CN108112234A - 含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制并预防肌病的组合物 - Google Patents
含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制并预防肌病的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制和预防肌病的组合物，更详细的是，豆的生长过程中R6至R8时期由于含有豆叶萃取物，可抑制对肌细胞特异表达的Atrogin1和Murf1的过表达，恢复肌细胞的细胞活性，从而具有抑制和预防肌肉损伤的效果。
Description
技术领域
本发明主张基于2015年6月30日韩国专利发明第10-2015-0092701号的优先权利益，该韩国专利发明的文献中提到的所有内容包含在说明中，作为本说明书的一部分。
本发明涉及一种含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制并预防肌病的组合物，适用于有关肌病的食品、药学或化妆品组合物的制备领域。
背景技术
人出生后到30岁之前肌肉一直在生长并变得健壮，但从30岁开始肌肉的密度和功能就渐渐变弱了。尤其是如果不坚持锻炼身体，那么每10年就会损失3-5％的肌肉量，即使是坚持运动也会有某种程度的肌肉流失。虽然这种大部分的肌肉流失主要是伴随着老化而发生的现象，其在具体的诱发机制下具有各种不同的现象。
与一般由单纯老化引起的肌肉流失不同的是，病理方面的肌损失(sarcopenia)直接诱发肌力低下，带来跌伤或骨折的高度危险，诱发肌病，引起各种身体功能的降低和障碍，糖尿病和心血管类肌病的危险性也会增加8.2倍以上，整体上的死亡危害性变高。
因此，肌肉流失的抑制和预防是与其他有机关联的多种肌病的改善和预防，整体健康问题有直接联系的重要的解决课题中之一。另外，目前我国的出生率降低以及由平均寿命延长带来的人口高龄化急剧发展，尤其，根据2010年统计厅的资料，2005年65岁以上的老年人口占比为9.1％，到2020年预计能达到15.7％，2030年预计能达到24.1％。这是OECD国家中最快的增长率，从社会福利角度上被划分至急需解决的课题中。
为了抑制和预防这种趋势下的肌肉流失，很多的研究正在进行中。其中具有代表性的是包括构成肌肉的必需氨基酸-白氨酸(leucine)的BCAA(branched-chain aminoacid)的有关研究。但是有报告称与上述研究有关的白氨酸不能对老人的骨骼肌肉量变化产生很大的影响，所以估计还是很难成为肌肉流失症的根本的解决方法。
一方面，最近发现的与肌肉流失症有关的损失素第一型基因(Atrogin1)和肌肉环状指基因1(Murf1)的特异功能备受瞩目。Atrogin1和Murf1作为对肌细胞特别表达的泛激素连接酶(ubiquitin ligase)，它们的表达增加引起的肌肉蛋白质们成为泛素化(ubiquitination)，蛋白体(proteosome)依赖性地分解，从而诱发肌肉流失。
本发明的发明者们立足于新的观点寻找肌肉流失解决方案的过程中，确认了利用与所述机制相关的含有豆叶萃取物这一有效成分的组合物，对抑制肌肉流失具有相当的效果，从而完成了本发明。
[已有文献]
含有豆叶萃取物这一有效成分的用于预防或治疗肥胖、高血脂、动脉硬化、脂肪肝、糖尿病或代谢症候群的制剂(大韩民国公开专利10-2012-0022085)。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提供一种含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制和预防肌病的组合物。
具体是以提供一种能够抑制和预防肌肉流失的物质为目的。
同时旨在提供一种含有获取容易且副作用最小的来自天然的豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制和预防肌病的食品组合物、药学组合物或化妆品组合物。
为了达到上述目的，本发明提供一种含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制和预防肌病的组合物。
特征之一：所述豆叶萃取物的生长阶段中R6至R8时期的豆叶的萃取物。
特征之一：所述豆叶萃取物选自生豆叶萃取物、其衍生物、其脱水物、其脱水衍生物、其发酵物以及其浓缩物中的任何一个或一个以上。
所述组合物可以食品、药学或化妆品组合物等形态被使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过上述课题解决手段提供可以抑制和预防肌病的组合物。
具体来说是提供一种含有豆叶萃取物这一有效成分的可以抑制和预防肌肉流失的物质，即提供一种可间接改善或预防多种肌病的物质。
所提供的有效成分豆叶萃取物作为天然成分对人体的副作用小且获取容易，同时在制备时充分使用了以往在产业上利用度低下的豆叶，因此也很实惠。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是利用HPLC将(a)豆叶萃取物和(b)豆萃取物的成分进行比较和分析的结果；
图2是正常的肌细胞(control)与各实验组、对比组和比较组进行比较时相对的细胞活性度(％)的示意图；
图3是正常的肌细胞(control)与各实验组、对比组和比较组进行比较时相对的Atrogin1基因(mRNA)的表达量(％)的示意图；
图4是正常的肌细胞(control)与各实验组、对比组和比较组进行比较时相对的Murf1的基因(mRNA)的表达量(％)的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制和预防肌病(myopathy)的组合物。
本发明中“肌病”的含义应该理解为，只要是与下述的Atrogin1或Murf1蛋白质的表达有直接间接关系的肌病均无一例外地全部包括在内。对此并不做限定，但最理想的主要是伴随着肌肉减少症、肌肉流失症及肌肉萎缩症以及与此有直接间接关系的所有肌病。
以下将对本发明的内容进行详细说明。当然，为了帮助理解本发明，下述内容仅记载了最具代表性的实施形态，但本发明的权利范围并不限于此，包括与下述内容均等的全部范围。
本发明所涉及的‘豆’，其种类并无限制，例如可选自鼠目太(RhynchosiaNolubilis)、中国夏大豆(Glycine max(L.)Merr.)、蚕豆(Vicia faba)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、油豆角(Phaseolus vulgaris L.)、红小豆(Vigna angularis)、怀特赤豆(Phaseolus angularis W.F.WIGHT.)、豌豆(Pisum sativum L.)和大豆(GlycinemaxMERR)等组成的群组中任意一种或一种以上，但并无限制。
只是，本发明中萃取的对象仅限于“豆叶”,正如下述实施例1和图1所示，豆和豆叶的物质互不相同，是因为与豆的萃取物相比，豆叶萃取物抑制和预防肌病的效果更令人瞩目。另外，本发明可充分利用以往因产业上利用度低而被丢弃的豆叶，所以经济实惠且制备容易。
本发明中抑制和预防肌病效果更好的豆叶萃取物，是下述豆的整个生长阶段中R6至R8时期的豆叶萃取物。
VE时期：种下种子1至2周后，豆叶苗从土壤中长出
VC时期：豆叶完全展开，向上伸长了一节，外叶生成
V1时期：从第一片外叶开始长出一节，长出3片叶子
V2时期：在V1时期的基础上又长出一节，长出3片叶子
V3时期：在V2时期的基础上又长出一节，长出3片叶子
V4时期：在V3时期的基础上又长出一节，长出3片叶子
R2时期：豆花盛开的状态
R4时期：豆壳完全长出的状态
R5时期：豆壳里长出豆的状态
R6时期：豆壳里绿色的豆子完全长出的状态
R7时期：豆壳和豆变黄的状态
R8时期：豆叶掉下，豆壳和豆子完全变黄的状态
较为理想的是R7至R8时期的豆叶，最理想的是R7时期的豆叶萃取物。所述R7至R8时期的豆叶是叶子颜色变黄时期的豆叶，也被称作“枫叶豆叶”。
本说明书中的‘萃取物’是指从天然萃取物中萃取的成分物质，不论萃取方法、萃取溶剂、萃取的成分或萃取物的形态。例如，用水或有机溶剂从天然物萃取可溶解于溶剂的成分，包括所有萃取天然物的特定成分、油类特定成分后获取的所有，是一个广义的概念，包括萃取后经过加工等获取的物质或所有。具体来说，本发明的萃取物可以是生豆叶萃取物、追加加工或发酵或经酵素处理的衍生物、脱水物、脱水衍生物、发酵物及浓缩物所组成的群中选择任何一个以上的形态。
获取本发明所涉及的豆叶萃取物的方法是该业界普遍使用的方法，并不限于某一特定的方法，通常是将经过洗涤和干燥的细末化的豆叶粉末放入水或有机溶剂后萃取，使之沉降后通过过滤并离心分离后将残渣和萃余液分开，所述经分离的萃余液用减压浓缩的方法获取豆叶萃取物。
为了进行萃取，可以从水、乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿或这些溶剂和水的混合溶剂中选择任何一个或一个以上作为溶剂，出于对原料稳定性的考虑，最好使用水或30-70％浓度的乙醇。萃取物在通过反复萃取后所获取的各萃余液混合后使用更有效果。也就是说，如上从乙醇获取第1次萃取物后，在残渣中加入乙酸乙酯获取第2次萃取物，对该残渣反复进行1-2回的追加萃取后，混合所述萃取物的萃余液。
获得所述萃取物后，可用该技术领域公开的常见方法在常温下冷浸、加热并过滤后获取液状物质，或可进一步进行溶剂蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥的过程。
对于萃取物的浓度并无特别的限定，参考下述实施例2或实验例1-2，通常在100ppm内外也能充分体现出效果。
具体来说，根据疾病的症状和程度以及组合物的提供形态可使用各种浓度。
本发明所涉及的豆叶萃取物抑制骨骼肌的泛激素连接酶的表达或活性，从而抑制和预防肌病。通常体内的泛激素连接酶在杀灭对象蛋白质的表面用一种杀灭信号使泛激素附着，是诱导相应蛋白质分解的一种酵素。尤其是，骨骼肌减少时存在特异表达的泛激素连接酶Atrogin1和Murf1。但是所述Atrogin1和Murf1不同于诱导杀灭不必要的蛋白质的体内泛激素连接酶，在主要伴随病理性肌肉损失或肌肉萎缩的肌病患者身上看到了过表达的现象，是已知目前诱发肌肉减少症(sarcopenia)的分子生物学的直接原因中的一个。所述Atrogin1和Murf1过表达后，与肌细胞的合成相比，分解路径过于活性化，由此可能引起正常肌细胞的消失。
有关所述机制，本发明的豆叶萃取物抑制Atrogin1和Murf1基因的过表达，从而可防止肌肉流失并进一步改善和预防与此有机关联的其他肌病。
当大多数的肌肉流失肌病被归类于随着老化而出现的退行性疾患的一种，本发明的组合物可将上层(senior)作为对象积极使用。
本发明的组合物可以食品、药学和化妆品组合物中任何一种剂型提供。
食品组合物作为本发明的一种利用形态，主要是健康机能食品组合物，含有所述豆叶萃取物这一有效成分的混合在传统食品组合物中，直接添加或可使用其他食品或其食品的一种成分。对所述食品的种类并无特别的限制，包括饮料、茶、饮用剂、酒精饮料及维他命复合剂等，可利用一般可认定的所有形态。
药学组合物作为本发明的另一利用形态，可包括所述豆叶萃取物以及一种或一种以上其他有效成分以外的可用于药剂的载体进行制备。也就是说，生理盐水、无菌水、点滴液、缓冲生理盐水、大马革氏玫瑰溶液、甘油、乙醇及混合这些成分中任何一个或一个以上后使用，根据需要添加抗酸化剂、缓冲液、杀真菌剂等其他常规添加剂。
所述药学组合物可在另外添加稀释剂、喷射剂、界面活性剂、结合剂和润滑剂后制成水溶液、悬浊液、乳浊液等类似的注射用制剂和口服制剂。
所述口服制剂可以是选自锭剂、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、粉剂、软质胶囊剂、硬质胶囊剂、乳浊剂、糖浆剂和饮用剂组成的群组中任何一种或一种以上的形态。
化妆品组合物作为本发明的另一利用形态，可含有所述豆叶萃取物这一有效成分，还可含有其他功能型添加物和包含于普通化妆品组合物的所有成分。
所述功能型添加物可以是水溶性维他命、油溶性维他命、高分子肽、高分子多糖、鞘脂和海草精华中任何一种或一种以上。另外根据需要，也可再配合油脂成分、保湿剂、润滑剂、界面活性剂、有机和无机颜料、有机粉体、紫外线吸收剂、防腐剂、灭菌剂、防酸剂、植物萃取物、pH值调节剂、酒精、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、净化水等。
所述化妆品组合物的剂型可根据使用特点选择合适的，如可提供化妆水、皮肤软化剂、护肤水、收敛水、润肤液、乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底液、散粉、精华液、营养精华液、面膜、肥皂、洗面奶、洁面乳、洁面液、洁面霜、护体乳和身体清洁乳、喷雾等剂型。
以下将罗列本发明有关的实施例1和2以及实验例1和2。下述实施例和实验例只是与本发明的实施和效果有关的举例而已，本发明的权利范围和效果并不仅限于此。
【实施例1】豆叶和豆萃取物的成分比较
为了确定豆叶萃取物和豆萃取物的组成成分不同，利用HPLC(高效液相色谱法，high performance liquid chromatography)进行了成分分析。
HPLC分析条件
豆叶萃取物、豆萃取物各放在70％的乙醇中进行溶解，制成10,000ppm的溶液后，利用HPLC(Waters公司，2695型)、检测机(Waters公司，2996PDA检测机)对成分进行了分析。固定相用了Kanto Chemical公司的Mightysil RP-18和GP 250-4.6(5μm)柱，流动相则是将水和针对乙腈的乙酸0.1％溶液进行混合后使用。
HPLC分析结果
HPLC成分分析结果如图1所示。图1中，(a)是豆叶萃取物，(b)是豆萃取物。
从图1可以看出豆叶萃取物和豆萃取物的分离样式互不相同。各时点的峰值所显示的部分全都不同，可明确确定豆萃取物和豆叶萃取物的组成成分互不相同。
【实施例2】豆叶萃取物的制备
在不同生长期(VC/V2/V4/R2/R4/R6/R7时期，共7个时期)提取的各豆叶用纯净水洗涤干燥后碾成细末。将所述豆叶粉末100g放入1升的70重量％的乙醇中，在25℃的常温下萃取12小时后，用300网眼过滤器进行了过滤。
将所述萃取液放入3升的分液漏斗，加入1升醋酸纤维后，摇晃混合，直至完全分为2层后取出上层(醋酸纤维层)。下层再用分液漏斗进行2次萃取。将每次分离出的上层全部合在一起后用装有冷却电容机的蒸馏装置减压浓缩至50并干燥。这样就获取了各时期的豆叶萃取物10.3克。
【实验例1】肌细胞的细胞活性恢复能力的评估
本实验例1中，为了评估豆叶萃取物对地塞米松(Dexamethasone)引起的肌肉流失诱发模型中肌细胞的细胞活性减少的恢复效能，进行了实验。
地塞米松作为糖质糖皮质激素的一种，在实验管内(in vitro)和活体内(invivo)，增加Atrogin1和Murf1的表达，促进蛋白质的分解作用，从而诱发骨骼肌的减少并诱导肌细胞的杀灭，使细胞的活性低下。因此，在肌细胞中经地塞米松处理的实验模型是对肌肉减少症的机能评估较为有用的评估模型，正被广泛使用。
本实验例1中使用的C2C12(鼠的根源细胞)购自美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection,Manassas，VA，USA)并使用，在细胞培养时使用了10％FBS和含有100units/mL青霉素(Penicillin)、100mg/mL链霉素(streptomycin)的DMEM培养基。具体的实验方法如下。
首先，为了准备实验组，将C2C12分注入12孔检测盘后，一直培养至细胞在检测盘融合(confluent)至80-90％的程度。然后，用2％马的血清(Horse serum)和DMEM培养基交换后诱导了细胞的分化。培养基交换后再培养5到7天，等到细胞的分化完成后，将地塞米松处理至最终浓度为1μM，与此同时，将在上述实施例2中获取的VC/V2/V4/R2/R4/R6/R7时期的豆叶萃取物处理至最终浓度为100ppm。
一方面，对照组中使用了除地塞米松以外未经任何处理的细胞，比较组中使用了将已知能抑制炎症且对肌肉痛有效的物质右旋布洛芬(dexibuprofen)处理为最终浓度为100μM的细胞，代替了豆叶萃取物。
物质处理过24小时后，用含有10％的CCK8(cholecystokinin 8)溶液的培养基进行交换，反应10分钟后，测定450nm波长下的吸光度，测出细胞活性。为了提高可信度，每种实验材料均在反复测定3回之后导出平均值。
实验的结果如图2和下列表1。
表1
图2是正常肌细胞(control)进行比较的实验组、对照组(Dex)和比较组(dexibuprofen)的相对细胞活性度的示意图。上述表1中记录的是与对照组对比的实验组和比较组的细胞活性度变化量。
通过图2可以确认，与正常的肌细胞相比，经地塞米松处理的对照组的情况是，肌细胞活性变得低下。与此对照组相比，可以确认用豆叶萃取物处理的实验组中肌细胞的活性完全恢复。
具体看上述表1，R4至R7时期，在豆叶萃取物处理的实验组中的肌细胞活性与对照组对比明显增加了6.2％至18.1％，尤其是R7时期显示出豆叶萃取物十分有效地恢复了细胞活性。
由此可确认，本发明的豆叶萃取物具有抑制和预防肌肉流失的效能。
一方面，在比较组中未观察到经右旋布洛芬处理的群组中肌细胞的活性恢复，由此可知一般的肌肉痛抑制物质不适于抑制或预防肌肉流失，其作用机制也是不同的。
[实验例2]Atrogin1和Murf1基因(mRNA)的表达抑制能力的评估
本实验例2中，为了评估豆叶萃取物对地塞米松诱发的肌肉流失模型中Atrogin1和Murf1的mRNA的过表达的抑制效果，进行了实验。
本实验例2的实验组、对照组和比较组的准备和上述实验例1相同。
但是，各最终物质处理过6小时后，用冷的生理盐水洗涤2回，再用TRIzol抽提试剂(TRIzol agent,美国默塞飞世尔公司)萃取RNA。
接着，在所述萃取后，用定量的1ug/ul的RNA和逆转系统(普洛麦格Promega)合成cDNA。对合成的cDNA和Atrogin1、Murf1、GAPDH的各基因用事先设计的引体(Primer)和探测器(probe)(美国应用生物系统公司)测定各基因的表达现象。此时聚合酶链反应(PCR:polymerase chain reaction)的反应和分析使用了旋转器-振3000系统(Rotor-Gene 3000系统；澳洲悉尼科贝特研究)。为了提高可信度，各样品反复测定3回后导出其平均值。
实验结果如图3、图4如下表2和表3。
表2
表3
图3和图4是与正常肌细胞(control)对比的实验组、对照组(Dex)和比较组(dexibuprofen)的相对Atrogin1、Murf1的基因(mRNA)表达量的示意图。上述表2和表3中记录的是与对照组对比的实验组和比较组的Atrogin1、Murf1基因(mRNA)表达变化量。
通过图3和图4可以确认，与正常的肌细胞相比，经地塞米松处理的对照组的情况是，Atrogin1、Murf1基因变为过表达。与上述对照组相比显示出用豆叶萃取物进行再处理的实验组中，Atrogin1、Murf1基因表达量整体减少。
具体来说，通过上述表2可以看出Atrogin1中，与对照组对比，R2至R7时期的豆叶萃取物处理的实验组中基因的表达量明显减少至8.2至31.6％，尤其是R7时期在豆叶萃取物经处理的实验组中十分有效。
另外，通过上述表3可以看出Murf1中，与对照组对比，V4至R7时期的豆叶萃取物处理的实验组中基因的表达量明显减少至8.5至24.1％，尤其是R7时期在豆叶萃取物经处理的实验组中十分有效。
一方面，右旋布洛芬处理的比较组中，Atrogin1和Murf1基因的表达抑制效果十分微小，由此可以看出一般的肌肉痛抑制物质不适于肌肉流失的抑制或预防，其作用机制也是不同的。
从上述结果可期待，本发明的含有豆叶萃取物这一有效成分的组合物具有抑制和预防肌病的优良效果，很大可能以食品、药学或化妆品组合物等多种形式投入产业。
Claims (15)
1.一种含有豆叶萃取物这一有效成分的用于抑制和预防肌病的组合物。
2.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述肌病是选自肌肉减少症、肌肉流失和肌肉萎缩等肌病群组中任何一个或以上。
3.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述肌病是老年性肌病。
4.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是使所述肌细胞的细胞活性增加。
5.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是抑制骨骼肌的泛激素连接酶(ubiquit in ligase)的表达或活性。
6.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是抑制Atrogin1或Murf1基因的表达。
7.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述豆叶萃取物是豆的生长过程中R6至R8时期中任何一个时期的豆叶萃取物。
8.根据权利请求项7所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述豆叶萃取物是豆的生长过程中R7时期的豆叶萃取物。
9.根据权利请求项7所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述的豆是选自鼠目太、中国夏大豆、蚕豆、菜豆、油豆角、红小豆、怀特赤豆、豌豆和大豆组成的群组中的任意一种或一种以上。
10.根据权利请求项1所述的
用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述豆叶萃取物是用水、有机溶剂、或它们的混合物中选择的溶剂萃取的。
11.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述豆叶萃取物是用乙醇和醋酸纤维依次萃取的。
12.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述豆叶萃取物的获取方法包括以下步骤：
将豆叶加入水、有机溶剂、或它们的混合物溶剂进行1次萃取的阶段；
在所述1次萃取物中加入有机溶剂进行2次萃取的阶段；以及
用包括含有所述1次和2次萃取物的最终萃取物进行减压萃取浓缩和干燥的阶段。
13.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述豆叶萃取物选自生豆叶萃取物和衍生物、脱水物、脱水衍生物、发酵物及浓缩物所组成的群中选择任何一个以上。
14.根据权利请求项1所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述组合物是食品组合物、药学组合物和化妆品组合物中的任意一种。
15.根据权利请求项14所述的用于抑制和预防肌病的组合物，其特征是所述药学组合物是口服剂型的组合物。
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