CN108135986B - 对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途 - Google Patents

对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108135986B
CN108135986B CN201680057687.XA CN201680057687A CN108135986B CN 108135986 B CN108135986 B CN 108135986B CN 201680057687 A CN201680057687 A CN 201680057687A CN 108135986 B CN108135986 B CN 108135986B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ser
disease
gly
tau
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680057687.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108135986A (zh
Inventor
E·西古德松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
New York University NYU
Original Assignee
New York University NYU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by New York University NYU filed Critical New York University NYU
Publication of CN108135986A publication Critical patent/CN108135986A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108135986B publication Critical patent/CN108135986B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

本发明涉及基于抗体的分子(包括单结构域抗体片段、scFv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位‑结合结构域)，其能够免疫特异性和选择性结合至Tau的截短的Asp421表位。这类基于抗体的分子可用于检测生物样品中的病理Tau蛋白质构象异构体(如果存在)，特别是与阿尔茨海默病或其他tau疾病的诊断和/或治疗结合，从而提供对阿尔茨海默病和其他Tau病理的诊断。本发明基于抗体的分子尤其可用作阿尔茨海默病和相关Tau疾病的诊断标记物并且用作用于治疗这类病况的药物组合物。

Description

对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它 们在诊断和治疗Tau疾病中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请系列号62/204,699(2015年8月13日提交；待决)，和62/211,123(2015年8月28日提交；待决)的优先权，每篇申请通过引用以它们的整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(NIH)授予的根据批准号NS077239、AG032611和AG020197在政府的支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
序列表的参考
根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，所述序列表以计算机可读介质(文件名：1400-0008PCT_ST25.txt，2016年8月11创建，大小是170,987字节)公开，该文件通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及基于抗体的分子(包括单结构域抗体片段、scFv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位-结合结构域)，其能够免疫特异性和选择性结合Tau的截短的Asp421表位。这类基于抗体的分子可用于检测生物样品中的病理Tau蛋白质构象异构体(如果存在)，尤其与阿尔茨海默病或其他Tau疾病的诊断和/或治疗相结合，从而提供对阿尔茨海默病和其他Tau病理的诊断。本发明的基于抗体的分子可尤其用作阿尔茨海默病和相关Tau疾病的诊断标记物，以及用作用于治疗这类病况的药物组合物。
背景技术
阿尔茨海默病是痴呆的最常见的形式，其影响着全世界两千多万人。该疾病的诊断，尤其是在早期的诊断，是麻烦和困难的，并且存在对tau疾病(比如阿尔茨海默病)的精确诊断的需求。在脑脊液中异常Tau的抗体检测已经显示出一些前景(Blennow,K.等,“Cerebrospinal Fluid And Plasma Biomarkers In Alzheimer Disease,”Nat.Rev.Neurol.6,131-144(2010)和Weiner等,“The Alzheimer’s DiseaseNeuroimaging Initiative:A Review Of Papers Published Since Its Inception,”Alzheimers.Dement.9,e111-e194(2013))。
多年以来，在脑脊液中磷酸化-Tau蛋白(phospho-Tau protein)的抗体检测已经显示对于阿尔茨海默病的诊断的一些用途(Blennow,K.等,“Cerebrospinal Fluid AndPlasma Biomarkers In Alzheimer Disease,”Nat.Rev.Neurol.6,131-144(2010)；Lewis,J.等,“Neurofibrillary Tangles,Amyotrophy And Progressive Motor Disturbance InMice Expressing Mutant(P301L)Tau Protein,”Nat.Genet.25,402-405；Weiner,M.W.等(2013)“The Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative:A Review Of PapersPublished Since Its Inception,”Alzheimers.Dement.9:e111-e194)，这意味着在该领域进一步开发是值得的(见Congdon,E.E.(2014)“Harnessing The Immune System ForTreatment And Detection Of Tau Pathology,”J.Alzheimers Dis.40:S113-S121)。但是，在其他tau疾病中CSF Tau水平相较于对照通常是不改变的(Theunis,C.等“EfficacyAnd Safety Of A Liposome-Based Vaccine Against Protein Tau,Assessed InTau.P301L Mice That Model Tauopathy,”PLoS.One.8,e72301(2013)；Hales,C.M.等(2013)“From Frontotemporal Lobar Degeneration Pathology To FrontotemporalLobar Degeneration Biomarkers,”Int.Rev.Psychiatry 25:210-220)，且成像染料可能不能检测所有tau疾病中的病理Tau(Fodero-Tavoletti,M.T.等(2014)“Assessing THK523Selectivity For Tau Deposits In Alzheimer’s Disease And Non-Alzheimer’sDisease Tauopathies,”Alzheimers.Res.Ther.6:11)。使这些Tau病变(lesion)协同淀粉样β(Aβ)成像是更可能导致精确诊断的，因为Tau聚集体(Tau aggregate)的区域式样在不同tau疾病之间不同。更进一步，除了阿尔茨海默病，它们在某种程度上都通过缺少Aβ沉积而被定义。使用良好结合至β-折叠的化合物的Aβ斑块的体内成像已经处于临床应用中(Mason,N.S.等(2013)“Positron Emission Tomography Radioligands For In VivoImaging Of ABeta Plaques,”J.Labelled Comp.Radiopharm.56:89-95)。若干这样的基于染料的Tau结合配体最近已经在临床前研究中被鉴定，并且其中一些已经被评估(Fodero-Tavoletti,M.T.等(2014)“Assessing THK523Selectivity For Tau Deposits InAlzheimer’s Disease And Non-Alzheimer’s Disease Tauopathies,”Alzheimers.Res.Ther.6:11；Fodero-Tavoletti,M.T.等(2011)“18F-THK523:A Novel InVivo Tau Imaging Ligand For Alzheimer’s Disease,”Brain 134:1089-1100；Zhang,W.等(2012)“A Highly Selective And Specific PET Tracer For Imaging Of TauPathologies,”J.Alzheimers.Dis.31:601-612；Chien,D.T.等(2013)“Early ClinicalPET Imaging Results With The Novel PHF-Tau Radioligand[F-18]-T807,”J.Alzheimers.Dis.34:457-468；Maruyama,M.H.等(2013)“Imaging Of Tau Pathology InA Tauopathy Mouse Model And In Alzheimer Patients Compared To NormalControls,”Neuron 79:1094-1108；Okamura,N.等(2005)“Quinoline And BenzimidazoleDerivatives:Candidate Probes For In Vivo Imaging Of Tau Pathology InAlzheimer’s Disease,”J.Neurosci.25:10857-10862；Harada,R.,等(2013)“ComparisonOf The Binding Characteristics Of[18F]THK-523And Other Amyloid ImagingTracers To Alzheimer’s Disease Pathology,”Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 40:125-132；Ono,M.等(2011)“Rhodanine And Thiohydantoin Derivatives For Detecting TauPathology In Alzheimer’s Brains,”ACS Chem.Neurosci.2:269-275；Xia,C.F.等(2013)“[(18)F]T807,A Novel Tau Positron Emission Tomography Imaging Agent ForAlzheimer’s Disease,”Alzheimers.Dement.9:666-676；Chien,D.T.(2014)“EarlyClinical PET Imaging Results With The Novel PHF-Tau Radioligand[F18]-T808,”J.Alzheimers.Dis.38:171-184；Villemagne,V.L.等(2014)“In Vivo Evaluation Of ANovel Tau Imaging Tracer For Alzheimer’s Disease,”Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging41:816-826；Okamura,N.等(2014)“Non-Invasive Assessment Of Alzheimer’s DiseaseNeurofibrillary Pathology Using 18F-THK5105 PET,”Brain 137:1762-1771)。基于Tau的配体的希望和前景是，它们比Aβ配体更好地监控神经变性的状态和发展。基于抗体的探针可能提供对于检测Tau病变更强的特异性。尤其地，结合至Tau的较小的抗体片段作为配体用于在体内成像以在阿尔茨海默病或其他tau疾病患者中检测Tau病变是引人注目的。
在癌症领域，治疗用抗体已经常规地作为成像剂被共同开发，并且一些这样的抗体和Fab分子被FDA批准用于肿瘤成像(Kaur,S.等“Recent Trends In Antibody-BasedOncologic Imaging,”Cancer Lett.315,97-111(2012))。
本申请发明者已经发现，为检测Tau病变提供优异特异性的抗体衍生的分子，尤其是较小的单链可变区抗体片段(scFv分子)，对于Tau聚集体的体内成像是引人注目的。设想这些抗体衍生的成像配体可用于监控Tau病理的疾病发展、Tau靶向疗法的效力以及鉴定Aβ阴性tau疾病(Aβnegative tauopathies)。另外，这类抗体衍生的分子可用作预防、治疗和管理阿尔茨海默病和其他Tau疾病的治疗剂(therapeutics)。
发明内容
本发明涉及基于抗体的分子(包括单结构域抗体片段、scFv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位-结合结构域)，其能够免疫特异性和选择性结合至Tau的截短的Asp421表位。这类基于抗体的分子可用于检测生物样品中的病理Tau蛋白质构象异构体(如果存在)，尤其与阿尔茨海默病或其他Tau疾病的诊断和/或治疗相结合，从而提供对阿尔茨海默病和其他Tau疾病的诊断。本发明基于抗体的分子尤其可用作阿尔茨海默病和相关Tau疾病的诊断标记物，以及用作用于治疗这类病况的药物组合物。
详细地，本发明涉及结合分子，其能够免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位，其中所述表位存在于具有Tau 407-421(SEQ ID NO:7)：HLSNVSSTGSIDMVD的序列的肽上。
本发明尤其涉及这类结合分子的实施方式，其中所述分子与选自下述的抗体竞争结合：抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3/5G2G6。
本发明尤其涉及这类结合分子的实施方式，其中所述分子包含：
(a)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列；
(b)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:17、18和19；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列；
(c)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列；
(d)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列；
或
(e)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:37、38和39的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:41、42和43的氨基酸序列。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子包含：
(a)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中在外周注射至接受者后，所述分子基本上与Tau聚集体共定位。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子是抗体、双抗体、scFv，或包含抗体、双抗体或scFv的表位-结合片段。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子是抗体。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子是人源化抗体或包含人源化抗体的表位-结合片段。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子是scFv。
本发明尤其涉及任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子被可检测地标记，尤其地，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记。
本发明另外涉及任何这类基于抗体的分子用于检测或测量接受受试者的脑、脑脊液、血液、血清或血浆中截短的Tau蛋白质的存在或量的用途。
本发明尤其涉及这类用途的实施方式，其中所述检测或测量包括使与截短的Tau蛋白质结合的基于抗体的分子体内或离体成像。
本发明尤其涉及这类用途的实施方式，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
本发明另外涉及用于治疗受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的体内药物，其中所述药物包含有效治疗阿尔茨海默病或其他Tau疾病的量的任何上述基于抗体的分子，以及一种或多种载体、稀释剂和/或稳定剂。
本发明另外涉及这类体内药物用于治疗受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途。
本发明尤其涉及这类用途的实施方式，其中所述受试者是人。
本发明另外涉及试剂盒，其用于检测或测量受试者的脑中截短的Tau蛋白质的存在或量，或用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病，其中所述试剂盒包含上述基于抗体的分子。
本发明尤其涉及任何这类用途、药物或试剂盒的实施方式，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆(frontotemporal dementia)、与17号染色体连锁的帕金森症(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病(Pick's disease)、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆(tangle only dementia)、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症(diffuse neurofibrillary tangles with calcification)、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallerworden-Spatzdisease)、包涵体肌炎、克雅氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型(Niemann-Pick disease type C)、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结(non-guanamianmotor neuron disease with neurofibrillary tangles)、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
附图说明
图1A-1E显示了抗体1G10D2(图1A)、抗体1G11A10(图1B)、抗体5B3C11(图1C)、抗体5G2A3(图1D)和抗体5G2G6(图1E)在1:10、1:30、1:90、1:270、1:810和1:2430的杂交瘤培养物上清液的稀释度对于Tau的截短的Asp421表位的免疫特异性。
图2A-2B显示了抗体1G11A10(图2A)和5G2A3(图2C)在1:1000、1:3000、1:9000、1:27000和1:81000的抗体稀释度对于Tau的截短的Asp421表位的免疫特异性。
图3A-3B显示了抗体5G2A3和抗体1G11A10(10μg/mL)，随着时间的推移，对于用PHF(1μg/mL)预处理的JNPL3小鼠的混合皮质(图3A)或纯神经元(图3B)培养物的磷酸化的Tau水平的作用。也在纯神经元培养物中测试了抗体5G2G6。图3A中呈现的结果获得自蛋白质印迹分析，其使用检测抗体PHF-1(表6)。用IgG(10μg/mL)温育的、PHF处理的混合培养物被看作该组实验的对照。图3B中呈现的结果获得自蛋白质印迹分析，其使用对于{p}Ser199Tau特异性的检测抗体，其中IgG处理的对照设置为100％。数据未被归一化。
图4A-4B显示了抗体5G2A3和抗体1G11A10(10μg/mL)，随着时间的推移，对于细胞内Tau的作用，其使用以PHF(1μg/mL)预处理的JNPL3小鼠的混合皮质(图4A)或纯神经元(图4B)培养物。也在纯神经元培养物中测试了抗体5G2G6。图4A(表7)和图4B中呈现的结果获得自蛋白质印迹分析，其使用抗人Tau抗体(Dako)。用IgG(10μg/mL)温育的PHF处理的培养物被看作两组实验的对照并且呈现在图3A-3B中。数据未被归一化。
图5A-5B显示，证实抗体5G2A3比抗体1G11A10更有效降低混合皮质(图5A)和原代神经元(图5B)培养物中的磷酸化-Tau(phospho-Tau)水平。图5A：当与对照细胞相比时，用针对Ser199表位的抗体5G2A3(10μg/ml)处理48小时、72小时和96小时的混合皮质培养物显示磷酸化-Tau水平的非常显著的降低，即分别降低66％、81％和94％，p<0.0001，而用抗体1G11A10(10μg/ml)处理的细胞不能显著降低磷酸化-Tau水平。用IgG(10μg/ml)温育的、PHF处理的混合皮质培养物被看作该组实验的对照。图5B：通过在24h、48小时、72小时和96小时分别显示90％、89％、76％和68％的降低(p<0.0001)，证实针对Ser199表位的抗体5G2A3非常有效降地低原代神经元中的磷酸化-Tau水平。10μg/ml的抗体1G11A10处理也表明磷酸化-Tau水平从24小时至72小时降低68％、67％和68％，p<0.05，这在96小时减弱，仅显示9％的降低。
图6A-6B显示，证实抗体5G2A3有效降低混合皮质和原代神经元培养物中的总Tau，而抗体1G11A10更有效降低原代神经元培养物中的总Tau水平。图6A：当与用IgG(10μg/ml)处理的对照细胞相比时，使用混合皮质培养物的抗体5G2A3处理能够降低总Tau水平，直到96小时，减少高达54％，p<0.05，而抗体1G11A10处理表明仅仅在24小时(41％)和96小时(36％)显著降低总Tau水平，p<0.0001。图6A：证实了当与对照相比时，原代神经元中的抗体5G2A3处理在24小时(58％)、48小时(45％)和96小时时(43％)有效显著降低总Tau水平，p<0.05，而原代神经元培养物中的抗体1G11A10仅仅在48小时显示显著降低总Tau的水平，显示65％的降低，p<0.05。
图7显示，抗体5G2A3处理增加混合皮质培养物中的NeuN水平。来自第0天JNPL3小鼠的混合皮质培养物用PHF(1μg/ml)预处理，随后用抗体5G2A3(10μg/ml)和抗体1G11A10(10μg/ml)处理另外24小时、48小时、72小时或96小时。针对神经元细胞核标记物NeuN进行蛋白质印迹分析，表明与IgG(10μg/ml)处理的对照细胞相比，NeuN的水平在72小时(114％)和96小时时(170％)显著增加。抗体1G11A10处理未显示NeuN水平的任何显著改变。
图8显示，在混合皮质培养物中进行抗体5G2A3处理之后，Iba1表达下降。来自第0天JNPL3小鼠的混合皮质细胞用PHF(1μg/ml)预处理，随后用抗体5G2A3或抗体1G11A10(各自10μg/ml)分别处理24小时、48小时、72小时或96小时。针对小神经胶质细胞特异性标记物Iba1抗体进行免疫印迹，表明当与各个时间点的对照相比时，Iba1的水平在72小时(38％，p<0.05)和96小时(73％，p＝0.0004)显著下降，而抗体1G11A10处理在任何时间点均未显示Iba1表达的任何显著差异。用IgG(10μg/ml)处理的细胞被看作混合皮质和原代神经元培养物的对照。
图9显示对于混合皮质培养物中高剂量的PHF(10μg/ml)与对于Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体(10μg/ml)的共温育的NeuN水平的作用，如通过NeuN水平的变化测量的。在这些更有毒性的条件(更高的PHF剂量)下，通过非常有效清除病理Tau并且预防其毒性的抗体5G2A3观察到了如实施例3中的类似模式，而较低亲和性抗体1G11A10效力较小。
图10显示，当在混合皮质培养物中共温育高剂量的PHF(10μg/ml)与对于Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体(10μg/ml)时，观察到对归一化至NeuN水平的磷酸化的Tau水平的作用，如通过归一化至NeuN水平的、与Ser199表位的结合的变化所测量的。与单独的PHF以及PHF+IgG处理的细胞相比，抗体5G2A3抗体与PHF的共温育显示了磷酸化-Tau水平的显著下降，而抗体1G11A10抗体与PHF的共温育未能显示磷酸化-Tau水平的任何这样的改变。
图11显示，当共温育高剂量的PHF(10μg/ml)与能够免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位的抗体时，观察到对于归一化至NeuN水平的总Tau(磷酸化的以及非磷酸化的tau)的作用。
图12显示，当共温育高剂量的PHF(10μg/ml)与能够免疫特异性结合Tau的截短的Asp421表位的抗体时，观察到对于Iba1水平的作用。
图13A-13B显示JNPL3 Tau疾病小鼠(图13A)和hTau Tau疾病小鼠(图13B)中对于Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体的组织反应性。评估来自这类小鼠的低速上清液(LSS)样品。图的纵坐标值是分析的特定小鼠的代号。白色柱：抗体5G2A3；灰色柱：抗体1G11A10；黑色柱：抗Tau抗体C3。
图14显示了在来自人(对照)脑的脑上清液样品和来自人AD脑的纯化PHF中，对于Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体的组织反应性。图的纵坐标值是分析的特定受试者的代号。白色柱：抗体5G2A3；灰色柱：抗体1G11A10；黑色柱：抗Tau抗体C3。
具体实施方式
本发明涉及基于抗体的分子(包括单结构域抗体片段、scFv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位-结合结构域)，其能够免疫特异性和选择性结合Tau的截短的Asp421表位。这类基于抗体的分子可用于检测生物样品中的病理Tau蛋白质构象异构体(如果存在)，尤其与阿尔茨海默病或其他Tau疾病的诊断和/或治疗相结合，从而提供了用于阿尔茨海默病和其他Tau疾病的诊断。本发明基于抗体的分子尤其可用作用于Tau疾病(尤其用于阿尔茨海默病和相关Tau疾病)的诊断标记物以及用作用于治疗这类病况的药物组合物。
如本文所使用的术语“Tau疾病”包括涉及微管蛋白Tau在脑中病理性聚集的任何神经变性疾病。因此，除了家族性和偶发性阿尔茨海默病之外，本发明的tau疾病还包括，但不限于：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
本发明的基于抗体的分子对于检测患有AD或其他tau疾病患者中的Tau病变提供比β折叠染料更高的特异性。尤其地，结合至Tau的较小的抗体片段作为用于体内成像的配体是引人注目的。它们相比于抗体较小的尺寸导致其更好地接近Tau聚集体。另外的优点是，与具有较长半衰期的未修饰抗体相比，它们相对快速从循环中清除。在癌症领域里，治疗用抗体已经常规的作为成像剂被共同开发，并且若干这样的抗体和具有更好的药代动力学性质的Fab’s或更小的双抗体和scFv分子作为肿瘤成像剂被批准或提出(见Kaur,S.等(2012)“Recent Trends In Antibody-Based Oncologic Imaging,”Cancer Lett.315:97-111；Olafsen,T.等(2010)“Antibody Vectors For Imaging,”Semin.Nucl.Med.40:167-181)。
I、Tau和本发明优选的免疫原性Tau肽
如本文所使用，术语“Tau”与Tau蛋白质同义，其是指任何Tau蛋白质同等型(例如，在UniProt中鉴定为P10636，1-9)。Tau是可溶性微管相关蛋白质，其在细胞周期期间借助许多激酶而动态地磷酸化和去磷酸化。Tau稳定微管的能力取决于其磷酸化的程度。在其去磷酸化形式中，蛋白质能够与微管蛋白相互作用，以稳定微管并且促进微管蛋白组装成微管(其形成细胞的细胞骨架，并且，是有丝分裂中分开真核染色体的有丝分裂纺锤体的主要成分)。在其磷酸化的形式中，Tau能够从微管分离，从而允许进行有丝分裂。因此，Tau的磷酸化用作神经元中直接的微管结合-分离(microtubule association-dissociation)开关(Pedersen,J.T.等(2015)“Tau Immunotherapy For Alzheimer’s Disease,”TrendsMol.Med.2015 Apr 3.pii:S1471-4914(15)00058-1；第1-9页，通过引用以其整体并入本文)。
相对于下面显示的SEQ ID NO：1给出本文提供的Tau残基的氨基酸编号，其中甲硫氨酸是其第一个氨基酸残基。
SEQ ID NO:1：
Figure BDA0001616537130000101
术语“磷酸化-Tau”或“P-Tau”指在一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基处已经被磷酸化的Tau蛋白质或肽。如本文所使用，符号“{p}Ser”或“{p}S”表示氨基酸残基磷酸丝氨酸。例如，符号“{p}Ser199”指SEQ ID NO:1的多肽部分，其中对应SEQ ID NO:1的残基199的残基是磷酸丝氨酸残基。相比之下，符号“Ser199”指SEQ ID NO:1的多肽部分，其中对应SEQ IDNO:1的残基199的残基是丝氨酸残基。
Tau的高度磷酸化(Hyperphosphorylation)可造成成对螺旋丝体和直丝体的不可溶的自组装“缠结体”(本文中称为“Tau聚集体”)的形成。这样的Tau聚集体可为细胞内的(例如神经元内的)，但也可在细胞外形成。Tau聚集体的存在损害了Tau稳定微管的能力，因此引起微管解体、树突脊(dendritic spinal)塌陷瓦解和轴突的降解。正常Tau平均包含两个磷酸化位点；高度磷酸化Tau丝体平均七到八个磷酸化位点。高度磷酸化Tau是细胞内的神经元纤维缠结的主要成分，细胞内的神经元纤维缠结是阿尔茨海默病和其他Tau疾病的主要标志。如本文所使用，术语“病理Tau(pathological Tau)”指作为阿尔茨海默病和其他Tau疾病特征的高度磷酸化的Tau。
II、本发明优选的基于抗体的分子
本发明“基于抗体的分子”包括能够免疫特异性和选择性结合Tau的Asp421表位的抗体，以及其展示这类结合免疫特异性和选择性的片段和衍生物。如本文所使用，如果分子是通过实际片段化这类亲本分子获得的(例如，Fab或(Fab)2片段)，或如果分子包含的氨基酸序列含有这类亲本分子的一部分氨基酸序列，则认为该分子是另一分子的“片段”。如本文所使用，如果分子是通过实际化学修饰这类亲本分子或其部分获得的，或如果分子包含的氨基酸序列基本上与这类亲本分子或其相关部分的氨基酸序列类似(例如，与这类亲本分子或其这类相关部分的差异小于30％、小于20％、小于10％或小于5％，或与这类亲本分子或其相关部分相差10个氨基酸残基，或相差小于10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基)，认为该分子是另一分子(或其相关部分)的“衍生物”。
如本文所使用，术语“抗体”指完整的免疫球蛋白以及具有其表位结合片段的分子。如本文所使用，术语“片段”、“区域”和“结构域”一般旨在是同义的，除非它们使用的上下文另外指出。天然产生的抗体典型地包括四聚体，所述四聚体通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链组成。每条重链包括重链可变区(本文缩写为“VH区域”)和重链恒定区，重链恒定区通常包括三个结构域(CH1、CH2和CH3结构域)。重链可为任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为“VL区域”)和轻链恒定区(CL)。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变区通常负责抗原识别，而重链和轻链恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)，的结合。VH和VL区可进一步再划分成高变区，称为“互补决定区”或“CDR”，其中散布以具有更保守序列的区域，称为“构架区”(FR)。每个VH和VL区域均由三个CDR结构域和四个FR结构域组成，其从氨基-末端到羧基-末端以如下的顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。尤其相关的是，已经被“分离”的抗体和它们的表位结合片段，以便其存在于与其天然产生的物理环境不同的物理环境中，或已经被修饰以便在氨基酸序列方面与天然产生的抗体不同。
可获得展示表位-结合能力的抗体片段(包括Fab和(Fab)2片段)，例如，通过完整抗体的蛋白酶切割获得。更优选的，这样的片段为单结构域抗体片段、scFv分子和抗体的表位结合结构域等，其使用重组技术形成。例如，虽然Fv片段的两个结构域，VL区域和VH区域，通过不同的基因编码，但是，可使用重组方法，通过柔性连接体(典型地具有大约10、12、15或更多氨基酸残基)将这样的基因序列或它们的编码cDNA连接，这使得他们被制成单蛋白链，在其中VL和VH区域缔合以形成单价表位-结合分子(被称为单链Fv(scFv)分子；见例如，Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426；和Huston等(1988)“Protein Engineering Of Antibody Binding Sites:Recovery OfSpecific Activity In An Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced InEscherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:5879-5883)。可选地，通过采用太短的(例如，少于大约9个残基)而不能使单多肽链的VL和VH区域结缔合在一起的柔性连接体，可形成双特异性抗体、双抗体或类似的分子(其中两个这样的多肽链缔合在一起，以形成二价表位-结合分子)(关于双抗体的描述，见例如，Holliger,P.等(1993)“‘Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90(14),6444-8(1993))。单结构域抗体片段仅具有一个可变结构域(例如，VL或VH)。本发明包括的表位结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段、由VL、VN、CL和CH1结构域组成的单价片段，或单价抗体，如WO2007059782中所描述的；(ii)F(ab')2片段、包括通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward,E.S.等“Binding Activities Of ARepertoire Of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted FromEscherichia coli,”Nature 341:544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成，因此也称为结构域抗体(domain antibodies)(Holt,L.J.等(2003)“Domain Antibodies:ProteinsFor Therapy,”Trends Biotechnol.21(11):484-490)；(vi)骆驼科动物(camelid)抗体或纳米抗体(Revets,H.等(2005)“Nanobodies As Novel Agents For Cancer Therapy,”Expert Opin Biol Ther.5(l):lll-24)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)。更进一步，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，通过单独的基因编码，但可使用重组方法，通过合成连接体将他们连接，这使得它们可被制成单蛋白链，在其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，见例如，Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-BindingProteins,”Science 242:423-426和Huston等(1988)“Protein Engineering Of AntibodyBinding Sites:Recovery Of Specific Activity In An Anti-Digoxin Single-ChainFv Analogue Produced In Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:5879-5883)。本文进一步讨论这些和本发明上下文中的其他有用的抗体片段。也应该理解，术语抗体，除非另外指出，否则也包括抗体样(antibody-like)多肽，比如嵌合抗体和人源化抗体，以及任何已知技术提供的保持与抗原的特异性结合能力的抗体片段(抗原-结合片段)，所述已知技术比如酶法切割、肽合成和重组技术。产生的抗体可具有任何同种型。如本文所用，“同种型(isotype)”指免疫球蛋白类别(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)，其是通过重链恒定区基因编码的。同种型的选择通常通过期望的效应子功能(比如ADCC诱导)来引导。示例性的同种型是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区的任一个，κ或λ。如需要，本发明的抗-Tau抗体的类别可通过已知方法转换。例如，本发明的抗体初始为IgM，可被类别转换为本发明的IgG抗体。另外，类别转换技术可用于将一个IgG亚类转变为另外的亚类，例如从IgGl转换到IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能，可通过同种型转换成例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体而被改变，用于各种治疗用途。在一个实施方式中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1，
Figure BDA0001616537130000131
使用本领域技术人员已知的常规技术手段获得这样的抗体片段。例如，F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶处理抗体而产生。得到的F(ab')2片段可被处理以减少二硫键，从而产生Fab'片段。Fab片段可通过用木瓜蛋白酶处理IgG抗体而获得；Fab'片段可通过胃蛋白酶消化IgG抗体而获得。F(ab')片段也可通过如下描述的经硫醚键或二硫键结合Fab'而产生。Fab’片段是通过切断F(ab')2的铰链区的二硫键获得的抗体片段。Fab’片段可通过用还原剂，比如二硫苏糖醇处理F(ab')2片段而获得。抗体片段也可通过编码这些片段的核酸在重组细胞中的表达而产生(见例如，Evans,M.J.等(1995)“Rapid Expression Of An Anti-Human C5 Chimeric Fab Utilizing A Vector That Replicates In COS And 293Cells,”J.Immunol.Meth.184:123-38)。例如，编码部分F(ab')2片段的嵌合基因可包括编码CH1结构域和H链的铰链区的DNA序列，之后是翻译终止密码子，以产生截短的抗体片段分子。能够结合至期望的表位的合适的片段可容易地被筛选，用于以与完整的抗体同样的方式应用。
在一个实施方式中，这样的抗体片段是单价抗体，优选如PCT公布号WO2007/059782(其通过引用以其整体并入本文)中所描述的单价抗体，其具有铰链区的缺失。可通过包括以下步骤的方法构造这样的抗体：i)提供编码所述单价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选择的抗原特异性抗α-突触核蛋白抗体的VL区的核苷酸序列，以及编码Ig的恒定CL区的核苷酸序列，其中编码选择的抗原特异性抗体的VL区的所述核苷酸序列和编码Ig的CL区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列已经被修饰，这样在存在多克隆人IgG或当施用于动物或人类时，CL区不包含能够与包含同样的CL区的氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码所述单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选择的抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和编码人Ig的恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的所述核苷酸序列已经被修饰，这样对应于铰链区的区域，以及如Ig亚型、CH区的其他区域(比如CH3区)所要求的，不包括任何这样的氨基酸残基：所述氨基酸残基，在存在多克隆人IgG或当施用于动物或人类时，参与与包含人Ig的CH区的同样的氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价的或稳定的非共价的重链间键，其中编码选择的抗原特异性抗体的VH区的所述核苷酸序列和编码所述Ig的CH区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供细胞表达系统以产生所述单价抗体；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共同表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。
类似地，在一个实施方式中，抗体是单价抗体，其包含：
(i)如本文所描述的本发明的抗体的可变区或所述区的抗原结合部分，和
(ii)免疫球蛋白的CH区或其包含CH2和CH3区的片段，其中CH区或其片段已经被修饰，以便对应于铰链区的区域以及，如果免疫球蛋白不是IgG4亚型，CH区的其他区(比如CH3区)，不包括任何这样的氨基酸残基：所述氨基酸残基在多克隆的人IgG的存在下，能够与相同的CH区形成二硫键或与相同的CH区形成其他共价的或稳定的非共价的重链间键。
在进一步的实施方式中，单价抗体的重链已经被修饰，使得全部铰链缺失。
在另外的进一步实施方式中，所述单价抗体的序列已经被修饰，从而其不包含针对N-连接糖基化的任何受体位点。
如本文所使用，如果抗体或其表位结合片段相对于可选的表位更经常、更快速、以更大的持久性和/或更大的亲和力或亲合力与另一分子的区域(即，表位)反应或缔合，则认为所述抗体或其表位结合片段“免疫特异性”结合该表位。通过阅读该定义，也应理解，例如，免疫特异性结合第一靶标的抗体或其表位结合片段可能特异性或优先结合第二靶标或可能不特异性或不优先结合第二靶标。
如本文所使用，在抗体或其结合片段与预定抗原结合的情况下，当通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcore 3000仪器中测定时(优选使用抗体作为配体以及抗原作为分析物)，术语“结合”通常指以对应于大约10-7M或更少的，比如大约10-8M或更少的，比如大约10-9或更少的KD的亲和力进行结合，以及其以对应于KD的亲和力与预定抗原结合，相比于其与非特异性抗原(例如，牛血清白蛋白(“BSA”)、酪蛋白等)而不是预定抗原或密切相关的抗原结合的亲和力，所述KD为至多十分之一，比如至多百分之一，例如至多千分之一，比如至多万分之一，例如至多十万分之一。亲和力较低的量取决于抗体的KD，这样当抗体的KD非常低时(也就是，抗体是高度特异的)，那么针对抗原的亲和力比针对非特异性抗原的亲和力小的量是至少10,000倍。术语“kd”(秒-1或1/s)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。术语“ka”(M-1x秒-1或1/M)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的缔合速率常数。术语“KD”(M)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的解离平衡常数，其通过用kd除以ka获得。术语“KA”(M-1或1/M)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的缔合平衡常数，其通过ka除以kd获得。
如本文所用，如果相对于其结合(如果其完全结合)至非截短的肽表位，抗体或其表位结合片段以更高的亲合力免疫特异性结合至截短的肽表位，则认为所述抗体或其表位结合片段“选择性”结合该截短的肽表位。如本文所使用，术语“截短的表位”表示天然存在的(“非截短的”)表位的一部分的表位，这样非截短的表位具有从截短的表位的C末端和/或N末端延伸的一个或多个氨基酸残基。最优选地，这样的较高的亲和力为至少10倍更高、至少30倍更高、至少100倍更高、至少300倍更高、至少1,000倍更高、至少3,000倍更高或至少10,000倍更高。通过经ELISA或Biacore比较其免疫特异性结合至截短的表位的亲和力与其结合至非截短的表位的亲和力，来确定抗体或其表位-结合片段对于截短的Tau的“选择性”的程度。例如，包含“非截短的Asp421表位”的多肽具有包含SEQ ID NO:1的Asp421位的Tau表位。包含“截短的Asp421表位”的多肽具有包含SEQ ID NO:1的Asp421位的Tau表位，其中这样的Asp421残基是这样的多肽的N末端或C末端Tau残基。对于截短的Asp421表位展示免疫特异性的抗体，相对于非截短的Asp421表位，展示对于截短的Asp421表位增强的免疫特异性。因此，针对截短的Asp421表位展示免疫特异性的抗体，展示与包含Tau序列C末端至Tau(SEQ ID NO:1)的Asp421位的多肽基本上降低的结合。
术语“表位”指能够免疫特异性地结合至抗体的抗原决定簇。表位通常包含分子比如氨基酸或糖侧链的表面基团，且通常有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位区别在于在变性溶剂的存在下，与构象表位的结合消失，但与非构象表位的结合并不消失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性的组分)和并不直接参与结合的其他氨基酸残基，比如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹(footprint)内)。
如本文所用，术语“抗体的表位-结合片段”意思是能够免疫特异性结合至表位的抗体的片段。表位结合片段可包含这样的抗体的CDR结构域中的1个、2个、3个、4个、5个或全部6个，并且，虽然能够免疫特异性结合至这样的表位，但其对于与这样的抗体的表位不同的这类表位可展示免疫特异性、亲和性或选择性。然而，优选地，表位结合片段包含这样的抗体的全部6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可为单多肽链(例如scFv)或可包含两条或更多条多肽链，每条多肽链各具有氨基-末端和羧基末端(例如，双抗体、Fab片段、(Fab)2片段等)。
本发明的基于抗体的分子和它们的Tau表位结合片段优选为“人源化”的，尤其在它们被采用用于治疗目的情况下。术语“人源化的”指嵌合分子，通常使用重组技术制备，其具有衍生于来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余的免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包括融合至人恒定结构域的完整非人抗体可变结构域或仅仅包括移植到人可变结构域的适当的人框架区的这样的可变结构域的互补决定区(CDR)。这样的人源化分子的框架残基可为野生型的(例如全人的)或它们可被修饰以包含未在人抗体中发现的一个或多个氨基酸取代，所述人抗体的序列用作人源化的基础。人源化减少或消除分子的恒定区在人个体中作为免疫原的可能性，但是仍保留对外源可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另外的方法不仅关注提供人衍生的恒定区，而且还修饰可变区，以尽可能接近人的形式来重塑(reshape)它们。已知重链和轻链的可变区都包含三个互补-决定区(CDR)，侧翼是四个框架区(FR)，所述CDR对所讨论的抗原应答不同并且决定结合能力，所述框架区(FR)在给定物种中相对保守并且推定其为CDR提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，可通过将源自非人抗体的CDR移植在待修饰的人抗体中存在的FR上而“重塑”或“人源化”可变区。已经报道了该方法应用于各种抗体：Sato,K.等(1993)Cancer Res53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:GraftingAn Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The ImportanceOf Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”Bio/Technology9:266-271；Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of AnAnti-p185her2Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289；and Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies WithSpecificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方式中，人源化抗体保存所有的CDR序列(例如，人源化的小鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。在其他实施方式中，人源化抗体具有相对于初始抗体被改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其也称为“源自”初始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗原的能力是熟知的(例如，见美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
在一个实施方式中，本发明基于抗体的分子是人抗体。合适的人抗体可使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠产生。这样的转基因小鼠和转染色体小鼠包括在本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，其在本文统称为“转基因小鼠”。
HuMAb小鼠包含人免疫球蛋白基因微基因座(minilocus)和靶向突变，所述微基因座编码未重排的人重链可变和恒定(μ和Y)以及轻链可变和恒定(K)链免疫球蛋白序列，所述靶向突变使内源μ和K链基因座失活(Lonberg,N.等(1994)“Antigen-Specific HumanAntibodies From Mice Comprising Four Distinct Genetic Modifications,”Nature368:856-859)。因此，这样的小鼠展示小鼠IgM或IgK的减少的表达，以及响应免疫，引入的人重链和轻链转基因，经历类别转换和体细胞突变，以产生高亲和性人IgG，
Figure BDA0001616537130000171
单克隆抗体(Lonberg,N.等(1994)“Antigen-Specific Human Antibodies From Mice ComprisingFour Distinct Genetic Modifications,”Nature 368:856-859；Lonberg,N.(1994)“Human Monoclonal Antibodies from Transgenic Mice,”在以下中：HandbookExperimental Pharmacology,Volume 181(Starke,K.等编辑)Springer-Verlag BerlinHeidelberg；Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Intern.Rev.Immunol.13(1):65-93；Harding,F.等(1995)“Class Switching In HumanImmunoglobulin Transgenic Mice,”Ann.N.Y.Acad.Sci 764:536-546)。HuMAb小鼠的制备在以下文献中有详细描述：Taylor,L.等(1992)“A Transgenic Mouse That Expresses ADiversity Of Human Sequence Heavy And Light Chain Immunoglobulins,”Nucl.AcidsRes.20(23):6287-6295；Chen,J.等(1993)“Immunoglobulin Gene Rearrangement In BCell Deficient Mice Generated By Targeted Deletion Of The JH Locus,”Int’l.Immunol.5:647-656；Tuaillon,N.等(1994)“Biased Utilization Of DHQ52 AndJH4Gene Segments In A Human Ig Transgenic Minilocus Is Independent OfAntigenic Selection,”J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等(1994)“HumanImmunoglobulin Transgenes Undergo Rearrangement,Somatic Mutation And ClassSwitching In Mice That Lack Endogenous IgM,”Int’l.Immunol.6:579-591；Fishwild,D.等(1996)“High-Avidity Human IgG Kappa Monoclonal Antibodies From A NovelStrain Of Minilocus Transgenic Mice,”Nature Biotechnol.14:845-851；也见美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、5,770,429、5,545,807、PCT公开WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918和WO 01/09187)。
HCo7小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD扰乱(disruption)(如在Chen等(1993)“B Cell Development In Mice That Lack One Or Both Immunoglobulin KappaLight Chain Genes,”EMBO J.12:821-830中描述)、在它们的内源重链基因中具有CMD扰乱(如在PCT公开WO 01/14424的实施例1中描述)、具有KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild,D.等(1996)“High-Avidity Human Igg Kappa Monoclonal Antibodies From A NovelStrain Of Minilocus Transgenic Mice,”Nature Biotechnol.14:845-851中描述)、和具有HCo7人重链转基因(如在美国专利号5,770,429中描述)。
HCol2小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD扰乱(如在Chen等(1993)“B CellDevelopment In Mice That Lack One Or Both Immunoglobulin Kappa Light ChainGenes,”EMBO J.12:821-830中描述)、在它们的内源重链基因中具有CMD扰乱(如在PCT公开WO 01/14424的实施例1中描述)、具有KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild,D.等(1996)“High-Avidity Human Igg Kappa Monoclonal Antibodies From A Novel Strain OfMinilocus Transgenic Mice,”Nature Biotechnol.14:845-851中描述)、和具有HCol2人重链转基因(如在PCT公开WO 01/14424的实施例2中描述)。
在KM小鼠品系(strain)中，内源小鼠κ轻链基因已经被同型结合地(homozygously)扰乱，如Chen等(1993)“B Cell Development In Mice That Lack One OrBoth Immunoglobulin Kappa Light Chain Genes,”EMBO J.12:821-830中描述)，并且内源小鼠重链基因已经被同型结合地扰乱，如PCT公开WO 01/09187的实施例1中描述。该小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild,D.等(1996)“High-Avidity Human Igg KappaMonoclonal Antibodies From A Novel Strain Of Minilocus Transgenic Mice,”Nature Biotechnol.14:845-851描述)。该小鼠品系也携带包含染色体14片段hCF(SC20)的人重链转染色体，如PCT公开WO 02/43478中描述。
根据熟知的技术，这些转基因小鼠的脾细胞可用于产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。本发明的人单克隆或多克隆抗体，或本发明的来源于其他物种的抗体，也可通过产生另一非人类哺乳动物或植物以及以可回收的方式从其产生抗体而经转基因产生，所述非人类哺乳动物或植物针对感兴趣的免疫球蛋白重链和轻链序列是转基因的。就哺乳动物中的转基因产生而言，抗体可自山羊、奶牛或其他哺乳动物的奶中产生并从其中回收。见例如，美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
在一些抗体中，仅需要部分的CDR(即，结合所需要的CDR残基的子集(subset)，称为“SDR”)，以在人源化抗体中保持结合。未接触抗原的和不在SDR中的CDR残基可基于之前的研究从位于Chothia高变环之外的Kabat CDR的区域中鉴定(例如，CDR H2中的残基H60-H65通常是不需要的)(见Kabat等(1992)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICALINTEREST,National Institutes of Health Publication No.91-3242；Chothia,C.等(1987)“Canonical Structures For The Hypervariable Regions OfImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917)，其通过分子建模和/或经验进行，或如Gonzales,N.R.等(2004)“SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple HumanGermline Templates To Minimize Its Immunogenicity,”Mol.Immunol.41:863-872中所描述地进行。在这样的人源化抗体中，在一个或更多个供体CDR残基不存在的位置或在整个供体CR被省略的位置，占据所述位置的氨基酸可为在受体抗体序列中占据相应位置(根据Kabat编号)的氨基酸。待包括的受体在CDR中对供体氨基酸的这样的取代的数目反映了竞争考虑(competing consideration)的平衡。这些取代潜在地有利于减小人源化抗体中的小鼠氨基酸数目，因此减小潜在的免疫原性。但是，取代也可引起亲和力的改变，优选避免亲和力的显著下降。在CDR内的取代位置和用以取代的氨基酸也可根据经验选择。
CDR残基的单氨基酸的改变可导致功能性结合的丧失这一事实(Rudikoff,S.等(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79(6):1979-1983)提供了系统地鉴定可选的功能性的CDR序列的方法。在用于获得这样的变异的CDR的一个优选的方法中，编码CDR的多核苷酸被诱变处理(例如，通过随机诱变或通过定点方法(例如，用编码突变基因座的引物进行聚合酶链介导的扩增))，以产生具有取代的氨基酸残基的CDR。通过比较在原始的(功能性的)CDR序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性的)变异的CDR序列的身份，可以确定该取代的BLOSUM62.iij取代分数。BLOSUM系统提供通过分析序列数据库产生的氨基酸取代的矩阵，用于可靠地比对。(Eddy,S.R.(2004)“Where Did The BLOSUM62 Alignment Score MatrixCome From？,”Nature Biotech.22(8):1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Amino acidsubstitution matrices from protein blocks,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89:10915-10919；Karlin,S.等(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance OfMolecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87:2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino AcidSubstitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,”J.Mol.Biol.219,555-565。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表1示出了BLOSUM62.iij取代分数(分数越高，取代越保守，因此取代将更可能不影响功能)。如果例如包含产生的CDR的抗原-结合片段不能结合至ROR1，则BLOSUM62.iij取代分数被视为不够保守，因此具有更高的取代分数的新的候选取代被选择和产生。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)，以及非功能性取代残基是组氨酸(H)，则BLOSUM62.iij取代分将为0，并且优选更保守的变化(比如，变成天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸)。
Figure BDA0001616537130000201
因此，本发明考虑使用导向的诱变或随机诱变来鉴定改善的CDR。
在本发明的上下文中，可通过在下面三个表中的一个或多个中反映的氨基酸的种类内的取代，来限定保守取代：
用于保守取代的氨基酸残基种类:
Figure BDA0001616537130000211
可选的保守氨基酸残基取代类别:
Figure BDA0001616537130000212
氨基酸残基的可选的物理和功能分类:
Figure BDA0001616537130000213
更保守的取代基团包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
另外的氨基酸基团也可使用例如Creighton(1984)PROTEINS:STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES(第二版,1993),W.H.Freeman and Company中描述的原则被配制。
噬菌体展示技术可以可选地用于增加(或减小)CDR亲和力。该技术称为亲和力成熟(affinity maturation)，其采用诱变或“CDR步移”以及再选择，其使用靶抗原或其抗原片段以来鉴定这样的抗体：当与初始抗体或亲本抗体相比时，所述抗体具有以更高(或更低)亲和力结合抗原的CDR(见，例如Glaser等(1992)“Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System,”J.Immunology 149:3903-3913)。诱变处理整个密码子而非单核苷酸产生了氨基酸突变的半随机的库。可构建由变异的克隆池组成的文库，每个变异的克隆的差异在于单CDR中的单个氨基酸改变，并且克隆包括代表针对每个CDR残基的每个可能的氨基酸取代的变体。对于抗原具有增加的(或减小的)结合亲和力的突变体，可通过使固定的突变体与标记的抗原接触来筛选。任何本领域已知的筛选方法可用于鉴定对抗原具有增加或减小的亲和力的突变抗体(例如，ELISA)(见Wu,H.等(1998)“Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin,An AlphavBeta3-Specific Humanized Mab,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)95:6037-6042；Yelton等(1995)“Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis,”J.Immunology 155:1994)。可使用使轻链随机化的CDR步移(见，Schier,R.等(1996)“Isolation Of Picomolar Affinity Anti-c-erbB-2 Single-ChainFv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In TheCenter Of The Antibody Binding Site,”J.Mol.Biol.263:551-567)。
用于实现这类亲和力成熟的方法描述在例如下述文献中：Krause,J.C.等(2011)“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site ArchitectureEnhances Function Of A Human Antibody,”MBio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMBRecombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas,”Int.J.Cancer 10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等(2010)“Stability And CDRComposition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes,”J.Mol.Biol.401(1):84-96；Montgomery,D.L.等(2009)“Affinity Maturation And Characterization Of AHuman Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41,”MAbs 1(5):462-474；Gustchina,E.等(2009)“Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2Loop OfA Monoclonal Fab Derived From A Synthetic
Figure BDA0001616537130000221
Human Antibody Library AndDirected Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set OfFabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth,”Virology 393(1):112-119；Finlay,W.J.等(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized Rat AntibodyFor Anti-RAGE Therapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level OfMutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-DeterminingRegions,”J.Mol.Biol.388(3):541-558；Bostrom,J.等(2009)“Improving AntibodyBinding Affinity And Specificity For Therapeutic Development,”MethodsMol.Biol.525:353-376；Steidl,S.等(2008)“In Vitro Affinity Maturation Of HumanGM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification,”Mol.Immunol.46(1):135-144；和Barderas,R.等(2008)“Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In SilicoModeling,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105(26):9029-9034。
术语“转基因的非人动物”指这样的非人类动物，其基因组包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或非整合到动物天然基因组DNA中)，且其能够表达全人抗体。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因以及人重链转基因或人重链转染色体，以便当用Tau抗原和/或表达Tau的细胞对小鼠免疫时，小鼠产生人抗-Tau抗体。人重链转基因可整合到小鼠的染色体DNA中，对于转基因小鼠也是如此，例如HuMAb小鼠，比如HCo7或HCol2小鼠，或者人重链转基因可保持在染色体外，对于PCT公开WO 02/43478中所描述的转染色体KM小鼠也是如此。这样的转基因的和转染色体的小鼠(本文统称为“转基因小鼠”)，通过经历V-D-J重组和同种型转换，能够针对给定的抗原产生多种人单克隆抗体的同种型(比如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。
由于它们的特异性，本发明的基于抗体的分子作为Tau成像探针的用途具有很大的潜能。由于血脑屏障的总体的不渗透性，已经发现较小的单链可变抗体片段(scFv分子)作为体内成像配体以检测Tau病变是优选的。scFv分子作为抗体的重(H)链结构域和轻(L)链结构域的可变区(彼此通过大约10到大约25个氨基酸残基的短的连接体肽相连)的融合蛋白而形成。为了柔性，连接体通常富含甘氨酸(例如，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:2)(Fisher,A.等(2009)“Efficient Isolation Of Soluble Intracellular Single-ChainAntibodies Using The Twin-Arginine Translocation Machinery,”J.Nol.Biol.385(1):299-311；Bird,R.E.等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science242:423-426；Huston,J.S.等(1988)“Protein Engineering Of Antibody BindingSites:Recovery Of Specific Activity In An Anti-Digoxin Single-Chain FvAnalogue Produced In Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:5879-5883)，以及为了溶解性，连接体富含丝氨酸或苏氨酸，且可将重链可变结构域的N-末端与轻链可变结构域的C-末端连接，反之也可(Huang,L.等(2013)“Single-Chain FragmentVariable Passive Immunotherapies For Neurodegenerative Diseases,”Int.J.Mol.Sci.14(9):19109-19127；Ahmad,Z.A.等(2012)“scFv Antibody:PrinciplesAnd Clinical Application,”Clin.Dev.Immunol.2012:980250；Huhalov,A.等(2004)“Engineered Single Chain Antibody Fragments For Radioimmunotherapy,”Q.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 48(4):279-288)。这样的连接体的实例是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:3)(Whitlow,M.等(1993)“An Improved Linker ForSingle-Chain Fv With Reduced Aggregation And Enhanced Proteolytic Stability,”Protein Eng.6:989–995)。本发明特别优选的连接体具有氨基酸序列(SEQ ID NO:4):SSGGGGSGGGGGGSSRSS。
为了有助于纯化和/或回收，scFv可包括多组氨酸(poly histidine)(“His-标签(His-Tag)”)(例如(SEQ ID NO:5)HHHHHH)。His-标签的组氨酸残基的咪唑侧链可以以可逆的配位键与某些过度金属离子，比如Co2+、Zn2+，特别是Ni+2，接合。因此，当His-标识的scFv分子被应用至包含这样的金属离子的基质时，它们特异性地结合至基质，而大部分未标识的蛋白不这样做。scFv可另外地或可选地包括“HA-标签”，比如(SEQ ID NO:6)GAYPYDVPDYAS。人流感血凝素(HA)是人病毒的感染性所需要的表面糖蛋白。HA-标签源于人流感血凝素(HA)表面糖蛋白，并且允许使用抗HA-标签抗体(微孔过滤器(Millipore))检测scFv。
scFv分子可直接地被表达或作为连接至N末端前导肽的融合蛋白表达，该前导肽可被切割以便产生scFv(见，例如，Huston,J.S.等(1988)“Protein Engineering OfAntibody Binding Sites:Recovery Of Specific Activity In An Anti-DigoxinSingle-Chain Fv Analogue Produced In Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:5879-5883)。例如，scFv可与改性的trp LE前导肽(MLE))融合，并且被Asp-Pro肽键的酸切割而切割开(Piszkiewicz,D.等(1970)“Anomalous Cleavage Of Aspartyl-Proline Peptide Bonds During Amino Acid Sequence Determinations,”Biochem.Biophys.Res.Commun.40(5):1173-1178；Fraser,K.J.等(1972)“SpecificCleavage Between Variable And Constant Domains Of Rabbit Antibody LightChains By Dilute Acid Hydrolysis,”Biochemistry11(26):4974-4977；Poulsen,K.等(1972)“An Active Derivative Of Rabbit Antibody Light Chain Composed Of TheConstant And The Variable Domains Held Together Only By A Native DisulfideBond,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)69(9):2495-2499)。
在进一步的实施方式中，scFv可被连接至另外的scFv(其可为相同的或不同的)以形成二价分子。这可通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链完成，产生串联的scFv分子(Xiong,C.-Y.等(2006)“Development Of Tumor Targeting Anti-MUC-1 Multimer:Effects Of di-scFv Unpaired Cysteine Location On PEGylation And TumorBinding,”Protein Engineering Design and Selection 19(8):359-367；Kufer,P.等(2004)“A Revival Of Bispecific Antibodies,”Trends in Biotechnology 22(5):238-24)。可选地，通过形成重链可变结构域与其轻链可变结构域通过连接体而分开的scFv，所述连接体太短以至于不允许这样的结构域彼此复合(complex)以及形成表位-结合位点，可以迫使两个scFv分子作为双抗体二聚化(Hollinger,P.等(1993)“Diabodies”:SmallBivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90(14):6444-6448)。已经证明双抗体的解离常数是相应的scFv分子的至多四十分之一，这意味着它们对其靶具有远远更高的亲和力。因此，双抗体药可以相比于其他治疗用抗体少得多的剂量被施用，并且能够在体内高特异性地靶向肿瘤(Adams,G.P.等(1998)“Prolongedin vivo Tumour Retention Of A Human Diabody Targeting The ExtracellularDomain Of Human HER2/neu,”Brit.J.Cancer 77(9):1405-1412)。仍较短的连接体(一个或两个氨基酸)导致三聚体的形成，即所谓的三抗体(triabodies)或三抗体(tribodies)。也已经产生四抗体。它们相比于双抗体，显示与其靶的甚至更高的亲和力(Le Gall,F.等(1999)“Di-,Tri-And Tetrameric Single Chain Fv Antibody Fragments AgainstHuman CD19:Effect Of Valency On Cell Binding,”FEBS Letters 453(1):164-168)。所有这些形式均可包含可变scFv分子，以形成对两种或更多不同表位具有特异性的二聚体、三聚体等等(例如，双特异性双抗体等)(Dincq,S.等(2001)“Expression AndPurification Of Monospecific And Bispecific Recombinant Antibody FragmentsDerived From Antibodies That Block The CD80/CD86-CD28 Costimulatory Pathway,”Protein Express.Purificat.22(1):11-24)。
如上所讨论，神经元纤维缠结(NFT)(其包含高度磷酸化的Tau蛋白质的积聚)的形成是神经变性疾病比如阿尔茨海默病、皮克氏病和进行性核上性麻痹的特征性特点。作为胱天蛋白酶激活的作用，Tau在Asp421(即，在SEQ ID NO:1的残基D421)处的蛋白水解裂解，导致产生截短的Tau，已知其进一步刺激Tau聚合并且加速NFT的发展。因此，这样的切割被认为是与高度磷酸化的Tau积聚相关的若干机制中的一种(见Pedersen,J.T.等(2015)“TauImmunotherapy For Alzheimer’s Disease,”Trends Mol.Med.2015 Apr 3.pii:S1471-4914(15)00058-1,第1-9页；Jarero-Basulto,J.J.等(2013)“Luna Proteolytic CleavageOf Polymeric Tau Protein By Caspase-3:Implications For Alzheimer Disease,”J.Neuropathol.Exp.Neurol.72(12):1145-1161；Mondragón-Rodríguez,S.等(2014)“Phosphorylation Of Tau Protein At Sites Ser(396-404)Is One Of The EarliestEvents In Alzheimer's Disease And Down Syndrome,”Neuropathol.Appl.Neurobiol.40(2):121-135；Lerchundi,R.等(2011)“Tau Cleavage AtD421 By Caspase-3 Is Induced In Neurons And Astrocytes Infected With HerpesSimplex Virus Type 1,”J.Alzheimers Dis.23(3):513-520；Quintanilla,R.A.等(2009)“Caspase-Cleaved Tau Expression Induces Mitochondrial Dysfunction InImmortalized Cortical Neurons:Implications For The Pathogenesis Of AlzheimerDisease,”J.Biol.Chem.284(28):18754-18766；Mondragón-Rodríguez,S.等(2008)“Cleavage And Conformational Changes Of Tau Protein Follow PhosphorylationDuring Alzheimer's Disease,”Int.J.Exp.Pathol.89(2):81-90；Mondragón-Rodríguez,S.等(2008)“Conformational Changes And Cleavage Of Tau In Pick Bodies ParallelThe Early Processing Of Tau Found In Alzheimer Pathology,”Neuropathol.Appl.Neurobiol.34(1):62-75；Guillozet-Bongaarts,A.L.等(2006)“Pseudophosphorylation Of Tau At Serine 422 Inhibits Caspase Cleavage:InVitro Evidence And Implications For Tangle Formation in vivo,”J.Neurochem.97(4):1005-1014；Fasulo,L.等(2005)“Apoptotic Effect Of Caspase-3 Cleaved Tau InHippocampal Neurons And Its Potentiation By Tau FTDP-Mutation N279K,”J.Alzheimers.Dis.7(1):3-13；Guillozet-Bongaarts,A.L.等(2005)“Tau TruncationDuring Neurofibrillary Tangle Evolution In Alzheimer's Disease,”Neurobiol.Aging；26(7):1015-1022；Cho,J.H.等(2004)“Glycogen Synthase Kinase3Beta Induces Caspase-Cleaved Tau Aggregation In Situ,”J.Biol.Chem.279(52):54716-54723；和Berry,R.W.等(2003)“Inhibition Of Tau Polymerization By ItsCarboxy-Terminal Caspase Cleavage Fragment,”Biochemistry 42(27):8325-8331，每一篇参考文献在这里通过引用并以其整体入本文)。
本发明的基于抗体的分子展示对于“截短的Asp421表位”的免疫特异性。尽管包含(SEQ ID NO:1的)的游离Asp421残基的任何免疫原均可用于分离和表征这类抗体，但是优选使用具有对应Tau(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基407-421的氨基酸序列HLSNVSSTGSIDMVD(SEQ ID NO:7)的肽。采用的免疫原可包含该肽，并且优选地被修饰，以包含与钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合的N末端半胱氨酸残基。为了筛选选择性识别游离Asp421残基的抗体，可比较与该免疫原的结合和与不包含游离Asp421残基的肽(比如对应Tau(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基407-423的HLSNVSSTGSIDMVDSP(SEQ ID NO:105))的结合。抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11，抗体5G2A3和抗体5G2G6是展示对于截短的Asp421表位免疫特异性的示意性抗体。
A、抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11、抗体5G2A3和抗体5G2G6
这些努力导致免疫特异性结合至Asp421表位的抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11、抗体5G2A3和抗体5G2G6的分离。抗体1G10D2、抗体5B3C11、抗体5G2A3和抗体5G2G6靶向截短的Asp421表位，并且，如通过ELISA测定的，以高亲和力进行结合。抗体5G2A3以高亲和力(10-9M)结合截短的Asp421表位，如使用Biacore分析测定的。相反，抗体1G11A10以较低的亲和力(10-6M)结合截短的Asp421表位，如使用Biacore分析测定的。在序列分析时发现抗体5G2A3和抗体5G2G6的序列相同。因此，对这类抗体的进一步引用将仅仅指抗体5G2A3。
1、抗体1G10D2
抗体1G10D2的轻链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:8；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000271
因此，抗体1G10D2的轻链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：RSSQSILNSNGNTYLE
因此，抗体1G10D2的轻链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：KVSNRFS
因此，抗体1G10D2的轻链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：FQGSHVPWT
抗体1G10D2的重链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:12；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000272
因此，抗体1G10D2的重链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:13)：DSAMS
因此，抗体1G10D2的重链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:14)：SISTGGATYYPDGLKG
因此，抗体1G10D2的重链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:15)：RGVSSGNLFTY
2、抗体1G11A10
抗体1G11A10的轻链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:16；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000281
因此，抗体1G11A10的轻链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:17)：RSSQSIINSNGNTYLE
因此，抗体1G11A10的轻链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:18)：KVSNRFS
因此，抗体1G11A10的轻链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:19)：FQGSHVPWT
抗体1G11A10的重链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:20；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000282
因此，抗体1G11A10的重链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:21)：SYAMS
因此，抗体1G11A10的重链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:22)：SISSGGQTYSPDSVKG
因此，抗体1G11A10的重链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:23)：RGDPTMTATLFVY
3、抗体5B3C11
有时，相同的杂交瘤细胞可表达多于一种的抗体序列，这可能是由于杂交瘤是非单克隆的或由于重排事件或由于融合伴侣的遗传背景造成的。在该情况下，针对抗体5B3C11鉴定了两个轻链可变结构域：轻链VL1和轻链VL2。
a、抗体5B3C11的轻链VL1
抗体5B3C11的轻链VL1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:24；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000291
因此，抗体5B3C11的轻链VL1可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:25)：RSNQSILHSNGNTYLD
因此，抗体5B3C11的轻链VL1可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:26)：KVSNRFS
因此，抗体5B3C11的轻链VL1可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:27)：FQGSHIPWT
b、抗体5B3C11的轻链VL2
抗体5B3C11的轻链VL2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:28；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000292
因此，抗体5B3C11的轻链VL2可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:29)：RASSSVSSSYLH
因此，抗体5B3C11的轻链VL2可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:30)：STSNLAS
因此，抗体5B3C11的轻链VL2可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:31)：QQYSGYPRT
抗体5B3C11的重链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:32；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000293
因此，抗体5B3C11的重链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:33)：NYALS
因此，抗体5B3C11的重链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:34)：SISSGGNTYYPDSVKG
因此，抗体5B3C11的重链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:35)：RGDTTLITTLFTY
4、抗体5G2A3
抗体5G2A3的轻链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:36；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000301
因此，抗体5G2A3的轻链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:37)：RSSQSILHRNGNTYLD
因此，抗体5G2A3的轻链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:38)：KVSNRFS
因此，抗体5G2A3的轻链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:39)：FQGSHVPWT
抗体5G2A3的重链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:40；CDR以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000302
因此，抗体5G2A3的重链可变结构域CDR1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:41)：SYAMS
因此，抗体5G2A3的重链可变结构域CDR2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:42)：SISSGGNTFYPDTVKG
因此，抗体5G2A3的重链可变结构域CDR3具有氨基酸序列(SEQ ID NO:43)：RGDPNMITTLFGY
B、scFv分子
可由抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3产生scFv分子，其具有与这类抗体相同的轻链和重链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3。外周注射这类scFv分子在转基因Tau疾病小鼠中(而不在野生型或淀粉样蛋白-β斑块小鼠)中产生强的体内脑信号。成像信号与探针和神经元内Tau聚集体的共定位密切相关，并且与内体、自噬体和溶酶体的标记物相关，这表明它们在这些降解途径中的相互作用。源自抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3的scFv分子作为AD和相关Tau疾病的诊断标记物具有巨大潜能。
在优选的实施方式中，这类scFv分子作为融合蛋白被制备，其包含具有氨基酸序列(SEQ ID NO:44)：IQEEFKMKKTAIAIAVALAGFATVAQAA的N末端前导肽部分，和/或C末端序列肽部分。C末端肽部分可包含：抗体恒定结构域，比如(SEQ ID NO:45)：AKTTPPSVTSGQAGQ(Hussein,A.H.等(2007)“Construction and Characterization of Single-ChainVariable Fragment Antibodies Directed against the Bordetella pertussisSurface Adhesins Filamentous Hemagglutinin and Pertactin,”Infect.Immun.75(11):5476-5482)、His标签，比如(SEQ ID NO:5)：HHHHHH)，和/或HA标签，比如(SEQ ID NO:6)：GAYPYDVPDYAS，或其以任何顺序的任何组合或亚组合。优选的C末端肽部分具有氨基酸序列(SEQ ID NO:46)：AKTTPPSVTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS，因此包含(在N末端至C末端方向上)SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
1、由抗体1G10D2产生的scFv分子
由抗体1G10D2产生的示例性scFv分子的完整序列是(SEQ ID NO:47)(CDR残基以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000311
其中氨基酸残基1-112是抗体1G10D2的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQ IDNO:8)，氨基酸残基113-130是连接体的氨基酸残基(SEQ ID NO:4)(以小写斜体显示)，并且氨基酸残基131-249是抗体1G10D2的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQ ID NO:12)。
因此，在优选的实施方式中，这类scFv融合蛋白包含SEQ ID NO:48-56中任意之一的氨基酸序列(其中，ScFv融合物的N末端和/或C末端肽部分以下划线显示)：
SEQ ID NO:48(SEQ ID NO:44和57的融合物)：
Figure BDA0001616537130000321
SEQ ID NO:49(SEQ ID NO:47和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000322
SEQ ID NO:50(SEQ ID NO:47和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000323
SEQ ID NO:51(SEQ ID NO:47和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000324
SEQ ID NO:52(SEQ ID NO:47和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000331
SEQ ID NO:53(SEQ ID NO:44、47和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000332
SEQ ID NO:54(SEQ ID NO:44、47和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000333
SEQ ID NO:55(SEQ ID NO:44、47和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000334
SEQ ID NO:56(SEQ ID NO:44、47和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000335
Figure BDA0001616537130000341
2、由抗体1G11A10产生的scFv分子
由抗体1G11A10产生的示例性scFv分子的完整序列是(SEQ ID NO:57)(CDR残基以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000342
其中氨基酸残基1-112是抗体1G11A10的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQ IDNO:16)，氨基酸残基113-130是连接体的氨基酸残基(SEQ ID NO:4)(以小写斜体显示)，并且氨基酸残基131-250是抗体1G11A10的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQ ID NO:20)。
因此，在优选的实施方式中，这类scFv融合蛋白包括任意SEQ ID NO:58-66的氨基酸序列(其中ScFv融合物的N末端和/或C末端肽部分以下划线显示)：
SEQ ID NO:58(SEQ ID NO:44和57的融合物)：
Figure BDA0001616537130000343
SEQ ID NO:59(SEQ ID NO:57和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000344
Figure BDA0001616537130000351
SEQ ID NO:60(SEQ ID NO:57和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000352
SEQ ID NO:61(SEQ ID NO:57和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000353
SEQ ID NO:62(SEQ ID NO:57和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000354
SEQ ID NO:63(SEQ ID NO:44、57和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000355
SEQ ID NO:64(SEQ ID NO:44、57和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000361
SEQ ID NO:65(SEQ ID NO:44、57和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000362
SEQ ID NO:66(SEQ ID NO:44、57和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000363
3、由抗体5B3C11产生的scFv分子
a、由抗体5B3C11的轻链VL1产生的scFv分子
由抗体5B3C11(使用VL1轻链可变结构域)产生的示例性scFv分子的完整序列是(SEQ ID NO:67)(CDR残基以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000364
Figure BDA0001616537130000371
其中氨基酸残基1-112是抗体5B3C11的VL1轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQ IDNO:28)，氨基酸残基113-130是连接体的氨基酸残基(SEQ ID NO:4)(以小写斜体显示)，并且氨基酸残基131-251是抗体5B3C11的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQ ID NO:32)。
因此，在优选的实施方式中，这类scFv融合蛋白包含SEQ ID NO:68-76中任意之一的氨基酸序列(其中，ScFv融合物的N末端和/或C末端肽部分以下划线显示)：
SEQ ID NO:68(SEQ ID NO:44和67的融合物)：
Figure BDA0001616537130000372
SEQ ID NO:69(SEQ ID NO:67和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000373
SEQ ID NO:70(SEQ ID NO:67和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000374
SEQ ID NO:71(SEQ ID NO:67和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000381
SEQ ID NO:72(SEQ ID NO:67和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000382
SEQ ID NO:73(SEQ ID NO:44、67和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000383
SEQ ID NO:74(SEQ ID NO:44、67和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000384
SEQ ID NO:75(SEQ ID NO:44、67和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000385
Figure BDA0001616537130000391
SEQ ID NO:76(SEQ ID NO:44、67和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000392
b、由抗体5B3C11的轻链VL2产生的scFv分子
由抗体5B3C11(使用VL2轻链可变结构域)产生的示例性scFv分子的完整序列是(SEQ ID NO:77)(CDR残基以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000393
其中氨基酸残基1-108是抗体5B3C11的VL2轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQ IDNO:28)，氨基酸残基109-126是连接体的氨基酸残基(SEQ ID NO:4)(以小写斜体显示)，并且氨基酸残基127-247是抗体5B3C11的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQ ID NO:32)。
因此，在优选的实施方式中，这类scFv融合蛋白包含SEQ ID NO:78-86中任意之一的氨基酸序列(其中ScFv融合物的N末端和/或C末端肽部分以下划线显示)：
SEQ ID NO:78(SEQ ID NO:44和77的融合物)：
Figure BDA0001616537130000394
Figure BDA0001616537130000401
SEQ ID NO:79(SEQ ID NO:77和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000402
SEQ ID NO:80(SEQ ID NO:77和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000403
SEQ ID NO:81(SEQ ID NO:77和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000404
SEQ ID NO:82(SEQ ID NO:77和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000405
SEQ ID NO:83(SEQ ID NO:44、77和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000411
SEQ ID NO:84(SEQ ID NO:44、77和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000412
SEQ ID NO:85(SEQ ID NO:44、77和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000413
SEQ ID NO:86(SEQ ID NO:44、77和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000414
4、由抗体5G2A3产生的scFv分子
由抗体5G2A3(或抗体5G2G6，其具有相同的序列)产生的示例性scFv分子的完整序列是(SEQ ID NO:87)(CDR残基以下划线显示)：
Figure BDA0001616537130000421
其中氨基酸残基1-112是抗体5G2A3的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQ ID NO:36)，氨基酸残基113-130是连接体的氨基酸残基(SEQ ID NO:4)(以小写斜体显示)，并且氨基酸残基131-251是抗体5G2A3的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQ ID NO:40)。
因此，在优选的实施方式中，这类scFv融合蛋白包含SEQ ID NO:96-104中任意之一的氨基酸序列(其中ScFv融合物的N末端和/或C末端肽部分以下划线显示)：
SEQ ID NO:88(SEQ ID NO:44和87的融合物)：
Figure BDA0001616537130000422
SEQ ID NO:89(SEQ ID NO:87和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000423
SEQ ID NO:90(SEQ ID NO:87和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000424
Figure BDA0001616537130000431
SEQ ID NO:91(SEQ ID NO:87和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000432
SEQ ID NO:92(SEQ ID NO:87和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000433
SEQ ID NO:93(SEQ ID NO:44、87和45的融合物)：
Figure BDA0001616537130000434
SEQ ID NO:94(SEQ ID NO:44、87和5的融合物)：
Figure BDA0001616537130000435
Figure BDA0001616537130000441
SEQ ID NO:95(SEQ ID NO:44、87和6的融合物)：
Figure BDA0001616537130000442
SEQ ID NO:96(SEQ ID NO:44、87和46的融合物)：
Figure BDA0001616537130000443
虽然scFv能够经过血脑屏障运输，但是可使用各种辅助的方法以进一步促进这样的运输(Huang,L.等(2013)“Single-Chain Fragment Variable PassiveImmunotherapies For Neurodegenerative Diseases,”Int.J.Mol.Sci.14(9):19109-19127)。通过受体介导的胞吞转运使有限的蛋白和肽的组穿过血脑屏障运输(Hervé,F.等(2008)“CNS Delivery Via Adsorptive Transcytosis,”AAPS J.10(3):455-472)，三个研究最透彻的配体是胰岛素、铁-转铁蛋白(iron-transferrin)和LDL-胆固醇(Bickel,U.等(2001)“Delivery Of Peptides And Proteins Through The Blood-Brain Barrier,”Adv.Drug Deliv.Rev.46:247-279；Tuma,P.L.等(2003)“Transcytosis:CrossingCellular Barriers,”Physiol.Rev.83:871-932)。因此，穿过血脑屏障的scFv的运输可通过将scFv融合至抗体或其表位结合片段来促进，所述抗体或其表位结合片段对于这样的配体的受体(例如，人胰岛素受体(HIR)、转铁蛋白受体(TfR)、低密度脂蛋白受体-相关蛋1(LRP1)和2(LRP2)、无毒白喉毒素受体/肝素结合表皮生长因子样生长因子等)是免疫特异性的。得到的融合蛋白可通过其与受体的结合而穿过血脑屏障被运输(Boado,R.J.等(2010)“IgG-Single-Chain Fv Fusion Protein Therapeutic For Alzheimer’sDisease:Expression In CHO cells And Pharmacokinetics And Brain Delivery InThe Rhesus Monkey,”Biotechnol.Bioeng.105:627–635；Jones,A.R.等(2007)“Blood-Brain Barrier Transport Of Therapeutics Via Receptor-Mediation,”Pharm.Res.24(9):1759-1771；Wang,Y.Y.等(2009)“Receptor-Mediated Therapeutic TransportAcross The Blood-Brain Barrier,”Immunotherapy 1(6):983-993；Lajoie,J.M.等(2015)“Targeting Receptor-Mediated Transport For Delivery Of Biologics AcrossThe Blood-Brain Barrier,”Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.55:613-631；Pardridge,W.M.(2102)“Drug Transport Across The Blood-Brain Barrier,”J.Cereb.Blood FlowMetab.32(11):1959-1972；Bhaskar,S.等(2010)“Multifunctional Nanocarriers ForDiagnostics,Drug Delivery And Targeted Treatment Across Blood-Brain Barrier:Perspectives On Tracking And Neuroimaging,”Part.Fibre.Toxicol.7:3pp.1-25)。
scFv可被扩大以包含多聚阳离子肽，所述多聚阳离子肽促进吸附介导的胞吞转运。合适的多聚阳离子肽包括六亚甲基二胺、腐胺、亚精胺和精胺(Hervé,F.等(2008)“CNSDelivery Via Adsorptive Transcytosis,”AAPS J.10(3):455-472；Kandimalla,K.K.等(2006)“Physiological And Biophysical Factors That Influence Alzheimer’sDisease Amyloid Plaque Targeting Of Native And Putrescine Modified HumanAmyloid Beta40,”J.Pharmacol.Exp.Ther.318:17-25)。通过酰胺化其部分或全部羧基基团(例如，scFv的羧基-末端基团、或谷氨酸或天冬氨酸残基的羧基侧链)的处理，scFv可被扩大，以包含多聚阳离子基团。
可选地，scFv可被扩大，以包含穿透细胞的肽(“CPP”)(Rao,K.S.等(2009)“Targeting Anti-HIV Drugs To The CNS,”Expert Opin.Drug Deliv.6(8):771-784；Mathupala,S.P.等(2009)“Delivery Of Small-Interfering RNA(siRNA)To The Brain,”Expert Opin.Ther.Pat.19(2):137-140；Hervé,F.等(2008)“CNS Delivery ViaAdsorptive Transcytosis,”AAPS J.10(3):455-472)。这样的肽包括HIV-1反式激活转录活化因子(TAT)肽、单纯疱疹病毒1型转录因子(HSV VP-22)肽、触角足突变(antennapedia)和穿膜肽(penetratin)(Wadia,J.S.等(2004)“Transducible TAT-HA Fusogenic PeptideEnhances Escape Of TAT-Fusion Proteins After Lipid Raft Macropinocytosis,”Nat.Med.10:310-315；Richard,J.P.等(2003)“Cell-Penetrating Peptides.AReevaluation Of The Mechanism Of Cellular Uptake,”J.Biol.Chem.278:585-590；Temsamani,J.等(2004)“The Use Of Cell-Penetrating Peptides For Drug Delivery,”Drug Discov.Today 9:1012-1019)。
C、共有CDR序列
对鉴定抗体的CDR进行分析，以便鉴定抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11和/或抗体5G2A3的共有CDR序列和提供与所述抗体的结合性质类似的结合性质的可能的变异的CDR序列。使用Blosum62.iij分析，根据表1计算这类变异的CDR。表1提供了Blosum62.iij取代分数。分数越高取代越保守，因此取代更有可能不影响功能。
本发明允许形成具有1、2、3、4、5或6个变异的CDR的新抗体和抗原-结合片段。由于本发明的方法已经鉴定了大量的不同CDR，因此本发明允许识别在特定的经鉴定的CDR的任何变体中可能必要的CDR残基。这类残基以黑体显示在表5和表6中。对于发现在比较CDR中不同的那些残基，表1的取代分数提供了确定可能取代的身份的手段。例如，如果发现特定CDR的特定残基作为R或S而变化，则因为R和S的取代分数为-1，因此，具有-1或更大取代分数的、针对R或S的任何取代很可能是观察到的变体(R或S)(或比R或S更可能)，以产生变异的CDR，其具有与特定CDR的结合性质足够类似的结合性质，从而允许使用变异的CDR来代替它，以便形成功能抗体或抗原-结合片段。对于每个位置，具有更高取代分数的残基的选择优于具有更低取代分数的残基的选择。
表5呈现了抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11和抗体5G2A3的轻链CDR的分析，并且提供了观察到的本发明公开的抗体的轻链CDR的共有序列。
Figure BDA0001616537130000461
Figure BDA0001616537130000471
表6呈现了抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11和抗体5G2A3的重链CDR的分析，并且提供了观察到的本发明公开的抗体的重链CDR的共有序列。
Figure BDA0001616537130000472
Figure BDA0001616537130000481
因此，除了具有抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3的CDR的抗体和其抗原-结合片段，本发明另外提供了具有含有从这类轻链和/或重链共有CDR序列推导出的氨基酸序列的CDR的抗体和其抗原-结合片段。
虽然scFv能够经过血脑屏障运输，但是可使用各种辅助的方法以进一步促进这样的运输(Huang,L.等(2013)“Single-Chain Fragment Variable PassiveImmunotherapies For Neurodegenerative Diseases,”Int.J.Mol.Sci.14(9):19109-19127)。通过受体介导的胞吞转运使有限的蛋白和肽的组穿过血脑屏障运输(Hervé,F.等(2008)“CNS Delivery Via Adsorptive Transcytosis,”AAPS J.10(3):455-472)，三个研究最透彻的配体是胰岛素、铁-转铁蛋白(iron-transferrin)和LDL-胆固醇(Bickel,U.等(2001)“Delivery Of Peptides And Proteins Through The Blood-Brain Barrier,”Adv.Drug Deliv.Rev.46:247-279；Tuma,P.L.等(2003)“Transcytosis:CrossingCellular Barriers,”Physiol.Rev.83:871-932)。因此，穿过血脑屏障的scFv的运输可通过将scFv融合至抗体或其表位结合片段来促进，所述抗体或其表位结合片段对于这样的配体的受体(例如，人胰岛素受体(HIR)、转铁蛋白受体(TfR)、低密度脂蛋白受体-相关蛋1(LRP1)和2(LRP2)、无毒白喉毒素受体/肝素结合表皮生长因子样生长因子等)是免疫特异性的。得到的融合蛋白可通过其与受体的结合而穿过血脑屏障被运输(Boado,R.J.等(2010)“IgG-Single-Chain Fv Fusion Protein Therapeutic For Alzheimer’sDisease:Expression In CHO cells And Pharmacokinetics And Brain Delivery InThe Rhesus Monkey,”Biotechnol.Bioeng.105:627–635；Jones,A.R.等(2007)“Blood-Brain Barrier Transport Of Therapeutics Via Receptor-Mediation,”Pharm.Res.24(9):1759-1771；Wang,Y.Y.等(2009)“Receptor-Mediated Therapeutic TransportAcross The Blood-Brain Barrier,”Immunotherapy 1(6):983-993；Lajoie,J.M.等(2015)“Targeting Receptor-Mediated Transport For Delivery Of Biologics AcrossThe Blood-Brain Barrier,”Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.55:613-631；Pardridge,W.M.(2102)“Drug Transport Across The Blood-Brain Barrier,”J.Cereb.Blood FlowMetab.32(11):1959-1972；Bhaskar,S.等(2010)“Multifunctional Nanocarriers ForDiagnostics,Drug Delivery And Targeted Treatment Across Blood-Brain Barrier:Perspectives On Tracking And Neuroimaging,”Part.Fibre.Toxicol.7:3pp.1-25)。
scFv可被扩大以包含多聚阳离子肽，所述多聚阳离子肽促进吸附介导的胞吞转运。合适的多聚阳离子肽包括六亚甲基二胺、腐胺、亚精胺和精胺(Hervé,F.等(2008)“CNSDelivery Via Adsorptive Transcytosis,”AAPS J.10(3):455-472；Kandimalla,K.K.等(2006)“Physiological And Biophysical Factors That Influence Alzheimer’sDisease Amyloid Plaque Targeting Of Native And Putrescine Modified HumanAmyloid Beta40,”J.Pharmacol.Exp.Ther.318:17-25)。通过酰胺化其部分或全部羧基基团(例如，scFv的羧基-末端基团、或谷氨酸或天冬氨酸残基的羧基侧链)的处理，scFv可被扩大，以包含多聚阳离子基团。
可选地，scFv可被扩大，以包含穿透细胞的肽(“CPP”)(Rao,K.S.等(2009)“Targeting Anti-HIV Drugs To The CNS,”Expert Opin.Drug Deliv.6(8):771-784；Mathupala,S.P.等(2009)“Delivery Of Small-Interfering RNA(siRNA)To The Brain,”Expert Opin.Ther.Pat.19(2):137-140；Hervé,F.等(2008)“CNS Delivery ViaAdsorptive Transcytosis,”AAPS J.10(3):455-472)。这样的肽包括HIV-1反式激活转录活化因子(TAT)肽、单纯疱疹病毒1型转录因子(HSV VP-22)肽、触角足突变(antennapedia)和穿膜肽(penetratin)(Wadia,J.S.等(2004)“Transducible TAT-HA Fusogenic PeptideEnhances Escape Of TAT-Fusion Proteins After Lipid Raft Macropinocytosis,”Nat.Med.10:310-315；Richard,J.P.等(2003)“Cell-Penetrating Peptides.AReevaluation Of The Mechanism Of Cellular Uptake,”J.Biol.Chem.278:585-590；Temsamani,J.等(2004)“The Use Of Cell-Penetrating Peptides For Drug Delivery,”Drug Discov.Today 9:1012-1019)。
III、本发明的抗体和抗体片段的用途
本发明涉及对于Asp421表位免疫特异性的、基于抗体的分子诊断和/或治疗受试者患者中阿尔茨海默病或Tau疾病的用途。就这类诊断用途而言，这类用途可涉及使用，例如，抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3，或其Asp421表位-结合片段(特别是其scFv片段)，其优选地已经被可检测地标记(这类分子在本文统称为本发明的诊断分子)，检测受试者(即，体内)中病理Tau构象异构体的存在。可选地，这类用途可涉及使用本发明的诊断分子离体(例如，在活组织检查样品，或死后)检测病理Tau构象异构体的存在。
在一个实施方式中，本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子可以是人源化抗体。
就本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子的治疗用途而言，这类用途可涉及向患者施用治疗有效量的这类基于抗体的分子(例如，抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11，抗体5G2A3或抗体5G2G6，更具体而言，其scFv片段)，所述患者具有阿尔茨海默病或这类Tau疾病的一个或多个症状，因此需要这类疗法，或这类用途可涉及向患者施用预防有效量的这类基于抗体的分子，所述患者不展示这类症状，或展示指示初期阿尔茨海默病或Tau疾病的轻微痴呆或Tau疾病前的症状，这类分子在本文统称为本发明的治疗分子。
本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子可联合对于Asp421表位之外的表位具有免疫特异性的抗体和基于抗体的分子一起用于诊断和/或治疗目的。
IV、本发明的Tau-结合分子的产生
本发明的Tau-结合分子优选地经编码其组成多肽链的核酸分子的重组表达而产生。因此，本发明因此也涉及编码本发明的抗体或其片段的这样的一条或多条多肽链的表达载体。
在本发明的上下文中，表达载体可为任何合适的DNA或RNA载体，包括染色体的、非染色体的和合成核酸载体(包含合适的表达调控元件的组的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方式中，编码抗-Tau抗体的核酸包含在含有例如线性表达元件的裸DNA或RNA载体(例如，如在Sykes和Johnston,Nat Biotech12,355-59(1997)中所描述的)、压缩核酸载体(例如，如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所描述的)、质粒载体，比如pBR322、pUC19/18或pUC 118/119、“蠓(midge)”最小尺寸核酸载体(例如，如在Schakowski等,MoI Ther 3,793-800(2001)中所描述的)中，或作为沉淀(precipitated)核酸载体构建体，比如，CaP04-沉淀构建体(例如，如下面文献中所描述的：WO 00/46147；Benvenisty和Reshef,PNAS USA 83,9551-55(1986)；Wigler等Cell 14,725(1978)；以及Coraro and Pearson,Somatic Cell Genetics 2,603(1981))。这样的核酸载体和其用途是本领域所熟知的(见例如，US 5,589,466和US 55,973,972)。
在一个实施方式中，载体适于在细菌细胞中表达本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子。这类载体的例子包括表达载体，比如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem 264,5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison,WI)等)。表达载体也可以是或可选地是适于在酵母系统中表达这类基于抗体的分子的载体。可使用适于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子比如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(在以下中评述：F.Ausubel等编辑,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience NewYork(1987)；和Grant等,Methods in Enzymol 153，516-544(1987))。
在本发明的表达载体中，编码本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子的核酸分子可包含任何合适的启动子、增强子和其他促进表达的元件，或与任何合适的启动子、增强子和其他促进表达的元件连接。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)，有效的多聚腺甘终止序列、在大肠埃希氏菌(E.coli)中的质粒产物的复制的起点、作为选择标记物的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如，多连接体)。核酸也可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，比如CMV IE(技术人员将认识到，这类术语实际上是对于某些条件下基因表达程度的描述符号)。
在甚至进一步方面中，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞，比如转染瘤，其产生本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子。宿主细胞的例子包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，比如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施方式中，本发明提供的细胞包含稳定整合至细胞基因组中的核酸，其包含用于编码表达本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子的序列。在另一实施方式中，本发明提供细胞包含非整合核酸，比如质粒、黏粒、噬菌粒，或线性表达元件，其包含编码用于表达本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子的序列。
在进一步的方面中，本发明涉及产生本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子的方法，所述方法包括下述步骤：a)培养如本文上述的本发明的杂交瘤或宿主细胞，和b)从培养基纯化本发明的抗体。
一般而言，可通过包含任何适当数量的修饰的氨基酸和/或与这类缀合的取代基结合来修饰本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子。在这样的情况中，通常通过至少实质上保持与非衍生化亲本抗Tau抗体相关的、对于Asp421表位的免疫特异性的能力来确定合适性。一个或多个修饰的氨基酸的存在在以下方面可以是有利的：例如延长多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或提高多肽储存稳定性。氨基酸在重组产生过程中，经例如共翻译或后翻译被修饰(例如，在哺乳动物细胞中表达过程中，在N-X-S/T基序的N-连接的糖基化)或通过合成方法被修饰。修饰氨基酸的非限制性实例包括糖基化氨基酸、含硫氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼化(farnesylated)、牻牛儿基牻牛儿基化(geranylgeranylated))氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、PEG化(PEGylated)氨基酸、生物素化(biotinylated)氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等等。足以指导本领域技术人员修饰氨基酸的参考文献遍布整个文献。示例性的方案可见于Walker(1998)Protein Protocols On CD-Rom,HumanaPress,Totowa,NJ。修饰的氨基酸可选自，例如，糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸或与有机衍生剂缀合的氨基酸。
如上所述，当需要延长施用的本发明的治疗分子的半衰期时，可使这样的分子形成为包含碳水化合物部分，比如聚氧乙烯化多元醇或聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在大约1,000和大约40,000之间，比如在大约2,000和大约20,000之间，例如，大约3,000-12,000g/mol之间的PEG)(Moosmann,A.等(2014)“Purification Of PEGylated Proteins,With TheExample Of PEGylated Lysozyme and PEGylated scFv,”Methods Mol.Biol.1129:527-538；Jevsevar,S.等(2010)“PEGylation Of Therapeutic Proteins,”Biotechnol.J.5:113-228)，或通过糖基化或通过添加或结合蛋白质，比如人血清白蛋白形成这样的分子(Müller,M.R.等(2012)“Improving The Pharmacokinetic Properties Of Biologics ByFusion To An Anti-HSA Shark VNAR Domain,”MAbs.4(6):673-685；Stork,R.等(2008)“N-Glycosylation As Novel Strategy To Improve Pharmacokinetic Properties OfBispecific Single-Chain Diabodies,”J.Biol.Chem.283:7804-7812；Alt,M.等(1999)“Novel Tetravalent And Bispecific IgG-like Antibody Molecules CombiningSingle-Chain Diabodies With The Immunoglobulin Gamma1Fc or CH3 Region,”FEBSLett.454:90-94；Peters T.等(1985)“Serum Albumin,”Adv.Protein Chem.37:161-245)。示例性的聚合物和将其连接至多肽的方法是已知的(见，例如，美国专利号4,766,106、4,179,337、4,495,285和4,609,546)。
V、本发明的药物组合物
本发明的基于Asp421表位特异性的抗体的分子有利地作为药物组合物被施用，所述药物组合物包含活性治疗剂和各种其他药学上可接受的组分中的一种或多种。见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第21版)(2005)(Troy,D.B.等(编辑)Lippincott Williams&Wilkins(Publs.),Baltimore MD)，其通过引用并以其整体入本文。优选的形式取决于意图的施用模式和治疗应用。取决于期望的制剂，组合物也可包括药学上可接受的、非毒性载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、清洁剂(例如非离子清洁剂，比如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如糖或无蛋白质的氨基酸(protein-free aminoacids))、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或其他材料，所述其他材料是适合包含到药物组合物中的，并且其为通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、磷酸盐-缓冲生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank’s溶液。另外，药物组合物或制剂也可包括其他载体、或非毒性、非治疗性、非免疫源性稳定剂等等。可在本发明的药物组合物中采用的合适的水性的和非水性的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其合适的混合物、植物油，比如橄榄油、玉米油、花生油、棉花籽油和芝麻油、羧甲基纤维素胶体溶液、西黄芪胶和可注射的有机酯，比如油酸乙酯和/或各种缓冲剂。其他的载体在药物学领域是熟知的。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。对于药学上的活性物质，这样的介质和药剂的用途在本领域是已知的。除非目前与活性化合物不相容的任何传统的介质或药剂，考虑其在本发明药物组合物中的用途。
组合物也可包括大的、缓慢代谢的大分子，比如蛋白质、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳胶官能化的琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素等等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。基于对本发明选择的化合物或药物组合物针对抗原结合的期望生物学性质没有显著消极影响(例如，少于实质影响(例如，10％或更少的相对抑制、5％或更少的相对抑制等等))，确定药物组合物的载体和其他组分的适合性。
本发明的药物组合物也可包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水可溶性的抗氧化剂，比如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油-可溶性的抗氧化剂，比如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，比如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
本发明的药物组合物也可在组合物中包含等渗剂(isotonicity agents)，比如糖、多元醇，比如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物也可包含一种或多种适于选择的施用途径的佐剂，比如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高药物组合物的保存期或有效性。本发明的化合物可与保护化合物避免快速释放的载体一起制备，比如控释制剂，包括植入物(implant)、透皮贴片和微胶囊化递送系统。这样的载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、可生物降解的、生物相容的聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸，胶原、聚原酸酯和聚乳酸，单独地或同蜡或其他本领域熟知的材料一起。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员所知悉的。见例如，Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在一个实施方式中，本发明的化合物可被配制以保证在体内适当地分布。用于肠胃外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。对于药学上的活性物质，这样的介质和药剂的用途是本领域已知的。除非目前与活性化合物不相容的任何传统的介质或药剂，考虑其在本发明药物组合物中的用途。补充性的活性化合物也可包含在组合物中。
用于注射的药物组合物通常在制造和储存条件下必须为无菌和稳定的。组合物可作为溶液、微乳剂、脂质体、或适合高药物浓度的其他有序结构(ordered structure)被配制。载体可为水性溶剂或非水性溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其合适的混合物、植物油，比如橄榄油和可注射的有机酯，比如油酸乙酯。例如，通过使用涂层比如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持要求的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂(isotonic agents)，例如，糖、多元醇，比如甘油、甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂来实现可注射的组合物的延长的吸收，所述延迟吸收的药剂例如，单硬脂酸盐和明胶。可通过在合适的溶剂中掺入需要量的活性化合物与一种例如如上面列举的成分或成分的组合(如需要)，然后进行杀菌微滤，来制备无菌可注射溶液。通常，通过在无菌媒介中掺入活性化合物制备分散体，所述无菌媒介包含基本分散介质和需要的其他成分，比如来自上面列举的那些的成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其之前的无菌-过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
可通过在合适的溶剂中掺入需要量的活性化合物与一种如上面列举的成分或成分的组合(如需要)，然后进行杀菌微滤，来制备无菌可注射溶液。通常，通过在无菌媒介中掺入活性化合物制备分散体，所述无菌媒介包含基本分散介质和来自上面列举的所需的其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其之前的无菌-过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
对于肠胃外施用，本发明的药剂通常与药物载体一起在生理学上可接受的稀释剂中被配制为物质的可注射剂量的溶液或悬夜，所述药物载体可为无菌液体，比如水、油、盐水、甘油或乙醇。另外，助剂(auxiliary substances)，比如润湿或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等等可在组合物中存在。药物组合物的其他组分是石油来源，动物来源、植物来源或合成来源那些组分。花生油、大豆油和矿物油都是有用的材料的实例。一般而言，乙二醇，比如丙二醇或聚乙二醇，是优选的液体载体，尤其对于可注射溶液来说。本发明的药剂可以储库(depot)注射剂或植入物制剂的形式施用，所述注射剂或制剂可以以允许活性成分缓释的这样的方式被配制。示例性的组合物包括大约5mg/mL的scFv，其在水性缓冲溶液中被配制，所述缓冲溶液由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成，用HCl调节至pH 6.0。
典型地，组合物因此被制备为可注射的，作为液体溶液或悬夜；也可制备在注射前适合溶解或悬浮在液体媒介中的固体形式。制剂也可在脂质体或微粒，比如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物，中被乳化或胶囊化，以增强佐剂效果(Langer,等Science 249:1527(1990)；Hanes,等Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119(1997)，其通过引用以其整体并入本文)。适合其他施用模式的另外的制剂包括口服制剂、鼻内制剂和肺部制剂、栓剂和经皮肤应用。
VI、本发明的药物组合物的施用
本发明的分子可经肠胃外、局部、口服或鼻内途径施用，用于预防性和/或治疗性治疗。肌肉注射(例如，注射到手臂或腿肌肉中)和静脉内输注是本发明的分子的优选的施用方法。在一些方法中，这样的分子作为缓释组合物或设备施用，所述设备比如MedipadTM设备(Elan Pharm.Technologies,都柏林,爱尔兰)。在一些方法中，本发明的分子被直接注射到已经积累沉积物的特定的组织中，例如颅内注射。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物经肠胃外施用。如本文所用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”表示肠和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，包括表皮、静脉内、肌肉、动脉内、鞘内、囊内、颅内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内(intratendinous)、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下的、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射、皮下和输注。在一个实施方式中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注来施用。
在预防性应用中，药物组合物或药物被施用至易患阿尔茨海默病的患者，或有阿尔茨海默病风险的患者，施用的量足以消除或降低风险、减少严重性或延迟疾病发作，所述疾病包括疾病的生化症状，组织学症状和/或行为症状，在疾病的发展过程中存在的其并发症和中间的病理表型。
在治疗应用中(例如，在涉及已经被诊断为患有阿尔茨海默病或其他tau疾病的患者的应用中)，本发明的治疗分子被施用至这样的患者，施用的量足以治愈、治疗或至少部分抑制疾病的症状(如生化评估、组织学评估和/或行为评估所证明的)，所述症状包括在疾病的发展过程中其并发症和中间的病理表型。在一些实施方式中，施用本发明的治疗分子降低或消除在还未发展特征性阿尔茨海默病理的患者中的轻微认知损伤。
本发明提供的治疗分子用于治疗上述病况的有效剂量可随着许多不同的因素而变化，所述因素包括施用方法、靶位点、患者的生理状态、施用的其他药品以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量通常被滴定(titrated)以最优化其安全和效力。在给予剂量的任何给定日，剂量范围可为约0.0001mg/kg至约100mg/kg(更通常约0.01mg/kg至约10mg/kg)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1mg/kg-10mg/kg体重的范围内。因此，示例性剂量包括约0.1mg/kg/体重至约10mg/kg/体重、约0.1mg/kg/体重至约5mg/kg/体重、约0.1mg/kg/体重至约2mg/kg/体重、约0.1mg/kg/体重至约1mg/kg/体重，例如约0.15mg/kg/体重、约0.2mg/kg/体重、约0.5mg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约1.5mg/kg/体重、约2mg/kg/体重、约5mg/kg/体重，或约10mg/kg/体重。
具有本领域普通技术的医生或兽医可容易地确定或指定需要的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可从在药物组合物中采用低于达到期望的治疗效果所需要的水平的抗-Tau抗体或片段的剂量开始，然后逐渐增加剂量，直到达到期望的效果。总的来说，本发明组合物的合适的每日剂量是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这样的有效剂量通常取决于上面描述的因素。施用可为例如静脉内、肌肉、腹膜内或皮下施用，例如靠近靶位点施用。如需要，药物组合物的有效的每日剂量可以两个、三个、四个、五个、六个或更多个的亚剂量(sub-doses)在全天以合适的间隔分别施用，任选地，以单位剂量形式施用。虽然单独施用本发明的化合物是可能的，但优选以上面所描述的药物组合物来施用化合物。
示例的治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6月施用一次。在一些方法中，一种、两种或更多种抗体(或其表位结合片段)将与本发明的治疗分子的施用结合施用，在这种情况下，每种这样的施用分子的剂量落入所描述的范围内。
施用的剂量和频率，可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长的时间段内，以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高的剂量，直到疾病的发展被减轻或终止为止，以及优选地，直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可使用预防性给药方案向患者施用这样的治疗分子。
为了治疗目的，本发明的分子通常在多个时机被施用。在单次剂量(例如，大丸药或输注)之间的间隔可为每周一次、每月一次或每年一次。在一些方法中，剂量被调整，以实现1-1000μg/mL的血浆浓度，以及在一些方法中，实现25-300μg/mL的血浆浓度。可选地，本发明的治疗分子可作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。总的来说，人抗体显示最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。scFv分子通常有短的血清半衰期。
本发明的另一方面是联合疗法，其中识别Tau蛋白质或其免疫源性表位的另外的抗体或其表位结合片段，联合本发明的治疗分子被施用。在促淀粉样变性(amyloidogenic)疾病，比如阿尔茨海默病和唐氏综合症的情况下，清除淀粉状蛋白-β(Aβ)沉积的免疫调节是新兴疗法。靶向Aβ的免疫疗法持续导致认知改善。很可能Tau和Aβ病理是协同作用的。因此，同时把两种病理的清除都作为目标的联合疗法，相较于把每种病理单独作为目标更有效。在帕金森疾病和相关神经变性疾病的情况中，清除α-突触核蛋白蛋白质的聚集形式的免疫调节也是新兴疗法。同时把Tau和α-突触核蛋白蛋白质的清除作为目标的联合疗法可以比把每个单独作为目标更有效。
VII、本发明的Tau-结合分子的用途
A、诊断用途
使用本发明的基于Asp421表位特异性抗体的诊断分子检测受试者中病理Tau构象异构体的存在可通过如下方式实现：从受试者获得生物样品(例如，血液、尿、脑脊液)；使生物样品与所述诊断抗体接触；和检测诊断分子与来自受试者样品的病理Tau蛋白质构象异构体的结合。用于在生物样品中进行病理Tau蛋白的检测的测定可容易地改造成检测本发明的诊断分子，这在本领域是熟知的，其包括但不限于，ELISA、免疫组织化学、蛋白质印迹等。
可选地，使用本发明的基于Asp421表位特异性抗体的诊断分子检测受试者中病理Tau蛋白质构象异构体的存在，可使用体内成像技术实现。体内成像涉及向受试者施用具有对病理Tau肽的抗原特异性的诊断抗体，并且检测诊断抗体试剂在体内与病理Tau蛋白构象异构体的结合。
本发明的基于Asp421表位特异性抗体的诊断分子可通过注射(例如，静脉内注射、颈动脉内注射等)施用至患者体内，或通过颅内注射直接施用至脑中。这类分子的剂量应为约0.0001mg/kg至约100mg/kg(更通常为约0.01mg/kg至约5mg/kg)的宿主体重。例如，剂量可以是约1mg/kg体重或约10mg/kg体重或在约1-10mg/kg的范围内。
典型地，本发明的基于Asp421表位特异性抗体的诊断分子被标记，虽然在一些方法中，分子可为未标记的，并且二级标记剂被用于与这样的分子结合(使用在本领域已知的技术，与分子直接连接或缀合，或通过中间体(比如，例如，本领域已知的连接体)与分子间接连接或缀合)。标记的选择取决于检测的手段。例如，荧光标记(比如，稀土螯合物(例如铕螯合物))、荧光素(fluorescein)-型标记(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素)、若丹明型标记(例如ALEXA
Figure BDA0001616537130000591
568(Invitrogen)、
Figure BDA0001616537130000592
或丹磺酰氯(dansyl chloride))、VIVOTAG680XLFLUOROCHROMETM(Perkin Elmer)、藻红素、7-羟基香豆素、丽丝胺(Lissamine)、花菁、藻红素、德克萨斯红(Texas Red)、BODIPY
Figure BDA0001616537130000593
(Invitrogen)或其类似物，是适合光学检测的。可采用化学发光标记(例如，鲁米诺(luminol)、荧光素酶、虫荧光素(luciferin)和水母发光蛋白)。这样的诊断和检测也可通过将本发明的诊断分子与可检测的物质连接来完成，所述可检测的物质包括但不限于：各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶，或通过将其与辅基复合物(prosthetic groupcomplexes)连接来完成，所述辅基复合物比如，但不限于：链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。也可采用顺磁标记和放射性同位素标记，其优选地使用正电子放射断层成像术(Positron Emission Tomography)(PET)或单光子计算机断层成像术(Single-PhotonEmission Computed Tomography)(SPECT)被检测。放射性标记包括但不限于，铋(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、铬(51Cr)、钴(57Co、60Co)、铜(64Cu)、镝(165Dy)、铒(169Er)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、金(198Au)、钬(166Ho)、氢(3H)、铟(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、124I、125I、131I)、铱(192Ir)、铁(59Fe)、氪(81mKr)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、钯(103Pd)、磷(32P)、钾(42K)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、铷(81Rb、82Rb)、钌(82Ru、97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、钠(24Na)、锶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Tl)、锡(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb、177Yb)、钇(90Y)和锌(65Zn)和锆(89Zr)；使用各种正电子放射断层成像术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子(比如，顺磁性铝(Al)离子、钡(Ba)离子、钙(Ca)离子、铈(Ce)离子、镝(Dy)离子、铒(Er)离子、铕(Eu)离子、钆(Gd)离子、钬(Ho)离子、铱(Ir)离子、锂(Li)离子、镁(Mg)离子、锰(Mn)离子，钼(M)离子、钕(Nd)离子、锇(Os)离子、氧(O)离子、钯(Pd)离子、铂(Pt)离子、铑(Rh)离子、钌(Ru)离子、钐(Sm)离子、钠(Na)离子、锶(Sr)离子、铽(Tb)离子、铥(Tm)离子、锡(Sn)离子、钛(Ti)离子、钨(W)离子和锆(Zr)离子，尤其是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+和V+4)。制备放射性标记的氨基酸和相关的肽衍生物的方法在本领域是已知的(见例如，Junghans等，在以下中：Cancer Chemotherapy andBiotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo，编辑，Lippincott Raven(1996))和美国专利号4,681,581；4,735,210；5,101,827；5,102,990；RE 35,500；5,648,471和5,697,902。例如，可通过氯胺T法缀合放射性同位素(Lindegren,S.等(1998)“Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate,”Nucl.Med.Biol.25(7):659-665；Kurth,M.等(1993)“Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated PhenethylamineDerivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased RadioactivityLocalization In Tumor,”J.Med.Chem.36(9):1255-1261；Rea,D.W.等(1990)“Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors,”Cancer Res.50(3Suppl):857s-861s)。
通过将在受试者中或来自受试者的样品中的标记的病理Tau构象异构体、Tau聚集体和/或神经元纤维缠结的数目、大小和/或强度与相应的基线值比较，来进行诊断。基线值可代表在非患病个体的群体中的平均水平。基线值也可代表相同受试者中测定的之前的水平。
上面描述的诊断方法也可用于监控受试者对治疗的应答。在该实施方式中，在治疗开始前，确定病理Tau在受试者中的存在的检测。在该时间点，病理Tau在受试者中的水平被用作基线值。在治疗过程中的各种时间点，重复病理Tau蛋白构象异构体、Tau聚集体和/或神经元纤维缠结的检测，然后，将测量值与基线值比较。相对于基线的值的减小，表示对治疗的积极应答。随着从脑中清除病理Tau，值也可在生物流体中临时增加。
本发明进一步涉及用于进行上述诊断和监控方法的试剂盒。典型地，这样的试剂盒包含本发明的诊断抗体。试剂盒也可包含可检测标记。诊断抗体本身可包含可检测标记(例如，荧光分子、生物素等等)，其是直接可检测的或经二级反应(例如与链酶抗生物素的反应)可检测的。可选地，可应用包含可检测标记的第二剂，其中所述第二剂对于一级抗体有结合特异性。在适合用于测量生物样品中的病理Tau蛋白质诊断试剂盒中，试剂盒的抗体可以预结合(pre-bound)至固相，比如预结合至微量滴定盘(microtiterdish)的孔被提供。
为诊断的目的，可体内检测标记的抗-Tau抗体或其Tau-结合片段的存在。在一个实施方式中，这样的诊断包括：a)向受试者施用有效量的这样的标记分子；b)在施用后等待一段时间间隔，以允许标记的分子集中在聚集的Tau的位点(如果有)，并且允许未结合的标记分子被清除至背景水平；c)测定背景水平；和d)检测受试者中的这样的标记的分子，这样超过背景水平的标记的分子的检测指示受试者有tau疾病或指示这样的tau疾病的严重性。根据这样的实施方式，抗体被标记以适合使用本领域技术人员已知的具体成像系统检测的成像部分。背景水平可通过各种本领域已知的各种方法测定，所述方法包括比较检测的标记分子的量与之前针对特定成像系统确定的标准值。可用在本发明的诊断方法中的方法和系统包括但不限于：计算机断层成像术(CT)、全身扫描，比如正电子放射断层成像术(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波扫描术。
B、治疗性用途
如上所述，本发明的一个方面涉及预防或治疗受试者中的阿尔茨海默病或其他tau疾病的方法，其通过施用有效量的本发明的基于Asp412表位特异性的抗体的分子(尤其是1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3或其scFv片段)，以有效量预防或治疗这样的阿尔茨海默病或其他tau疾病。可提供这样的施用，以促进从受试者的脑清除Tau聚集体，或提供这样的施用，以减缓受试者中的缠结相关的行为表型。另外，这样的施用可预防性地提供，以延迟、阻碍、减弱或预防阿尔茨海默病或与神经元纤维缠结相关的其他tau疾病的发作
如本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指改善、减缓或逆转疾病或病症的发展或严重性，或改善、减缓或逆转这样的疾病或病症的一种或多种症状或副作用。为本发明的目的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”还指用于获得有益或期望的临床结果的方法，其中“有益或期望的临床结果”包括，但不限于：减轻症状、减小病症或疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病或病症状态、延迟或减缓疾病或病症状态的发展、改善或缓和疾病或病症状态、以及缓解疾病或病症，无论部分的还是全部的，可检测的还是不可检测的。
当用于本发明的抗体时，“有效量”是指，以剂量和在需要的时间段足以实现预期的生物效果或期望的治疗结果的量，所述预期生物效果或期望的治疗结果包括但不限于临床结果。当用于本发明的抗体时，短语“治疗有效量”旨在表示这样的抗体的量：所述抗体的量足以改善、缓和、稳定、逆转、减缓或延迟病症或疾病状态的发展，或病症或疾病症状的发展。在实施方式中，本发明的方法使抗体与其他化合物联合施用。在这样的情况下，“有效量”是足以引起预期的生物效果的联合的量。
足以实现治疗性治疗或预防性治疗的量分别被定义为治疗有效剂量或预防有效剂量。在预防性方案和治疗性方案两者中，通常以若干剂量施用药剂，直到实现充分的免疫应答。典型地，监控免疫应答，并且，如果免疫应答开始衰落，则给予重复剂量。这样的抗体或其表位结片段的治疗有效剂量或预防有效剂量可根据因素而变化，所述因素比如疾病状态、年龄、性别和个体重量，以及分子在受试者中引发期望的应答的能力。治疗有效量也是这样的一种量：其中，有益治疗效果超过任何抗体或抗体部分的有毒的或有害的效果。
服从治疗的患者包括患有阿尔茨海默病或患有这类其他tau疾病的个体，所述个体显示这类病况的公认的临床症状或适应症，以及包括目前没有显示这类病况的症状的患者。虽然阿尔茨海默病仅在死后活组织检查中被确认诊断，但临床上使用“阿尔茨海默病和相关病症协会(“ADRDA”)标准诊断患有阿尔茨海默病的个体(Carrillo,M.C.等(2013)“Revisiting The Framework Of The National Institute On Aging-Alzheimer’sAssociation Diagnostic Criteria,”Alzheimers Dement.9(5):594-601；Budson,A.E.等(2012)“New Criteria For Alzheimer Disease And Mild Cognitive Impairment:Implications For The Practicing Clinician,”Neurologist 18(6):356-363；Sarazin,M.等(2012)“Clinical And Research Diagnostic Criteria For Alzheimer’sDisease,”Neuroimaging Clin.N.Amer.22(1):23-32；Husain,M.M.(2005)“ClinicalDiagnosis And Management Of Alzheimer’s Disease,”Neuroimaging Clin.N.Amer.15(4):767-777；Small,G.W.等(1997)“Diagnosis And Treatment Of Alzheimer DiseaseAnd Related Disorders.Consensus Statement Of The American Association ForGeriatric Psychiatry,The Alzheimer’s Association,And The American GeriatricsSociety,”JAMA 278(16):1363-1371)。可选地，可通过相关风险因素(例如，已经发现与阿尔茨海默病或这类其他tau疾病具有高于50％的并发率(coincidence)的一种或多种因素)的存在，将这类个体与患有与阿尔茨海默病或其他tau疾病无关的疾病或病况的那些个体区别开。这类相关风险因素包括这样的发现：患者的亲属经历过阿尔茨海默病或这类其他tau疾病，或存在高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。这类相关风险因素尤其包括这样的发现：患者具有与这类实际疾病的发生相关(例如，被发现与其具有高于50％的并发率)的一种或多种遗传或生化标记物。这样的倾向于阿尔茨海默病的风险的遗传标记物的实例包括在APP基因中的相关突变，例如，在APP基因的717位和670和671位的突变(分别指Hardy和Swedish突变)。已知的遗传风险的其他合适的标记物包括在早老素基因(PS1和PS2)和在ApoE4基因(Bekris，L.M.等(2010)“Genetics of Alzheimer Disease,”J.Geriatr.Psychiatry Neurol.23(4):213–227)中的相关突变。
PS1的同等型1的氨基酸序列是(SEQ ID NO:103)：
Figure BDA0001616537130000621
Figure BDA0001616537130000631
这类PS1突变包括取代：R35Q；A79V；V82L；L85P；V89L；V94M；V96F；V97L；F105I；F105L；F105V；L113P；L113Q；Y115C；Y115D；Y115H；T116I；T116N；P117A；P117L；P117R；P117S；E120D；E120D；E120G；E120K；E123K；N135D；N135S；A136G；M139I；M139I；M139K；M139T；M139V；I143F；I143M；I143N；I143T；I143V；M146I；M146I；M146I；M146L；M146L；M146V；T147I；L153V；Y154C；Y154N；H163R；H163Y；W165C；W165G；L166H；L166P；L166R；S169L；S169P；S170F；L171P；L173F；L173W；L174M；L174R；F175S；F177L；F177S；S178P；G183V；E184D；V191A；G206A；G206D；G206S；G206V；G209E；G209R；G209V；S212Y；I213F；I213L；I213T；H214D；H214Y；G217D；G217R；L219F；L219P；Q222H；Q222R；Q223R；L226F；L226R；I229F；A231T；A231V；M233I；M233L；M233L；M233T；M233V；L235P；L235V；F237I；F237L；K239N；T245P；A246E；L248R；L250S；L250V；Y256S；A260V；V261F；V261L；L262F；C263F；C263R；P264L；G266S；P267L；P267S；R269G；R269H；L271V；V272A；E273A；T274R；R278I；R278K；R278S；R278T；E280A；E280G；L282F；L282R；L282V；P284L；P284S；A285V；L286P；L286V；T291P；E318G；R358Q；S365A；R377M；G378E；G378V；L381V；G384A；F386S；S390I；V391F；L392P；L392V；G394V；N405S；A409T；C410Y；V412I；L418F；L420R；L424F；L424H；L424R；L424V；A426P；A431E；A431V；A434C；L435F；P436Q；P436S；和I439S。
PS2的同等型1的氨基酸序列是(SEQ ID NO:104)：
Figure BDA0001616537130000632
Figure BDA0001616537130000641
这类PS2突变包括取代：R29H；G34S；R62C；R62H；R71W；A85V；T122P；T122R；S130L；V139M；N141I；L143H；V148I；R163H；M174V；S175C；Y231C；Q228L；M239V；M230I；A252T；P334R；T430M；和D439A。
这类ApoE4等位基因包括ε4等位基因、ε3等位基因和ε2等位基因(Verghese,P.B.等(2011)“Apolipoprotein E In Alzheimer's Disease And Other NeurologicalDisorders,”Lancet Neurol.10(3):241-252)。
另外，许多诊断测试可用于鉴定患有阿尔茨海默病的个体。这些包括测量CSF Tau和Aβ42水平。升高的Tau和降低的Aβ42水平预示着存在阿尔茨海默病。
在阿尔茨海默病的情况下，事实上任何人都有患阿尔茨海默病的风险。因此，本发明的治疗分子可预防性地施用至普通人群，而不需要针对受试患者的风险的任何评估。本发明方法尤其可用于预防性治疗具有已知的阿尔茨海默病的遗传风险的个体。在无症状的患者中，治疗可开始于任何年龄(例如，10、20、30岁)。然而，通常，在患者达到40、50、60、70、80或90岁的年龄以前没有必要开始治疗。治疗典型地需要在一段时间内施用多个剂量。通过分析抗体或活化的T-细胞或B-细胞随时间对治疗剂的应答，治疗可被监控。如果应答失败，则指示加强剂量。在潜在唐氏综合症患者的情况下，治疗可在产前开始，这通过在妊娠期间向母亲施用治疗剂，或患者出生后立即开始治疗。
本发明提供：
1、一种结合分子，其能够免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位。
2、这类结合分子的实施方式，其中所述分子与选自下述的抗体竞争结合：抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11和5G2A3。
3、这类结合分子的实施方式，其中所述分子包含：
(a)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列；
(b)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:17、18和19的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列；
(c)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列；
(d)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列；
(e)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:37、38和39的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:41、42和43的氨基酸序列；
(f)(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列。
4、这类结合分子的实施方式，其中所述分子包含：
(a)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具有SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别具SEQ ID NO:118、119和120的有氨基酸序列。
5、任何这类结合分子的实施方式，其中当外周注射至接受者后，所述分子基本上与Tau聚集体共定位。
6、任何这类结合分子的实施方式，其中所述分子是抗体、双抗体、scFv，或包含抗体、双抗体或scFv的表位-结合片段。
7、任何这类结合分子的实施方式，其中所述分子是抗体。
8、任何这类结合分子的实施方式，其中所述分子是抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11或抗体5G2A3。
9、任何上述结合分子的实施方式，其中所述分子免疫特异性结合至Tau 407-421肽(SEQ ID NO:7)：HLSNVSSTGSIDMVD。
10、任何上述结合分子的实施方式，其被可检测地标记。
11、任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记。
12、(A)任何上述可检测地标记的结合分子用于制造用于检测或测量接受受试者的脑中或接受受试者的生物样品中病理Tau蛋白质的存在或量的药物的实施方式，或
(B)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于检测或测量接受受试者的脑中或接受受试者的生物样品中病理Tau蛋白质的存在或量的用途。
13、(A)任何上述可检测地标记的结合分子用于制造用于检测或测量接受受试者的脑中或接受受试者的生物样品中病理Tau蛋白质的存在或量的药物的实施方式，或
(B)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于检测或测量接受受试者的脑中或接受受试者的生物样品中病理Tau蛋白质的存在或量的用途；
其中所述检测或测量包括使与截短的Tau蛋白质结合的结合分子体内成像。
14、(A)任何上述可检测地标记的结合分子用于制造用于检测或测量接受受试者的脑中或接受受试者的生物样品中病理Tau蛋白质的存在或量的药物的实施方式，或
(B)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于检测或测量接受受试者的脑中或接受受试者的生物样品中病理Tau蛋白质的存在或量的用途；
其中所述检测或测量包括使与截短的Tau蛋白质结合的结合分子离体成像。
15、(A)(1)任何上述结合分子的实施方式，其被可检测地标记；或
(2)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记；
其用于制造用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的药物；或
(B)(1)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途；或
(2)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记。
16、(A)(1)任何上述结合分子的实施方式，其被可检测地标记；或
(2)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记；
其用于制造用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的药物；或
(B)(1)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途；或
(2)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记；
其中所述药物是施用至受试者的体内药物。
17、(A)(1)任何上述结合分子的实施方式，其被可检测地标记；或
(2)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记；
其用于制造用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的药物；或
(B)(1)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途；或
(2)任何上述可检测地标记的结合分子的实施方式用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的用途，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记；
其中所述药物与受试者的活组织检查样品一起离体温育。
18、任何这类用途的实施方式，其中Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
实施例
下述实施例阐释了组合物在本发明的诊断或治疗方法中的各种方法。实施例旨在是阐释性的而绝不限制本发明的范围。
实施例1
针对Tau的截短的Asp421表位的抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11、抗体5G2A3(或抗体5G2G6)的特异性
为了证明抗体(抗体1G10D2、抗体1G11A10、抗体5B3C11、抗体5G2A3/5G2G6)免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位的能力，在存在对应Tau残基407-421(SEQ ID NO:7)或407-423(SEQ ID NO:105)(分别对应SEQ ID NO:1的残基407-421和407-423)的固定肽的情况下，温育抗体制剂，并且经ELISA测定与固定肽结合的抗体的量。发现抗体1G10D2(图1A)、抗体1G11A10(图1B)、抗体5B3C11(图1C)、抗体5G2A3(图1D)和抗体5G2G6(图1E)各自能够烈强结合至截短的(Tau 407-421)肽(SEQ ID NO:7)，但是不能结合包含非截短的表位的肽(Tau 407-423；SEQ ID NO:105)。因此，该数据确认了抗体1G11A10、5G2A3和5G2G6免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位的能力。
如图2A-2B中显示，抗体1G11A10和5G2A3的结合亲和力特征不同，其中抗体1G11A10以更低的亲和力结合至截短的Asp421表位，这样，相对于即使在非常低的抗体浓度也展示与截短的Asp421表位的高亲和力结合的抗体5G2A3(图2B)，在较高的抗体稀释度观察到较少的结合(图2A)。
Biacore分析确认了由ELISA数据推断的结合亲和力。分析结果显示在表7中。
Figure BDA0001616537130000681
因此，抗体5G2A3靶向截短的Asp421表位并且以高的亲和力(10-9M)进行结合。相反，抗体1G11A10以较低的亲和力(10-6M)结合截短的Asp421表位，但是未可检测地结合至非截短的表位。
实施例2
抗体识别Tau的Asp421表位以清除病理Tau的能力
使用针对Tau表位，比如涉及在396和404位具有磷酸丝氨酸残基({p}Ser396和{p}SerSer404)的Tau的“{p}Ser396/{p}Ser404Tau表位”，的单克隆抗体的免疫疗法，已经表证明了高度磷酸化的Tau水平的降低和与其相关的病理学。为了进一步证明本发明的截短的Tau表位-结合分子的治疗能力，使用原代神经元培养物研究免疫特异性结合至截短的Asp421表位的单克隆抗体5G2A3/5G2G6和1G11A10影响高度磷酸化的Tau的能力。另外，使用混合皮质培养物研究抗体5G2A3和1G11A10影响高度磷酸化的Tau的能力。
因此，将来自第0天JNPL3小鼠的原代神经元和混合皮质培养物用PHF(1μg/mL)预处理24小时，随后添加抗体5G2A3/5G2G6(仅纯神经元培养物)或抗体1G11A10(10μg/mL)进行另外的24小时、48小时、72小时或96小时。针对抗体PHF-1(其结合{p}Ser396/{p}Ser404表位)、抗人Tau抗体(Dako)和磷酸化的Tau({p}Ser199)进行免疫印迹。
表8显示了用PHF预处理的混合神经元培养物的该实验的结果。
Figure BDA0001616537130000691
Figure BDA0001616537130000701
表8的数据图形化显示在图3A中。数据显示，当与对照细胞相比时，在用抗体5G2A3和1G11A10处理之后，这类细胞(出生后第0天)具有显著降低水平的PHF-1({p}Ser396/{p}Ser404)，p<0.0001。
表9显示了用抗人Tau抗体(Dako)免疫印迹的混合神经元培养物的该实验的结果，从而显示总Tau。
Figure BDA0001616537130000702
Figure BDA0001616537130000711
表9的数据图形化显示在图4A中。数据显示，当与用IgG处理的对照细胞相比时，在96小时，5G2A3处理(54％，p<0.0001)比1G11A10(36％，p<0.05)更有效降低总Tau水平。
与没有作用的对照IgG相比，对截短的Asp421表位特异性的更高亲和性抗体(抗体5G2A3)的存在导致混合培养物中磷酸化-Tau(在96小时，下降高达87％，p<0.001)和总Tau(在96小时，下降高达54％，p<0.0001)二者的显著和持续下降(图3A和4A)。该tau抗体在24小时和48小时时在原代神经元中具有显著的作用(磷酸化-Tau：在两个时间点都下降89％，p<0.001；总Tau：在24小时下降58％，p＝0.001，和在48小时下降45％，p＝0.005)，在稍后的时间点该作用稍微减弱(磷酸化-Tau：在72小时下降75％，p＝0.003，和在96小时，下降68％，p＝0.008；总Tau：在72小时，下降6％，p>0.05和在96小时，下降43％，p＝0.006；图3B和4B)。
对于截短的Asp421表位特异性的较低亲和性抗体(抗体1G11A10)的存在对于降低混合皮质培养物中磷酸化-Tau和总Tau效力较低(分别为，在96小时，下降高达49％，p<0.0001，和在96小时，下降36％，p<0.0001)(图3A和4A)，并且在原代神经元培养物中不能降低磷酸化-Tau或总Tau(图3B和4B)。
综上所述，该研究清楚地证明：1)靶向在Asp421处截短的Tau蛋白质的治疗效力；2)针对该特定表位的更高亲和性抗体更有效；和3)在混合皮质培养物中观察到了比原代神经元中更大的效力，推测是因为来自促进tau-抗体复合物降解的噬菌性小神经胶质细胞(phagocytic microglia)的贡献。混合培养物中的神经元也更健康，因此，可能更适合清除/降解这类复合物。
该研究清楚地证明了在混合皮质细胞和原代神经元细胞二者中，抗体5G2A3介导高度磷酸化的Tau水平的显著降低，以及总体细胞内Tau水平的显著降低的能力。因此，该发现表明了Asp421表位作为Tau免疫疗法的治疗性靶标的重要性。
这些数据表明存在多种机制，并且细胞外阻断和促进细胞内清除都是预防Tau疾病和相关毒性散播的有效方法。可影响这两种途径的抗体可能比仅仅在一个区室(compartment)中发挥作用的那些抗体更有效。
实施例3
用靶向Tau蛋白质的Asp421的抗体处理预防病理Tau的毒性并清除病理Tau，伴随相关的小胶质细胞增生的减少
为了阐释能够免疫特异性结合Tau的截短的Asp421表位的抗体的作用，将混合皮质培养物和原代神经元二者用PHF(1μg/ml)预处理24小时，随后施用10μg/ml的抗体5G2A3和抗体1G11A10，进行另外的24小时、48小时、72小时或96小时，并且评估这样的处理对于清除细胞内Tau的作用。
通过对来自第0天JNPL3幼崽的混合皮质培养物和原代神经元培养物针对磷酸化Ser 199表位进行蛋白质免疫印迹分析，测定细胞内Tau清除的程度。混合皮质和原代神经元培养物二者都用PHF(1μg/ml)预处理24小时，随后用抗体5G2A3(10μg/ml)或抗体1G11A10(10μg/ml)抗体处理另外的24小时、48小时、72小时或96小时。抗体5G2A3显示在混合皮质以及原代神经元二者中磷酸化-Tau的水平的降低。
总体的Tau和磷酸化-Tau值针对GAPDH标准化，以确定抗体5G2A3和抗体1G11A10清除PHF的作用。混合皮质培养物和原代神经元之间的比较分析，阐释了抗体5G2A3被证实在两种细胞模型中都有效降低磷酸化-Tau，其中对于混合皮质培养物，在96小时观察到最大的降低(94％)(图5A)。在原代神经元(图5B)中，与用IgG(10μg/ml)处理的对照细胞相比，尽管发现抗体5G2A3的施用与所有时间点(即，从24小时直到96小时)磷酸化Tau的水平的显著下降相关，但是在各个时间点都观察到了磷酸化Tau水平的稍微增加，似乎合理地描绘了当与混合皮质培养物相比时，抗体5G2A3不能在原代神经元中持续降低磷酸化Tau水平。
抗体1G11A10处理仅仅证实了在原代神经元中有效降低磷酸化-Tau水平，显示从24小时直到72小时～68％的降低，但是，发现抗体1G11A10处理不能显著降低混合皮质培养物中的磷酸化Tau的水平。
混合皮质培养物和原代神经元之间的比较分析，阐释了在抗体5G2A3处理之后，在两种细胞类型中总Tau水平的降低。在来自第0天JNPL3小鼠的混合皮质和原代神经元培养物中针对总Tau(Dako)进行蛋白质印迹。皮质和原代神经元培养物二者均用PHF(1μg/ml)预处理24小时，随后用抗体5G2A3(10μg/ml)或抗体1G11A10(10μg/ml)处理另外24小时、48小时、72小时或96小时。用IgG(10μg/ml)处理的细胞被看作混合皮质培养物和原代神经元二者的对照。在抗体5G2A3处理之后，在混合皮质培养物中显示了总Tau水平从48小时直到96小时的持续降低(54％)(图6A)，而在原代神经元中，在24小时、48小时和96小时观察到～50％的降低(图6B)，阐释了抗体5G2A3在混合皮质和原代神经元培养物中降低总Tau水平的有益效果。
抗体1G11A10被证实在24小时(41％)和96小时(36％)时有效降低混合皮质培养物中的总Tau水平(图6A)，但是，与对照相比，原代神经元中总Tau的水平的显著降低仅仅在48小时是明显的(65％)(图6B)。
GAPDH被看作是所有实验的上样(loading)对照。在混合皮质和原代神经元中，在抗体5G2A3或抗体1G11A10处理之后，GAPDH水平不改变。用PHF(1μg/ml)预处理、随后以10μg/ml的抗体5G2A3或抗体1G11A10处理的混合皮质培养物和原代神经元培养物，与IgG处理的对照相比时，在24小时、48小时、72小时和96小时各自均未表现出GAPDH水平的任何显著改变，p>0.05。
为了进一步表征能够免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位的抗体的作用，在用抗体5G2A3或抗体1G11A10处理的混合皮质培养物中测量NeuN和Iba1水平。NeuN被用作有丝分裂后神经元标记物，以确定神经元的形态功能状态，这样，NeuN水平的下降就提示神经元损失或损伤。抗体5G2A3-处理的细胞显示了NeuN水平从24小时直到96小时逐渐增加，其中，当与各个时间点的用IgG处理的对照细胞相比时，在72小时和96小时时观察到统计学上显著的增加(图7)。对于抗体1G11A10-处理的细胞，当与对照或仅仅用PHF处理的细胞相比时，没有观察到NeuN水平的显著改变。
Iba1是神经胶质特异性标记物，已知其在激活的小神经胶质细胞中被上调。Iba1用作标记物来研究由于PHF和抗体处理造成的小神经胶质细胞激活的作用。相对于对照和仅仅用PHF处理的细胞，在抗体5G2A3处理的混合皮质培养物中，在72小时和96小时观察到了Iba1的水平的显著下降(图8)。已知Tau聚集体激活小神经胶质细胞，已知所述小神经胶质细胞进而引起对细胞因子的刺激，进一步导致炎症反应的增加。尽管增加的小神经胶质细胞激活将进一步有助于清除PHF，但是，也已知小神经胶质细胞和炎症细胞因子的持续增加通过造成增加的细胞损伤而加重总体病理学。抗体5G2A3处理之后Iba1表达的下降提示小神经胶质细胞介导的对抗体-tau复合物的清除之后，炎症反应机制的下降，而效力较小的抗体1G11A10处理，与对照相比时，未能显示Iba1水平的任何显著改变。
抗体5G2A3处理的混合皮质培养物中磷酸化Tau(pSer199)、总Tau和Iba1水平的显著下降伴随NeuN水平的增加可能提示，抗体5G2A3通过进一步降低小神经胶质细胞激活、炎症反应并且维持通过NeuN表达的增加观察到的神经元生理学而在清除PHF中的有益效果。
实施例4
在混合皮质培养物中共温育高剂量的PHF(10μg/ml)与对Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体(10μg/ml)
为了进一步阐释能够免疫特异性结合Tau的截短的Asp421表位的抗体的作用，将来自出生后第0天JNPL3小鼠的混合神经元培养物与PHF(10μg/ml)和抗体5G2A3(10μg/ml)或抗体1G11A10(10μg/ml)共温育24小时、48小时、72小时或96小时的时间。针对NeuN进行蛋白质免疫印迹，并且证明当与未处理的细胞相比时，对于仅仅用PHF处理的细胞以及PHF+IgG共温育的细胞，NeuN水平在48小时(27％)、72小时(37％)和96小时(53％)时显著下降，p<0.0001。对于抗体5G2A3共温育的细胞，从24小时直到72小时，没有观察到NeuN水平的显著改变，p＝0.18，而当与未处理的细胞相比时，在96小时观察到了突然增加(122％，p<0.0001)。当与未处理的细胞相比时，用抗体1G11A10和PHF共温育的细胞显示，直到48小时，NeuN的水平没有显著改变，随后NeuN水平在72小时(18％)和96小时(24％)时逐渐下降。该研究的结果显示在图9中。
为了进一步阐释能够免疫特异性结合Tau的截短的Asp421表位的抗体的作用，将来自出生后第0天JNPL3小鼠的混合神经元培养物与PHF(10μg/ml)和抗体5G2A3(10μg/ml)或抗体1G11A10(10μg/ml)共温育24小时、48小时、72小时或96小时的时间。针对Ser199表位进行免疫印迹并且针对NeuN水平归一化(图10)。与仅仅用PHF处理和PHF+IgG处理的细胞相比，抗体5G2A3抗体与PHF的共温育显示磷酸化-Tau水平在48小时(78％)、72小时(92％)和96小时(95％)时显著下降，p<0.0001，而当与未处理的细胞相比时，在各个时间点，对于用抗体5G2A3和PHF共温育的细胞没有观察到磷酸化-Tau水平的显著改变。当与仅仅用PHF处理和PHF+IgG处理的细胞相比时，在所有时间点，抗体1G11A10抗体与PHF的共温育不能显示磷酸化-Tau水平的任何显著改变。
也将来自出生后第0天JNPL3小鼠的混合神经元培养物与PHF(10μg/ml)和能够免疫特异性结合Tau的截短的Asp421表位的抗体(抗体5G2A3(10μg/ml)和抗体1G11A10(10μg/ml))共温育24小时、48小时、72小时或96小时的时间。针对识别细胞中磷酸化的以及非磷酸化的tau种类的Tau(Dako)进行免疫印迹。针对NeuN将值归一化(图11)。与对照细胞(用PHF+IgG处理的细胞)相比，抗体5G2A3和抗体1G11A10抗体中，仅仅抗体5G2A3被证实有效降低总Tau水平，在48小时、72小时和96小时分别显示32％、37％和91％的降低，p<0.0001。当与对照细胞相比时，抗体1G11A10在所有时间点都不能降低总Tau水平。
也将来自出生后第0天JNPL3小鼠的混合神经元培养物与PHF(10μg/ml)和抗体5G2A3(10μg/ml)或抗体1G11A10(10μg/ml)共温育24小时、48小时、72小时或96小时的时间，并且针对Iba1进行免疫印迹，以证明这类抗体的施用对于小神经胶质细胞活性的作用。当与未处理的对照细胞相比时，抗体5G2A3抗体与PHF的共温育未显示Iba1水平的任何显著改变，而对于仅仅用PHF、PHF+IgG和PHF+抗体1G11A10处理的细胞，在72小时和96小时观察到Iba1水平的显著增加，p<0.0001(图12)。
实施例5
对于Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体在Tau疾病小鼠中的组织反应性
为了评估对于Tau的截短的Asp421表位免疫特异性的抗体的组织反应性，对来自JNPL3 Tau疾病小鼠(图13A)和来自hTau Tau疾病小鼠(图13B)的脑上清液样品进行斑点印迹分析。
就JNPL3 Tau疾病小鼠(图13A)而言，通过更高亲和性抗体5G2A3在大部分小鼠中检测到更强的信号。但是，更低亲和性抗体1G11A10在一些小鼠中产生更强的信号，表明这两种抗体识别的确切表位不同。针对相同表位的商业上可得到的抗体，抗Tau抗体C3(Millipore Sigma,Abcam,Delobel,P.等(2008)“Analysis of Tau Phosphorylation andTruncation in a Mouse Model of Human Tauopathy,”Am.J.Pathol.172(1):123-131)几乎在所有的样品中都显示最低信号。
实施例6
来自人(对照)脑和来自人AD脑的纯化PHF的脑上清液样品中的组织反应性
也对来自人(对照)脑的脑上清液样品和来自已经从人AD脑纯化的PHF的脑上清液样品，进行抗体的组织反应性的评估，所述抗体针对Tau的截短的Asp421表位具有免疫特异性。该研究的结果显示在图14中。在人样品中，抗体5G2A3产生了检测从阿尔茨海默氏脑分离的PHF材料的最强信号。其也具有最好的特异性，因为其在对照脑上清液(C1-C6)中具有低的信号。抗体1G11A10和商业C3抗体具有检测病理学PHF材料的相当的信号，但是抗体1G11A10具有较好的特异性，因为其在对照脑中具有比C3较低的信号。
本说明书提到的所有出版物和专利通过参考并入本文，达到如同具体和单独指出每个单个出版物或专利申请通过参考以其整体并入的相同程度。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，其能够被进一步修改，并且本申请旨在覆盖大体上根据本发明原理并且包括与本公开的偏离的本发明的任何变型、用途或改变，只要在本发明所属领域的已知或习惯实践内并且如可应用至本文之前所阐释的本质特征。
序列表
<110> 纽约大学
<120> 对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途
<130> 1400.0008PCT
<150> US 62/204、699
<151> 2015-08-13
<150> US 62/211、123
<151> 2015-08-28
<160> 105
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(441)
<223> Tau蛋白质
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 3
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 4
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标签肽
<400> 5
His His His His His His
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA标签肽
<400> 6
Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> Tau蛋白质 (SEQ ID NO:1)的氨基酸残基407-421
<400> 7
His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp
1 5 10 15
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> 抗体1G10D2的轻链可变结构域
<400> 8
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体1G10D2的轻链CDR1
<400> 9
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗体1G10D2的轻链CDR2
<400> 10
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗体1G10D2的轻链CDR3
<400> 11
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(119)
<223> 抗体1G10D2的重链可变结构域
<400> 12
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 抗体1G10D2的重链 CDR1
<400> 13
Asp Ser Ala Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体1G10D2的重链 CDR2
<400> 14
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 抗体1G10D2的重链 CDR3
<400> 15
Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> 抗体1G11A10的轻链可变结构域
<400> 16
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体1G11A10的轻链CDR1
<400> 17
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗体1G11A10的轻链CDR2
<400> 18
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗体1G11A10的轻链CDR3
<400> 19
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 抗体1G11A10的重链可变结构域
<400> 20
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 抗体1G11A10的重链 CDR1
<400> 21
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体1G11A10的重链 CDR2
<400> 22
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> 抗体1G11A10的重链 CDR3
<400> 23
Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL1可变结构域
<400> 24
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL1 CDR1
<400> 25
Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL1 CDR2
<400> 26
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL1 CDR3
<400> 27
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 28
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(108)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL2可变结构域
<400> 28
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL2 CDR1
<400> 29
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL2 CDR2
<400> 30
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗体5B3C11的轻链VL2 CDR3
<400> 31
Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 抗体5B3C11的重链 VL2可变结构域
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 抗体5B3C11的重链 CDR1
<400> 33
Asn Tyr Ala Leu Ser
1 5
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体5B3C11的重链 CDR2
<400> 34
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> 抗体5B3C11的重链 CDR3
<400> 35
Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> 抗体5G2A3的轻链可变结构域
<400> 36
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体5G2A3的轻链CDR1
<400> 37
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗体5G2A3的轻链CDR2
<400> 38
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗体5G2A3的轻链CDR3
<400> 39
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 40
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 抗体5G2A3的重链可变结构域
<400> 40
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala
115 120
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 抗体5G2A3的重链 CDR1
<400> 41
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 抗体5G2A3的重链 CDR2
<400> 42
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> 抗体5G2A3的重链 CDR3
<400> 43
Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端前导肽
<400> 44
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala
20 25
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端肽部分
<400> 45
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
1 5 10 15
<210> 46
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选的C末端肽
<400> 46
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His
1 5 10 15
His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
20 25 30
Ser
<210> 47
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<400> 47
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asp Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly
180 185 190
Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Arg Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 48
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(277)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<400> 48
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ser Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg
245 250 255
Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ala
275
<210> 49
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(249)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (250)..(264)
<223> C末端肽
<400> 49
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asp Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly
180 185 190
Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Arg Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
245 250 255
Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
260
<210> 50
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(249)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (250)..(255)
<223> His标签
<400> 50
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asp Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly
180 185 190
Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Arg Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His His His
245 250 255
<210> 51
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(249)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (250)..(261)
<223> HA标签肽
<400> 51
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asp Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly
180 185 190
Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Arg Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val
245 250 255
Pro Asp Tyr Ala Ser
260
<210> 52
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(249)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (250)..(282)
<223> 优选的C末端肽
<400> 52
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asp Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly
180 185 190
Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Arg Arg Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
245 250 255
Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala
260 265 270
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
275 280
<210> 53
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(277)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (278)..(292)
<223> C末端前导肽
<400> 53
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ser Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg
245 250 255
Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Gly
275 280 285
Gln Ala Gly Gln
290
<210> 54
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(277)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (278)..(283)
<223> His标签肽
<400> 54
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ser Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg
245 250 255
Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ala His His His His His His
275 280
<210> 55
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(277)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (278)..(289)
<223> HA标签肽
<400> 55
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ser Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg
245 250 255
Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
275 280 285
Ser
<210> 56
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(277)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (278)..(310)
<223> 优选的C末端肽
<400> 56
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ser Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Gly Leu Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg
245 250 255
Gly Val Ser Ser Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Gly
275 280 285
Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp
290 295 300
Val Pro Asp Tyr Ala Ser
305 310
<210> 57
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<400> 57
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ser Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250
<210> 58
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(278)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<400> 58
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser
275
<210> 59
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(249)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (251)..(265)
<223> C末端肽
<400> 59
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ser Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
245 250 255
Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
260 265
<210> 60
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(250)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (251)..(256)
<223> His标签肽
<400> 60
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ser Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser His His His His His His
245 250 255
<210> 61
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(250)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (251)..(262)
<223> HA标签肽
<400> 61
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ser Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp
245 250 255
Val Pro Asp Tyr Ala Ser
260
<210> 62
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(250)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (251)..(283)
<223> 优选的C末端肽
<400> 62
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ser Arg Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
245 250 255
Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly
260 265 270
Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
275 280
<210> 63
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(278)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (279)..(293)
<223> C末端肽
<400> 63
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser
275 280 285
Gly Gln Ala Gly Gln
290
<210> 64
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(278)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (279)..(284)
<223> C末端肽
<400> 64
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser His His His His His His
275 280
<210> 65
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(278)
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (279)..(290)
<223> HA标签肽
<400> 65
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
275 280 285
Ala Ser
290
<210> 66
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体1G11A10产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(278)
<223> 由抗体1G10D2产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (279)..(311)
<223> 优选的C末端肽
<400> 66
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Thr Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Thr Met Thr Ala Thr Leu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser
275 280 285
Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr
290 295 300
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
305 310
<210> 67
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<400> 67
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr
210 215 220
Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
245 250
<210> 68
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<400> 68
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
275
<210> 69
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(266)
<223> C末端肽
<400> 69
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr
210 215 220
Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
245 250 255
Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
260 265
<210> 70
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(257)
<223> His标签肽
<400> 70
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr
210 215 220
Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His His
245 250 255
His
<210> 71
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(263)
<223> HA标签肽
<400> 71
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr
210 215 220
Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr
245 250 255
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
260
<210> 72
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(284)
<223> 优选的C末端肽
<400> 72
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr
210 215 220
Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
245 250 255
Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His
260 265 270
Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
275 280
<210> 73
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(294)
<223> C末端肽
<400> 73
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr
275 280 285
Ser Gly Gln Ala Gly Gln
290
<210> 74
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(285)
<223> His标签肽
<400> 74
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His His His
275 280 285
<210> 75
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(291)
<223> HA标签肽
<400> 75
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
275 280 285
Tyr Ala Ser
290
<210> 76
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL1)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(312)
<223> 优选的C末端肽
<400> 76
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
245 250 255
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr
275 280 285
Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro
290 295 300
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
305 310
<210> 77
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<400> 77
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
210 215 220
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 78
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(275)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<400> 78
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Glu Asn Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
35 40 45
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Arg Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly
195 200 205
Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr
245 250 255
Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ala
275
<210> 79
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(247)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(262)
<223> C末端肽
<400> 79
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
210 215 220
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr
245 250 255
Ser Gly Gln Ala Gly Gln
260
<210> 80
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(247)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(253)
<223> His标签肽
<400> 80
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
210 215 220
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala His His His His His His
245 250
<210> 81
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(247)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(259)
<223> HA标签
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(259)
<223> HA标签肽
<400> 81
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
210 215 220
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
245 250 255
Tyr Ala Ser
<210> 82
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(247)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(280)
<223> 优选的C末端肽
<400> 82
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg
210 215 220
Gly Asp Thr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr
245 250 255
Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro
260 265 270
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
275 280
<210> 83
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(275)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (275)..(290)
<223> C末端肽
<400> 83
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Glu Asn Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
35 40 45
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Arg Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly
195 200 205
Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr
245 250 255
Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala
275 280 285
Gly Gln
290
<210> 84
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(275)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (276)..(281)
<223> His标签肽
<400> 84
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Glu Asn Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
35 40 45
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Arg Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly
195 200 205
Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr
245 250 255
Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ala His His His His His His
275 280
<210> 85
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(275)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (276)..(287)
<223> HA标签
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (276)..(287)
<223> HA标签肽
<400> 85
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Glu Asn Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
35 40 45
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Arg Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly
195 200 205
Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr
245 250 255
Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
275 280 285
<210> 86
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(275)
<223> 抗体5B3C11产生的scFv分子 (VL2)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (276)..(308)
<223> 优选的C末端肽
<400> 86
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Glu Asn Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
35 40 45
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Arg Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly
195 200 205
Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Thr Ser Arg Gly Asp Thr Thr
245 250 255
Leu Ile Thr Thr Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala
275 280 285
Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
290 295 300
Asp Tyr Ala Ser
305
<210> 87
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<400> 87
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala
245 250
<210> 88
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<400> 88
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala
275
<210> 89
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(266)
<223> C末端肽
<400> 89
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
245 250 255
Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln
260 265
<210> 90
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(257)
<223> His标签肽
<400> 90
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala His His His His His
245 250 255
His
<210> 91
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(263)
<223> HA标签肽
<400> 91
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr
245 250 255
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
260
<210> 92
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(251)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(284)
<223> 优选的C末端肽
<400> 92
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Arg Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
245 250 255
Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His
260 265 270
Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
275 280
<210> 93
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(294)
<223> C末端肽
<400> 93
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr
275 280 285
Ser Gly Gln Ala Gly Gln
290
<210> 94
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(285)
<223> His标签肽
<400> 94
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala His His His His His His
275 280 285
<210> 95
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(291)
<223> HA标签肽
<400> 95
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
275 280 285
Tyr Ala Ser
290
<210> 96
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> N末端前导肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(279)
<223> 由抗体5G2A3产生的scFv分子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280)..(312)
<223> 优选的C末端肽
<400> 96
Ile Gln Glu Glu Phe Lys Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Asp Val Leu Met
20 25 30
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Arg Asn Gly Asn Thr
50 55 60
Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val
145 150 155 160
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
245 250 255
Gly Asp Pro Asn Met Ile Thr Thr Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr
275 280 285
Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro
290 295 300
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
305 310
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR1共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X1 (aa3)是N或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X2 (aa8)是N或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X3 (aa9)是A、R、N、Q、E、H、K、M、S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X4 (aa16)是E或D
<400> 97
Arg Ser Xaa Gln Ser Ile Leu Xaa Xaa Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Xaa
1 5 10 15
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR2共有序列
<400> 98
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR3共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X1 (aa6)是V或I
<400> 99
Phe Gln Gly Ser His Xaa Pro Trp Thr
1 5
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X1 (aa1)是N、 D、 Q、 E或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X2 (aa2)是A、 R、 N、 D、 C、 Q、 E、 G、 H、 I、 L、 K、 M、 F、 S、 T、 Y或
V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X3 (aa4)是L或M
<400> 100
Xaa Xaa Ala Xaa Ser
1 5
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X1 (aa1)是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X2 (aa7)是A、 R、 N、 D、 Q、 E、 G、 H、 K、 M、 P、 S、 T或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X3 (aa9)是F或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X4 (aa10)是A、 R、 N、 C、 Q、 E、 H、 I、 L、 K、 M、 F、 S、 T、 Y或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X5 (aa13)是A、 R、 N、 D、 Q、 E、 G、 H、 I、 L、 K、 P、 S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X6 (aa14)是I、 L、 M或V
<400> 101
Ser Ile Ser Xaa Gly Gly Xaa Thr Xaa Xaa Pro Asp Xaa Xaa Lys Gly
1 5 10 15
<210> 102
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X1 (aa3)不存在或为D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X2 (aa4)不存在或为A、 D、 Q、 E、 K、 P、 S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X3 (aa5)是A、 R、 N、 D、 C、 Q、 E、 G、 H、 I、 L、 K、 M、 F、 P、 S、 T、 Y
或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X4 (aa6)是A、 R、 C、 I、 L、 K、 M、 F、 S、 T、 Y或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X5 (aa7)是A、 C、 I、 L、 M、 F、 S、 T、 Y或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X6 (aa 8)是A、 R、 N、 D、 Q、 E、 G、 H、 I、 L、 K、 P、 S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X7 (aa9)是N、 S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X8 (aa12)是A 、R 、N、 D、 C、 Q、 E、 G、 H、 K、 M、 F、 P、 S、 T、 W、 Yor
V
<400> 102
Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Phe Xaa Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 467
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(467)
<223> 的同种型1PS1
<400> 103
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met
1 5 10 15
Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gln Asn Asp Asn
20 25 30
Arg Glu Arg Gln Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu
35 40 45
Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys
65 70 75 80
His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val Val
85 90 95
Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gln
100 105 110
Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gln Arg
115 120 125
Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val
130 135 140
Val Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys
145 150 155 160
Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe
165 170 175
Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala
180 185 190
Val Asp Tyr Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly Val Val
195 200 205
Gly Met Ile Ser Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gln Gln Ala
210 215 220
Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr
225 230 235 240
Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val
260 265 270
Glu Thr Ala Gln Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu Ile Tyr
275 280 285
Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro Glu
290 295 300
Ala Gln Arg Arg Val Ser Lys Asn Ser Lys Tyr Asn Ala Glu Ser Thr
305 310 315 320
Glu Arg Glu Ser Gln Asp Thr Val Ala Glu Asn Asp Asp Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gln Arg Asp Ser His Leu Gly Pro His Arg
340 345 350
Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gln Glu Leu Ser Ser Ser Ile
355 360 365
Leu Ala Gly Glu Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly
370 375 380
Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala
385 390 395 400
Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile
405 410 415
Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala
435 440 445
Thr Asp Tyr Leu Val Gln Pro Phe Met Asp Gln Leu Ala Phe His Gln
450 455 460
Phe Tyr Ile
465
<210> 104
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(448)
<223> PS2的同种型1
<400> 104
Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gln
20 25 30
Glu Gly Arg Gln Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gln Trp Arg
35 40 45
Ser Gln Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val
50 55 60
Cys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr
85 90 95
Leu Cys Met Ile Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Arg Phe Tyr
100 105 110
Thr Glu Lys Asn Gly Gln Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr
115 120 125
Pro Ser Val Gly Gln Arg Leu Leu Asn Ser Val Leu Asn Thr Leu Ile
130 135 140
Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile Phe Leu Val Val Leu Tyr
145 150 155 160
Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Phe Ile His Gly Trp Leu Ile Met Ser Ser
165 170 175
Leu Met Leu Leu Phe Leu Phe Thr Tyr Ile Tyr Leu Gly Glu Val Leu
180 185 190
Lys Thr Tyr Asn Val Ala Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Thr Val
195 200 205
Trp Asn Phe Gly Ala Val Gly Met Val Cys Ile His Trp Lys Gly Pro
210 215 220
Leu Val Leu Gln Gln Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala
225 230 235 240
Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Ser Ala Trp Val Ile Leu
245 250 255
Gly Ala Ile Ser Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly
260 265 270
Pro Leu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala Gln Glu Arg Asn Glu Pro Ile
275 280 285
Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Ala Met Val Trp Thr Val Gly Met
290 295 300
Ala Lys Leu Asp Pro Ser Ser Gln Gly Ala Leu Gln Leu Pro Tyr Asp
305 310 315 320
Pro Glu Met Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Ser Phe Gly Glu Pro Ser Tyr
325 330 335
Pro Glu Val Phe Glu Pro Pro Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Glu Glu Leu
340 345 350
Glu Glu Glu Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile
355 360 365
Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gly Ser Gly Asp
370 375 380
Trp Asn Thr Thr Leu Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys
385 390 395 400
Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu
405 410 415
Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Phe Ser Thr Asp Asn
420 425 430
Leu Val Arg Pro Phe Met Asp Thr Leu Ala Ser His Gln Leu Tyr Ile
435 440 445
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> Tau蛋白质 (SEQ ID NO:1)的氨基酸残基407-423
<400> 105
His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser
1 5 10 15
Pro

Claims (46)

1.一种基于抗体的分子，其能够免疫特异性结合至Tau的截短的Asp421表位，其中所述表位存在于具有Tau 407-421 (SEQ ID NO:7)：HLSNVSSTGSIDMVD的序列的多肽上，其中：
（A）SEQ ID NO:7的天冬氨酸残基为所述多肽的C-末端Tau残基；和
（B）相对于所述免疫特异性结合，所述基于抗体的分子展示出与含有另外的Tau序列残基C末端至SEQ ID NO:7的所述天冬氨酸残基的多肽降低的结合；并且
（C）所述基于抗体的分子能够结合至病理Tau蛋白质；
其中所述分子包含：
(1)可变轻链CDR1、CDR2、CDR3，其分别为SEQ ID NO:37、38和39的氨基酸序列；和
(2)可变重链CDR1、CDR2、CDR3，其分别为SEQ ID NO:41、42和43的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的基于抗体的分子，其中相对于结合至含有另外的Tau序列残基C末端至SEQ ID NO:7的所述天冬氨酸残基的多肽，所述基于抗体的分子展示出至少1000倍更高地结合至包含所述Tau的截短的Asp421表位的所述多肽。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的基于抗体的分子，其中所述分子是抗体，或包含抗体的表位-结合片段。
4.根据权利要求3所述的基于抗体的分子，其中所述分子是双抗体。
5.根据权利要求3所述的基于抗体的分子，其中所述分子是scFv。
6.根据权利要求3所述的基于抗体的分子，其中所述分子是人源化抗体或包含人源化抗体的表位-结合片段。
7.根据权利要求6所述的基于抗体的分子，其中所述分子是双抗体。
8.根据权利要求6所述的基于抗体的分子，其中所述分子是scFv。
9.根据权利要求3所述的基于抗体的分子，其中所述分子包含抗体的表位-结合片段。
10.根据权利要求9所述的基于抗体的分子，其中所述分子是双抗体。
11.根据权利要求9所述的基于抗体的分子，其中所述分子是scFv。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的基于抗体的分子，其被可检测地标记。
13.根据权利要求12所述的基于抗体的分子，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记。
14.根据权利要求3所述的基于抗体的分子，其被可检测地标记。
15.根据权利要求14所述的基于抗体的分子，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记。
16.根据权利要求4所述的基于抗体的分子，其被可检测地标记。
17.根据权利要求16所述的基于抗体的分子，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁标记、放射性同位素标记或酶标记。
18.根据权利要求12或13中任一项所述的基于抗体的分子在制备用于检测或测量受试者的脑、脑脊液、血液、血清或血浆中所述截短的Tau蛋白质的存在或量的试剂盒中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述检测或测量包括使与所述截短的Tau蛋白质结合的所述基于抗体的分子体内或离体成像。
20.根据权利要求18所述的用途，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
22.根据权利要求20所述的用途，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
23.根据权利要求14或15中任一项所述的基于抗体的分子在制备用于检测或测量受试者的脑、脑脊液、血液、血清或血浆中所述截短的Tau蛋白质的存在或量的试剂盒中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述检测或测量包括使与所述截短的Tau蛋白质结合的所述基于抗体的分子体内或离体成像。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
28.根据权利要求16或17中任一项所述的基于抗体的分子在制备用于检测或测量受试者的脑、脑脊液、血液、血清或血浆中所述截短的Tau蛋白质的存在或量的试剂盒中的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述检测或测量包括使与所述截短的Tau蛋白质结合的所述基于抗体的分子体内或离体成像。
30.根据权利要求28所述的用途，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
31.根据权利要求29所述的用途，其中所述检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
32.根据权利要求30所述的用途，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
33.一种用于治疗受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的体内药物，其中所述药物包含有效治疗所述阿尔茨海默病或其他Tau疾病的量的根据权利要求1-3中任一项所述的基于抗体的分子，以及一种或多种载体、稀释剂和/或稳定剂。
34.根据权利要求33所述的药物，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
35.根据权利要求1-3中任一项所述的基于抗体的分子在制备用于治疗所述受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的体内药物中的用途。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述受试者是人。
37.一种用于治疗受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的体内药物，其中所述药物包含有效治疗所述阿尔茨海默病或其他Tau疾病的量的根据权利要求4-11中任一项所述的基于抗体的分子，以及一种或多种载体、稀释剂和/或稳定剂。
38.根据权利要求37所述的药物，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
39.根据权利要求4-11中任一项所述的基于抗体的分子在制备用于治疗所述受试者的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病的体内药物中的用途。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述受试者是人。
41.一种包含根据权利要求12所述的基于抗体的分子的试剂盒，其用于检测或测量受试者的脑中所述截短的Tau蛋白质的存在或量，或用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
43.一种包含根据权利要求14所述的基于抗体的分子的试剂盒，其用于检测或测量受试者的脑中所述截短的Tau蛋白质的存在或量，或用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
45.一种包含根据权利要求16所述的基于抗体的分子的试剂盒，其用于检测或测量受试者的脑中所述截短的Tau蛋白质的存在或量，或用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或另外的Tau疾病。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述Tau疾病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合征、拳击员痴呆、唐氏综合征、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩症、尼曼匹克症C型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。
CN201680057687.XA 2015-08-13 2016-08-11 对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途 Active CN108135986B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562204699P 2015-08-13 2015-08-13
US62/204,699 2015-08-13
US201562211123P 2015-08-28 2015-08-28
US62/211,123 2015-08-28
PCT/US2016/046513 WO2017027685A2 (en) 2015-08-13 2016-08-11 Antibody-based molecules specific for the truncated asp421 epitope of tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108135986A CN108135986A (zh) 2018-06-08
CN108135986B true CN108135986B (zh) 2022-07-29

Family

ID=57984099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680057687.XA Active CN108135986B (zh) 2015-08-13 2016-08-11 对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10988528B2 (zh)
EP (1) EP3334453A4 (zh)
JP (1) JP6913078B2 (zh)
CN (1) CN108135986B (zh)
WO (1) WO2017027685A2 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110520440A (zh) 2017-02-17 2019-11-29 戴纳立制药公司 抗τ抗体及其使用方法
US20210032351A1 (en) * 2017-12-13 2021-02-04 Xdcexplorer (Shanghai) Co., Ltd. Egfrviii antibody and conjugate, and preparation method and use thereof
WO2020206093A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 B-Portal Biologics, Inc. Fusion constructs and uses thereof
WO2020201828A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Tauc3 Biologics Limited Anti-tauc3 antibodies and uses thereof
CN110679549B (zh) * 2019-11-05 2021-08-20 南通大学 一种阿尔茨海默病小鼠模型的构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015067432A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 Nordic Bioscience A/S Biomarkers of alzheimmer's disease progression

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DE69032742T2 (de) 1989-08-09 1999-06-17 Rhomed Inc Direkte radioetikettierung von antikörpern und sonstigen proteinen mittels technetium oder rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE398176T1 (de) 1991-12-06 2008-07-15 Max Planck Gesellschaft Phosphorylierungsepitope aus dem tau-protein zur diagnose und behandlung der alzheimer-krankheit
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US6136548A (en) 1994-11-22 2000-10-24 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for identifying useful T-PA mutant derivatives for treatment of vascular hemorrhaging
US5670477A (en) 1995-04-20 1997-09-23 Joseph F. Poduslo Method to enhance permeability of the blood/brain blood/nerve bariers to therapeutic agents
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
IL127193A (en) 1996-05-22 2006-10-31 Viventia Biotech Inc Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
JP2004518488A (ja) 2000-11-02 2004-06-24 コーネル リサーチ ファンデーション インコーポレーテッド インビボ多光子診断的な神経変性疾患の検出および撮像
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
AU2002314794A1 (en) 2001-05-23 2002-12-03 New York University Detection of alzheimer's amyloid by magnetic resonance imaging
EP1539233B1 (en) 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
CN102659946A (zh) * 2002-03-13 2012-09-12 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗αvβ6抗体
ATE512365T1 (de) 2004-04-15 2011-06-15 Univ Florida Map-2 proteolytische produkte als diagnostische biomarker fur neuralen verletzungen
UY28886A1 (es) * 2004-05-10 2005-12-30 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos que consisten en polipéptidos y derivados conprendiendo tres secuencias conteniendo respectivamente los siguientes números de seq. id: 1-3 y 4-6; 7-9 y 10-12 y 13-15 ó 16-18
EP1879613B1 (en) 2005-05-05 2011-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
BRPI0619056A2 (pt) 2005-11-28 2011-09-20 Genmab As anticorpo monovalente, método para preparar e produzir um antcorpo monovalente, construção de ácido nucleico, célula hospedeira, imunoconjugado, uso de um anticorpo monovalente, e, composição farmacêutica
US8012936B2 (en) 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy
US20080220449A1 (en) 2007-02-08 2008-09-11 Oligomerix, Inc. Biomarkers and assays for Alzheimer's disease
EP2185592B1 (en) 2007-09-13 2013-01-23 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
CA2755683A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Ac Immune S.A. Method for therapeutic use
UA107571C2 (xx) 2009-04-03 2015-01-26 Фармацевтична композиція
WO2010144711A2 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins
RU2518291C2 (ru) 2009-07-30 2014-06-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Антигенные tau-пептиды и их применения
JP2013533732A (ja) * 2010-05-03 2013-08-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
CA2826286C (en) * 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
US9751942B2 (en) * 2012-03-29 2017-09-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-LAMP5 antibody and utilization thereof
CN107073297B (zh) 2014-07-08 2021-09-14 纽约大学 Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途
US20190224339A1 (en) * 2016-04-29 2019-07-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015067432A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 Nordic Bioscience A/S Biomarkers of alzheimmer's disease progression

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Caspase cleavage of tau：Linking amyloid and neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease;T.chris Gamblin等;《PNAS》;20030819;第100卷(第17期);摘要、第10033页左栏第2段及右栏第1和3段、第10034页左栏第2段、第10035页右栏第1段、图1-4 *
T.chris Gamblin等.Caspase cleavage of tau：Linking amyloid and neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease.《PNAS》.2003,第100卷(第17期),第10032-10037页. *
Tau immunotherapy for Alzheimer’s Disease;Jan Torleif Pedersen等;《Trends Mol Med》;20150403;第21卷(第6期);摘要、表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190315841A1 (en) 2019-10-17
US20210198349A1 (en) 2021-07-01
US11958898B2 (en) 2024-04-16
EP3334453A4 (en) 2019-02-06
US10988528B2 (en) 2021-04-27
JP6913078B2 (ja) 2021-08-04
JP2018534236A (ja) 2018-11-22
EP3334453A2 (en) 2018-06-20
WO2017027685A3 (en) 2017-03-23
WO2017027685A2 (en) 2017-02-16
CN108135986A (zh) 2018-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210238265A1 (en) Human Anti-Tau Antibodies
US10703808B2 (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
TWI741987B (zh) 特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法
US9975947B2 (en) Anti-alpha synuclein binding molecules
JP6284548B2 (ja) ヒト抗タウ抗体
US11519920B2 (en) Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
US9587014B2 (en) TDP-43 specific binding molecules
CN108135986B (zh) 对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途
JP2021003100A (ja) ヒト由来抗ハンチンチン（ｈｔｔ）抗体及びその使用
KR20230104759A (ko) 인간-유래의 항-디펩티드 반복체(dpr) 항체
CN108137679B (zh) 对Tau的{p}Ser404表位有选择性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途
US11542322B2 (en) Nano-theranostics for Parkinson&#39;s disease
NZ709976B2 (en) Human anti-tau antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1250659

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant