地1至10cm,更特别优选地2至5cm。
任选地,所述基质还可以包含在所述反应区下游的试剂迁移监测区。这个迁移监测区向用户指示至少一部分样品已通过所述基质。固定化在这个区上的试剂,当所述试剂与迁移缓冲液、任选地与能够直接或间接地产生可检测信号的添加的标记物、底物或结合配偶体发生接触时,必须能够产生信号。
所述基质也可以包含标记区,其包含对所述扩增产物标记物特异的底物或结合配偶体,所述底物或结合配偶体能够直接或间接地产生可检测信号。所述标记区优选地位于所述迁移缓冲液施加区下游和所述扩增产物施加区上游。
所述多孔基质的每个不同区与相邻的区流体连通。
任选地,所述基质可以与吸收垫流体连通,所述吸收垫位于所述反应区下游或如果存在监测区的话就位于所述监测区下游。
根据特定实施方式,在本发明的方法中使用的侧流测定装置包含多孔基质,其包含:
(i)迁移缓冲液施加区,
(ii)扩增产物施加区,其位于所述迁移缓冲液施加区下游,和
(iii)反应区,其位于所述扩增产物施加区下游,
(iv)迁移监测区,其所述反应区下游,以及
(v)吸收垫,其位于所述监测区下游。
在侧流测定法的情形中,将所述扩增产物装载到多孔基质上,它们将通过毛细管作用经所述多孔基质迁移到所述反应区。
因此,当在本文中使用时,术语“多孔基质”是指能够优选地通过毛细管作用力确保流体的流动和转移的任何类型的多孔材料。具体来说,该术语是指适合于侧流测定法的任何膜。作为非限制性实例,所述多孔基质可以是硝酸纤维素、聚酯、玻璃纤维、纤维素纤维、聚醚砜(PES)、纤维素酯等。所述基质的各个不同区可以由相同材料或不同材料制成。当所述基质的各个不同区由不同材料制成时,所述基质优选地通过组装各个不同元件来形成。为了确保两个相邻元件之间的流体连通最优,因此优选地允许其中两个元件重叠约1或2mm的区。例如,所述扩增产物施加区、反应区和迁移监测区可以由硝酸纤维素制成,所述标记区由玻璃纤维制成,并且所述吸收垫和/或迁移缓冲液施加区由纤维素纤维制成。
根据特定实施方式,所述多孔基质包含硝酸纤维素膜,其优选地包含反应区。特别优选地,所述硝酸纤维素膜包含反应区,并且包含扩增产物施加区和/或迁移监测区。硝酸纤维素膜的实例包括但不限于下述膜:MilliporeTMHF240,MilliporeTMHF180,MilliporeTMHF135,MilliporeTMHF120,MilliporeTMHF090,MilliporeTMHF075,SartoriusTMCN140和SartoriusTMCN150,FF120HP膜(GE),FF170HP膜(GE),FF80HP膜(GE),AE膜(GE),Immunopore膜(GE)。优选地,所述硝酸纤维素膜具有50至250sec/4cm、优选地70至180sec/4cm、特别优选地100至170sec/4cm、更特别优选地80至140sec/4cm的毛细管流速。
所述扩增产物施加区优选地由硝酸纤维素制成,但是也可以由与迁移缓冲液施加区相同的材料例如纤维素纤维制成。在后一种情况下,并且在不存在标记区的实施方式中,所述迁移缓冲液施加区和扩增产物施加区可以合并。
所述标记区由能够结合对所述扩增产物标记物特异的底物或结合配偶体的材料例如玻璃纤维制成。
所述吸收垫和/或迁移缓冲液施加区由具有高吸收能力的材料例如纤维素纤维制成。
所述基质的尺寸可以由本领域普通技术人员容易地选择。根据某些优选实施方式,所述基质是长度为5至20cm、优选为7至15或10cm,并且宽度为0.3至1cm、优选为0.5至0.8cm的条。优选地,当所述基质由各个不同的组装元件构成时,后者具有相同的宽度。
所述多孔基质可以被任选地附连到固相支持物例如通常由塑料制成的板或盒。当所述基质由各个不同的组装元件构成时,使用固相支持物是特别有利的。所述支持物可以是例如柔性板,所述多孔基质的各个不同元件在其上组装并附连。
根据一种实施方式,在装载到所述侧流测定装置上之前对所述扩增产物进行热变性,通常在约90–95℃下几分钟,以便增加单链核酸的量。
根据另一种实施方式,所述扩增产物直接使用所述侧流测定装置进行分析,不需初步的纯化或变性步骤。因此,将所述扩增反应产物直接装载到所述扩增产物施加区上。当所述扩增通过不对称PCR、更具体来说通过LATE–PCR来进行时,这个实施方式是更加恰当的。
所述测定法的反应区包含一种或多种固定化的核苷酸探针,其通过与扩增产物特异性杂交而充当捕获剂。每种探针被固定化在不同位点上并且对待基因分型的SNP的等位基因变体具有特异性。
所述固定化的探针包含与目标多态性位点的等位基因的序列严格互补的核苷酸序列。这些探针优选地具有与所述靶序列互补的8至25个核苷酸、更特别优选地10至20个核苷酸的长度(不计入任选的间隔子和聚(dT))。
根据实施方式,将5至25pmol、优选地10至20pmol的每种探针装载到所述反应区中的不同位点上。
与所述多态性位点相关的核苷酸(即随着待检测的等位基因而变的核苷酸)优选地位于对所述靶特异的核苷酸序列的中间或基本上中间。
除了对所述待检测的等位基因特异的序列之外,所述探针还可以在3’或5’末端处、优选地在5’位置处包含一个或多个间隔子基团。这些基团具体来说可以是聚(dT)间隔子或连接到一个或多个嫁接基团的C3至C12间隔子、优选为C6或C7。所述嫁接基团具体来说可以是氨基、醛、羧基等,优选为氨基。根据特定实施方式,所述探针包含5’聚(dT)间隔子,优选为包含5至20dT、特别优选地15dT的聚(dT)间隔子。根据另一种实施方式,所述探针在探针的5’末端处包含连接到嫁接集团、优选为氨基的5’C3至C12间隔子、优选为C6或C7间隔子。根据优选实施方式,所述探针包含C3至C12间隔子、优选为C6或C7间隔子和优选地包含5至20dT、特别优选地15dT的聚(dT)间隔子两者。
固定化在所述反应区上的各个不同探针被设计成具有相近的熔点(Tm)。优选地,固定化在基质上的各个不同探针的Tm相差少于8℃,更特别优选地少于6、5、4、3或2℃。
所述探针可以按照本领域普通技术人员公知的技术固定化在所述多孔基质上。具体来说,所述探针可以通过共价键、吸附或任何其他适合的方法固定化在所述基质上。优选地,所述探针通过吸附来固定化。
所述侧流测定法的进展取决于用于标记扩增产物的标记物、即能够直接或间接地产生可检测信号的标记物的本质。
如果所述扩增产物用能够间接地产生可检测信号的标记物标记,则意味着所述标记物只有在与另一种化合物例如底物或结合配偶体相互作用后才能产生可检测信号。
在这种情况下,可以设想两个实施方式:
(i)所述迁移缓冲液包含能够与所述标记物相互作用以直接或间接地产生可检测信号的底物或结合配偶体,或者
(ii)所述侧流测定装置包含标记区,其包含对所述扩增产物标记物特异的底物或结合配偶体,所述底物或结合配偶体能够直接或间接地产生可检测信号。所述标记区优选地位于所述迁移缓冲液施加区下游和所述扩增产物施加区上游。
根据特定实施方式,所述扩增产物标记物是配体/抗配体对的第一个成员。在这种情况下,所述迁移缓冲液或标记区包含任选地偶联到可检测标记物的所述对的第二个成员。可检测标记物的实例包括但不限于胶体金属例如金或银;非胶体金属例如硒、碲或硫粒子;乳胶;可见、荧光、发光或化学发光染料,磁性粒子;放射活性元素;或酶。优选地,所述可检测标记物是有色粒子例如胶体金属粒子,特别优选为金粒子。
根据优选实施方式,所述扩增产物标记物是生物素,并且所述迁移缓冲液或标记区包含偶联到可检测标记物、优选地偶联到金粒子的抗生物素抗体。在这个实施方式中,所述迁移监测区可以包含装载到基质上的生物素化的分子例如生物素化的牛血清白蛋白,其通过偶联到可检测标记物的抗生物素抗体来揭示。
如果所述扩增产物用能够直接地产生可检测信号的标记物标记,则意味着不需要底物或结合配偶体来产生可检测信号。迁移缓冲液的施加足以使所述扩增产物向反应区迁移,并产生来自于所述扩增产物与固定化的探针的杂交的信号。
在将所述扩增产物装载到装置上之后,通过浸泡所述施加区或通过将缓冲液直接装载到施加区上,将所述迁移缓冲液施加到所述装置。取决于实施方式,所述迁移缓冲液包含或不包含用于所述扩增产物标记物的底物或结合配偶体。
任选地,所述方法可以包括附加步骤,其由在装载所述扩增产物之前用所述迁移缓冲液“润湿”所述多孔基质构成。这个“润湿”步骤可以通过浸泡所述缓冲液施加区或通过将所述缓冲液直接装载到所述施加区上来进行。在这个步骤期间,所述基质优选被置于用于将所述探针与所述扩增产物杂交的温育温度下。
所述迁移缓冲液优选地使所述单链结构在迁移期间稳定,以便获得通过所述被润湿的膜的均匀的迁移,在迁移期间提供良好的粒子迁移率以便避免聚集现象,并提供足够的严紧性以允许特异性探针/靶杂交。
所述迁移缓冲液优选地包含用于维持中性pH的缓冲液系统例如SSC,一种或多种表面活性剂例如SDS或20,和/或使氢键去稳定化的一种或多种变性剂例如脲或甲酰胺。根据实施方式,所述迁移缓冲液包含SSC、优选地0.2至1%的SDS、优选地5至20%的20和优选地2至10%的甲酰胺。根据特定实施方式,所述迁移缓冲液配方如下:1XSSC,0.5%SDS,10%20和5%甲酰胺。
然后将所述测定装置温育,直至在所述反应区中检测到由所述扩增产物标记物直接或间接地产生的信号,和/或如果存在迁移监测区的话在所述迁移监测区中检测到信号。
在这个步骤期间的温育温度基本上取决于所述固定化的探针的Tm。优选地,所述温育温度被选择成使得所有探针都不具有与所述温育温度相差超过8℃、优选地超过7或6℃、特别优选地超过5℃的Tm。
任选地,所述方法还可以在温育之后和读取结果之前包含清洗步骤。旨在降低背景噪音的所述清洗可以通过浸泡或直接沉积,在所述缓冲液施加区上添加一定体积的迁移缓冲液来进行。
通过检测由所述固定化的探针产生的信号来读取结果。取决于信号的本质,所述检测通过简单的目测检查或利用检测系统来实现。优选地,所述产生的信号是肉眼可见的有色信号,并且所述检测通过简单的目测检查来实现。
然后对所述结果进行解释,从探针固定化位点检测到信号指示所述样品中含有的核酸包含与所述探针互补的等位基因变体。
当所述装置包含迁移监测区时,当在所述区中也检测到信号时,认为结果有效。
根据第二方面,本发明还涉及如上所述的侧流测定装置,其包含:
多孔基质,其任选地附连到固相支持物,所述基质包含:
(i)迁移缓冲液施加区,
(ii)扩增产物施加区,其位于所述迁移缓冲液施加区下游,和
(iii)反应区,其优选地由硝酸纤维素制成并位于所述扩增产物施加区下游,其包含固定化在不同位点上的一种或多种探针,每种探针具有与目标SNP的等位基因变体互补的序列。
在这一方面中,还设想了与所述装置相关并且在上文本发明的第一方面的情况中描述的实施方式。
根据特定实施方式,所述反应区包含对同一SNP的两个不同变体特异的至少两种探针,或对两个不同SNP特异的至少两种探针。
任选地,所述基质还可以包含在所述反应区下游的试剂迁移监测区和/或在所述缓冲液施加区下游和所述扩增产物施加区上游的标记区。
所述多孔基质的每个不同区与相邻的区流体连通。
任选地,所述基质可以与位于所述反应区下游或者如果存在监测区的话就位于所述监测区下游的吸收垫流体连通。
根据一种实施方式,所述装置包含任选地附连到固相支持物的多孔基质,所述基质包含:
–由纤维素纤维制成的迁移缓冲液施加区,
–由硝酸纤维素或纤维素纤维制成,优选地由硝酸纤维素制成的扩增产物施加区,和
–由硝酸纤维素制成的反应区,
以及任选地
–由硝酸纤维素制成的监测区,和/或
–由纤维素纤维制成的吸收垫,和/或
–由玻璃纤维制成的标记区。
根据特定实施方式,所述装置包含任选地附连到固相支持物的多孔基质,所述基质包含:
–由纤维素纤维制成的迁移缓冲液施加区,
–由硝酸纤维素制成的扩增产物施加区、反应区和监测区,
–由纤维素纤维制成的吸收垫,以及
–任选地,由玻璃纤维制成的标记区。
根据另一种特定实施方式,所述装置包含任选地附连到固相支持物的多孔基质,所述基质包含:
–由纤维素纤维制成的迁移缓冲液施加区,
–由纤维素纤维制成的扩增产物施加区,
–由硝酸纤维素制成的反应区和监测区,
–由纤维素纤维制成的吸收垫,以及
–任选地,由玻璃纤维制成的标记区。
根据特定实施方式,所述固定化的探针对一个或多个血型抗原系统、优选地对选自Duffy、MNS和Kidd系统的一个或多个系统具有特异性。特别地,所述探针可以选自具有SEQ ID NO:9至20的序列的探针。
另一方面,本发明还涉及一种试剂盒,其包含本发明的侧流测定装置以及用于扩增含有一个或多个SNP的基因组区域的至少一个引物对。
优选地,所述试剂盒包含一个或多个引物对,其用于扩增含有与血型抗原系统例如Duffy、MNS和Kidd相关的一个或多个SNP的一个或多个基因组区域。根据特定实施方式,所述试剂盒包含选自SEQ ID NO:1至8的一个或多个引物。优选地,所述试剂盒包含一个或多个下述引物对:(1)SEQ ID NO:1和2,(2)SEQ ID NO:3和4,(3)SEQ ID NO:5和6,以及(4)SEQ ID NO:7和8。
所述试剂盒还可以包含迁移缓冲液,扩增试剂,尤其是通过LATE–PCR扩增靶所必需的试剂,例如dNTP、聚合酶或缓冲液,和/或说明书散页。
根据另一方面,本发明涉及本发明的侧流测定装置或本发明的试剂盒的用途,其用于按照本发明的方法对一个或多个SNP进行基因分型。
本发明还涉及本发明的侧流测定装置或本发明的试剂盒的用途,其用于对来自于样品、优选为血液、血浆或血清样品的个体血型抗原进行分型。所述分型具体来说可以涉及Duffy、MNS和Kidd系统中的一者或多者。
本说明书中引用的所有参考文献均通过引用并入本申请。在阅读了纯粹在说明性而非限制性的基础上给出的下述实施例后,本发明的其他特点和优点将变得更加显而易见。
实施例
实施例1
材料和方法
氯化钠、柠檬酸钠、甲醇、蔗糖、十二烷基硫酸钠(SDS)、20、甲酰胺和生物素化的牛血清白蛋白购自Sigma–Aldrich。偶联到抗生物素抗体的金粒子(40nm,9×1010个粒子/mL)购自BBI Solutions(England)。寡核苷酸、引物和探针由Eurogentec(Belgium)合成。
全血样品、表型分型和基因分型技术
全血样品由 du Sang收集在抗凝剂(EDTA)上,并在Blood Donation Qualification Laboratory(Metz–Tessy,France)中使用标准的血清学技术进行广泛的表型分型。所述样品使用以前描述的血型基因分型技术(Paris等,2014)进行广泛的基因分型。
LATE–PCR引物的设计
所述引物被设计成在非化学计量浓度下并在下述基础上使用:随着引物的工作浓度调整Tm值,以满足(Tm限制性引物–Tm过量引物)≥5℃的约束,能够以高效率产生单链产物(Pierce等,2005;Sanchez等,2004)。将所述引物在5’位置处用生物素基团标记,以允许通过使用用抗生物素抗体功能化的金纳米粒子,通过硝酸纤维素膜上有色斑点的出现来检测被杂交的靶。所述引物序列描述在表1中。
表1:用于通过LATE–PCR扩增血型系统的引物序列
LATE–PCR扩增条件
基因组DNA提取从400μL全血,在MagNA Pure Compact系统(Roche Diagnostics,Switzerland)上,使用MagNA Pure Compact分离试剂盒I(Roche Diagnostics,Switzerland)来进行。在提取后,将DNA洗脱在100μL缓冲溶液中,并在NanoVue分光光度计(GE Healthcare,USA)上定量。
单重LATE–PCR扩增条件
主混合物含有1μL基因组DNA、1X缓冲液(Eurogentec,Belgium)、MgCl2(1.5mM)、dNTP(0.2mM)、Diamond Taq DNA聚合酶(5单位每μL)和特异性引物。
单重PCR在TProfessional热循环仪(Biometra,Germany)上进行,开始是95℃下3分钟的酶激活步骤,然后进行35个循环,每个循环包括95℃30秒、55.5℃30秒和72℃30秒。扩增产物通过装载有GelRedTM(Biotum,USA)的2%琼脂糖凝胶的UV照射来监测。
多重LATE–PCR扩增条件
将基因组DNA用于在单个PCR微量管中同时扩增86至133bp的基因组片段。将非常规的不对称PCR、即LATE–PCR的条件应用于等位基因JK*01/JK*02、FY*wt/FY*02M.02(FY*Fy)和GYPB*03(MNS*03)/GYPB*04(MNS*04)的扩增(表1)。主混合物含有2.5μL基因组DNA、1XKAPA2G缓冲液、MgCl2(1.5mM)、牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)、dNTP(0.2mM)、KAPA2G FastHotStart DNA聚合酶(5单位每μL)和特异性引物。
多重PCR在2.0仪器(Roche Diagnostics,Germany)上使用高的升温速率来进行。首先是在95℃下30秒的酶激活步骤,然后进行45个循环,每个循环包括95℃5秒、55℃10秒和72℃10秒。扩增产物通过装载有GelRedTM(Biotum,USA)的2%琼脂糖凝胶的UV照射来监测。
硝酸纤维素膜的制备
HF135硝酸纤维素膜(Millipore,USA)购自Millipore(USA)。探针被特别设计以检测三种血型系统的等位基因(表2)。探针被设计成在5’位置处、在氨基连接物与特异性序列之间带有dT15聚(dT)间隔子,以便提高杂交效率。试条用硝酸纤维素膜(80mm×5mm)和吸收垫组装。所述膜和吸收垫使用闸刀式切纸机进行切割。
将浓度为5mg.mL–1的生物素化的BSA溶液固定化在所述试条的上部上,以形成所述测定期间的对照区(CT)。
使用在载样缓冲液(6X SSC,0.1%SDS,2%甲醇,2%蔗糖)中浓度为50μM.L–1的探针溶液,将探针手动装载到所述膜上。在装载后,将膜在80℃下干燥45分钟。
表2.在多重血型基因分型期间使用的探针序列。每种探针的多态性(SNP)由粗体和下划线的核苷酸指明。.
血型基因型在膜上的目测检测
既不使用纯化步骤也不使用变性步骤,将PCR产物直接施加到膜的下部(膜的底部上方1至1.5cm之间),然后将膜浸泡在96孔微孔板的孔中,所述孔含有10μL在迁移缓冲液(1X SSC,0.5%SDS,10%20,5%甲酰胺)中稀释两次的偶联的金纳米粒子的溶液。在所述纳米粒子迁移后,将膜浸泡在含有100μL迁移缓冲液的第一个50–mL锥形管(GreinerBio–One,Germany)中,并在53℃下温育。在迁移5分钟后,将膜浸泡在新鲜的在迁移缓冲液中稀释两次的金纳米粒子的溶液中。
在所述纳米粒子迁移后,将膜再次浸泡在50–mL锥形管(Greiner Bio–One,Germany)中并在53℃下温育。在30分钟内完成血型基因分型的目测检测。
结果
本发明人开发了一种采取单重格式,利用被扩增的靶在硝酸纤维素膜上的迁移的血型基因分型测定法。
通过单重LATE–PCR扩增两种血型系统JK(JK*1/JK*2)和FY(FY*1/FY*2)的目标靶。对2%琼脂糖凝胶上的扩增产物的检查显示出存在预期尺寸的条带(JK*1/JK*2:100bp,FY*1/FY*2:86bp)(图7)。
将表型和基因型已事先通过参比技术确定(表型通过血清学确定,基因型利用DNA微阵列确定(Paris等,2014))的具有不同概况的6个样品(图2和3),使用LATE–PCR流程进行扩增。将PCR产物施加到其上已装载有对目标等位基因特异的探针的硝酸纤维素膜(HF135,Millipore)。
在通过侧流的迁移后有色区的出现,显示出目测检测被扩增的等位基因的存在和/或不存在,确定与通过参比技术获得的结果相符的血型基因型,以及辨别JK和FY系统的不同基因型的可能性(图1A和1B)。试条的对照区(生物素化的BSA)上着色的出现验证了在所述测定法期间检测粒子正确发挥作用及其通过膜的令人满意的迁移。
本发明人还开发了一种采取整合了新的目标系统(MNS:MNS*3/MNS*4,FY:FY*wt/FY*Fy)的多重格式,利用被扩增的靶在硝酸纤维素膜上的迁移的血型基因分型测定法。
设计对每个等位基因特异的新的探针,然后将其装载到膜上以便进行所述基因分型测定法。具有不同概况的5个基因组DNA样品(图4)通过多重LATE–PCR来进行扩增。它们在侧流系统上的迁移导致出现有色区(图1C和1D),并允许确定每个样品的基因型。在从所述基因型与参比技术预测的表型之间,得到的结果相符,并证明了以多重格式同时确定6种目标抗原的血型基因型(图1D)和预测扩展表型的可能性。
实施例2
材料和方法
设计新的探针以允许在比实施例1中展示的迁移温度更低的迁移温度下确定血型基因型。序列呈现在表3中。所述试条用HF090硝酸纤维素膜(80mm×5mm)和吸收垫组装。所述膜和吸收垫使用闸刀式切纸机切割。
将浓度为5mg.mL–1的生物素化的BSA溶液固定化在所述试条的上部上,以形成所述测定期间的对照区(CT)。
使用在载样缓冲液(6X SSC,0.1%SDS,2%甲醇,2%蔗糖)中浓度为50μM.L–1的探针溶液,将探针手动装载到所述膜上。在装载后,将膜在80℃下干燥40–45分钟。
表3.在JK和FY系统的多重血型基因分型期间使用的探针序列。每种探针的多态性(SNP)用粗体和下划线的核苷酸指明。
将PCR产物直接施加到膜的下部,然后将其浸泡在96孔微孔板的孔中,所述孔含有10μL在迁移缓冲液(1X SSC,0.5%SDS,10%20,5%甲酰胺)中稀释两次的偶联的金纳米粒子的溶液。在所述纳米粒子迁移后,将膜浸泡在含有100μL迁移缓冲液的50–mL锥形管(Greiner Bio–One,Germany)中,并在30℃下温育。在不到30分钟内完成血型基因分型的目测检测。
结果
对在实施例1中描述的侧流系统上进行血型基因分型的方法进行调整,以允许该测定法在30℃的温度下进行。
通过双重LATE–PCR扩增两种血型系统JK(JK*1/JK*2)和FY(FY*1/FY*2)的目标靶。与实施例1中描述的方法相比,探针的尺寸减小,并且所述硝酸纤维素膜被具有更高毛细管流速的膜(HF090硝酸纤维素膜)代替。
通过双重LATE–PCR扩增具有不同概况的3个基因组DNA样品,并将其施加到其上已装载有对所涉及的等位基因特异的探针的硝酸纤维素膜。在所述膜的反应区上有色斑点的出现(图5),使得可以同时确定JK和FY系统的基因型并预测表型。得到的结果与通过其他参比技术确定的结果相符。
实施例3
本发明人还显示,本发明的用于血型基因分型的方法可以从全血样品直接进行。
为此目的,按照实施例1中详细描述的流程,使用2.5μL全血代替基因组DNA,通过多重LATE–PCR扩增4种血型系统JK(JK*1/JK*2)、FY(FY*1/FY*2)、MNS(MNS*3/MNS*4)和FY(FY*wt/FY*Fy)的目标靶。
将表型和基因型已事先通过参比技术确定(表型通过血清学确定,基因型利用DNA微阵列确定(Paris等,2014))的具有不同概况的4个样品,使用LATE–PCR流程进行扩增。将PCR产物施加到其上已装载有对目标等位基因特异的探针的硝酸纤维素膜(HF135,Millipore)(参见实施例1)。
在通过侧流的迁移后有色区的出现,使得可以确定血型基因型与通过参比技术获得的结果相符(图8)。
参考文献
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序列表
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<120> 用于SNP基因分型的方法和装置
<130> B2091PC
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于JK系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的过量引物
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'生物素化的引物
<400> 1
cagtctttca gccccatttg ag 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于JK系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的限制性引物
<400> 2
ggtgagcgcc atgaacattc ctccc 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MNS系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的过量引物
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'生物素化的引物
<400> 3
acctggtaca gtgaaacgat g 21
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MNS系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的限制性引物
<400> 4
aggaaacccg cagaacagtt tgattcc 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于FY系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的过量引物
<220>
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<223> 5'生物素化的引物
<400> 5
atgattcctt cccagatgga gac 23
<210> 6
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<212> DNA
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<220>
<223> 用于FY系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的限制性引物
<400> 6
tgcagagtca tccagcaggt tacaggagt 29
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于FY (FY*Fy)系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的过量引物
<220>
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<223> 5'生物素化的引物
<400> 7
ccctcattag tccttggctc tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于FY (FY*Fy)系统特异性SNP的LATE-PCR扩增的限制性引物
<400> 8
ctcaccctgt gcagacagtt cccc 24
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<212> DNA
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<220>
<223> JK*01等位基因的特异性探针
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<220>
<223> JK*02等位基因的特异性探针
<220>
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<223> 5'间隔子基团C6 NH2-(dT)15
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aagtagatgt tctcaaatgg g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> FY*01等位基因的特异性探针
<220>
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<212> DNA
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<223> FY*02等位基因的特异性探针
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aggttggcat catagtctc 19
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<223> FY*wt等位基因的特异性探针
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<223> FY*02M.02 (FY*Fy)等位基因的特异性探针
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<400> 14
gcttccaagg taagagcca 19
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<212> DNA
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<223> MNS*03等位基因的特异性探针
<220>
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<223> 5'间隔子基团C6 NH2-(dT)15
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aggagaaatg ggacaacttg 20
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<220>
<223> MNS*04等位基因的特异性探针
<220>
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ataggagaaa cgggacaact t 21
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<212> DNA
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<220>
<223> JK*01等位基因的特异性探针
<220>
<221> misc_feature
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agatgtcctc aa 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JK*02等位基因的特异性探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'间隔子基团C6 NH2-(dT)15
<400> 18
tagatgttct caat 14
<210> 19
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FY*01等位基因的特异性探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'间隔子基团C6 NH2-(dT)15
<400> 19
tggcaccata g 11
<210> 20
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FY*02等位基因的特异性探针
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'间隔子基团C6 NH2-(dT)15
<400> 20
tggcatcata gt 12
Claims (23)
1.一种对核酸样品中的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的体外方法,所述方法包括:
a)扩增含有待基因分型的SNP的所述核酸的一个或多个区域,扩增产物包含能够直接或间接地产生可检测信号的标记物,以及
b)使用侧流测定装置分析在步骤(a)中获得的扩增产物,所述侧流测定装置包含反应区,所述反应区包含固定化在不同位点上的一种或多种核苷酸探针、优选地至少两种核苷酸探针,每种探针具有与待基因分型的SNP的等位基因变体互补的序列,
在所述探针固定化位点处检测到信号指示所述核酸包含对所述探针特异的等位基因变体。
2.权利要求1的方法,其中所述扩增通过不对称PCR、优选地通过LATE–PCR来进行。
3.权利要求1或2的方法,其中所述核酸的几个区域的同时扩增通过多重PCR来进行。
4.前述权利要求任一项的方法,其中所述扩增产物是5’–标记的,优选地通过在所述扩增期间使用5’–标记的引物进行5’–标记。
5.前述权利要求任一项的方法,其中所述扩增产物用有色、发光、荧光、磷光或放射活性化合物,用酶或配体/抗配体对的第一个成员,优选地用生物素来标记。
6.前述权利要求任一项的方法,其中所述侧流测定装置包含:
多孔基质,其包含:
(i)迁移缓冲液施加区,
(ii)扩增产物施加区,其位于所述迁移缓冲液施加区下游,和
(iii)反应区,其位于所述扩增产物施加区下游,以及
(iv)任选的试剂迁移监测区,其位于所述反应区下游,和/或
(v)任选的标记区,其包含对能够直接或间接地产生可检测信号的扩增产物标记物特异的底物或结合配偶体,所述标记区位于所述迁移缓冲液施加区下游和所述扩增产物施加区上游,和/或
(vi)任选的吸收垫,其位于所述反应区下游或如果存在监测区的话就位于所述监测区下游,
所述多孔基质的各个不同区与相邻的区流体连通,并且所述吸收垫与所述多孔基质流体连通。
7.前述权利要求任一项的方法,其中所述扩增产物不需初步的纯化或变性步骤,使用所述侧流测定装置直接分析。
8.前述权利要求任一项的方法,其中所述分析包括:
i)将在步骤(a)中获得的扩增产物装载到所述侧流测定装置上,
ii)在所述装置上施加迁移缓冲液,
iii)将所述装置温育,直至在所述反应区中检测到由所述扩增产物标记物直接或间接地产生的信号,和/或当存在迁移监测区时在所述迁移监测区中检测到信号,以及
iv)读取并解释结果。
9.前述权利要求任一项的方法,其中所述基质由硝酸纤维素、聚酯、玻璃纤维、纤维素纤维、聚醚砜(PES)和/或纤维素酯制成。
10.前述权利要求任一项的方法,其中所述基质包含硝酸纤维素膜。
11.权利要求10的方法,其中所述硝酸纤维素膜包含所述基质的反应区。
12.权利要求11的方法,其中所述硝酸纤维素膜还包含所述基质的扩增产物施加区和/或监测区,优选地包含所述基质的扩增产物施加区和监测区。
13.前述权利要求任一项的方法,其中所述基质的迁移缓冲液施加区和/或所述吸收垫由纤维素纤维制成。
14.前述权利要求任一项的方法,其中所述基质的标记区由玻璃纤维制成。
15.前述权利要求任一项的方法,其中所述迁移缓冲液包含用于维持中性pH的缓冲系统、一种或多种表面活性剂和/或使氢键去稳定化的一种或多种变性剂。
16.前述权利要求任一项的方法,其中所述样品中包含的待基因分型的核酸是基因组DNA,优选为人类基因组DNA。
17.前述权利要求任一项的方法,其中所述核酸样品是全血、血清或血浆样品。
18.权利要求17的方法,其中扩增含有待基因分型的SNP的所述核酸的一个或多个区域的步骤在所述全血、血清或血浆样品上进行,不需所述核酸的部分或完全纯化的初步步骤。
19.前述权利要求任一项的方法,其中所述扩增产物标记物是生物素,并且所述迁移缓冲液或标记区包含偶联到可检测标记物、优选地偶联到金粒子的抗生物素抗体。
20.一种试剂盒,其包含权利要求6和9至14任一项中所定义的侧流测定装置和用于扩增含有一个或多个SNP的基因组区域的至少一个引物对,以及任选地包含迁移缓冲液,扩增试剂,优选为dNTP、聚合酶和/或缓冲液,和/或解释所述试剂盒的使用的说明书散页。
21.权利要求20的试剂盒,其包含用于扩增一个或多个基因组区域的一个或多个引物对,所述基因组区域含有与血型抗原系统、优选为Duffy、MNS和/或Kidd系统相关的一个或多个SNP。
22.权利要求20或21的试剂盒,其包含选自SEQ ID NO:1至8的一个或多个引物。
23.权利要求20至22任一项的试剂盒的用途,其用于按照权利要求1至19任一项的方法对一个或多个SNP进行基因分型。
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