CN108129338A - 一种阳性脂质体dotap的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，包括(±)‑DOTAP,(S)‑DOTAP,(R)‑DOTAP的制备方法。本发明采用廉价的3‑氯‑1,2‑丙二醇为起始物，通过两步法合成DOTAP产品，经硅胶柱纯化可获得高纯度的阳性脂质体DOTAP。本发明提供了一种成本低廉且工序简单的DOTAP制备方法，该方法涉及的原料成本低，反应条件温和，同时后处理简单，无需离子交换工序，具有经济、环保、高效性。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种阳性脂质体DOTAP的制备方法。
背景技术
阳性脂质体作为一种高效的基因传递载体，通过将核酸特异性地传递到靶细胞中，达到将外源基因导入真核细胞的目的，其基因转染率高，离体细胞可以瞬间表达外源基因，在基因治疗方面有广泛而独特的应用。DOTAP是一种常用的阳离子脂质体,全称为2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵，具有生物惰性，可生物降解，无毒，无免疫原性，它与核酸能形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放到细胞内，而自身不会对机体造成损伤，因此常被用作真核细胞转染剂和DNA疫苗的载体。CN105920599A报道阳性脂质体DOTAP是一种良好的佐剂，与蛋白质抗原形成一种胶束膜疫苗，既可诱导体液免疫应答，又可诱导细胞免疫应答。CN102133404A报道阳性脂质体DOTAP可用作肿瘤靶向治疗药物的载体，DOTAP可与卵磷脂组成一种新型脂质体，这种新型质体与生物活性物质形成稳定的复合物，从而将活性物质定向、高效地携带到人体内部的靶细胞内，达到输送药物的目的。然而，目前阳性脂质体DOTAP的制备方法成本高昂，制备工艺复杂，反应时间长，安全隐患高。
US5264618报道了一种制备DOTAP消旋体的方法，该方法是通过氯甲烷对二甲基氨基化合物进行甲基化反应制备，反应条件为30℃，恒定绝对压力为1200mbar，反应137小时。该方法所用的氯甲烷为易燃、易爆气体，且需要高压密封，反应长达5.7天。此反应条件苛刻，设备要求高，反应时间长，安全隐患高且环境不友好。
DE4013632A1中概述了DOTAP的一种合成方法，该方法是在氯仿/甲醇/HCl水溶剂系统中进行DOTAP溴化物的离子交换，然后借助色谱柱纯化。DOTAP溴化物是预先从1-溴-2,3-二油酰氧基丙烷制得。该方法的制备成本高昂且离子交换工序繁琐。
Leventis和Silvius在Biochim.Biophys.Acta中报道了DOTAP的一种合成方法，在两相溶剂/NaCl溶液系统中进行DOTAP碘化物的离子交换。DOTAP碘化物是通过碘甲烷甲基化相应的二甲氨基化合物而制得。该方法用到剧毒的碘甲烷气体且离子交换工序繁琐，环境不友好且制备成本高。
以上报道的合成方法反应条件苛刻，且用到大量易燃、易爆且剧毒的气体，反应操作及后处理工序繁琐，制备成本高昂。
发明内容
本发明目的在于：针对上述存在的问题，本发明提供了一种成本低廉且工序简单的DOTAP制备方法，该方法涉及的原料成本低，反应条件温和，同时后处理简单，无需离子交换工序，具有经济、环保、高效性。
本发明采用的技术方案如下：
一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，以3-氯-1,2-丙二醇为基础物质，以三甲胺、油酸为中间反应物来合成DOTAP，所述3-氯-1,2-丙二醇中的氯可以用F，Br，I，HSO4 -，H2PO4 -替代。具体包括以下步骤：
步骤一：制备2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵：
将3-氯-1,2-丙二醇加入单口瓶中，再加入30％的三甲胺和溶剂，升温至20-100℃，保温搅拌6-20h至原料3-氯-12-丙二醇,反应完全。降温至20℃，用乙酸乙酯洗涤反应液3-5次，收集滤液并在60-70℃减压浓缩至干得类白色固体，即为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵。
步骤二：制备DOTAP：
向氮气置换后的250mL的单口瓶中先后加入步骤一所得产物和缩合剂、碱、溶剂和油酸，反应体系在0-30℃下保温4-16h至反应完全。向体系中加入水使固体析出，过滤收集到的固体，所得滤饼即为DOTAP粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体，即为DOTAP。
步骤三：
将上述步骤得到的DOTAP进行真空冷冻干燥，干燥条件：-10--30℃，干燥12-20h，得到干燥的DOTAP。
所述步骤一中所述3-氯-1,2-丙二醇包括：(±)-3-氯-12-丙二醇，(S)-3-氯-12-丙二醇，(R)-3-氯-12-丙二醇中的一种；所述溶剂包括水，甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮，四氢呋喃或乙醚中的至少一种。
所述步骤一中所述三甲胺包括三甲胺气体，三甲胺水溶液，三甲胺四氢呋喃溶液，三甲胺丙酮溶液或三甲胺醇溶液中的至少一种，优选三甲胺水溶液；所述三甲胺使用当量为3-氯-1,2-丙二醇的1.5-5.0倍，优选3.0倍。
所述步骤二中所述缩合剂为HATU、HBTU、HOBT、HOAT、DCC或EDCl中的至少一种，优选EDCl，缩合剂的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的1.0-3.0倍。
所述步骤二中所述碱为常用有机碱，包括DMAP,DIPEA,三乙胺或吡啶中的至少一种，优选DMAP，碱的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的0.5-3.0倍，优选0.5倍；所述溶剂为DMF和DMSO中的至少一种，优选DMF。
所述步骤二还可通过下面的方式实现：向250mL单口瓶中加入油酸和二氯甲烷，然后逐滴滴加二氯亚砜，滴加完后0-30℃保温4-16h至反应完全，浓缩反应液除去未反应的二氯甲烷和二氯亚砜，得油酰氯。向氮气置换后的单口瓶中先后加入2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵，碱，溶剂，0-5℃下滴加油酰氯，滴加完毕反应体系升温至20-30℃搅拌9h至反应完全，向体系加水使固体析出，过滤固体即得粗品，经硅胶柱纯化得DOTAP。所述氯化亚砜的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵使用当量的1.5-2.0倍，优选1.5倍；所述碱为常用有机碱，包括DMAP,DIPEA,三乙胺或吡啶中的至少一种，优选三乙胺，碱的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的0.5-3.0倍，优选3.0倍；所述溶剂为DMF和DMSO中的至少一种，优选DMF。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明提供了一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，该方法实现的成本低，反应条件温和，同时后处理简单，无需离子交换工序，具有经济、环保、高效的优点。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是中间产物2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成路线，其中X＝F,Cl，Br，I，HSO4 -，H2PO4 -。
图2是终产物DOTAP的合成路线。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
外消旋DOTAP的制备:
(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在500mL单口瓶中加入50.00g(±)-3-氯-1，2-丙二醇(0.452mol)，178.00g 30％三甲胺水溶液(0.904mol)和50mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(100mL×3),收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体70.00g，收率91.2％，HPLC纯度93.40％。
(±)-DOTAP的合成方法一
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.83g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.20g EDCI(0.121mol)、0.98gDMAP(0.008mol)、42mLDMF和25.00g油酸(0.088mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体23.70g，收率84.3％，HPLC纯度98.66％。
(±)-DOTAP的合成方法二
向250mL单口瓶中加入25.00g油酸(0.088mol)和100mL二氯甲烷，然后逐滴滴加15.80g二氯亚砜(0.133mol)；滴加完毕后25℃保温搅拌16h后反应完全。浓缩反应液以除去二氯甲烷和未反应的二氯亚砜，得浅棕色液体即油酰氯。向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.40g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.020mol)、6.08g三乙胺(0.060mol)和20mLDMF，0-5℃下滴加制备的油酰氯，滴完后反应体系自然升温至25℃并继续搅拌9h后反应完全。向反应体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体6.50g，收率46.5％，HPLC纯度98.01％。
实施例2
外消旋DOTAP的制备：
(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在500mL单口瓶中加入50.00g(±)-3-氯-1，2-丙二醇(0.452mol)，178.00g 30％三甲胺水溶液(0.904mol)和50mL乙醇，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(100mL×3),收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体55.33g，收率72.1％，HPLC纯度92.40％。
(±)-DOTAP的合成方法一
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.83g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.20g EDCI(0.121mol)、0.98gDMAP(0.008mol)、42mLDMF和25.00g油酸(0.088mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体22.50g，收率80.0％，HPLC纯度97.20％。
(±)-DOTAP的合成方法二
向250mL单口瓶中加入25.00g油酸(0.088mol)和100mL二氯甲烷，然后逐滴滴加15.80g二氯亚砜(0.133mol)；滴加完毕后25℃保温搅拌16h后反应完全。浓缩反应液以除去二氯甲烷和未反应的二氯亚砜，得浅棕色液体即油酰氯。向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.40g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.020mol)、6.08g三乙胺(0.060mol)和20mLDMF，0-5℃下滴加制备的油酰氯，滴完后反应体系自然升温至25℃并继续搅拌9h后反应完全。向反应体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体6.00g，收率42.9％，HPLC纯度97.01％。
实施例3
外消旋DOTAP的制备：
(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在500mL单口瓶中加入50.00g(±)-3-氯-1，2-丙二醇(0.452mol)，178.00g 30％三甲胺水溶液(0.904mol)和50mL乙醇，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(100mL×3),收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体55.94g，收率72.9％，HPLC纯度92.40％。
(±)-DOTAP的合成方法一
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.83g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、16.47g HOAT(0.121mol)、0.98gDMAP(0.008mol)、42mLDMF和25.00g油酸(0.088mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体21.08g，收率74.96％，HPLC纯度96.80％。
(±)-DOTAP的合成方法二
向250mL单口瓶中加入25.00g油酸(0.088mol)和100mL二氯甲烷，然后逐滴滴加15.80g二氯亚砜(0.133mol)；滴加完毕后25℃保温搅拌16h后反应完全。浓缩反应液以除去二氯甲烷和未反应的二氯亚砜，得浅棕色液体即油酰氯。向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.40g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.020mol)、6.08g三乙胺(0.060mol)和20mLDMF，0-5℃下滴加制备的油酰氯，滴完后反应体系自然升温至25℃并继续搅拌9h后反应完全。向反应体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体5.82g，收率41.7％，HPLC纯度96.21％。
实施例4
外消旋DOTAP的制备：
(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在500mL单口瓶中加入50.00g(±)-3-氯-1，2-丙二醇(0.452mol)，178.00g 30％三甲胺水溶液(0.904mol)和50mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(100mL×3),收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体70.00g，收率91.2％，HPLC纯度93.40％。
(±)-DOTAP的合成方法一
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.83g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.20g EDCI(0.121mol)、0.98g DMAP(0.008mol)、42mL DMF和25.00g油酸(0.088mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体23.50g，收率84.4％，HPLC纯度98.66％。
(±)-DOTAP的合成方法二
向250mL单口瓶中加入25.00g油酸(0.088mol)和100mL二氯甲烷，然后逐滴滴加15.80g二氯亚砜(0.133mol)；滴加完毕后25℃保温搅拌16h后反应完全。浓缩反应液以除去二氯甲烷和未反应的二氯亚砜，得浅棕色液体即油酰氯。向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.40g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.020mol)、6.08g三乙胺(0.060mol)和20mL DMSO，0-5℃下滴加制备的油酰氯，滴完后反应体系自然升温至25℃并继续搅拌9h后反应完全。向反应体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体5.50g，收率39.4％，HPLC纯度96.51％。
实施例5
外消旋DOTAP的制备：
(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在500mL单口瓶中加入50.00g(±)-3-氯-1，2-丙二醇(0.452mol)，178.00g 30％三甲胺水溶液(0.904mol)和50mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(100mL×3),收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体70.00g，收率91.2％，HPLC纯度93.40％。
(±)-DOTAP的合成方法一
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.83g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.20g EDCI(0.121mol)、1.03g DIPEA(0.008mol)、42mL DMF和25.00g油酸(0.088mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体23.10g，收率82.1％，HPLC纯度97.36％。
(±)-DOTAP的合成方法二
向250mL单口瓶中加入25.00g油酸(0.088mol)和100mL二氯甲烷，然后逐滴滴加15.80g二氯亚砜(0.133mol)；滴加完毕后25℃保温搅拌16h后反应完全。浓缩反应液以除去二氯甲烷和未反应的二氯亚砜，得浅棕色液体即油酰氯。向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.40g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.020mol)、6.08g三乙胺(0.060mol)和20mL DMSO，0-5℃下滴加制备的油酰氯，滴完后反应体系自然升温至25℃并继续搅拌9h后反应完全。向反应体系中加入40mL水析出大量固体，过滤收集固体得DOTAP氯化物消旋体粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体5.60g，收率40.1％，HPLC纯度96.51％。
通过实施例1，2的比对发现，在步骤一生成(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的过程中，所用溶剂的种类对反应是有影响的，溶剂为水时，反应生成的(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵产率高，以致后续反应生成的DOTAP的产率，纯度相应的提高；通过实施例2,3的比对发现，在(±)-DOTAP的合成方法一的合成过程中所用的缩合剂不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，缩合剂为EDCl时，生成(±)-DOTAP的产率高，纯度好；通过实施例1,4的比对发现，在(±)-DOTAP的合成方法二的合成过程中所用的溶剂不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，溶剂为DMF时，生成(±)-DOTAP的产率高，纯度好；通过实施例4,5的比对发现，在(±)-DOTAP的合成方法一的合成过程中所用的碱不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，碱为DMAP时，生成(±)-DOTAP的产率高，纯度好。
实施例6
(S)-DOTAP的制备：
(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入10.00g(R)-3-氯-1，2-丙二醇(0.090mol)，35.60g 30％三甲胺水溶液(0.180mol)和10mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(R)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(20mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体14.70g，收率95.7％，HPLC纯度96.10％。
(S)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入5.00g(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.029mol)、13.90g EDCI(0.073mol)、0.98g DMAP(0.006mol)、25mL DMF和20.50g油酸(0.073mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入25mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(S)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体15.40g，收率74.8％，HPLC纯度98.32％。
实施例7
(S)-DOTAP的制备：
(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入10.00g(R)-3-氯-1，2-丙二醇(0.090mol)，35.60g 30％三甲胺水溶液(0.180mol)和10mL乙醇，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(R)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(20mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体11.27g，收率73.4％，HPLC纯度95.20％。
(S)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入5.00g(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.029mol)、13.90g EDCI(0.073mol)、0.98g DMAP(0.006mol)、25mL DMF和20.50g油酸(0.073mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入25mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(S)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体14.66，收率71.2％，HPLC纯度97.43％。
实施例8
(S)-DOTAP的制备：
(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入10.00g(R)-3-氯-1，2-丙二醇(0.090mol)，35.60g30％三甲胺水溶液(0.180mol)和10mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(R)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(20mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体14.70g，收率95.7％，HPLC纯度96.10％。
(S)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入5.00g(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.029mol)、13.90g EDCI(0.073mol)、0.98g DMAP(0.006mol)、25mL DMSO和20.50g油酸(0.073mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入25mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(S)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体9.64g，收率46.8％，HPLC纯度97.50％。
实施例9
(S)-DOTAP的制备：
(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入10.00g(R)-3-氯-1，2-丙二醇(0.090mol)，35.60g 30％三甲胺水溶液(0.180mol)和10mL乙醇，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(R)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(20mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体11.37g，收率70.1％，HPLC纯度95.20％。
(S)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入5.00g(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.029mol)、13.90g EDCI(0.073mol)、0.78g DIPEA(0.006mol)、25mL DMF和20.50g油酸(0.073mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入25mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(S)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体14.16，收率68.8％，HPLC纯度97.01％。
通过实施例6，7的比对发现，在生成(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的过程中，所用溶剂的种类对反应是有影响的，溶剂为水时，反应生成的(S)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵产率高，以致后续反应生成的DOTAP的产率，纯度相应的提高；通过实施例6,8的比对发现，在(S)-DOTAP的合成过程中所用的溶剂不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，溶剂为DMF时，生成(S)-DOTAP的产率高，纯度好；通过实施例7,9的比对发现，在(S)-DOTAP的合成过程中所用的碱不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，碱为DMAP时，生成(S)-DOTAP的产率高，纯度好。
实施例10
(R)-DOTAP的制备：
(R)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入5.00g(S)-3-氯-1，2-丙二醇(0.045mol)，17.80g 30％三甲胺水溶液(0.090mol)和5mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(S)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(10mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体6.90g，收率90.5％，HPLC纯度95.80％。
(R)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.90g(R)-2，3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.58g EDCI(0.123mol)、1.00g DMAP(0.008mol)、45mL DMF和25.50g油酸(0.090mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入45mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(R)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体23.40g，收率82.4％，HPLC纯度98.19％。
实施例11
(R)-DOTAP的制备：
(R)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入5.00g(S)-3-氯-1，2-丙二醇(0.045mol)，17.80g 30％三甲胺水溶液(0.090mol)和5mL乙醇，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(S)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(10mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体5.50g，收率71.6％，HPLC纯度94.80％。
(R)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.45g(R)-2，3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.02mol)、11.79g EDCI(0.062mol)、0.51g DIPEA(0.004mol)、23mL DMF和12.75g油酸(0.045mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入23mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(R)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体22.40g，收率78.8％，HPLC纯度97.20％。
实施例12
(R)-DOTAP的制备：
(R)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入5.00g(S)-3-氯-1，2-丙二醇(0.045mol)，17.80g30％三甲胺水溶液(0.090mol)和5mL乙醇，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(S)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(10mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体5.56g，收率72.5％，HPLC纯度95.80％。
(R)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入3.45g(R)-2，3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.02mol)、11.79g EDCI(0.062mol)、0.51g DIPEA(0.004mol)、23mL DMF和12.75g油酸(0.045mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入23mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(R)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体11.30g，收率79.5％，HPLC纯度97.20％。
实施例13
(R)-DOTAP的制备：
(R)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成
在100mL单口瓶中加入5.00g(S)-3-氯-1，2-丙二醇(0.045mol)，17.80g 30％三甲胺水溶液(0.090mol)和5mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料(S)-3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(10mL×3)，收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体6.90g，收率90.5％，HPLC纯度95.80％。
(R)-DOTAP的合成
向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.90g(R)-2，3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.58g EDCI(0.123mol)、1.00g DMAP(0.008mol)、45mL DMSO和25.50g油酸(0.090mol)，反应体系在25℃下保温搅拌16h后反应完全。向体系中加入45mL纯化水析出固体，过滤收集固体得(R)-DOTAP氯化物粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体21.80g，收率76.7％，HPLC纯度96.90％。
通过实施例10，11的比对发现，在生成(R)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的过程中，所用溶剂的种类对反应是有影响的，溶剂为水时，反应生成的(R)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵产率高，以致后续反应生成的DOTAP的产率，纯度相应的提高；通过实施例11,12的比对发现，在(R)-DOTAP的合成过程中所用的碱不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，碱为DMAP时，生成(R)-DOTAP的产率高，纯度好；通过实施例10,13的比对发现，在(R)-DOTAP的合成过程中所用的溶剂不同，以致最终生成的DOTAP的产率，纯度不同，溶剂为DMF时，生成(R)-DOTAP的产率高，纯度好。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
Claims (9)
1.一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于：以3-氯-1,2-丙二醇为基础物质，以三甲胺、油酸为中间反应物来合成DOTAP。
2.根据权利要求1所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇中的氯可以用F，Br，I，HSO4 -，H2PO4 -替代。
3.根据权利要求2所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵：
将3-氯-1,2-丙二醇加入单口瓶中，再加入30％的三甲胺和溶剂，升温至20-100℃，保温搅拌6-20h至原料3-氯-12-丙二醇,反应完全。降温至20℃，用乙酸乙酯洗涤反应液3-5次，收集滤液并在60-70℃减压浓缩至干得类白色固体，即为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵。
步骤二：制备DOTAP：
向氮气置换后的250mL的单口瓶中先后加入步骤一所得产物和缩合剂、碱、溶剂和油酸，反应体系在0-30℃下保温4-16h至反应完全。向体系中加入水使固体析出，过滤收集到的固体，所得滤饼即为DOTAP粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体，即为DOTAP。
步骤三：
将上述步骤得到的DOTAP进行真空冷冻干燥，干燥条件：-10--30℃，干燥12-20h，得到干燥的DOTAP。
4.根据权利要求3所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤二还可通过下面的方式实现：
向250mL单口瓶中加入油酸和二氯甲烷，然后逐滴滴加二氯亚砜，滴加完后0-30℃保温4-16h至反应完全，浓缩反应液除去未反应的二氯甲烷和二氯亚砜，得油酰氯。向氮气置换后的单口瓶中先后加入2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵，碱，溶剂，0-5℃下滴加油酰氯，滴加完毕反应体系升温至20-30℃搅拌9h至反应完全，向体系加水使固体析出，过滤固体即得粗品，经硅胶柱纯化得DOTAP。
5.根据权利要求3所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤一中所述3-氯-1,2-丙二醇包括：(±)-3-氯-12-丙二醇，(S)-3-氯-12-丙二醇，(R)-3-氯-12-丙二醇中的一种；所述溶剂包括水，甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮，四氢呋喃或乙醚中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤一中所述三甲胺包括三甲胺气体，三甲胺-水溶液，三甲胺-四氢呋喃溶液，三甲胺-丙酮溶液或三甲胺-醇溶液中的至少一种，优选三甲胺水溶液；所述三甲胺使用当量为3-氯-1,2-丙二醇的1.5-5.0倍，优选3.0倍。
7.根据权利要求3所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤二中所述缩合剂为HATU、HBTU、HOBT、HOAT、DCC或EDCl中的至少一种，优选EDCl，缩合剂的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的1.0-3.0倍。
8.根据权利要求3所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤二中所述碱为常用有机碱，包括DMAP,DIPEA,三乙胺或吡啶中的至少一种，优选DMAP，碱的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的0.5-3.0倍，优选0.5倍；所述溶剂为DMF和DMSO中的至少一种，优选DMF。
9.根据权利要求4所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤二中所述氯化亚砜的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵使用当量的1.5-2.0倍，优选1.5倍；所述碱为常用有机碱，包括DMAP,DIPEA,三乙胺或吡啶中的至少一种，优选三乙胺，碱的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的0.5-3.0倍，优选3.0倍；所述溶剂为DMF和DMSO中的至少一种，优选DMF。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN87105804A (zh) * | 1986-08-26 | 1988-03-16 | 钟渊化学工业株式会社 | 卤化-3-卤代-2-羟基丙基三甲基铵的制备方法 |
| US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| WO2012024233A2 (en) * | 2010-08-14 | 2012-02-23 | The Regents Of The University Of California | Zwitterionic lipids |
-
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