CN108136016A - 化合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了使用光化学内化方法在细胞表面上表达抗原分子或其部分的方法，其中使用细胞因子，优选GM‑CSF来增强该方法。该方法可用于刺激免疫反应和用于各种治疗或预防方法。包含用于该方法的组分的药物组合物或试剂盒、通过该方法产生的细胞及其在治疗和预防中的用途也形成本发明的多个方面。
Description
本发明涉及一种疫苗接种或免疫的方法，其涉及使用光敏剂、抗原分子例如疫苗组分和增强光化学内化(PCI)介导的疫苗接种(其是本文定义的细胞因子)的效果的试剂，以及使用波长能有效激活光敏剂的光进行照射。本发明还涉及可用于这种方法的抗原性组合物，例如疫苗组合物。本发明还提供了产生抗原呈递细胞的方法，所述细胞可用于产生免疫应答，例如用于疫苗接种，所述方法涉及使用与上述相同的组分以将抗原分子例如疫苗组分引入细胞以实现抗原呈递，以及用于这种方法的抗原组合物。本发明还提供了通过这种方法在体外产生的细胞施用于患者体内以引发免疫反应例如实现疫苗接种的用途。还提供了将抗原分子内化到细胞中的方法。
疫苗接种涉及施用抗原分子以激发免疫系统从而刺激对病原体的适应性免疫的发展。疫苗可以预防或改善感染的发病率。疫苗接种是预防传染病的最有效方法，由于疫苗接种引起的广泛免疫是全世界根除天花和使世界上许多地方免受脊髓灰质炎、麻疹和破伤风等疾病肆虐的主要原因。
疫苗的活性剂可以是致病病原体的完整但失活(非感染性)的形式或减毒(具有降低的感染性)的形式，或者是已被发现具有免疫原性的病原体的纯化组分(例如，例如病毒的外部衣壳蛋白)。类毒素(toxoid)被生产以用于针对基于毒素的疾病的免疫，例如改造破伤风的破伤风毒素以去除其毒性作用，但保持其免疫原性效应。
由于大多数疫苗通过内吞作用被抗原呈递细胞吸收，并通过内体转运到溶酶体用于抗原消化和通过MHC II类途径呈递，接种主要激活CD4T辅助细胞和B细胞。为了与病症或疾病如癌症以及细胞内感染作斗争，重要的是刺激细胞毒性CD8T细胞应答。然而，因为难以将抗原递送至细胞质和抗原呈递的MHC I类途径，细胞毒性CD8T细胞的诱导通常失败。光化学内化(PCI)改善分子进入细胞溶质的递送，并且采用PCI的疫苗接种方法是已知的。PCI是使用光敏剂并结合照射步骤以激活该试剂的技术，并且已知实现将共同施用于细胞的分子释放到细胞的细胞质中。这种技术允许被细胞摄取的分子进入细胞器例如内体，在照射后从这些细胞器释放到细胞质中。PCI提供了以不会导致广泛的细胞破坏或细胞死亡的方式将本不可透膜(或不易渗透)的分子引入细胞的细胞质中的机制。
光化学内化(PCI)的基本方法描述于WO 96/07432和WO 00/54802中，其通过引用并入本文。在这些方法中，使待内化的分子(在本发明中其将是抗原分子)和光敏剂与细胞接触。光敏剂和待内化的分子被吸收到细胞内的细胞膜结合的亚室中，即它们被内吞到细胞内囊泡(例如溶酶体或内体)中。当细胞暴露于适当波长的光时，光敏剂被激活，其直接或间接产生破坏细胞内囊泡膜的反应性物质。这允许内化分子释放到细胞质中。
据发现，在这方法中，大多数细胞的功能或活力没有受到有害影响。因此，提出了称为“光化学内化”的这种方法的用途，用于将多种不同分子(包括治疗剂)运输到细胞质中，即进入细胞内部。
WO 00/54802利用这种一般方法在细胞表面上呈递或表达转移分子。因此，在将分子运输和释放到细胞质中之后，其(或该分子的一部分)可以被运输到细胞的表面，在该处它可以呈递于细胞外部，即在细胞表面上。这种方法在疫苗接种领域具有特殊的用途，其中疫苗组分即抗原或免疫原可以被引入细胞中用于呈递在该细胞的表面上，以便诱导、促进或增强免疫应答。
尽管疫苗接种已经取得了一些值得注意的成功，但仍然需要替代的和改进的疫苗接种方法。本发明解决了这种需要。
有利地，本发明人惊奇地发现以下方法能改善疫苗接种或改善免疫应答，该方法涉及使用光敏剂、抗原分子例如疫苗组分，以及作为如本文所定义的细胞因子的试剂，并用波长能有效激活光敏剂的光进行照射。
如将在下面的实施例中更详细地描述的，本发明的方法提供改进的疫苗接种或改善的免疫应答，例如产生增加量的抗原特异性T细胞。预期实现了协同效应。
虽然不希望受理论束缚，但是据信本发明的方法导致MHC I类分子上的抗原呈递增加，致使CD8+ T细胞应答增加，从而改善疫苗接种方法。如实施例中所公开，使用OT-1细胞的模型系统可用于评估MHC I类呈递(参见例如Delamarre等人，J.Exp.Med.198：111-122,2003)。在该模型系统中，抗原表位SIINFEKL的MHC I类呈递导致OT-1T细胞的活化，并且活化可以测量为抗原特异性T细胞增殖的增加或IFNγ或IL-2的产生增加。
因此，在第一方面，本发明提供了在细胞表面上表达抗原分子或其一部分的方法，该方法包括使所述细胞与所述抗原分子、光敏剂和作为细胞因子的试剂接触，以及用波长能有效激活所述光敏剂的光照射所述细胞，其中所述抗原分子释放到所述细胞质中，所述抗原分子或其一部分随后呈递在所述细胞的表面上。
优选地，该方法(以及随后描述的方法)在所述方法中仅使用上述三种活性成分(试剂)，并且所述试剂在所述方法中以适当的水平(例如，下文所述的最低水平)存在，使得它们影响该方法的功效(即在增强PCI接种/抗原呈递/免疫应答刺激中具有积极作用)。因此，优选地，所述试剂存在于没有其它活性成分的缓冲液中。
在这些方法中，所述抗原分子和所述光敏剂，以及任选地作为本文定义的细胞因子的所述试剂各自被摄入胞内囊泡；并且当照射细胞时，胞内囊泡的膜被破坏，将抗原分子释放到细胞溶质中。
各种试剂可以相对于彼此被吸收到相同或不同的细胞内囊泡中。已经发现，由光敏剂产生的活性物质可以延伸超过它们被包含在其中的囊泡和/或囊泡可以聚结以允许囊泡的内容物通过与被破坏的囊泡聚结而释放。如本文所述，“摄取(taken up)”表示所摄取的分子完全包含在囊泡内。细胞内囊泡由膜结合，并且可以是在胞吞作用后产生的任何这样的囊泡，例如内体或溶酶体。
如本文所用，“破碎的(disrupted)”区室是指永久或暂时破坏该区室的膜的完整性，足以允许释放包含在其中的抗原分子。
本文所述的“光敏剂”是当在适当的波长和强度的照射下激活该试剂以产生活化物质时能够将吸收的光的能量转化到化学反应中的化合物。这些过程的高度反应性终产物可导致细胞毒性和血管毒性。方便地，这种光敏剂可以是定位于胞内区室、特别是内体或溶酶体的光敏剂。
光敏剂可以通过多种机制直接或间接地发挥其作用。因此，例如，某些光敏剂在被光激活时直接变得有毒，而其它光敏剂则产生毒性物质，例如，氧化剂如单线态氧或其它反应性氧物质，其对细胞材料和生物分子如脂质、蛋白质和核酸具有极强的破坏性。
一系列这样的光敏剂是本领域已知的，并且描述在文献中，包括WO96/07432，其通过引用并入本文，并且可以用于本发明的方法中。存在许多已知的光敏剂，包括卟啉、酞菁、紫红素、二氢卟吩、苯并卟啉、亲溶酶体弱碱、萘酞菁、阳离子染料和四环素或其衍生物(Berg等，(1997),J.Photochemistry and Photobiology,65,403-409)。其它光敏剂包括得克萨卟啉、脱镁叶绿甲酯、卟啉烯(porphycene)、菌绿素、酮基二氢卟吩(ketochlorin)、血卟啉衍生物和由5-氨基乙酰丙酸及其衍生物诱导的内源性光敏剂、光敏素(Photofrin)、光敏剂之间的二聚体或其它共轭物。
卟啉是最广泛研究的光敏剂。它们的分子结构包括通过次甲基桥连接在一起的四个吡咯环。它们是通常能够形成金属络合物的天然化合物。例如在氧运输蛋白血红蛋白的情况下，铁原子被引入血红素B的卟啉核心。
二氢卟吩是大的杂环芳香环，其在核心由三个吡咯和一个吡咯啉通过四个次甲基键联接组成。与卟啉不同，二氢卟吩因此大部分是芳香性的，但在环的整个圆周上不是芳香性的。
本领域技术人员将理解哪种光敏剂适合用于本发明。特别优选的是位于细胞内体或溶酶体的光敏剂。因此，光敏剂优选是吸收到溶酶体或内体的内区室中的试剂。优选地，光敏剂通过内吞作用被吸收到细胞内区室中。优选的光敏剂是二磺化和四磺化铝酞菁(例如AlPcS2a)、磺化四苯基卟吩(TPPSn)、磺化四苯基菌绿素(例如TPBS2a)、尼罗蓝、二氢卟吩e6衍生物、尿卟啉I、藻红蛋白、血卟啉和亚甲蓝。用于本发明的其它合适的光敏剂描述于WO03/020309中，其也通过引用并入本文，即磺化的内消旋四苯基二氢卟吩，优选TPCS2a。优选的光敏剂是两亲性光敏剂(例如二磺化光敏剂)，例如两亲性酞菁、卟啉、二氢卟吩和/或菌绿素，特别包括TPPS2a(四苯基卟吩二磺酸盐)、AlPcS2a(铝酞菁二磺酸盐)、TPCS2a(四苯基二氢卟吩二磺酸盐)和TPBS2a(四苯基菌绿素二磺酸盐)或其药学上可接受的盐。还优选的是亲水性光敏剂，例如TPPS4(内消旋-四苯基卟吩四磺酸盐)。特别优选的光敏剂是磺化铝酞菁、磺化四苯基卟吩、磺化四苯基二氢卟吩和磺化四苯基菌绿素，优选TPCS2a、AlPcS2a、TPPS4和TPBS2a。在本发明的一个特别优选的实施方式中，光敏剂是二氢卟吩TPCS2a(二磺化四苯基二氢卟吩，例如)。
光敏剂可以连接到载体以提供光敏试剂。因此，在本发明的该实施方式的优选方面，光敏试剂是如式(I)中定义的光敏剂和壳聚糖的缀合物：
其中
n是大于或等于3的整数；
R在所述化合物中出现n次，且
在所述总Rn基团的0.1％～99.9％(优选0.5％～99.5％)中，每个R是选自以下的基团A：
其中每个R1相同或不同，其选自H、CH3和-(CH2)b-CH3；a为1、2、3、4或5；且b是0、1、2、3、4或5(其中抗衡离子是例如Cl-)；优选R1是CH3，b是1，
和
其中Y是O、S、SO2、–NCH3或-N(CH2)dCH3；c＝1、2、3、4或5；且d＝1、2、3、4或5，优选Y是NCH3且c是1，
其中每个R基团相同或不同，并且
在所述总Rn基团的0.1％～99.9％(优选0.5％～99.5％)中，每个R是选自以下的基团B：
其中
e是0、1、2、3、4或5；且f是1、2、3、4或5；优选e和f＝1，
R2是选自以下的基团：
W是选自O、S、NH或N(CH3)的基团；优选NH，
R3是选自以下的基团：
V是选自CO、SO2、PO、PO2H或CH2的基团；优选CO，且
R4是相同或不同的选自H、-OH、-OCH3、-CH3、-COCH3、C(CH3)4、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2和-NCOCH3的基团，其是o、m或p位的取代基，优选H，
其中每个R基团相同或不同。
壳聚糖聚合物具有至少3个单元(n＝3)。然而，优选地，n为至少10、20、50、100、500、1000，例如从10至100或10至50。
在优选实施方式中，R2选自
在另一个优选的实施方式中，R3选自
优选R2或R3是TPPa、TPCa1或TPCc1。
基团A可以提供总Rn基团的70％～95％，基团B可以提供总Rn基团的5％～30％。
在最优选的实施方式中，光敏剂和壳聚糖的缀合物选自(参见图4中方案1-5B中的编号)：
17：B：25％，A：75％
19：B：25％，A：75％
33：B：10％；A：90％
和
37：B：10％；A：90％
在上述结构中，所提供的A/B％值是指作为基团A或B的Rn基团的比例。星号表示壳聚糖多聚体的剩余部分。
这些化合物可以通过使用本领域技术人员熟悉的标准程序的合成方法制备。作为实例，下文讨论的优选的缀合物(编号17、19、33和37)的合成显示在图1的反应方案1-5B中(也参见图1图例)。
本文提及的“抗原性”分子是当以适当的方式呈递给免疫系统或免疫细胞时，其本身或其一部分能够刺激免疫应答的分子。因此，有利的是，抗原分子是疫苗抗原或疫苗成分，例如含多肽的实体。
许多这样的抗原或抗原疫苗组分是本领域已知的，包括所有方式的细菌或病毒抗原，或实际上任何病原物种(包括原生动物或更高级生物)的抗原或抗原组分。虽然传统上疫苗的抗原组分包括完整生物体(无论是活的、死的还是减毒的)，即全细胞疫苗，但在文献中另外还已广泛研究和报道了亚单位疫苗(sub-unit vaccine)，即基于生物体的特定抗原组分(例如蛋白质或肽，或者碳水化合物)的疫苗。任何这样的“亚单位”类疫苗组分可以用作本发明的抗原分子。
然而，本发明特别适用于肽疫苗领域。因此，根据本发明的优选抗原分子是肽(其在本文中定义为包括较短和较长长度的肽，即肽、寡肽或多肽，以及蛋白质分子或其片段，例如5至500个、例如10至250个、诸如5至75个、或8至25个氨基酸的肽)。已经使用例如卵白蛋白作为形成本发明的优选方面的抗原分子来说明本发明，但是特别优选不是卵白蛋白的抗原分子，例如在实施例中使用的那些。
在文献中已经提出了大量的肽疫苗候选物，例如在病毒性疾病和感染如AIDS/HIV感染或流感、犬细小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治疗中(参见，例如Phanuphak等，AsianPac.J.Allergy.Immunol.1997,15(1),41-8；Naruse,Hokkaido Igaku Zasshi 1994,69(4),811-20；Casal等，J.Virol.,1995,69(11),7274-7；Belyakov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(4),1709-14；Naruse等，Proc.Natl.Sci.USA,1994 91(20),9588-92；Kabeya等，Vaccine 1996,14(12),1118-22；Itoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83(23)9174-8)。类似地，可以使用细菌肽，实际上可以使用源自其他生物体或物种的肽抗原。
除了来源于病原生物的抗原之外，肽也已被提议用作针对癌症或其它疾病如多发性硬化的疫苗。例如，突变癌基因肽极有望作为充当刺激细胞毒性T淋巴细胞的抗原的癌症疫苗(Schirrmacher,Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995,121,443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers,1997,17,316-327)。因此，黑素瘤抗原可以用作本发明的抗原分子。在可选的实施方式中，可以使用不是黑素瘤抗原的抗原分子。本文所述的“黑素瘤抗原”是当以合适的方式呈递给免疫系统或免疫细胞时，自身或其一部分能够刺激免疫应答的黑素瘤细胞衍生的分子。“源自”黑素瘤的分子是可出现在黑素瘤细胞中或相对于黑素瘤中的天然分子被修饰的分子，例如通过截短、表达后修饰和/或序列修饰，条件是经修饰的分子保留来自天然分子的一个或多个表位，其允许所述经修饰的分子产生识别天然分子的免疫应答。黑素瘤抗原可以通过从适当的来源例如受试者的黑素瘤分离得到，或者例如通过化学合成或肽/蛋白质表达进行合成。
合成肽疫苗也已经被评估用于治疗转移性黑色素瘤(Rosenberg等，Nat.Med.1998,4(3),321-7)。用于治疗多发性硬化的T细胞受体肽疫苗在Wilson等，J.Neuroimmunol.1997,76(1-2),15-28中描述。任何这样的肽疫苗组分都可以用作本发明的抗原分子，实际上文献中作为肽疫苗描述或提出的任何肽都可以使用。因此，所述肽可以是合成的或分离的肽或者以其他方式衍生自生物体。优选的肽包括在实施例中使用的那些，例如HPV肽，例如HPV长肽，其序列为QAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR的。
在一个实施方式中，佐剂也用于本发明的方法中。例如，佐剂可以选自Toll样受体(TLR)配体，例如TLR3配体，例如聚(IC)(例如高(例如1.5kb～8kb的平均大小)分子量(MW)或低(例如0.2kb～1kb的平均大小)分子量聚(IC))。对于小鼠，聚(IC)的剂量可以为5μg～200μg，例如10μg～100μg，优选10μg或50μg，其可以在需要用于治疗其他动物时适当地缩放。本发明的产品、方法或用途优选含有或使用聚(IC)。
一旦通过光化学内化过程释放在细胞溶质中，抗原分子可以由细胞的抗原加工单元加工。因此，在细胞表面上表达或呈递的抗原分子可以是被内化(内吞)的抗原分子的一部分或片段。呈递或表达的抗原分子的“部分(part)”优选包含由细胞内的抗原加工单元产生的部分。然而，可以通过适当的抗原设计(例如pH敏感键)或通过其他细胞处理手段实现的其他方式来产生“部分”。方便的是，这些部分具有足够的尺寸以产生免疫应答，例如，在肽长于5、例如长于10或20个氨基酸的情况下。
如本文所讨论的，增强PCI介导的疫苗接种的试剂是细胞因子。术语“细胞因子”涵盖由各种源自胚胎的细胞在整个身体中产生的大的各种各样的调节子家族。细胞因子是小的细胞信号传导分子，其可以是蛋白质、肽或糖蛋白。细胞因子包括免疫调节剂，例如白细胞介素(IL)和干扰素(IFN)以及集落刺激因子、肿瘤坏死因子(TNF)和其它调节分子。细胞因子基于其功能、分泌细胞或作用靶标被归类为淋巴因子、白细胞介素和趋化因子。每种细胞因子具有匹配的细胞表面受体，其启动改变细胞功能的细胞内信号传导的级联。细胞因子是本领域公知的，并且所有这样的细胞因子都涵盖在根据本发明的应用中。优选的家族如本文所述。
细胞因子根据结构和/或功能以各种方式分类，并且已经鉴定了各种家族。细胞因子可以根据它们所结合的受体进行分类。受体(及其配体)可以分为1型细胞因子(血细胞生成素)受体、II型细胞因子受体、TNF受体、免疫球蛋白超家族受体和7种跨膜α螺旋受体。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)连同C-CSF、M-CSF、IL-3和IL-5同属于作为上述造血细胞因子受体配体的细胞因子家族。在该受体家族中有GM-CSF受体家族，其具有共同的β链。GM-CSF由多种细胞类型作为含有128个氨基酸的单链糖蛋白分泌，具有保守的二硫键。GM-CSF的功能由GM-CSF受体介导，所述GM-CSF受体包含GM-CSF特异性α链，以及在人类细胞中与IL-3和IL-5受体共有的β链。α链作为单体在细胞表面上表达，并以高亲和力结合GM-CSF。在这样的结合之后，β链被募集到复合物并激活信号转导和功能应答。此外，α链可以作为可溶性外部分子(通过选择性剪接产生)存在。该受体与其膜结合对应物竞争对细胞因子结合，但不参与激动性信号传导。GM-CSF作为白细胞生长因子起作用。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。因此，在对抗感染中GM-CSF是重要的。
在I型细胞因子受体家族中还有IL-2受体家族。该家族的成员具有共同的γ链。该家族的受体包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体。大多数白介素由辅助CD4T淋巴细胞，以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。它们促进T、B和造血细胞的发育和分化。
IL-7结合IL-7受体，IL-7受体是由白细胞介素-7受体α和共同的γ链受体组成的异源二聚体。IL-7对B和T细胞发育都很重要。该细胞因子和肝细胞生长因子(HGF)形成异源二聚体，其充当前原B细胞(pre-pro-B cell)生长刺激因子。IL-7也是T细胞受体β(TCRβ)在早期T细胞发育过程中V(D)J重排的辅因子。IL-7可以由肠上皮和上皮杯状细胞局部产生，但不是由淋巴细胞本身产生的，并且血清IL-7水平与淋巴细胞计数反相关。细胞因子与其受体的结合导致对T细胞发育重要的信号传导(在胸腺内和在外周内的存活)。IL-7刺激多能(多能性)造血干细胞分化为淋巴祖细胞(与其中分化受IL-3刺激的骨髓祖细胞相对)。它还刺激淋巴谱系中的所有细胞(B细胞、T细胞和NK细胞)的增殖。它对于在B细胞成熟的某些阶段的增殖、T和NK细胞存活、发育和体内平衡是重要的。
如上所述，IL-2、IL-15和IL-21与IL-7相关，因为它们属于所谓的γ(c)细胞因子家族，即它们以共同的γ链与受体结合。这些细胞因子都使用共同的细胞因子γ链用于信号传导，并且对T细胞和NK细胞具有有效的作用。
IL-2主要由T辅助细胞产生并作用于先天和适应性免疫系统的多种免疫细胞。IL-2是诱导应答性T细胞增殖的淋巴因子。此外，它通过受体特异性结合作用于一些B细胞，作为生长因子和作为抗体生产刺激剂。IL-2作为单个糖基化多肽分泌，并且信号序列的切割是其活性所需的。溶液NMR表明IL-2的结构包含4个螺旋(称为A-D)的束，侧翼为2个较短的螺旋和几个不明确的环。螺旋A中以及螺旋A和B之间的环区域中的残基对于受体结合是重要的。二级结构分析表明与IL-4和GM-CSF的相似性。
IL-15由多种细胞类型和组织组成型表达，但主要是膜结合的。IL-15和IL-2表现出相似的免疫作用并且共享IL-2受体亚基IL-2Rβ和IL-2Rγ(c)，但每种细胞因子具有单独的α受体。IL-15具有多种生物学功能，包括刺激和维持细胞免疫应答。IL-15刺激T淋巴细胞的增殖。
IL-21与IL-15同源，但受体由称为IL-21Rα和IL-2Rγ(c)的独特亚基组成。IL-21由活化的CD4+ T辅助细胞和NK T细胞产生。所有淋巴细胞和树突细胞都具有IL-21受体。通过细胞因子结合刺激受体可导致CD8+ T细胞的共刺激、活化和增殖、NK细胞毒性增强、CD40驱动的B细胞增殖、分化和同种型转换的增加、以及Th17细胞的促进和分化。
干扰素(IFN)是结合II型细胞因子受体的细胞因子的实例。干扰素是由宿主细胞响应于病原体如病毒、细菌、寄生虫或肿瘤细胞的存在而产生和释放的蛋白质。它们允许细胞之间的通信以触发根除病原体或肿瘤的免疫系统的保护性防御。干扰素可以激活免疫细胞，例如自然杀伤细胞和巨噬细胞，并且它们增加未感染的宿主抵抗病毒的新感染的能力。
已经在哺乳动物中鉴定了大约十种不同的IFN(在人中为七种)。有三种IFN类别，它们基于受体信号通过的受体类型描述。所有I型IFN结合到称为IFN-α受体(IFNAR)的特定细胞表面受体复合物，其由IFNAR1和IFNAR2链组成。存在于人类中的I型干扰素是IFN-α、IFN-β和IFN-ω。II型IFN结合IFNGR，其由IFNGR1和IFNGR2链组成。在人类中，这是IFN-γ。III型干扰素通过由IL10R2和IFNLR1组成的受体复合物传递信号。
IFN-α蛋白由白细胞产生，并且主要参与针对病毒感染的先天免疫应答。有13个亚型：IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。这些IFN-α分子的基因一起存在于染色体9上的簇中。
根据本发明，试剂可以是任何细胞因子。上述细胞因子的所有已知形式可用于本发明，包括其功能等同变体、衍生物和片段。因此，本文所用的术语“细胞因子”包括已知细胞因子多肽的氨基酸序列变体，以及细胞因子多肽或其衍生物的片段，条件是这些片段、变体或衍生物是活性的或“功能性的”，即其保留相关细胞因子的至少一种功能或活性(例如生物活性)。细胞因子可以是重组多肽、合成多肽或可以从天然来源分离。合适的细胞因子是可商购的，并且是本领域技术人员已知的，例如人细胞因子可从GenScript(Piscataway，NJ，美国)获得。
细胞因子可以来自任何物种(更特别是任何脊椎动物物种)，但优选是哺乳动物，更优选是人。
细胞因子的变体可以包括例如不同的等位变体，它们在自然界中(例如在其他物种中或由于地理变异等原因)出现。功能等同变体还可以包括掺入一个或多个氨基酸取代、或者序列或末端缺失或添加到已知序列的多肽。
功能等同衍生物可包括氨基酸序列的化学修饰，包括例如包括化学取代或修饰的氨基酸残基或者聚乙二醇化(PEGylated)细胞因子。
衍生物也可以是作为细胞因子多肽的肽模拟物的分子。换句话说，其可以是功能上等同于或相似于多肽并且可以采用与其多肽对应物相似的3-D结构但不仅仅由通过肽键连接的氨基酸组成的分子。因此，肽模拟物可以由不是氨基酸但在结构和功能上类似于氨基酸的亚单元组成。亚单元的骨架部分可以不同于标准氨基酸，例如，它可以包含一个或多个氮原子而不是一个或多个碳原子。优选的一类肽模拟物是拟肽(peptoid)，即N-取代的甘氨酸。拟肽与它们的肽对应物密切相关，但化学上不同，因为它们的侧链沿着分子的主链附接到氮原子，而不是如它们在氨基酸中那样附接到α-碳。
根据本发明，所有这些变体和衍生物都包括在内，条件是它们保留相关细胞因子的活性并增强光化学内化作用(例如，通过实施例中描述的方法评估的增强PCI介导的疫苗接种)。
本领域已知可修饰蛋白质或肽的序列而同时保留活性，这可以使用本领域标准的技术实现，例如，随机或定点诱变、核酸的切割和连接、化学肽合成等。
优选地，氨基酸改变是次要性的改变，即，不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常为1至30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸；添加至多约20至25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能(例如多组氨酸链、抗原性表位或结合结构域)来促进纯化的小延伸。因此，蛋白质或肽的N和/或C延伸包括在定义中。每个延伸的衍生物的长度可以变化，例如，衍生物可以延长多达50、30、20、10或5个氨基酸。
保守取代的实例为在以下的组内：碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。细胞因子优选与本文所述的细胞因子的已知氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性或相似性。例如，优选的已知细胞因子的氨基酸序列显示在下表中：
两个核酸和两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序确定，例如GCG程序包中提供的GAP(Needleman和Wunsch,1970,Journal of MolecularBiology 48:443-453)。出于确定2个氨基酸序列之间的同一性程度的目的，可以使用具有以下设置的GAP：GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1。氨基酸相似性可以使用来自威斯康星大学的GCG Version 10软件包的Best Fit程序来测量。该程序使用Smith和Waterman的局部同源性算法，缺省值为：空位产生罚分＝8，空位延伸罚分＝2，平均匹配＝2.912，平均错配＝2.03。
优选地，根据本发明使用的细胞因子是作为I型或II型细胞因子受体的配体的细胞因子。特别优选地，细胞因子是IL-2受体家族成员或GM-CSF受体家族成员的配体，或细胞因子是干扰素、优选I型IFN。在本发明的一个特别优选的实施方式中，细胞因子选自GM-CSF、IL-7、IFN-α、IL-2、IL-15或IL-21或其同源物或衍生物，再更优选细胞因子选自GM-CSF、IL-7或IFN-α。最优选地，细胞因子是GM-CSF，尽管本发明扩展到使用不是GM-CSF的细胞因子。优选地，细胞因子源自人。
如本文所定义，“配体”是能够结合受体并通过该受体启动信号传导，或通过天然配体拮抗或促进通过该受体的信号传导的分子。
如本文所用，“表达”或“呈递(presenting)”是指抗原分子或其部分在所述细胞的表面上的存在，使得该分子的至少一部分暴露并且可对于该细胞周围的环境可及，优选使得可以对所呈递的分子或其部分产生免疫应答。可以实现在“表面”上的表达，其中待表达的分子与细胞膜和/或可以存在于或使之存在于该膜中的组分相接触。
术语“细胞”在本文中用于包括所有真核细胞(包括昆虫细胞和真菌细胞)。代表性的“细胞”因此包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞(例如鱼细胞)、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和原生动物。然而，优选地，细胞是哺乳动物细胞，例如来自猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的细胞，但最优选来自人。本发明的方法、用途等所使用的细胞可以是能够在其表面上表达或呈递被施用或转运到其细胞质中的分子的任何细胞。
便利的是，所述细胞是免疫细胞，即参与免疫应答的细胞。然而，其他细胞也可以向免疫系统呈递抗原，并且这些也落入本发明的范围内。因此，有利地，根据本发明的细胞是下文所述的抗原呈递细胞。所述抗原呈递细胞可以参与如本文定义的免疫应答的任何方面或“臂(arm)”。
细胞毒性细胞的刺激需要抗原呈递给细胞，以通过抗原呈递细胞以特定方式刺激，例如MHC I类呈递(例如CD8+细胞毒性T细胞的活化需要MHC-1抗原呈递)。抗体产生细胞也可以通过抗原呈递细胞呈递抗原来刺激。
抗原可以通过内吞作用被抗原呈递细胞摄取，并在胞吞囊泡中降解为肽。这些肽可以结合内体中的MHC II类分子，并被转运到细胞表面，其中肽-MHC II类复合体可被CD4+T辅助细胞识别并诱导免疫应答。另外一种方式，细胞溶质中的蛋白质可以例如通过蛋白酶体被降解，并通过TAP(与抗原呈递相关的转运蛋白)的方式转运到内质网中，其中所述肽可以结合MHC I类分子并被转运到细胞表面(Yewdell and Bennink,1992,Adv.Immunol.52:1-123)。如果肽是外来抗原来源的，则I型肽-MHC复合物将被CD8+细胞毒性T细胞(CTL)识别。CTL将结合肽-MHC(HLA)I类复合物，从而被激活，开始增殖并形成CTL克隆。靶细胞和在细胞表面上具有相同的肽-MHC I类复合物的其它靶细胞可以被CTL克隆杀死。如果可以将足够量的抗原引入细胞溶质中，可建立针对外源抗原的免疫(Yewdell和Bennink,1992,见上；Rock,1996,Immunology Today 17:131-137)。这是开发尤其是癌症疫苗的基础。最大的实际问题之一是将足够量的抗原(或抗原的部分)引入细胞溶质中。这可以根据本发明来解决。
如前所述，一旦通过光化学内化过程释放在细胞溶质中，抗原分子可以被细胞的抗原加工单元处理并以适当的方式(例如通过I类MHC)呈递在细胞表面上。这种处理可能涉及抗原的降解，例如蛋白质或多肽抗原降解成肽，然后所述肽与MHC的分子复合以呈递。因此，根据本发明表达或呈递在细胞表面上的抗原分子可以是被内化(内吞)的抗原分子的部分或片段。
多种不同的细胞类型可以在其表面上呈递抗原，包括例如淋巴细胞(T和B细胞二者)、树突细胞、巨噬细胞等。其它包括例如癌细胞如黑素瘤细胞。这些细胞在本文中称为“抗原呈递细胞”。“专职抗原呈递细胞”是免疫系统主要参与向免疫系统效应细胞的抗原呈递的免疫系统细胞，在本领域是已知的，并且在文献中有描述，包括B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞。优选地，所述细胞是专职抗原呈递细胞。
对于抗原呈递细胞对细胞毒性T细胞(CTL)的抗原呈递，抗原分子需要进入抗原呈递细胞的细胞溶质(Germain,Cell,1994,76,287-299)。
在本发明的实施方式中，例如涉及体外或离体方法或者体内方法时，细胞是树突细胞。树突细胞是形成哺乳动物免疫系统一部分的免疫细胞。它们的主要功能是处理抗原材料并将其呈递到免疫系统的其他细胞的表面。一旦被激活，它们迁移到淋巴结，在那里它们与T细胞和B细胞相互作用以启动适应性免疫应答。
树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转变成未成熟树突状细胞，其特征在于高内吞活性和低T细胞活化潜能。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们被激活成成熟树突状细胞并开始迁移到淋巴结。不成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解成小块，并且在成熟时，使用MHC分子在其细胞表面呈递那些片段。
树突细胞可以源自任何适当的树突细胞来源，例如来自皮肤、鼻内衬、肺，胃和肠或血液。在本发明的一个特别优选的实施方式中，树突细胞来源于骨髓。
树突细胞可以从天然来源分离用于本发明的体外方法或可以在体外产生。树突细胞产生自单核细胞，即在体内循环的白细胞，并且根据正确的信号，可以分化为树突细胞或巨噬细胞。单核细胞又由骨髓中的干细胞形成。单核细胞衍生的树突细胞可以在体外从外周血单核细胞(PBMC)产生。在组织培养瓶中平板接种PBMC使得单核细胞粘附。用白细胞介素4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理这些单核细胞导致在约一周内分化成未成熟的树突细胞(iDC)。随后用肿瘤坏死因子(TNF)处理进一步将iDC分化成成熟树突细胞。
如本文所用，“接触”是指使细胞与本文定义的光敏剂和/或抗原分子和/或细胞因子在适于内化进入细胞的条件下彼此物理接触，例如，优选在37℃在合适的营养培养基中，例如，25℃至39℃，或在体内于体温即36℃至38℃。
细胞可以与本文所定义的光敏剂和抗原分子和细胞因子依序或同时接触。优选地并且方便地，使组分与细胞同时接触。光敏剂和抗原分子(和任选的细胞因子)可以被细胞吸收到相同或不同的细胞内区室中(例如它们可以是共转运的)。
然后将细胞暴露于合适波长的光以活化光敏化合物，这又导致细胞内区室膜的破坏。
WO 02/44396(其通过引用并入本文)描述了一种方法，其中该方法中的步骤的顺序可以安排成使得例如使光敏剂与细胞接触并且通过照射活化，其后待内化的分子(在这种情况下是抗原分子)与所述细胞接触。该方法利用了这样的事实，即待内化的分子不需要在照射时与光敏剂存在于相同的细胞亚室中。
因此，在一个实施方式中，将本文定义的所述光敏剂和/或所述抗原分子和/或细胞因子一起或相对于彼此分别施用于细胞。然后，在至少抗原分子和光敏剂出现在相同的细胞内区室时进行照射。这被称为“后光照(light after)”法。
在一个替代实施方式中，所述方法可以通过首先使所述细胞与光敏剂接触，随后与如本文所定义的抗原分子和/或细胞因子接触来进行，并且在将光敏剂摄取到细胞内区室之后，但是在抗原分子(和任选的细胞因子)被细胞摄取进入含有所述光敏剂的细胞内区室之前(例如，可以在曝光时存在于不同的细胞内区室中)、优选在其被细胞摄取到任何细胞内区室之前(例如在任何细胞摄取之前)进行照射。因此，例如可以施用光敏剂，然后照射，然后施用剩余的试剂。这就是所谓的“前光照(light before)”的方法。
本文所用的“内化”是指细胞内的例如细胞溶质内的分子的递送。在本情况下，“内化”可以包括将分子从胞内/膜结合区室释放到细胞的胞质中的步骤。
如本文所用，“细胞摄取(cellular uptake)”或“转运(translocation)”是指内化步骤之一，其中细胞膜外部的分子被吸入细胞中，使得它们位于外层细胞膜的内部，通过内吞作用或其它适当的摄取机制，例如进入细胞内膜限制性区室或与细胞内膜限制性区室相关，例如内质网、高尔基体、溶酶体、内体等。
使细胞与各种试剂接触的步骤可以以任何方便或期望的方式进行。因此，如果要在体外进行接触步骤，则可以将细胞方便地保持在水性介质(例如合适的细胞培养基)中，并且在适当的时间点，可以在适当的条件下，例如以适当的浓度和适当的时长，将各种试剂简单地加入到培养基中。例如，可以在无血清培养基或含血清培养基的存在下使细胞与试剂接触。
下面的评论分别讨论了各种试剂对细胞的应用。然而，如上所述，这些试剂可一起、分开、同时或依次施用于细胞。如本文所述，用于本发明方法中的各种试剂可以施用于体外或体内的细胞。在后一种情况下，施用可以通过如下文更详细描述的直接(即局部)或间接(即全身或非局部)施用。
使光敏剂以适当的浓度和适当的时长与细胞接触，这可以由技术人员使用常规技术容易地确定，并且将取决于诸如所使用的特定光敏剂和靶细胞类型和位置之类的因素。便利的是，光敏剂的浓度使得一旦其被吸收到细胞中(例如，进入该细胞的一个或多个细胞内区室或与一个或多个细胞内区室结合)并通过照射激活，一个或多个细胞结构就被破坏，例如，一个或多个细胞内区室被裂解或破坏。例如，本文所述的光敏剂可以以例如10μg/ml至50μg/ml的浓度使用。对于体外使用，该范围可以更广泛，例如0.0005μg/ml至500μg/ml。对于体内人类治疗，当全身施用时，光敏剂可以以0.05mg/kg体重至20mg/kg体重的范围使用。作为另外一种选择，可以将0.005mg/kg体重至20mg/kg体重的范围用于全身施用。如果局部施用，例如通过皮内、皮下或肿瘤内施用，剂量可以为1μg至5000μg，例如10μg至2500μg、25μg至1000μg、50μg至500μg、10μg至300μg或100μg至300μg。优选地，剂量选自100μg、150μg、200μg和250μg。优选地，剂量为75μg至125μg，例如100μg。所提供的剂量用于平均体重(即70kg)的人。对于皮内注射，光敏剂剂量可以溶解在100μl至1ml中，即浓度可以在1μg/ml至50000μg/ml的范围内。在较小的动物中，浓度范围可以是不同的，并且可以相应地调整，不过当局部施用时，对于不同的动物，给药的变化很小。
待使用的抗原的浓度将取决于待使用的抗原。方便地，可以在体外使用浓度为0.001μg/ml至500μg/ml(例如20μg/ml至500μg/ml、20μg/ml至300μg/ml、20μg/ml至100μg/ml、20μg/ml至50μg/ml、10μg/ml至50μg/ml、5μg/ml至50μg/ml、1μg/ml至50μg/ml、0.01μg/ml至50μg/ml或0.001μg/ml至50μg/ml)的抗原。对于肽抗原，
可以使用较低浓度，例如0.001μg/ml至500μg/ml，例如可以使用0.001μg/ml至1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml或100μg/ml。对于蛋白质抗原，可以使用较高浓度，例如0.5μg/ml至500μg/ml。对于体内使用，蛋白质抗原剂量可以在0.5μg至500μg，例如10μg至100μg或10μg至200μg。对于肽抗原，可以采用0.1μg至4000μg，例如0.1μg至2000μg、0.1μg至1000μg或0.1μg至500μg，例如0.1μg至100μg的体内剂量。这种剂量适于局部施用。适当的浓度可以根据所讨论的试剂摄取到所述细胞中的效率和期望在细胞中达到的最终浓度来确定。
本文定义的细胞因子的浓度也将取决于待使用的特定分子。方便地，在体外，
可以使用如下表中所示的浓度。例如对于局部施用，对GM-CSF可以使用为5μg至500μg，例如50μg至250μg的体内剂量，对IFN-α可以使用500,000IU至50,000,000IU的内部剂量。对IL-2可以使用500,000IU/kg(或IU/m2)至10,000,000IU/kg(或IU/m2)的体内剂量；对IL-7可以使用1μg/kg至500μg/kg,例如20μg/kg至50μg/kg的体内剂量；对IL-15和IL-21可以使用1μg/kg至100μg/kg,例如10μg/kg至50μg/kg的体内剂量。
显示适宜细胞因子剂量的表
在大多数情况下，本文定义的光敏剂、抗原分子和细胞因子一起施用，但这可以变化。因此，针对每种不同组分考虑不同的时间或模式或施用部位(或与细胞接触)，并且这些方法包括在本发明的范围内。
在一个实施方式中，本文定义的细胞因子与抗原分开施用，例如在单独的制剂中，或全身施用，例如通过口服给药。因此，在一个实施方式中，可以在施用抗原和/或光敏剂之前、例如24小时之前施用细胞因子。
细胞因子可以相对于其它试剂单独施用，例如大约在照射前2小时。在一个替代实施方式中，所述试剂可以与抗原一起或与其在相同的时刻，即同时施用。
本文定义的细胞与光敏剂和/或抗原分子和/或细胞因子之间的接触方便地为15分钟至24小时，例如30分钟至4小时，优选1.5至2.5小时。另外一种方式，时间范围可以是约1小时至约48小时，例如约2小时至约40小时，或约6小时至约36小时，例如12小时至30小时，例如16小时至20小时，例如18小时或约18小时。
在优选的实施方式中，细胞与用光敏剂一同初始温育。在一个实施方式中，施用光敏剂和抗原分子和/或细胞因子之间的时间为几小时。例如，光敏剂可以在照射前16至20小时、例如18小时施用，并且抗原分子和/或细胞因子可以在照射前1至3小时、例如2小时施用。因此，施用光敏剂和抗原分子和/或细胞因子之间的时间可以在15至23小时的范围内。
因此，在与光敏剂温育后，将细胞与本文定义的抗原和/或细胞因子一起温育。方便地，在与光敏剂/抗原接触之后和在照射之前，可将细胞置于无光敏剂/抗原的培养基中，例如30分钟至4小时，例如1.5至2.5小时，这取决于与光敏剂和抗原分子和细胞因子温育的时间。
在体内，使各种试剂与靶细胞接触的适当的温育方法和时间将取决于诸如施用模式和所使用的试剂类型等因素。例如，如果将试剂注射到待治疗/照射的肿瘤、组织或器官中，则靠近注射点的细胞将与试剂接触，并因此倾向于比离注射点较远距离的细胞更快地吸收试剂，离注射点较远距离的细胞将在稍后的时间点和较低浓度下与试剂接触。方便地，可以使用6至24小时的时间。
此外，通过静脉内注射或口服施用的试剂可能需要一些时间才能到达靶细胞，因此可能需要更长时间的施用，例如几天，以便足够或最佳量的试剂在靶细胞或组织中积累。因此，体内个体细胞所需的施用时间可能根据这些和其它参数而变化。
然而，尽管体内的情况比体外更复杂，但本发明的基本概念仍然相同，即分子与靶细胞接触的时间必须使得在照射发生之前适当量的光敏剂已被靶细胞吸收，并且：(i)在照射之前或期间，抗原分子(和任选的细胞因子)已被摄取到细胞中，或者在与靶细胞充分接触后被摄取到细胞中，例如进入相对于光敏剂相同或不同的细胞内区室，或者(ii)在照射后，抗原分子(和任选地细胞因子)与细胞接触一段时间足以允许其被摄取到细胞中。
对于在体内施用本文所述的试剂，可以使用本领域常用或标准的任何施用方式，例如注射、输注、局部施用、透皮施用，以及内部和外部体表面等。对于体内使用，本发明可以用于包含如下细胞的任何组合，其中含有光敏剂的化合物或待内化的分子位于所述细胞中，包括体液位置以及固体组织。可以处理所有组织，条件是光敏剂被靶细胞摄取，并且光可以被适当地递送。优选的施用方式是皮内、皮下、局部或肿瘤内施用或注射。优选地通过皮内注射施用。
为了实现所需的结果，例如抗原呈递、免疫应答或疫苗接种的产生，所述方法或其一部分可以重复，例如可以发生“再接种(re-vaccination)”。因此，在方法的适当间隔或多个部分可以重复之后，整个方法可以被执行多次(例如2、3或更多次)，例如进一步施用如本文所定义的细胞因子或额外的照射步骤。例如，在第一次施用后，该方法或该方法的一部分可以再次执行数天，例如在5至60天之间(例如7、14、15、21、22、42或51天)，例如7至20天，优选14天，或者数周，例如1至5周(例如，1、2、3或4周)。该方法的全部或部分可以以适当的时间间隔重复多次，例如，每两周或14天。在优选的实施方式中，该方法重复至少一次。在另一个实施方式中，该方法重复两次。
在一个实施方式中，在第二次或随后进行该方法时，组合施用抗原分子与光敏剂和照射，即细胞因子不在第二次或随后进行该方法时施用。
其中在所述方法中使用佐剂(例如聚(I:C))的实施方式中，在第二次或随后进行该方法时，抗原分子可以与光敏剂和照射组合施用，即佐剂不在第二次或随后进行该方法时施用。在这种情况下，在第二次或随后进行该方法时细胞因子可以存在或不存在。
在一个替代实施方式中，本发明方法的部分可以在实施本发明的方法之前进行。例如，在进行本发明的方法之前，该方法可以在不存在细胞因子的情况下进行一次或多次，例如两次。作为另外一种选择，该方法可以在进行本发明的方法之前在没有光敏剂和照射的情况下进行一次或多次，例如两次。该方法的一部分可以在实施本发明的方法之前数天例如7或14天，或数周例如1、3或4周进行。在执行本发明的方法之前，可以以这些时间间隔重复该方法的一部分一次或多次。因此，在一个优选的方面，抗原分子施用(例如施用于受试者)两次或两次以上(例如以上述时间间隔)，其中至少所述抗原分子的施用根据本发明的方法进行。
激活光敏剂的“照射”是指如下文所述直接或间接施用光。因此，受试者或细胞可以用光源照射，例如直接(例如在体外在单个细胞上)或间接地照射，例如，于体内当细胞在皮肤表面下时或者是细胞层的形式时，不是所有细胞都被直接照射(即没有其他细胞的遮蔽)。细胞或受试者的照射可以在施用如本文定义的光敏剂、抗原分子和细胞因子后约18至24小时发生。
激活光敏剂的光照射步骤可以根据本领域熟知的技术和程序进行。使用的光的波长根据所使用的光敏剂来选择。合适的人造光源是本领域公知的，例如，使用蓝色(400nm至475nm)或红色(620nm至750nm)波长的光。例如对于TPCS2a，可以使用400nm至500nm之间，更优选400nm至450nm，例如430nm至440nm，甚至更优选约435nm或435nm的波长。在适当情况下，光敏剂，例如卟啉或二氢卟吩可以被绿光激活，例如KillerRed(Evrogen，Moscow，俄罗斯)光敏剂可以被绿光激活。
合适的光源在本领域中是公知的，例如PCI Biotech AS的LumiSource灯。另外一种方式，可以使用具有高达60mW的可调输出功率和430nm至435nm的发射光谱的基于LED的照射装置。对于红光，合适的照射源是PCI Biotech AS 652nm激光系统SN576003二极管激光器，但是可以使用任何合适的红光源。
在本发明的方法中细胞暴露于光的时间可以变化。分子进入细胞溶质的内化效率随着暴露于光的增加而增加直至最大值，超过该最大值，细胞损伤并且由此细胞死亡增加。
照射步骤的优选时长取决于诸如靶、光敏剂、积聚在靶细胞或组织中的光敏剂的量以及光敏剂的吸收光谱与光源的发射光谱之间的重叠等因素。通常，照射步骤的时长为数秒至数分钟或长达数小时(甚至长达12小时)的量级，例如优选长达60分钟，例如从0.25或1分钟至30分钟，例如0.5至3分钟或1至5分钟或1至10分钟，例如3至7分钟，并优选为约3分钟，例如2.5至3.5分钟。也可以使用较短的照射时间，例如1至60秒，例如10至50秒、20至40秒或25至35秒。
合适的光剂量可以由本领域技术人员选择，并且还将取决于使用的光敏剂和在靶细胞或组织中累积的光敏剂的量。当使用可见光谱的具有较高消光系数(例如，在红色区域中，或者如果使用蓝色光时的蓝色区域中，取决于所使用的光敏剂)的光敏剂时，光剂量通常较低。例如，当使用具有高达60mW的可调输出功率和430nm至435nm的发射光谱的基于LED的照射装置时，在0.05mW/cm2至20mW/cm2的注量范围内例如2.0mW/cm2时，可以使用0.24J/cm2至7.2J/cm2的光剂量。作为另外一种选择，例如如果采用灯，在0.1mW/cm2至20mW/cm2的注量范围(例如所提供的13mW/cm2)内，0.1J/cm2至6J/cm2的光剂量是合适的。对于红光，在0.5mW/cm2至5mW/cm2的注量范围，例如0.81mW/cm2，可以使用0.03J/cm2至1J/cm2例如0.3J/cm2的光剂量。
此外，如果要维持细胞活力，则应避免产生过量水平的毒性物质，并相应地调整相关参数。
本发明的方法可能不可避免地由于光化学处理，即通过在光敏剂活化时产生毒性物质的光动力治疗效应而引起一些细胞损伤。根据所提出的用途，这种细胞死亡可能不严重，并且对于一些应用(例如癌症治疗)实际上是有利的。然而，在大多数实施方式中，避免细胞死亡以允许产生来自呈递细胞的免疫应答。可以修改本发明的方法，使得通过选择与光敏剂的浓度相关的光剂量来调节存活细胞的分数或比例。同样，这样的技术在本领域中是已知的。
优选地，基本上所有的细胞或显著的大多数(例如至少75％，更优选至少80％、85％、90％或95％的细胞)未被杀死。在PCI治疗后的体外细胞活力可以通过本领域已知的标准技术如MTS测试来测量。可以在施用点的1cm半径内(或在组织的某一深度)例如通过显微镜评估一种或多种细胞类型的体内细胞死亡。由于细胞死亡可能不立即发生，细胞死亡百分比(％)是指在照射后数小时内(例如照射后长达4小时)保持存活的细胞百分比，但优选指照射后4小时以上的存活细胞百分比(％)。
该方法可以在体内，体外或离体进行。优选地，所述方法在体外或离体使用以产生用于体内施用的细胞或以便所述方法在体内使用。因此，在优选的特征中，该方法可以用于在受试者中产生免疫应答。
因此，在另一方面，本发明提供了在受试者中产生免疫应答的方法，包括向所述受试者施用如上文所定义的抗原分子、光敏剂和细胞因子，并且用波长能有效激活所述光敏剂的光照射所述受试者，其中产生免疫应答。
可以产生的“免疫应答”可以是体液和细胞介导的免疫，例如刺激抗体产生或刺激细胞毒性或杀伤细胞，其可识别和破坏(或者消除)其表面上表达“外来”抗原的细胞。术语“刺激免疫应答”因此包括所有类型的免疫应答和刺激它们的机制，并且包括刺激CTL，其形成本发明的优选方面。优选地，被刺激的免疫应答是细胞毒性CD8T细胞。免疫应答的程度可以通过免疫应答的标志物来评估，例如分泌的分子例如IL-2或IFNγ或产生抗原特异性T细胞(例如如实施例中所述评估)。
细胞毒性细胞或产生抗体的细胞的刺激需要抗原呈递给细胞以通过抗原呈递细胞以特定方式刺激，例如MHC I类呈递(例如CD8+细胞毒性T细胞的活化需要MHC-I抗原呈递)。优选地，通过MHC-I呈递刺激免疫应答。
优选地，免疫应答用于治疗或预防疾病、病症或感染，例如癌症。在本文所述的方法和用途中，癌症可以是黑素瘤。在替代实施方式中，癌症可以为非黑素瘤癌症。
优选地，该方法用于疫苗接种。如本文所述，“疫苗接种”是使用抗原(或含有抗原的分子)引发针对疾病、病症或感染的发展(或进一步发展)的预防性或治疗性的免疫应答，其中所述疾病、病症或感染与该抗原的异常表达或存在相关。优选地，所述疾病是癌症(并且疫苗接种是治疗性的)或将产生针对感染的免疫应答(并且疫苗接种是预防性的)。
在本发明的一个优选实施方式中，该方法例如疫苗接种的受试者是非哺乳动物(例如鱼)或哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选地，受试者是人。
优选地，本文所述的方法实现协同作用，即细胞表面呈递的程度或产生的免疫应答比通过(i)在不存在细胞因子的情况下用抗原分子执行所述方法和(ii)在不存在所述光敏剂和所述照射步骤的情况下用所述抗原分子执行所述方法进行观察到的组合增强更强，即观察到方法之间的协同作用。细胞表面呈递或免疫应答产生的水平可以通过适当的方法来评估，例如抗原特异性CD8+细胞的数量或免疫应答激活的标记物例如IFNγ或IL-2的水平。
如本文所用的“协同作用(synergy)”是指相对于仅仅加和效应的定量改进。
在本发明的方法中使用的各种试剂可以单独地、依次地或同时地施用给受试者。
以上关于在本发明的细胞表面上表达抗原分子或其部分的方法讨论的方面和特征在适当时也适用于上文产生免疫应答的方法。
本发明还提供了将抗原分子引入细胞质中的方法，包括使所述细胞与本文所定义的待引入的抗原分子、光敏剂和细胞因子接触，并用波长有效激活所述光敏剂的光照射所述细胞。一旦被激活，包含所述化合物的所述细胞内的细胞内区室将包含在这些区室中的分子释放到细胞质中。
上述本发明的方法可以在体外或体内使用，例如用于原位处理或用于离体处理，然后将处理的细胞施用于身体。
本发明还提供了在其表面上表达抗原分子或抗原分子的一部分的细胞或细胞群体，所述细胞是通过本文所定义的任何方法可获得的(或获得)。还提供了用于如下文所述的预防或治疗的细胞或细胞群体。
可以在药物组合物中提供细胞群体，所述药物组合物另外包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。
本发明还提供了包含本文定义的抗原分子、光敏剂和细胞因子以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物。
这些组合物(和本发明的产品)可以根据制药领域中已知的技术和程序以任何方便的方式配制，例如使用一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。本文所述的“药学上可接受的”是指与组合物(或产品)的其它成分相容的，以及接受者生理上可接受的成分。组合物和载剂或赋形剂材料的性质、剂量等可以根据选择和所需的给药途径、治疗目的等以常规方式选择。剂量同样可以常规方式确定，并且可能取决于分子(或组合物或产品的组分)的性质、治疗目的、患者年龄、施用方式等。关于光敏剂，还应考虑在照射时破坏膜的效力/能力。
可以在体外制备细胞，例如抗原呈递细胞。在治疗方法中，这些细胞可以体内施用于身体或离体施用于身体组织，使得那些细胞可以刺激免疫应答，例如用于预防或治疗目的的免疫应答。
因此，本发明进一步提供了如本文定义的细胞群体(或包含其的组合物)，或本文定义的抗原分子、光敏剂和细胞因子，用于在受试者中预防或治疗或用于刺激免疫应答，例如用于疫苗接种目的，例如用于刺激的CTL，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，特别是用于治疗或预防癌症。作为另外一种选择，本发明提供了(i)细胞群、(ii)本文定义的组合物、或(iii)抗原分子和/或光敏剂和/或细胞因子在制备用于刺激受试者中的免疫应答(例如用于刺激CTL)的药物中的应用，所述药物优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，其中优选地所述免疫应答通过本文定义的方法刺激。
所述刺激、治疗或预防优选包括向所述受试者施用所述药物。
抗原分子、光敏剂和细胞因子可以组合并存在于组合物中。换言之，本发明提供本文定义的抗原分子和/或光敏剂和/或细胞因子在制备用于刺激免疫应答(例如用于刺激受试者中的CTL)的药物中的用途，优选治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，特别是用于疫苗接种目的，其中所述药物包含通过本文定义的方法可获得的在细胞表面上表达抗原分子或抗原分子的一部分的细胞群体，以用于施用于所述受试者。优选地，通过这些方法获得细胞群。该群体用于对受试者施用。
在另一个实施方式中，本发明提供了本文定义的抗原分子、光敏剂和细胞因子，其用于在细胞表面上表达所述抗原分子或其部分，以刺激受试者的免疫应答(例如刺激CTL)，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，其中所述用途包括本文定义的方法，优选用以制备细胞(例如树突细胞)群体。然后可以将这些细胞施用于受试者。
本发明进一步提供了一种产品，其包含作为组合制剂的如本文所定义的抗原分子、光敏剂和细胞因子，其用于在本文定义的方法中同时、分开或依次地用于刺激受试者的免疫应答(或用于在细胞表面上表达抗原分子或其部分或用于将抗原分子内化到细胞质中)，优选用以治疗或预防受试者的疾病、病症或感染。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于刺激受试者中的免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者中的疾病、病症或感染(例如用于接种或免疫)或用于在细胞表面上表达抗原分子或其部分，或用于在本文定义的方法中将抗原分子内化到细胞的胞质中，所述试剂盒包括：
含有如本文所定义的光敏剂的第一容器；
含有如本文所定义的所述抗原分子的第二容器；和
含有如本文所定义的细胞因子的第三容器。
本发明的产品和试剂盒可用于实现如本文定义的细胞表面呈递(或治疗方法)。
在另一个实施方式中，本发明提供了在受试者中产生免疫应答(例如用于刺激CTL)、优选治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染的方法，包括根据本文定义的方法制备细胞群体，随后将所述细胞施用于所述受试者。
当在体内施用处理的细胞时，通过要求保护的本发明实现的抗原呈递可有利地导致刺激免疫应答。优选地，产生免疫应答，其提供了针对被包含或含有所述抗原分子或其部分的实体的随后攻击的保护，并因此发现本发明作为疫苗接种方法具有特别的功用。
所述疾病、病症或感染是可以通过产生免疫应答(例如通过消除可以基于抗原(或其表达水平)鉴定的异常或外来细胞)来治疗或预防的任何疾病、病症或感染，所述抗原(或其表达水平)使之能相对于正常细胞被区分(和消除)。待使用的抗原分子的选择决定了待治疗的疾病、病症或感染。基于上述抗原分子，本文所述的方法、用途、组合物、产品、试剂盒等可用于治疗或预防例如感染(例如上文提到的病毒或细菌)、癌症或多发性硬化。对此类疾病、病症或感染的预防可视为疫苗接种。
如本文所定义，“治疗”是指相对于治疗前的症状，减轻、缓解或消除正在治疗的疾病、病症或感染的一种或多种症状。“预防”(或防治)是指延迟或预防疾病、病症或感染的症状的发作。预防可以是绝对的(使得没有疾病发生)，或者可以仅在一些个体中或在有限的时间内有效。
对于体内施用细胞，可以使用本领域中常见或标准的细胞群的任何施用方式(例如，注射或输注)通过适当的途径进行。方便地，通过淋巴内注射施用细胞，优选受试者每kg施用1×104至1×108个细胞(例如，在人中为每kg 1.4×104至2.8×106)。因此，例如在人中，可以以剂量(即每剂量)例如作为疫苗接种剂量施用0.1×107至20×107个细胞的剂量。如果需要，可以在稍后的时间重复该剂量。
现在将在以下非限制性实施例中参考以下附图更详细地描述本发明，其中：
图1显示了方案1：合成化合物5的合成路线。试剂和条件：(a)丙酸，回流，1h(20％)；(b)NaNO2(1.8当量)，TFA，室温，3分钟。67％)；(c)SnCl2.2H2O，浓HCl，600℃，1h(88％)；(d)溴乙酰溴、Et3N、CH2Cl2，室温，1h(64％)；(e)哌嗪、CH2Cl2，室温，1h(94％)。
方案2：N-修饰的壳聚糖衍生物(TPP-CS-TMA &TPP-CS-MP)的合成。这里A-代表第一批化合物，B-代表第二批化合物。试剂和条件：(a)MeSO3H/H2O，10℃至室温，1h，(90％)；(b)TBDMSCl、咪唑、DMSO，室温，24h(96％)；(c)溴乙酰溴、Et3N、CH2Cl2，-20℃，1h(92％)；(d)化合物5即TPP-NH-Pip(0.1或0.25当量)、Et3N、CHCl3，室温，2h(92％-90％)(e)NMe3或1-甲基哌嗪，CHCl3，室温，24h；(f)TBAF、NMP，55℃，24h，或浓HCl/MeOH，室温，24h。
方案3：化合物1、3、20和21的合成方案。
反应和条件：(a)丙酸，回流，1h，(20％)；(b)NaNO2(1.8当量)，TFA，室温，3分钟；(c)SnCl2.2H2O，浓HCl，60℃，1h，(54％)；(d1)对甲苯磺酰肼、K2CO3、吡啶，回流24小时；(d2)邻氯苯，CH2Cl2，室温，80％；e)氯乙酰氯、Et3N、CH2Cl2，室温，2h，原位；(f)哌嗪、CH2Cl2，室温，12h，(61％)。化合物20和21的所有衍生物将含有TPCa1和TPCa2异构体。然而，在方案和结构图中仅示出了TPCa1结构。
方案4：化合物22至28的合成方案。反应和条件：(a)乙酰氯，MeOH，回流，24h，(87％)；(b)BF3.Et2O，室温，对氯醌，48h，(14％)；(c)2N KOH(MeOH中)，THF:吡啶(10:1)，回流，24h(71％)；(d1)对甲苯磺酰肼，K2CO3，吡啶，回流，24h；(d2)邻氯醌，CH2Cl2:MeOH(75:25)，室温(70％)；(e)EDCI.HCl、HOBT、Et3N、N-Boc-哌嗪5、DMF，室温，24h(54％)；(f)TFA、CH2Cl2，室温，1h(89％)。化合物26至28的所有衍生物将含有TPCc1和TPCc2异构体。然而，在方案和结构图中仅示出了TPCc1结构。
方案5A和5B：试剂和条件(6A)：(a)化合物21，即TPC-NH-Pip(0.1当量)，Et3N，CHCl3，室温，2h(78％)；(b)NMe3或1-甲基哌嗪，CHCl3，室温，24h。试剂和条件(6b)：a)化合物28，即TPC-CO-Pip(0.1当量)，Et3N，NMP，75℃，12h(89％)；(b)NMe3或1-甲基哌嗪，CHCl3，室温，24h。
图2显示了佐剂GM-CSF的效果。用10μg OVA、用10μg OVA和10μg GM-CSF、用10μgOVA和150μg TPCS2a、用10μg OVA、10μg GM-CSF和150μg TPCS2a对小鼠进行免疫，或未处理。照射接受TPCS2a的小鼠。在第7天，对小鼠放血，并通过流式细胞术分析OVA特异性CD8T细胞的频率。(A)显示了来自流式细胞术分析的代表性点图。首先对细胞进行CD8表达门控，然后分析CD8+群体的SIINFEKL五聚体结合(y轴)和CD44表达(x轴)。椭圆内的群体因此代表CD8+、五聚体+、CD44+细胞，代表抗原特异性(五聚体结合)、活化(CD44表达)的CD8+细胞。(B)显示实验组(每组5只动物，误差条：平均值的标准误差)的平均值(总CD8+细胞的CD44+细胞，抗原特异性％)。
图3显示了GM-CSF对具有HPV 16E7肽抗原的小鼠的接种的作用。在使用或没有PCI的情况下，用单独的HPV或GM-CSF与HPV免疫小鼠。该图显示了表达HPV五聚体的总CD8细胞％。
图4显示了GM-CSF、任选地与Poly(IC)一起对具有HPV 16E7肽抗原的小鼠的接种的作用。如图2所示，在采用或不用PCI时用HPV、聚(IC)和/或GM-CSF免疫小鼠。在图中最后两个柱中所示的结果中使用了2次免疫接种。该图显示了表达HPV五聚体的总CD8细胞％。
实施例
实施例1：细胞因子对用OVA体内接种的影响
材料和方法
老鼠
C57BL/6小鼠购自Harlan(Horst，荷兰)。识别来自卵白蛋白(OVA)的MHC I类限制性表位OVA257-264的T细胞受体转基因的OT-I小鼠在苏黎世大学的机构中育种(最初购自Taconic Europe(Ry，丹麦))。所有小鼠保持在指定的无病原体(SPF)条件下，并且所进行的程序由瑞士兽医管理机关批准。在OT-1小鼠中，T细胞受体的基因已经经工程化而使得这些小鼠中几乎所有的CD8+ T细胞(称为OT-1细胞)将从卵清蛋白(OVA)抗原中特异性识别特异性肽表位(SIINFEKL)。
免疫方案
在第0天，在尾静脉中静脉内用来自Rag2/OT-1小鼠的1.5×106个脾细胞注射雌性C57BL/6小鼠。以这种方式，接种的小鼠具有可以响应来自OVA的SIINFEKL-表位的CD8T细胞的“背景”，条件是当且仅当其在MHC I类上适当地呈递在抗原呈递细胞上。因此，OT-1细胞的转移“扩增”了接种的小鼠中的检测系统，使得可以通过测量抗原特异性CD8+ T细胞和IFN-γ和IL-2生产而容易地测定体内疫苗接种的效果。
4小时后，通过腹部皮内注射(2×50μl含下述成分的溶液)对动物进行疫苗接种。14组4只动物接受以下的总剂量：
组1：250μg TPCS2a(Amphinex)+10μg卵白蛋白(OVA,Grade V,Sigma-Aldrich)。
组2：250μg TPCS2a+10μg卵白蛋白+10μg GM-CSF。
组3：250μg TPCS2a+10μg卵白蛋白+500000IU IL-2。
组4：250μg TPCS2a+10μg卵白蛋白+10μg IL-7。
组5：250μg TPCS2a+10μg卵白蛋白+10μg IL-15。
组6：250μg TPCS2a+10μg卵白蛋白+10μg IL-21。
组7：250μg TPCS2a+10μg卵白蛋白+3,000,000IU IFNα。
组8：10μg卵白蛋白。
组9：10μg卵白蛋白+25μg GM-CSF。
组10：10μg卵白蛋白+500,000IU IL-2。
组11：10μg卵白蛋白+10μg IL-7。
组12：10μg卵白蛋白+10μg IL-15。
组13：10μg卵白蛋白+10μg IL-21。
组14：10μg卵白蛋白+3,000,000IU IFNα。
在第1天，将第1到7组的动物麻醉，并使用LumiSource灯(PCI Biotech AS)用蓝光照射6分钟。在注射抗原溶液后约18小时照射动物，照射的注量率为约13mW/cm2。在第7天，从尾静脉给小鼠放血，并用SIINFEKL五聚体(ProImmune)对血细胞染色，并对CD8和CD44抗体进行流式细胞术分析(参见下面的方案)。在第14天，将小鼠安乐死并收集脾脏。将脾细胞的一个等分试样用SIINFEKL肽(EMC Microcollections，Tuebingen，德国)再刺激，对细胞内IFN-γ表达进行，并通过流式细胞术进行分析(见下文)。将另一等份的脾细胞重悬浮于细胞培养基中，保持在该培养基中过夜(纯粹由于实际原因)，不进行再刺激，如上所述通过SIINFEKL-五聚体染色，并通过流式细胞术进行分析(参见下面的方案)。
脾细胞的SIINFEKL-五聚体染色
对已经重悬于细胞培养基中的细胞进行SIINFEKL-五聚体染色和对脾细胞的流式细胞术，并且在没有再刺激的情况下保持在该培养基中过夜(纯粹由于实际原因)。
SIINFEKL-五聚体染色和流式细胞术
收集5至10滴全尾血，并加入0.5ml红细胞裂解溶液(Sigma)。5至6分钟后，离心细胞并用0.5ml PBS洗涤两次。将细胞沉淀重悬浮于FACS缓冲液(含有0.01％叠氮化钠的2％FCS/PBS)中，转移至U形的96孔板中，并与FcR阻断抗体(1.0μl抗CD16/CD32，来自Pharmingen)在冰上温育10分钟(1μl+49μl FACS缓冲液)。在不洗涤的情况下，加入SIINFEKL-五聚体-PE(ProImmune；每个样品5μl)，混合并在37℃温育15分钟。不洗涤，加入荧光标记的CD8或CD44至终浓度为1:100，并在冰上温育25至45分钟。将细胞在100μl FACS缓冲液中洗涤并悬浮于100μl FACS缓冲液中。用FACSCanto分析细胞。
脾细胞的离体再刺激
分离脾细胞，并通过破碎脾脏，通过在裂解缓冲液(Sigma)中搅拌1至2分钟在2％FCS/PBS中分离细胞，并在2％FCS/PBS中洗涤从而为细胞内染色做准备。在24孔板(500,000个细胞/ml)的每孔中加入1ml在完全培养基中的细胞悬浮液，并向每个孔中加入5μg/mlSIINFEKL并在37℃温育过夜。将布雷菲德菌素A(1μg/ml至2μg/ml)加入每个孔中并在37℃孵育4小时。将细胞转移到U形的96孔板中，在2％FCS/PBS中洗涤，并重悬于具有FcR阻断抗体(1.0μl来自Pharmingen的抗CD16/CD32)的50μl FACS缓冲液中，并在冰上温育10分钟。在不洗涤的情况下，将细胞与表面抗体CD8或CD44在冰上(黑暗)温育20至45分钟，在FACS缓冲液中洗涤，并通过在冰上重悬于100μl多聚甲醛(PFA)(1％在PBS中)10至20分钟来固定。将细胞在FACS缓冲液中洗涤，重悬于100μl NP40(0.1％在PBS中)并在冰上孵育3分钟。在FACS缓冲液中洗涤后，加入荧光标记的干扰素-γ抗体，并在冰上在黑暗中温育35分钟。在FACS缓冲液中洗涤和悬浮后，使用FlowJo 8.5.2软件(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)用FACSCanto分析细胞。
流式细胞术
通过流式细胞术(FACSCanto，来自BD Biosciences，San Jose，美国)测定OVA特异性T细胞的频率。在执行流式细胞术之前，使用分别用每种抗体染色的珠进行补偿。在抗体染色之前，使用Red Cell Lyse溶液(Sigma)裂解红细胞。对于每个样品记录10000个CD8+事件，并且使用来自Tree Star，Inc.(Ashland，OR)的FlowJo 8.5.2软件(http://www.flowjo.com/)计算SIINFEKL-五聚体阳性细胞的百分比。
ELISA
根据制造商的说明书针对相关分子使用Ready-set Go！试剂盒(eBioscience)进行ELISA。
通过上述免疫方案在体内对小鼠进行接种。7天后分离血液，14天后分离脾脏。分析血液的抗原特异性CD8+ T细胞，或者直接分析脾细胞的抗原特异性CD8+ T细胞，或者在体外再刺激后分析IFN-γ或IL-2产生。
血液和脾脏中抗原特异性T细胞的水平
通过流式细胞术，使用与抗原特异性T细胞特异性结合的荧光标记的抗原特异性“五聚体”，测量抗原特异性T细胞的水平。测定动物中总CD8+ T细胞的抗原特异性CD8+ T细胞数％(参见免疫方案中描述的染色和流式细胞术分析以及SIINFEKL染色的细节)。
内源性T细胞用作效应的抗原特异性的内部对照，因为对T细胞的一般刺激作用也会影响内源性T细胞，不会导致抗原特异性细胞％的增加。典型地，OT-1细胞的％在接种前和接种后的时间点进行测定。将单独的抗原(“常规疫苗接种”)的作用与抗原+PCI的作用进行比较。
用抗原离体刺激后脾细胞中IFN-γ生产的水平(流式细胞术)
在接种的第14天摘除的脾脏经脾细胞分离和用SIINFEKL抗原肽再刺激，并通过如上述方案中所述的流式细胞术针对IFN-γ生产进行细胞内染色以用于分析CD8+T细胞。
用抗原离体刺激后脾细胞中IFN-γ和IL-2生产的水平(ELISA)
在接种的第14天摘除的脾脏经脾细胞分离和用SIINFEKL抗原肽再刺激，并通过如上述方案中所述的ELISA针对IFN-γ和IL-2生产进行分析。
实施例2：GM-CSF对用OVA体内免疫接种的影响
材料和方法
动物
C57BL/6小鼠购自Harlan(Horst，荷兰)。CD8T细胞受体转基因OT-I小鼠(B6.129S6-Rag2tm1Fwa Tg(TcraTcrb)1100Mjb)购自Taconic Europe(Ry，丹麦)或JacksonLaboratories(Bar Harbor，Maine)。OT-I CD8T细胞识别来自卵白蛋白的H-2Kb-限制性表位SIINFEKL(OVA，aa257-264)。所有小鼠保持在SPF条件下，所进行的程序在瑞士和挪威由兽医管理局批准。
材料和细胞
鸡OVA购自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士)，SIINFEKL肽来自EMC微集落(Tuebingen，德国)，和GM-CSF来自Preprotech(Wien)。光敏剂四苯基氯二磺酸盐(TPCS2a)来自PCIBiotech(Lysaker，挪威)。OVA、TPCS2a和相关时的GM-CSF在PBS中混合，保持避光，并在制备后60分钟内施用于小鼠。通过用LumiSourceTM(PCI Biotech)照射激活TPCS2a。
小鼠的皮内光敏化和免疫
在免疫前一天，从雌性OT-1小鼠中分离脾脏和淋巴结，通过裂解(来自Sigma-Aldrich的RBC溶解缓冲液Hybri-Max)从均质化的细胞悬浮液中除去红细胞。剩余的细胞在PBS中洗涤，通过70微米尼龙滤器过滤，并通过静脉内注射将2×106个OT-1细胞施用到接受体雌性C57BL/6小鼠中；过继转移SIINFEKL特异性CD8T细胞有助于通过流式细胞术监测免疫应答。一天或8小时后，通过尾部出血给小鼠放血，将血液收集在含有肝素的试管中，用于分析OVA特异性CD8T细胞的基线频率。
然后，将小鼠在腹部剃毛，并且由OVA或OVA的不同混合物、TPCS2a和GM-CSF(10μg)组成的疫苗使用具有29G针的注射器皮内注射。疫苗保持避光并在制备后60分钟内使用。疫苗在腹部中线的左侧和右侧两次注射各50μl。OVA以10μg或100μg的剂量使用，TPCS2a剂量为150μg。疫苗注射后18小时，通过腹膜内注射氯胺酮(25mg/kg体重)和甲苯噻嗪(xylazin)(4mg/kg)的混合物将小鼠麻醉，并置于LumiSource光源上(用于照射和活化光敏剂TPCS2a)。照射时间为6分钟。
在第7天，在通过流式细胞术分析抗原特异性CD8T细胞之前，通过尾部出血放血并通过裂解除去红细胞。在实验结束时，将小鼠安乐死。
免疫反应分析
通过用抗CD8抗体和H-2Kb/SIINFEKL Pro5五聚体(Proimmune，Oxford，英国)对细胞染色来监测血液中OVA特异性CD8T细胞的频率，以便通过流式细胞术分析。通过流式细胞术测试CD44的表达进一步分析细胞的活化状态。使用FACSCanto(BD Biosciences，SanJose，美国)并使用FlowJo 8.5.2软件(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)分析细胞。
GM-CSF实验
如“材料和方法”所述进行实验，并且如所述通过流式细胞术分析接种后第7天的小鼠血液样品。所有小鼠如上所述接受OT-1细胞。
包括以下实验组：
1.未处理：小鼠接受OT-1细胞，但未接种或照射。
2.OVA：用10μg OVA接种小鼠。它们没有被照射。
3.OVA+GM-CSF：用10μg OVA+10μg GM-CSF的混合物接种小鼠。它们没有被照射。
4.OVA PCI：用10μg OVA+150μg TPCS2a的混合物接种小鼠。如所述进行照射。
5.OVA+gm-CSF PCI：用10μg OVA+10μg gm-CSF+150μg TPCS2a的混合物接种小鼠。如上所述进行照射。
图2A显示了来自流式细胞术分析的代表性点图。椭圆内的群体因此代表CD8+、五聚体+、CD44+细胞，代表抗原特异性(五聚体结合)、活化(CD44表达)的CD8+细胞。可以看出，在OVA+GM-CSF和OVAPCI组中，该群体中的细胞数量增加(与OVA组相比)，并且在OVA+GM-CSFPCI组中的作用进一步显著增加。
图2B显示实验组的平均值(总CD8+细胞的CD44+细胞，％抗原特异性)，再次显示OVA+GM-CSF PCI组相对于所有其他组的显著增加。
实施例3：GM-CSF对用HPV体内免疫接种的影响
材料和方法
动物
C57BL/6小鼠购自Harlan(Horst，荷兰)。所有小鼠保持在SPF条件下，所进行的程序由挪威的兽医管理局批准。
材料和细胞
HPV 16 E7肽抗原(序列QAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR，CD8表位加下划线)得自United Peptides(Herndon，VA)。高MW聚(IC)来自InvivoGen(San Diego，美国)。GM-CSF(重组鼠)购自PeproTech Inc.，Rocky Hill，美国(目录号315-03)。光敏剂四苯基二氢卟吩二磺酸盐(TPCS2a)来自PCI Biotech(Lysaker，挪威)，且HPV五聚体来自Proimmune(Oxford，英国)，(Proimmune肽编码502H)。
小鼠的皮内光敏化和免疫
将小鼠在腹部剃毛，使用具有29G针的注射器皮内注射由50μg HPV长肽抗原、100μg TPCS2a和10μg GM-CSF和/或聚(IC)(如下所述)组成的疫苗。疫苗保持避光并在制备的60分钟内使用。疫苗在腹部中线的左侧和右侧两次注射各50μl。免疫18小时后，通过腹膜内注射氯胺酮(25mg/kg体重)和甲苯噻嗪(4mg/kg)的混合物来麻醉小鼠并如下所述进行照射。
在每次免疫后第7天，在通过流式细胞术分析抗原特异性CD8T细胞之前，通过尾部出血放血和通过裂解除去红细胞。
免疫小鼠的照射
通过用LumiSourceTM(PCI Biotech)照射激活TPCS2a。在免疫后18小时用LumiSource照射6分钟。
通过五聚体染色来分析免疫应答
在用抗CD8和抗CD44抗体和对应于所用HPV抗原的五聚体染色细胞后，通过流式细胞术监测血液中抗原特异性CD8T细胞的频率。通过流式细胞术测试CD44的表达来分析细胞的活化状态。使用FACSCanto(BD Biosciences，San Jose，美国)并使用FlowJo 8.5.2软件(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)分析细胞。
实施例3a：PCI与HPV长肽抗原和GM-CSF的效果
如“材料和方法”所述进行实验。在第0天和第14天用下述疫苗混合物免疫动物。在免疫后18小时用LumiSource照射装置进行6分钟的照射。每次免疫后第6天的血液样品用HPV五聚体、CD8和CD44抗体染色，并如上所述通过流式细胞术分析。包括以下实验组：
2×HPV:用50μg HPV长肽免疫小鼠2次。小鼠不经照射。
2×HPV+GM-CSF:用50μg HPV长肽和10μg GM-CSF免疫小鼠2次。小鼠不经照射。
2×HPV+GM-CSF+PCI:用50μg HPV长肽、100μg TPCS2a和10μg-GM-CSF免疫小鼠2次。在两次免疫中均照射小鼠。
结果
从图3中可以看出，与仅用抗原观察到的应答相比，用抗原+GM-CSF进行的两次免疫不能提高免疫学CD8细胞应答。然而，将GM-CSF与PCI组合显著增加了CD8-细胞应答。
实施例3b：PCI与HPV长肽抗原、GM-CSF和聚(IC)的效果
如“材料和方法”所述进行实验。在第0天和第14天用下述疫苗混合物免疫动物。在免疫后18小时用LumiSource照射装置进行6分钟的照射。每次免疫后第6天的血液样品用HPV五聚体、CD8和CD44抗体染色，并如所述通过流式细胞术分析。包括以下实验组：
2×HPV:用50μg HPV长肽免疫小鼠2次。小鼠不经照射。
2×HPV+聚(IC):用50μg HPV长肽和10μg聚(IC)免疫小鼠2次。小鼠不经照射。
第1次:HPV+p(IC)+PCI.第2次:HPV+PCI:用50μg HPV长肽、10μg聚(IC)和100μgTPCS2a(第一次免疫)以及50μg HPV长肽和100μg TPCS2a(第二次免疫)的混合物免疫小鼠。在两次免疫中均照射小鼠。
第1次:HPV+p(IC)+GM-CSF+PCI.第2次:HPV+GM-CSF+PCI:用50μg HPV长肽、10μg聚(IC)、10μg GM-CSF和100μg TPCS2a(第一次免疫)以及50μg HPV长肽、10μg GM-CSF和100μgTPCS2a(第二次免疫)的混合物免疫小鼠。在两次免疫中均照射小鼠。
结果
在该实验中，首先用单独的HPV抗原、用抗原+聚(IC)或用抗原+聚(IC)+PCI的组合，或用抗原+聚(IC)+GM-CSF+PCI进行免疫。第二次免疫用相同的组合进行，但是，对于用PCI处理的样品，不用聚(IC)。从图4可以看出，虽然单独使用PCI+聚(IC)的治疗方案对免疫应答具有积极作用，但将GM-CSF添加到相同的方案中显著增强了应答。用抗原+GM-CSF+PCI免疫与单独使用抗原观察到的相比显著改善了免疫学CD8-细胞应答(图3)，但是响应的量级显著小于对于GM-CSF和聚(IC)和PCI的组合所观察到的(图4)。综合所述观察，在不采用PCI时，使用聚(IC)与单独使用抗原所达到的相比并没有改善免疫应答，所述实验表明当与PCI一起使用时，GM-CSF和聚(IC)PCI可协同地起作用以增强对肽抗原的CD8应答。
Claims (34)
1.一种在细胞的表面上表达抗原分子或其一部分的方法，所述方法包括使所述细胞与所述抗原分子、光敏剂和细胞因子接触，并用波长能有效激活所述光敏剂的光照射所述细胞，其中所述抗原分子释放到所述细胞的细胞质中，所述抗原分子或其部分随后呈递在所述细胞的表面上。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子是I型或II型细胞因子受体的配体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2受体家族成员或GM-CSF受体家族成员的配体。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞因子是干扰素，优选I型IFN。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、IL-7、IFN-α、IL-2、IL-15和IL-21或其同源物或衍生物，其中优选所述细胞因子是GM-CSF。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗原分子是能够刺激免疫应答的分子，优选疫苗抗原或疫苗组分。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述抗原呈递导致刺激免疫应答。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法在体外或离体进行。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述光敏剂选自TPCS2a、AlPcS2a、TPPS4和TPBS2a，优选TPCS2a，或式(I)中定义的光敏剂和壳聚糖的缀合物：
其中
n是大于或等于3的整数；
R在所述化合物中出现n次，且
在所述总Rn基团的0.1％～99.9％、优选0.5％～99.5％中，每个R是选自以下的基团A：
其中每个R1相同或不同，其选自H、CH3和-(CH2)b-CH3；a为1、2、3、4或5；且b是0、1、2、3、4或5，其中抗衡离子是例如Cl-；优选R1是CH3，b是1，
和
其中Y是O、S、SO2、–NCH3或-N(CH2)dCH3；c＝1、2、3、4或5；且d＝1、2、3、4或5，优选Y是NCH3且c是1，
其中每个R基团相同或不同，并且
在所述总Rn基团的0.1％～99.9％、优选0.5％～99.5％中，每个R是选自以下的基团B：
其中
e是0、1、2、3、4或5；且f是1、2、3、4或5；优选e和f＝1，
R2是选自以下的基团：
W是选自O、S、NH或N(CH3)的基团；优选NH，
R3是选自以下的基团：
V是选自CO、SO2、PO、PO2H或CH2的基团；优选CO，且
R4是相同或不同的选自H、-OH、-OCH3、-CH3、-COCH3、C(CH3)4、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2和-NCOCH3的基团，其是o、m或p位的取代基，优选H，
其中每个R基团相同或不同。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗原分子是肽。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述细胞是抗原呈递细胞，优选树突细胞。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述抗原分子、光敏剂和细胞因子同时、分别或依次接触。
13.一种在受试者中产生免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者施用权利要求1、6或10中定义的抗原分子、权利要求1或9中定义的光敏剂和权利要求1至5中任一项中定义的细胞因子，并用波长能有效激活所述光敏剂的光照射所述受试者，其中产生免疫应答。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述方法是疫苗接种的方法。
15.如权利要求13或14所述的方法用于治疗或预防疾病、病症或感染、优选癌症。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述受试者是非哺乳动物，优选鱼或哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，最优选所述受试者是人。
17.如权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述抗原分子、光敏剂和细胞因子同时、分别或依次施用于所述受试者。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1、6或10中任一项定义的抗原分子、权利要求1或9中定义的光敏剂和权利要求1至5中任一项中定义的细胞因子，以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。
19.一种在其表面上表达抗原分子或抗原分子的一部分的细胞或细胞群体，所述细胞可通过权利要求1至12中任一项所定义的方法获得，其中优选所述细胞是树突细胞。
20.一种药物组合物，其包含权利要求19定义的细胞或细胞群体和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。
21.如权利要求19中定义的细胞或细胞群体或如权利要求18或20所定义的组合物，其用于预防或治疗。
22.如权利要求19中定义的细胞或细胞群体或如权利要求18或20所定义的组合物，其用于刺激受试者的免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症。
23.如权利要求19中定义的细胞群体或权利要求18或20中定义的组合物在制备用于刺激受试者中的免疫应答的药物中的用途，优选用于治疗或预防受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述刺激、治疗或预防包括对所述受试者施用所述药物。
25.如权利要求1、6或10中任一项所定义的抗原分子、如权利要求1或9中所定义的光敏剂和权利要求1至5中任一项所定义的细胞因子，用于预防或治疗。
26.如权利要求25所述的抗原分子、光敏剂和细胞因子，其用于刺激受试者的免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或治疗或预防癌症，其中所述用途优选包括权利要求1至17中任一项所定义的方法。
27.如权利要求1至5中任一项所定义的抗原分子、光敏剂和细胞因子，其用于如权利要求25或26所述的用途，其中所述用途包括如权利要求1至12中任一项所定义的方法以制备细胞群体，其中所述细胞优选是树突细胞。
28.如权利要求27所述的抗原分子、光敏剂和试剂，其中所述细胞群体待施用于所述受试者。
29.如权利要求1、6或10中任一项所定义的抗原分子和/或如权利要求1或9中所定义的光敏剂和/或如权利要求1至5中任一项所定义的细胞因子在制备用于刺激受试者中的免疫应答的药物中的用途，优选用于治疗或预防受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，其中所述免疫应答优选通过如权利要求13至17中任一项所述的方法进行刺激。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述药物包含在通过权利要求1至12中任一项所定义的方法获得的所述细胞的表面上表达的抗原分子或抗原分子的一部分的细胞群体，以用于施用于所述受试者。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述抗原分子和/或光敏剂和/或细胞因子用于如权利要求1至12中任一项所定义的方法中，以获得所述细胞群体用于制造所述药物。
32.一种产品，该产品包含作为组合制剂的权利要求1、6或10中任一项所定义的抗原分子、权利要求1或9中所定义的光敏剂和权利要求1至5中任一项所定义的细胞因子，其同时、单独或顺序地用于刺激受试者的免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，或用于在根据权利要求1至17中任一项所述的方法中在细胞的表面上表达抗原分子或抗原分子的一部分。
33.一种用于刺激受试者中的免疫应答的试剂盒，其优选用于治疗或预防所述受试者中的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，或用于在根据权利要求1至17中任一项所述的方法中在细胞的表面上表达抗原分子或抗原分子的一部分，所述试剂盒包括：
含有如权利要求1或9中所定义的光敏剂的第一容器；
含有如权利要求1、6或10中任一项所定义的所述抗原分子的第二容器；和
含有如权利要求1至5中任一项所定义的细胞因子的第三容器。
34.一种在受试者中产生免疫应答的方法，其优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，所述方法包括根据权利要求1至12中任一项所述的方法来制备·细胞群体，并随后将所述细胞施用于所述受试者。
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