CN108118028A - 一种间充质干细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干细胞无血清培养基，包括基础培养基，细胞生长因子、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠。通过本发明提供的间充质干细胞无血清培养基所获得的细胞，不仅可避免血清培养基所携带的病原体污染造成纯化细胞困难的问题，而且能够提高细胞生产的稳定性、提高细胞增殖量，以及增强细胞活性。

Description

一种间充质干细胞无血清培养基
技术领域
本发明在于干细胞培养基及方法领域。
背景技术
诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制及探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。
干细胞尽量含量甚微，但广泛分布于哺乳动物的各个组织器官，这些组织或器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤等。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植，而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位。例如，被注入心脏的间充质干细胞能够形成健康的新组织等。1976年，Freidenstein首次发现在骨髓里存在一群不纯一的细胞群体，这种细胞在体外培养时贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，呈克隆性增殖，并提出“骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)的概念。后经过深入和广泛的研究，发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。人类对间充质干细胞的生物学特性、来源、诱导分化、前期临床应用等取得了长足的进展。
目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯化带来很大的困难。而且动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养细胞增加了难度。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无毒性且无污染的间充质干细胞无血清培养基，旨在减少血清成分的引入的问题。
本发明的技术方案如下：
一种间充质干细胞无血清培养基，其中，所述培养基组分包括基础培养基，细胞因子、含铁的食品添加剂、谷氨酰胺和亚硒酸钠；
所述基础培养基为DMEM高糖培养基；
所述的细胞因子为人表皮生长因子、甲状腺素、肾上腺素和胰岛素中一种或者多种；
所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁中一种或多种。
在本发明提供的间充质干细胞无血清培养基中，所述间充质干细胞无血清培养基中，细胞因子的浓度为1-30μg/ml、谷氨酰胺的浓度为1-5mmol/L、含铁的食品添加剂的浓度为1-25ug/ml、亚硒酸钠的浓度为1-20ng/ml。
本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：
获取间充质干细胞，采用上述的间充质干细胞无血清培养基进行体外培养。
实施本发明提供的间充质干细胞无血清培养基及干细胞的培养方法，可以达到以下有益效果：1、采用间充质干细胞无血清培养基能够避免现有技术中血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；2、可避免现有技术存在血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用；3、能够避免不明的血清组分对细胞培养及试验研究的影响；4、成份相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化。
本发明提供的间充质干细胞无血清培养基，该培养基能够快速扩增间充质干细胞同时又不影响间充质干细胞的潜能，间充质干细胞的扩增速度较常规培养基提高3-5倍，而且能用于培养多种组织的间充质干细胞，具有极佳的适用性，所培养的间充质干细胞分化能力强，可分化成多种功能细胞，具有很高的科研和医学应用价值。
具体实施方式
实施例1：
对间充质干细胞增殖的加速作用的实验
1.受试培养基：常规培养基组份：DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清(FBS)；本发明的培养基，包括：DMEM高糖基础培养基、hEGF(人表皮生长因子)10ng/ml、甲状腺素50ng/ml、肾上腺素500ng/ml、胰岛素25ug/ml、转铁蛋白20ug/ml、谷氨酰胺5mM/L、柠檬酸铁1ug/ml、亚硒酸钠10ng/ml。
2.培养干细胞来源：来源于尿液的尿源间充质干细胞
3.体外细胞培养实验：
在无菌条件下，取健康志愿者清洁中段尿液200-250ml，为防止感染，加入含有青霉素100U/ml加链霉素0.1mg/ml的双抗5ml，并立即分离提取。将清洁尿液分装至50ml离心管中，400g离心10min，弃上清。经PBS以400g离心10min洗涤两次。取100μL细胞重悬液并应用台盼蓝检测细胞活性并计数，调整细胞密度，接种至含有无血清培养基的六孔板中，置于37℃下5％CO2饱和湿度的孵箱中培养。14-21天后，可以陆续观察到克隆逐渐向四周延伸，克隆逐渐变大。待细胞达到80％左右的融合度后，胰蛋白酶消化离心，重悬后得到尿液间充质干细胞。
干细胞接种密度为4000个/ml，接种于12孔板中放入培养箱培养(37℃，5％CO2)。每隔24小时里利用血球计数板测一次细胞数量，结果发现，经本发明的培养基培养的尿液间充质干细胞比经常规培养基培养的细胞便显出更快的扩增速度(数据为三次独立实验的平均值)。
时间 0h 24h 48h 72h 96h 120h
常规培养基 1*104 1.3*104 1.9*104 3.0*104 5.2*104 9.7*104
本发明培养基 1*104 1.6*104 2.4*104 3.7*104 10*104 19*104

Claims (5)

1.一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基，其特征在于：还包括细胞生长因子、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述细胞生长因子包括hEGF(人表皮生长因子)、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素中的一种或者多种。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基中细胞因子的浓度为1-30μg/ml、谷氨酰胺的浓度为1-5mmol/L、含铁的食品添加剂的浓度为1-25ug/ml、亚硒酸钠的浓度为1-20ng/ml。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM高糖培养基。
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