CN108107206A - A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108107206A
CN108107206A CN201711218250.2A CN201711218250A CN108107206A CN 108107206 A CN108107206 A CN 108107206A CN 201711218250 A CN201711218250 A CN 201711218250A CN 108107206 A CN108107206 A CN 108107206A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
influenza virus
area
monoclonal antibody
coated film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711218250.2A
Other languages
English (en)
Inventor
马岚
吴峰
岑瑜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Original Assignee
Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Graduate School Tsinghua University filed Critical Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority to CN201711218250.2A priority Critical patent/CN108107206A/zh
Publication of CN108107206A publication Critical patent/CN108107206A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用。其中，该流感病毒的检测试剂盒包括：基底层；第一包被膜，所述第一包被膜形成在所述基底层上，且包被有荧光标记的第一抗体，所述第一抗体特异性结合所述A型H5亚型流感病毒；第二包被膜，所述第二包被膜形成在所述基底层上，并与所述第一包被膜相连，所述第二包被膜上设置有分离的第一区域和第二区域，且第一区域位于近所述第一包被膜端，其中，所述第一区域包被有第二抗体，所述第二抗体和所述第一抗体能够特异性结合所述A型H5亚型流感病毒，所述第二区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一抗体。该试剂盒的检测灵敏度高、特异性强、速度快。

Description

A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体地，涉及A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用，更具体地，涉及A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒和检测A型H5亚型流感病毒的方法
背景技术
A型流感病毒即甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒容易发生变异，其亚型常被人们称为“禽流感”。禽流感是严重危害世界养禽业的毁灭性疫病，其病原容易突变，具有多个血清型，给该病的防控带来困难，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡。甲型流感H5亚型对人类致病性高,据WHO统计，人感染H5亚型的死亡率高达60％。
目前常见的A型H5亚型流感病毒的检测方法主要有：核酸检测和病毒分离鉴定。核酸检测有RT-PCR检测和real-time RT-PCR检测方法，核酸检测依赖于样本模板RNA的质与量，操作要求严格，需要大量仪器与设备及专业人员操作，检测时间较长，检测灵敏度高。病毒分离鉴定常用于对阳性样品病毒的亚型鉴定，需要专门实验室才能进行。
由此，A型H5亚型流感病毒的检测方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒的检测灵敏度高、特异性强、能快速、简便地检测A型H5亚型流感病毒。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种流感病毒的检测试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：基底层；第一包被膜，所述第一包被膜形成在所述基底层上，且包被有荧光标记的第一抗体，所述第一抗体特异性结合所述A型H5亚型流感病毒；第二包被膜，所述第二包被膜形成在所述基底层上，并与所述第一包被膜相连，所述第二包被膜上设置有分离的第一区域和第二区域，且第一区域位于近所述第一包被膜端，其中，所述第一区域包被有第二抗体，所述第二抗体和所述第一抗体能够特异性结合所述A型H5亚型流感病毒，所述第二区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一抗体。
根据本发明实施例的试剂盒，发明人通过对大量A型H5亚型流感病毒的抗体进行筛选，获得能同时特异性结合于A型H5亚型流感病毒的两种抗体，即本发明的两种抗体(即第一抗体和第二抗体)能与抗原的不同表面决定簇特异性结合，从而形成双抗体夹心复合物，基于检测复合物中的第一抗体上带的荧光标记的荧光强度来判断样品中是否存在所说的抗原。该试剂盒的检测灵敏度高、特异性强，检测时间短，检测成本低，易于操作和推广。
另外，根据本发明上述实施例的流感病毒的检测试剂盒，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：吸水垫，所述吸水垫与所述第二包被膜的远所述第一包被膜端相连。
根据本发明的实施例，所述第一抗体和所述第二抗体均为单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-35的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-71的单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-22的单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述荧光标记为荧光微球标记。
根据本发明的实施例，所述荧光微球的平均直径为10-500nm。根据本发明的优选实施例，所述荧光微球的平均直径为20-300nm。根据本发明的更优选实施例，所述荧光微球的平均直径为100-120nm。
根据本发明的实施例，所述第一抗体与所述荧光微球标记通过肽键共价结合。
根据本发明的实施例，所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
根据本发明的实施例，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被膜为硝酸纤维素膜。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测流感病毒的方法。根据本发明的实施例，该方法包括，将待测样本与前述A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒中的第一包被膜接触；检测所述试剂盒中的第一区域和第二区域的荧光强度，获得第一区域荧光检测值和第二区域荧光检测值；基于所述第一区域荧光检测值和第二区域荧光检测值，判定所述待测样本中是否存在A型H5亚型流感病毒。由此，利用该方法检测A型H5亚型流感病毒，检测的灵敏度高、特异性强，检测时间短，检测成本低，易于操作和推广。
根据本发明的实施例，将荧光强度比值与阈值进行比较，判定所述待测样本中是否存在A型H5亚型流感病毒，其中，所述荧光强度比值＝第一区域荧光检测值/第二区域荧光检测值。
根据本发明的实施例，所述阈值为0.01-0.03。根据本发明的优选实施例，所述阈值为0.018。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的流感病毒的检测试剂盒的主视结构示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的流感病毒的检测试剂盒的侧视结构示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的流感病毒的检测试剂盒的主视结构示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的制备流感病毒的检测试剂盒的方法的流程示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的流感病毒的检测试剂盒的检测值与浓度的曲线示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
试剂盒
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种流感病毒的检测试剂盒。发明人通过对大量A型H5亚型流感病毒的抗体进行筛选，获得能同时特异性结合于A型H5亚型流感病毒的两种抗体，即本发明实施例的两种抗体(即第一抗体和第二抗体)能与抗原的不同表面决定簇特异性结合，从而形成双抗体夹心复合物，基于检测复合物中的第一抗体上带的荧光标记的荧光强度来判断样品中是否存在所说的抗原。该试剂盒的检测灵敏度高、特异性强，检测时间短，检测成本低，易于操作和推广。
为了便于理解本发明实施例的试剂盒，参考图1和2，根据本发明的实施例，对该试剂盒进行解释说明，具体如下：
基底层100：根据本发明的实施例，基底层100的类型不受特别的限制，只要不与待测样品发生反应或者不影响抗原抗体结合即可，本领域技术人员可以根据需要自行进行选择。根据本发明的一些具体实施例，可以选取惰性材料作为基底层，比如纸板和塑料板等。
第一包被膜200：该第一包被膜200形成在基底层100上，且包被有荧光标记的第一抗体，该第一抗体特异性结合A型H5亚型流感病毒。其中，需要说明的是，第一包被膜200可以是部分区域也可以是全部区域包被有荧光标记的第一抗体。根据本发明的具体实施例，第一包被膜中的包被有荧光标记第一抗体的区域为长约2cm、宽约3mm的长方形。由此，待测样品与第一抗体结合效果好。
其中，需要说明的是，本发明中的术语“包被”为免疫学术语，包含固定和/或吸附之意。
根据本发明的实施例，第一抗体为单克隆抗体。由此，第一抗体特异性的与A型H5亚型流感病毒结合，试剂盒的灵敏度和准确度高。
根据本发明的实施例，荧光标记为荧光微球标记。荧光微球是受外界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。根据本发明的一些实施例，荧光微球负载的荧光物质可以为掺杂荧光染料、稀土络合物和量子点等的转换荧光纳米材料。由此，受外界能量刺激易于激发出荧光，检测的灵敏度更高。
根据本发明的实施例，为了提高荧光标记物的稳定性，荧光微球负载的荧光物质可以通过高分子聚合物修饰有活性官能基团，例如，该活性官能基团可以为羧基，氨基，羟基，巯基。根据本发明的一些实施例，第一抗体与荧光微球标记通过肽键共价结合。由此，荧光标记物的稳定性高，避免了抗体空间位阻的影响，有利于提高灵敏度和特异性。
根据本发明的实施例，荧光微球的平均直径为10-500nm。根据本发明的优选实施例，所述荧光微球的平均直径为20-300nm。根据本发明的更优选实施例，所述荧光微球的平均直径为100-120nm。由此，荧光微球的直径小，有效避免了抗体之间空间位阻的影响，使抗体易于结合在A型H5亚型流感病毒上，有利于提高灵敏度和特异性。
根据本发明的一个具体实施例，荧光微球可以购自Bangs Laboratories,Inc.公司，产品目录号为FC02F/10930固含量为10mg/ml，为羧基修饰的荧光微球，该荧光微球平均直径为110nm。
第二包被膜300：该第二包被膜300形成在基底层100上，并与第一包被膜200相连，该第二包被膜200上设置有分离的第一区域310和第二区域320，且第一区域310位于近第一包被膜200端，其中，第一区域310包被有第二抗体，且第二抗体和第一抗体能够特异性结合所述A型H5亚型流感病毒，第二区域320包被有抗抗体，且该抗抗体能够特异性结合第一抗体。
根据本发明的一些实施例，第二包被膜中的第一区域和第二区域都为线状，其中，第一区域可以被称为检测线(T线)，第二区域可以被称为质控线(C线)，两个区域所在的线状平面都平行于两包被膜的粘结边。根据本发明的一些具体实施例，线状第一或第二区域的宽度大约为0.5-1mm、长为膜的宽。由此，第一和第二区域的宽度适宜，便于第一抗体在第一区域与流感病毒结合形成的复合物在第一区域与第二抗体结合形成双抗夹心复合物，同时，便于未形成双抗夹心复合物的第一抗体在第二区域与抗抗体结合，与特异性结合，即与多余的带荧光标记第一抗体结合形成免疫复合物，确保第一抗体的有效性，通过激发荧光，从而，使试剂盒的灵敏性更高。
根据本发明的实施例，第一抗体和第二抗体均为单克隆抗体。由此，第一抗体和第二抗体特异性地与流感病毒结合，检测的准确性高。由于A型流感病毒不同亚型间的抗原表位变异复杂，单克隆抗体的结合位点和自身的空间位阻等直接影响第一抗体和第二抗体是否能同时结合到流感病毒上，使针对H5亚型流感病毒不同表位的特异抗体难以获得，发明人通过大量的实验研究，对大量的A型H5亚型流感病毒的单克隆抗体进行筛选，得到了能同时结合到流感病毒上的第一抗体和第二抗体，并且第一抗体和第二抗体对A型H5亚型流感病毒的特异性高。根据本发明的实施例，第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体。根据本发明的实施例，第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-35的单克隆抗体，第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-71的单克隆抗体。根据本发明的实施例，第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体，第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体。根据本发明的实施例，第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-22的单克隆抗体。其中，第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体的试剂盒，检测的特异性和灵敏度更佳。
根据本发明的实施例，抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。由此，该抗抗体能够与第一抗体特异性结合，与未形成双抗夹心复合物的多余的带荧光标记第一抗体结合形成免疫复合物，激发荧光，从而能够定性和/或定量检测该免疫复合物。
根据本发明的实施例，第一包被膜200为玻璃纤维素膜。由于玻璃纤维膜呈化学惰性，不含粘合剂，采用100％硼硅酸玻璃纤维制造而成，其上包被有荧光标记的第一抗体，利于第一抗体与待测样品中的目标抗原发生特异性结合。根据本发明的一个具体实施例，玻璃纤维膜可以购自Millipore公司、商品目录号为GF-CP20300。
根据本发明的实施例，第二包被膜300为硝酸纤维素膜。由于硝酸纤维素膜已经添加了表面活性剂，亲水能力强，而且存在一定的缓冲系统，具有毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分，流速快，耐高温，利于其上包被的第二抗体与荧光标记第一抗体-流感病毒抗原发生特异性结合反应，激发荧光。根据本发明的一个具体实施例，硝酸纤维素膜可以购自Millipore公司、商品目录号为Hi-Flow Plus HF135。
参考图3，根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：吸水垫400，该吸水垫400与第二包被膜300的远第一包被膜200端相连，例如，第一包被膜200、第二包被膜300和吸水垫400依次相连。根据本发明的实施例，吸水垫可为强吸水物质，在检测液态样品时，吸水垫400能够给予定向作用力使液态样品从第一包被膜定向层析至第二包被膜。根据本发明的一个具体实施例，吸水垫可以购自Millipore公司、商品目录号为CF-SP22300。
为了便于理解前述的A型H5亚型流感病毒试剂盒，在此提供制备该试剂盒的一般方法，包括以下步骤：
(1)羧基修饰的荧光微球标记探针的制备
采用适合的羧基修饰的荧光微球，活化其表面的羧基后，采用共价偶联的方式分别将A型H5亚型流感病毒标记第二抗体定向连接到该羧基修饰的荧光微球表面。
(2)第一和第二区域抗体的包被
采用喷膜仪器，于第二包被膜的第一区域处喷涂A型H5亚型流感病毒包被的第二抗体，该第一区域即为检测线(T线)，于第二区域处喷涂羊抗鼠IgG抗体，该区域即为控制线(C线)。
(3)第一包被膜处标记探针的包被
采用喷涂仪器，于第一包被膜(也可以称为样品垫)特定位置处喷涂荧光微球标记的A型H5亚型流感病毒抗体混合物，该特定位置为第一包被膜上的一块区域，该区域即作为后续的“加样端”。
(4)试剂盒的组装成型
参考图3，于基底层中间粘贴作为测试区的第二包被膜，于第二包被膜的T线端粘贴样品垫，C线端粘贴吸水垫。采用试纸分切机，将其分切为一定宽带的纸条，比如4mm宽，并装入夹片，用装有干燥剂的铝箔袋进行包装。
(5)抗原-抗体荧光免疫复合物的形成
于上述组装成型的加样端处加入待测样品，样品中的A型H5亚型流感病毒与荧光微球标记的A型H5亚型流感病毒标记抗体结合后层析到T线处喷涂的A型H5亚型流感病毒包被抗体，在T线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物，多余的荧光微球标记A型H5亚型流感病毒抗体则在C线处与羊抗鼠IgG形成的荧光标记免疫复合物。
(6)荧光标记免疫复合物荧光强度检测
用荧光检测仪测定T线处和C线处荧光强度，通过与设定的阈值比对而确定其阳性或阴性结果，C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。其中，荧光标记免疫复合物的荧光强度，是指在T线、C线处分别滞留下的结合荧光微球的数量用荧光检测仪测定后所得到的数值。通过双抗体夹心免疫反应的条件，经大量测定正常样本和添加阳性样本可确定出各不同正常样本的测定均值，以此作为临界值(cutoff)来确定检测样本的阳性或阴性结果。C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。
检测流感病毒的方法
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测流感病毒的方法。发明人发现，利用该方法检测A型H5亚型流感病毒，检测的灵敏度高、特异性强，检测时间短，检测成本低，易于操作和推广。
参考图4，根据本发明的实施例，对检测流感病毒的方法进行解释说明，该方法包括：
S100加样
根据本发明的实施例，将待测样本与前述A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒中的第一包被膜接触。进而，通过层析作用，待测样本向第二包被膜运动，从而与相应抗体结合。
S200荧光检测
根据本发明的实施例，检测试剂盒中的第一区域和第二区域的荧光强度，获得第一区域荧光检测值和第二区域荧光检测值。例如，可以通过手持仪器检测荧光强度。
S300判断
根据本发明的实施例，基于第一区域荧光检测值和第二区域荧光检测值，判定待测样本中是否存在A型H5亚型流感病毒。
根据本发明的实施例，将荧光强度比值与阈值进行比较，判定待测样本中是否存在A型H5亚型流感病毒，其中，荧光强度比值＝第一区域荧光检测值/第二区域荧光检测值。
发明人通过参考利用已知的双抗体夹心免疫反应的条件和市售试剂盒产品，大量测定正常样本和添加阳性样本的正常样本确定阈值，以第一区域和第二区域荧光检测值的比值的均值作为阈值，可以准确判断检测样本是阳性或阴性的。根据本发明的实施例，该阈值为0.01-0.03。根据本发明的优选实施例，所述阈值为0.018。荧光强度比值大于阈值为阳性，即检测到A型H5亚型流感病毒，荧光强度比值小于阈值为阴性，即未检测到A型H5亚型流感病毒。由此，利用本发明实施例的试剂盒，基于该阈值能够实现对A型流感病毒H5亚型的快速和高灵敏的测定。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Millipore公司。
实施例1
利用本发明实施例的方法，制备检测A型H5亚型流感病毒试剂盒的步骤如下：
1、缓冲液制备
(1)pH为7.4的0.02M PBS缓冲液：称取2.3g Na2HPO4、0.524gNaH2PO4.H2O、8.77gNaCl溶于纯水，用纯水定容至1L，调pH至7.4，得到pH为7.4的0.02M PBS缓冲液。
(2)膜处理缓冲液：将Tween-20、BSA、蔗糖溶于上述pH为7.4的0.02M PBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0.2％、BSA的质量百分含量为1％、蔗糖的质量百分含量为2％，调pH至7.4，得到膜处理缓冲液。
(3)50mM pH为8.5的硼砂缓冲液：称取1.9g Na2B4O7.10H2O溶于100ml纯水，调pH至8.5得到50mM pH为8.5的硼砂缓冲液。
(4)样品处理液：将Tween-20溶于上述pH为7.4的0.02M PBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0.2％，调pH至7.4，得到样品处理液。
2、荧光微球标记A型H5亚型流感病毒标记抗体的制备
以平均直径为110nm、羧基修饰的荧光微球(购自Bangs Laboratories,Inc.公司，产品目录号为FC02F/10930)，抗A型H5亚型流感病毒的第一单克隆抗体(购自昆明云大单抗中心，编号为F5-25)，按照下述方法制备荧光微球标记A型H5亚型流感病毒标记第一抗体：
(1)取5mg的上述羧基修饰的荧光微球用MES缓冲液(0.1M、pH4.7)洗涤并离心后，用1ml MES缓冲液(0.1M、pH4.7)重悬，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)至终浓度为5mM、加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺)至终浓度为10mM，室温避光，反应半小时得到活化后羧基修饰的荧光微球。
(2)用50mM pH8.5的硼砂缓冲液洗涤该活化后羧基修饰的荧光微球，分别取0.37mg上述待标记A型H5亚型流感病毒第一抗体(编号为F5-25)和5mg上述活化后羧基修饰的荧光微球混合到50mM pH8.5的硼砂缓冲液中充分混匀。室温避光下反应2小时，让该抗体和荧光微球形成稳定的肽键共价结合，得到荧光微球与A型H5亚型流感病毒抗体的偶联物。反应结束后，加入终浓度为1％(质量百分含量)的BSA溶液对荧光微球与A型H5亚型流感病毒抗体的偶联物上剩余活性羧基位点进行封闭，室温避光反应0.5小时。完成后，用pH7.4的0.02M PBS缓冲液洗涤、重悬得到5mg/ml荧光微球标记A型H5亚型流感病毒抗体液体，4℃保存待用。
3、检测A型H5亚型流感病毒试剂盒的制备
(1)以A型H5亚型流感病毒包被第二抗体，以羊抗鼠IgG抗体制备第二包被膜，具体方法如下：
(a)采用pH7.4的0.02M PBS缓冲液，将羊抗鼠IgG抗体(长沙博优生物科技有限公司，ABGAM-0500)配制为浓度1mg/ml溶液，将A型H5亚型流感病毒包被第二抗体(购自昆明云大单抗中心，编号为F5-39)配制浓度为2mg/ml的溶液。
(b)选用BioDot的XYZ3050喷膜系统将步骤(1)得到羊抗鼠IgG抗体溶液喷至第二包被膜(硝酸纤维素膜)的质控线(C线)位置，将A型H5亚型流感病毒包被抗体缓冲液喷至检测线(T线)位置，于相对湿度为10％以下的干燥车间进行抽湿4小时后干燥待用，得到具有检测线和质控线的包被膜。
(2)用膜处理缓冲液浸泡步骤3-(1)得到的玻璃纤维纸半小时，浸泡的温度为37℃，于同样的抽湿条件进行抽湿4小时后，用膜处理缓冲液稀释步骤1所得荧光微球标记A型H5亚型流感病毒抗体液体至荧光微球标记A型H5亚型流感病毒第一抗体含量为0.05mg/ml的混合液后，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统将其喷涂至上述处理过的玻璃纤维素膜上，制备形成样品垫，于同样的抽湿条件进行干燥。在10万级洁净和干燥的车间中把上述干燥好的具有检测线和质控线的第二包被膜、样品垫、吸水垫和基底层按图3所示进行搭配组装后，采用BioDot的CM4000裁切系统将贴好的纸板裁切为4mm/条的宽度，装入检测用夹片待用。
实施例2
对实施例1得到的检测A型H5亚型流感病毒试剂盒进行评估，具体方法如下：
1、检测灵敏度
以A型H5亚型流感病毒HI试验抗原作为待测样品来测定实施例1的检测A型H5亚型流感病毒试剂盒的灵敏度。
同时将A型H5亚型流感病毒HI试验抗原用pH为7.4的0.02M PBS缓冲液分别和混合配制成系列浓度(64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0HAunit)，分别加入由实施例1得到的检测A型H5亚型流感病毒试剂盒的加样端中，并采用荧光检测仪检测。检测步骤：检测前先将待检测样品恢复室温(25℃)，用精确移液器取待检测样品60μl垂直缓慢滴入上述得到的检测A型H5亚型流感病毒试剂盒的加样端上，10分钟后用荧光检测仪进行测试。
其检测结果如下表1所示。从检测结果中可以得出上述试剂盒检测A型H5亚型流感病毒的灵敏度为0.016HA unit，T/C Cut-Off值大于0.018为阳性。
A型H5亚型流感病毒试剂盒检测值与浓度曲线图如图5所示。
表1A型H5亚型流感病毒不同样品浓度的试剂盒检测值
浓度(HAU) 64 32 16 8 4 2 1 0.5
T/C检测值 1.3051 1.1768 0.7836 0.4978 0.275 0.1922 0.1053 0.0597
浓度(HAU) 0.25 0.125 0.063 0.031 0.016 0.008 0
T/C检测值 0.0427 0.0283 0.0228 0.0214 0.0193 0.0145 0.0156
2、精密性检测
选取3份不同浓度的样本，分别按照本发明所述的方法重复测量10次，根据10次的结果计算批内平均偏差CV％值。按照本发明所述的方法制备的3批试剂盒，选取3份不同浓度的样本，分别重复测量10次，根据结果计算批间平均偏差CV％值。其检测结果如下表2所示，可以看出利用该试剂盒检测精密度高。
表2批内批间差测定
3、交叉反应检测
将A型流感病毒亚型HI试验抗原和其他常见呼吸道病毒HI试验抗原，用pH为7.4的0.02M PBS缓冲液配制为浓度64HA unit，分别用精确移液器取60μl垂直缓慢滴入实施例1得到的检测A型H5亚型流感病毒试剂盒的加样端，10分钟后用荧光检测仪进行测试。其检测结果如下表3所示。该A型H5亚型流感病毒试剂盒与A型流感病毒其他亚型和其他常见呼吸道病毒之间没有交叉反应，对H5亚型具有很强的特异性。
表3A型H5亚型流感病毒试剂盒交叉反应检测
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括：
基底层；
第一包被膜，所述第一包被膜形成在所述基底层上，且包被有荧光标记的第一抗体，所述第一抗体特异性结合所述A型H5亚型流感病毒；
第二包被膜，所述第二包被膜形成在所述基底层上，并与所述第一包被膜相连，所述第二包被膜上设置有分离的第一区域和第二区域，且第一区域位于近所述第一包被膜端，其中，
所述第一区域包被有第二抗体，所述第二抗体和所述第一抗体能够特异性结合所述A型H5亚型流感病毒，
所述第二区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：
吸水垫，所述吸水垫与所述第二包被膜的远所述第一包被膜端相连。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体和所述第二抗体均为单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体，
任选地，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-35的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-71的单克隆抗体，
任选地，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-39的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，
任选地，所述第一抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-25的单克隆抗体，所述第二抗体为购自昆明云大单抗中心的编号为F5-22的单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为荧光微球标记，
任选地，所述荧光微球的平均直径为10-500nm，优选地，为20-300nm，更优选地，为100-120nm。
6.权利要求5的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体与所述荧光微球标记通过肽键共价结合。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被膜为硝酸纤维素膜。
9.一种检测流感病毒的方法，其特征在于，包括，
将待测样本与权利要求1-8任一项所述A型H5亚型流感病毒的检测试剂盒中的第一包被膜接触；
检测所述试剂盒中的第一区域和第二区域的荧光强度，获得第一区域荧光检测值和第二区域荧光检测值；以及
基于所述第一区域荧光检测值和第二区域荧光检测值，判定所述待测样本中是否存在A型H5亚型流感病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将荧光强度比值与阈值进行比较，判定所述待测样本中是否存在A型H5亚型流感病毒，其中，所述荧光强度比值＝第一区域荧光检测值/第二区域荧光检测值，
任选地，所述阈值为0.01-0.03，优选地，为0.018。
CN201711218250.2A 2017-11-28 2017-11-28 A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用 Pending CN108107206A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711218250.2A CN108107206A (zh) 2017-11-28 2017-11-28 A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711218250.2A CN108107206A (zh) 2017-11-28 2017-11-28 A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108107206A true CN108107206A (zh) 2018-06-01

Family

ID=62208637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711218250.2A Pending CN108107206A (zh) 2017-11-28 2017-11-28 A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108107206A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104407135A (zh) * 2014-11-03 2015-03-11 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒
CN107589252A (zh) * 2017-09-06 2018-01-16 扬州千代科技有限公司 一种h5亚型禽流感病毒荧光微球检测卡及其应用
CN207472897U (zh) * 2017-11-09 2018-06-08 詹爱军 新型三价禽流感荧光免疫层析试纸条

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104407135A (zh) * 2014-11-03 2015-03-11 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒
CN107589252A (zh) * 2017-09-06 2018-01-16 扬州千代科技有限公司 一种h5亚型禽流感病毒荧光微球检测卡及其应用
CN207472897U (zh) * 2017-11-09 2018-06-08 詹爱军 新型三价禽流感荧光免疫层析试纸条

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA SAKURAI等: "Broad-spectrum detection of H5 subtype influenza A virus with a new fluorescent immunochromatography system", 《PLOS ONE》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104407135A (zh) A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒
CN103901216B (zh) 人h-fabp胶体金检测试纸及其制备方法
KR101761426B1 (ko) 간이 멤브레인 어세이 장치
CN107132359B (zh) 胃蛋白酶原ⅰ和胃蛋白酶原ⅱ检测方法及其试剂盒
CN108318691A (zh) A型流感病毒和b型流感病毒侧向层析检测试剂盒及方法
JP6523020B2 (ja) 生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用標識試薬粒子
CN103558381B (zh) 检测人类艾滋病病毒抗体的免疫层析试纸及其制备方法
CN107271669A (zh) 胃蛋白酶原、抗幽门螺杆菌抗体和胃泌素17检测方法及其试剂盒
CN113607944B (zh) 胶体金层析试剂条、制备方法以及新冠抗原检测试剂盒
CN108333368A (zh) 一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法
EP3076177B1 (en) Immunochromatography-assisted detection method
CN107328938A (zh) 胃蛋白酶原和抗幽门螺杆菌抗体检测方法及其试剂盒
CN105388292A (zh) 试剂盒及联合检测pct、crp及il-6的方法
CN104407133A (zh) A型流感病毒检测方法及其试剂盒
CN104407134A (zh) A型流感病毒h1亚型检测方法及其试剂盒
JP5006459B1 (ja) 標識用複合粒子
TWI275796B (en) Method for measuring physiologically active sample substance by the use of porous filter
CN205333641U (zh) 一种pct时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条
WO2021132470A1 (ja) イムノクロマト用ストリップ、イムノクロマト用装置、イムノクロマト用キット、及び被検物質検出方法
CN109459570A (zh) 一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法
CN108061801A (zh) B型流感病毒的检测试剂盒及其应用
WO2017213228A1 (ja) 糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法
CN103235131B (zh) 检测黄热病毒的侧向流免疫层析测定产品及其制备方法
CN108107206A (zh) A型h5亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用
CN108051592A (zh) A型h7亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180601