CN108114004A

CN108114004A - 可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法

Info

Publication number: CN108114004A
Application number: CN201810052677.8A
Authority: CN
Inventors: 陈廷涛; 辛洪波; 孟凡景
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-06-05

Abstract

本发明提供了一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法，该技术方案基于各类益生菌的生理作用及其协同关系选择了植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌作物菌剂主体，在此基础上从用量配比、活菌数量等角度设计了复配方案，并提供了一种高效的制备方法。本发明菌剂可通过口服直接进行免疫治疗，对肿瘤具有显著的抑制作用，同时不受肿瘤体积、类型的局限，对各类肿瘤均表现出量化的治疗效果。本发明以创新性的技术改进实现了良好的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。

Description

可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，进一步涉及益生菌的生理学应用及肿瘤的治疗，具体涉及一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法。

背景技术

益生菌泛指对有机生命体的生活有益的一类微生物，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌等。近年来，随着对益生菌功效研究的不断深入，各类复合益生菌菌剂已经得到了商品化的应用，泛应涵盖生物工程、工农业、食品安全以及生命健康等领域。

肠道益生菌是指寄居于肠道的微生物，其中有500多种肠道微生物，其数目达到10¹⁴之多。一方面，肠道微生物进行分子拟态，肠道微生物不仅水解植物多糖，而且肠道微生物能够水解宿主细胞表面的多糖。通过一系列的加工“对L-岩藻糖的水解以及合成”，使得细菌表面的抗原与宿主细胞表面高度一致，以逃避宿主的免疫细胞的识别，从而宿主肠道免疫系统对这些肠道微生物产生免疫耐受，因此肠道益生菌能够逃避免疫系统。另一方面，这些肠道微生物，在人体的免疫系统起着相当重要的作用。它们帮助肠道建立完善的免疫功能，例如，无菌老鼠发育受阻之后，在注入了常规饲养动物断奶前的肠内容物之后，这些老鼠恢复了免疫应答。因此，肠道益生菌在肠道发育和成熟的过程中发挥重要的作用，是肠道建立正常免疫功能所必须的。

尽管在维持肠道的正常环境中具有重要作用，但肠道益生菌能否对其他食源性疾病起到预防或治疗作用，现有技术中仍缺乏成熟的研究，在这种情况下，有必要进一步探索益生菌对人体其他生理作用的影响，进而挖掘其深层次的药物用途。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法，以拓展肿瘤的治疗途径。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规治疗方法对肿瘤的治疗效果有待提升。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂，由益生菌干粉和淀粉按1:1的重量比混合而成；其中，所述益生菌干粉由活菌数比为(1～3):(1～3):(1～3):(1～3):(1～3)的植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌组成。

作为优选，植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌的活菌数比为1:1:1:1:1。

作为优选，所述复合益生菌菌剂中活菌数量不低于10⁹个/g。

同时，本发明提供了一种上述复合益生菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)益生菌的选取和活化：取植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌的菌种，各自按培养基体积的5％分别接种于5mL MRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜；分别取培养所得的五种菌液，各自按培养基体积的5％分别接种5mLMRS培养基中，二次活化；活化至PH＝4.2时终止；

2)分别取步骤1)所得的五种活化产物，按1:1:1:1:1的体积比混合，固液分离取沉淀即为菌体，按照菌体总质量与冻干保护剂质量为1:1的比例向其中加入冻干保护剂；

3)放入冻干机中冻干。

作为优选，步骤2)所述固液分离是离心。

作为优选，步骤2)所述的冻干保护剂含有质量分数为10％的脱脂乳、质量分数为6％的海藻糖、质量分数为2％凝胶。

作为优选，还包括以下步骤4)：向步骤3)所得产物中加入奶粉并进行分装。分装后的产品通过封口器封口，常温保存以备用。

作为优选，还包括以下步骤4)：取步骤3)所得的冻干粉，加生理盐水按10～10⁶比例稀释，取50μL涂平板，过夜培养，进行活菌计数。

当本发明菌剂用于肿瘤治疗时，将已获得的复合益生菌菌剂直接对病人进行口服给药，观察病人的体重变化以及肿瘤的大小。

本发明提供了一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法，该技术方案基于各类益生菌的生理作用及其协同关系选择了植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌作物菌剂主体，在此基础上从用量配比、活菌数量等角度设计了复配方案，并提供了一种高效的制备方法。本发明菌剂可通过口服直接进行免疫治疗，对肿瘤具有显著的抑制作用，同时不受肿瘤体积、类型的局限，对各类肿瘤均表现出量化的治疗效果。

由于肿瘤具有抗原性，可以通过一系列的免疫应答达到对机体的癌细胞的清除，因此对肿瘤的治疗有较大的前景。但由于肿瘤表面的抗原表达十分微弱，有时甚至表达成自身抗原，受到T-reg细胞等监控，从而逃过机体的免疫应答并产生免疫耐受。目前有一些新的思路，将对肿瘤靶向性识别的鼠伤寒沙门氏菌进行减毒，当大量的细菌结合形成表面抗原簇，从而引导T细胞使得其摧毁肿瘤细胞。但由于鼠伤寒沙门氏菌是致病菌，难以控制。但复合益生菌采用的是益生菌，不用监控，因此能达到较好的治疗效果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1复合益生菌最佳PH的确定

初次活化：选取植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌5种不同所需菌群，从-80℃冰箱取出所需益生菌，按培养基体积的5％接种于5mL MRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜。

二次活化：取过夜培养的益生菌，按培养基体积的5％接种5mL MRS培养基中，二次活化。

活化设定为:分别以25℃、30℃、37℃、42℃设置温度梯度，并设置PH梯度为3、4、5、6、7、8、9；通过活菌计数法，确定复合益生菌的最佳活化条件。

实施例1的结果表明，在37℃，PH＝4.2的条件下发酵48h，10000rpm/min10离心后，发酵液澄清透亮。

实施例2肿瘤指标检测

实验材料：复合益生菌制剂，一次性针管，喂养器具，BalBc小鼠若干只

实验步骤：

(1)体重检测

A将小白鼠分为两组，分为实验组和空白对照组。

B将复合益生菌制剂用水溶解

C取完全溶解的复合益生菌制剂，取实验组小白鼠，用喂养器具对小白鼠进行灌胃；之后用喂养器具抽取等量的蒸馏水，对空白组小白鼠进行喂养。连续喂养3个月。

D每日对小白鼠的重量进行称量，观察小白鼠的体重变化，并照相。

实验结果表明，复合益生菌制剂对体重的维持具有较好的作用。

(2)肿瘤大小检测

A将肿瘤细胞注入小白鼠皮下

B将小白鼠分为两组，分为实验组和空白对照组。

C将复合益生菌制剂用水溶解

D取完全溶解的复合益生菌制剂，取实验组小白鼠，用喂养器具对小白鼠进行灌胃；之后用喂养器具抽取等量的蒸馏水，对空白组小白鼠进行喂养。连续喂养3个月。

E观察肿瘤大小，并照相。

实验结果表明，复合益生菌制剂使得肿瘤明显消退。

实施例3

一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂，由益生菌干粉和淀粉按1:1的重量比混合而成；其中，所述益生菌干粉由活菌数比为1:1:1:1:1的植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌组成；所述复合益生菌菌剂中活菌数量不低于10⁹个/g。

一种上述复合益生菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

3)放入冻干机中冻干。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述固液分离是离心。

步骤2)所述的冻干保护剂含有质量分数为10％的脱脂乳、质量分数为6％的海藻糖、质量分数为2％凝胶。

还包括以下步骤4)：向步骤3)所得产物中加入奶粉并进行分装。

还包括以下步骤5)：取分装产物，加生理盐水按10～10⁶比例稀释，取50μL涂平板，过夜培养，进行活菌计数。

实施例4

一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂，其特征在于由益生菌干粉和淀粉按1:1的重量比混合而成；其中，所述益生菌干粉由活菌数比为1:2:3:2:1的植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌组成。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂，其特征在于由益生菌干粉和淀粉按1:1的重量比混合而成；其中，所述益生菌干粉由活菌数比为(1～3):(1～3):(1～3):(1～3):(1～3)的植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌组成。

2.根据权利要求1所述的一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂，其特征在于植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌的活菌数比为1:1:1:1:1。

3.根据权利要求1所述的一种可直接给药进行免疫治疗的复合益生菌菌剂，其特征在于所述复合益生菌菌剂中活菌数量不低于10⁹个/g。

4.权利要求1所述复合益生菌菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)益生菌的选取和活化：取植物乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌的菌种，各自按培养基体积的5％分别接种于5mL MRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜；分别取培养所得的五种菌液，各自按培养基体积的5％分别接种5mL MRS培养基中，二次活化；活化至PH＝4.2时终止；

3)放入冻干机中冻干。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述固液分离是离心。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述的冻干保护剂含有质量分数为10％的脱脂乳、质量分数为6％的海藻糖、质量分数为2％凝胶。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括以下步骤4)：向步骤3)所得产物中加入奶粉并进行分装。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括以下步骤4)：取步骤3)所得的冻干粉，加生理盐水按10～10⁶比例稀释，取50μL涂平板，过夜培养，进行活菌计数。