CN108103082A - 一种腺相关病毒介导的lcat基因表达载体及其用途 - Google Patents
一种腺相关病毒介导的lcat基因表达载体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108103082A CN108103082A CN201710329155.3A CN201710329155A CN108103082A CN 108103082 A CN108103082 A CN 108103082A CN 201710329155 A CN201710329155 A CN 201710329155A CN 108103082 A CN108103082 A CN 108103082A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ham
- optlcat
- aav
- gene
- lcat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01043—Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase (2.3.1.43), i.e. lecithin-cholesterol acyltransferase or LCAT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
本发明提供一种重组腺相关病毒介导的治疗高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗药物。重组腺相关病毒载体携带优化的人卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(optimized Lecithin‑cholesterol acyltransferase,optLCAT)基因表达框。体内实验表明,该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内,持续稳定地表达LCAT蛋白,催化HDL中的胆固醇酯化,提高体内的HDL浓度,降低甘油三酯(TG)含量,显著降低动脉粥样硬化的发病率。结果提示,该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的治疗高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带LCAT基因表达框的治疗高脂血症和预防动脉粥样硬化的基因药物。
背景技术
卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)是由Glomset等人(Glomset JA. Biochim Biophys Acta.1962; 19(65): 128-135.)于1962年分离并命名的。LCAT在肝脏中合成,后分泌释放入血液,在血浆中以游离形式或以与脂蛋白结合形式存在,是血浆脂蛋白代谢的一种关键酶,对维持胆固醇稳态及调节血液循环中胆固醇转运具有十分重要的作用。
人类LCAT基因位于人的第16号染色体长臂q22上,包含6个外显子和5个内含子,全长大约4200 bp。LCAT 基因主要在肝脏中表达,少部分表达于大脑和睾丸(Calabresi L,et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25(9):1972-1978.)。编码LCAT的信使RNA长约1500 bp,其信号肽由440 个氨基酸组成。人的成熟LCAT是由416个氨基酸残基组成的分泌蛋白,属于糖蛋白,其中糖链约占24%,是维持其活性必不可少的组分。血浆胆固醇几乎70~80%是胆固醇酯,均是由LCAT催化生成。
LCAT对HDL的代谢具有重要作用,其表达水平与HDL-C呈正相关,与三酰甘油呈负相关,LCAT 活性和水平的改变都将影响HDL的成熟代谢过程(Calabresi L, et al. J Lipid Res.2011; 52(8): 1569-1574.)。LCAT主要是催化HDL的游离胆固醇酯化,促使新生的小球状或盘状的HDL3转化为成熟的球状HDL2,从而使HDL经前β1-HDL→HDL3→HDL2的过程逐渐成熟。由于胆固醇酯比游离胆固醇疏水作用更强,因此,胆固醇酯必须转运到脂蛋白的疏水中心,即HDL核心是LCAT酶反应产物胆固醇酯的贮存库,随后通过胆固醇酯转移蛋白将胆固醇酯转移至其他脂蛋白和细胞膜上,并与其交换,完成胆固醇的转移(Kimak E, etal. Cell Biochem Biophys.2013; 67(2): 695-702.)。由于LCAT 催化合成的胆固醇酯比胆固醇的疏水性更强,因此随着前β-HDL逐渐转变为成熟的、球状的α-HDL,而被转移至脂蛋白的疏水中心。在胆固醇酯转移蛋白和一些脂肪酶的协同作用下,α-HDL也可反转变为β-HDL。β-HDL的血浆半衰期很短,在肾中被迅速清除(Calabresi L, et al.Atherosclerosis. 2012; 222(2): 299-306.),而α-HDL有一个较慢的转变的过程,表明LCAT 在血浆HDL的代谢和决定血浆HDL水平中具有重要作用。此外,LCAT还主要参与胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport, RCT)的血管内阶段,该过程也是HDL调节动脉粥样硬化形成和发展的主要机制。
Calabresi等(Calabresi L, et al. J Lipid Res.2011; 52(8): 1569-1574.)在研究LCAT血浆水平和颈动脉内膜厚度的相关关系时发现,在高心血管风险受试者中,男性受试者的血浆LCAT水平与颈动脉内膜厚度没有相关性,而在女性受试者中,LCAT血浆水平升高与颈动脉内膜厚度增加相关,表明LCAT与动脉粥样硬化的发生密切相关,并且存在性别差异。近年来的大量研究表明,HDL在一定程度上能很好地预测动脉粥样硬化及心血管疾病的发生风险,其中HDL介导的RCT功能尤为重要。Calabresi等(Calabresi L, et al. J Intern Med.2015; 277(5): 552-561.)的研究发现,在慢性肾病患者中,伴随有获得性LCAT缺乏是其表现为低HDL水平的一个重要原因,因此LCAT成为了逆转血脂异常干预治疗的潜在目标,并有可能在这些慢性肾病患者中降低患心血管疾病的风险。Daniels等(Daniels JA, et al. Cardiovasc Diabetol.2014; 13: 16.)的研究发现,2型糖尿病患者增加水果和蔬菜摄取量后,LCAT和对氧磷酸酶1的水平和活性也随之升高,HDL3水平也有所上升,表明LCAT、HDL等均参与了抗动脉粥样硬化的发生、发展过程。
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)因在腺病毒制品中发现而得名(Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc Natl Sci USA. 1966; 55: 1467-1474.)。AAV是微小病毒科 (Parvovirus)成员,包含多种血清型,其基因组为单链DNA(Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.),其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒,需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.),或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时,AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(Chiorini JA, et al. Curr Top Microbiol Immunol. 1996; 218:25-33.),而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)(Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”( inverted terminal repeat, ITR),呈回文-发卡结构(Lusby E, et al. J Virol. 1980; 34: 402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框(ORF),分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.)。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件,在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948. )。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site,RBS)和末端解链位点trs(terminal resolutionsite),能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构,在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.)。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区,rep基因区和cap基因区(Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.)。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs(terminal resolution site)和GAGY重复基序(repeat motif)特异性结合(Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.),启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心,因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同,但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子,分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能,而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中,VP3分子量最小,但数量最多,在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的;VP2协助VP3进入细胞核;VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解,AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具,即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框,病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供,降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之,AAV病毒本身不具有致病性,使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs(terminal resolution site)序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补,形成双链,显著提高AAV载体的体内外转导效率(Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.)。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒,即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV(single-stranded AAV),即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小,仅为ssAAV包装容量的一半,约为2.2kb-2.5kb,但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多,不同的血清型具有不同的组织感染嗜性,因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.)。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障,将外源基因导致大脑神经元中,为靶向大脑的基因转导提供了可能(Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.)。此外,AAV载体的理化性质稳定,对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM, et al. Hum Gene Ther Methods. 2015; 26(2): 71-76.),容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装系统,便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus type 1,HSV1)为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中,三质粒转染包装系统因无需辅助病毒,安全性高,是应用最为广泛的AAV载体包装系统,也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是,高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统(Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5):613-624.),该系统生产效率高,但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在,影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略(伍志坚,吴小兵等。科学通报,1999,44(5):506-509. Conway JE, et al. Gene Ther. 1999;6:986-993.)。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略(Wustner JT, et al. Mol Ther. 2002;6(4):510-518.)。在此基础上,Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat,ITR)/外源基因表达框,然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞,包装产生AAV病毒(Booth MJ,et al. Gene Ther.2004;11:829-837.)。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统(Thomas DL, etal. Gene Ther.2009;20:861-870.),使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外,Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框,构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性,随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数,逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒(Chen H.Mol Ther.2008;16(5):924-930. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol.2011;107Suppl:S80-93.)以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略(Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2014;25:212-222.Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.)。每种包装系统都各具特点,可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点,AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗,特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月,世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项(http://www.abedia.com/wiley/vectors.php)。更为重要的是,基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市,成为西方世界批准的第一个基因治疗药物(Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.);血友病B(Kay MA, et al. Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.)和先天性黑蒙症(RPE65基因突变引起)(Jacobson SG, et al. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.)的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果,预期在不久的将来会上市销售,造福广大患者。
本发明中,我们选择AAV载体来携带optLCAT基因表达框,主要是基于AAV载体的以下特点。其一,AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列,不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因(Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).),免疫原性低。其二,AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达(Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.),避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三,AAV载体通过静脉注射对肝脏具有较高的转导效率(Sands MS.Methods Mol Biol. 2011;807:141-157. Wang L, et al. Mol Ther.2015;23(12):1877-1887.),保证optLCAT基因表达框能够在肝脏内高效地表达LCAT蛋白。
根据以上设计思路,我们制备得到rAAV-HAM-optLCAT病毒,并设计制备得到无optLCAT编码序列的rAAV-HAM对照病毒。将这些病毒分别等剂量注射至高脂血症大鼠模型体内,评价设计rAAV-HAM-optLCAT对高脂血症和动脉粥样硬化的治疗作用。结果显示,相比对照病毒,rAAV-HAM-optLCAT都能够在高脂血症大鼠模型体内持续表达LCAT蛋白,降低模型体内甘油三酯含量,提高高密度脂蛋白含量,有效缓解高脂血症症状,明显降低动脉粥样硬化的发生率,显示出巨大的高脂血症治疗潜力和预防动脉粥样硬化的作用,为高脂血症患者提供了新的治疗选择。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种基于AAV载体的新型的能够治疗高脂血症和预防动脉粥样硬化的基因药物。该药物由AAV载体携带optLCAT基因表达框。optLCAT基因由人LCAT基因优化而来。根据在基因表达框中,人为设计的HAM启动子调控optLCAT基因的高效表达。HAM启动子为肝脏特异性的高表达启动子,结合AAV载体本身的肝细胞转导特异性,保证了LCAT基因特异性地在肝脏中高效表达。基于上述设计,预期该药物通过静脉注射后能够在高脂血症大鼠肝脏内高效表达LCAT蛋白,降低模型体内甘油三酯含量,提高高密度脂蛋白含量,有效缓解高脂血症症状,从而达到治疗高脂血症的目的,并预防高脂血症病人中动脉粥样硬化的发病率。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种治疗高脂血症的基因治疗药物,其特征在于,该药物基于重组AAV载体,利用AAV载体通过静脉注射能高效地把药物效应元件导入体内,实现药物效应元件表达产物治疗作用蛋白LCAT的高效表达。为了实现LCAT蛋白的高效表达,根据不同血清型AAV的转导特点,主要选择AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8和AAV9等,优选为AAV3B和AAV8。
本发明提供的治疗高脂血症的基因治疗药物,其特征还在于,基于设计的optLCAT基因表达框能够实现LCAT蛋白肝细胞中高效表达。为此,首先根据密码子偏爱性、GC含量、CpG二聚体含量、mRNA二级结构、消除隐蔽剪接位点、消除让转录提前终止的polyA加尾信号、消除内部chi位点和核糖体结合位点、CpG岛、消除ARE序列等RNA不稳定基序和RNA重复序列(正向重复、反向重复和二重复等)等原则优化合成LCAT蛋白的编码区序列,得到optLCAT序列。接下来,在优化后的optLCAT序列的翻译起始密码子前添加Kozak序列“5’-GCCACC-3’”,提高蛋白翻译时的准确起始效率。采用人为设计的HAM启动子调控optLCAT基因转录,HAM启动子由人肝脏特异性的增强子序列、人alpha-1-antitrypsin(hAAT)基因的基础启动子和MVM内含子组成,使optLCAT基因能够特异性地在肝细胞中高效转录。
本发明提供的治疗高脂血症基因治疗药物,其特征还在于,采用高效特异性转导肝脏的AAV载体(如AAV3B、AAV8),保证了药物通过静脉注射给药后能够高效地转到肝细胞,在LCAT蛋白的天然主要表达部位表达LCAT蛋白。同时我们还采用表达效率更高的自身互补的双链AAV载体,保证了药物进入肝细胞后,快速而高效地表达LCAT蛋白。
本发明提供的治疗高脂血症基因治疗药物,其特征还在于,药物通过静脉注射给药进入体内后,能够高效地在肝细胞中表达产生LCAT蛋白,提高体内的高密度脂蛋白含量,降低血液中的甘油三酯含量,从而达到治疗高脂血症的目的。
本发明提供的高脂血症基因治疗药物,其特征还在于,一次给药后就能在体内持续高水平表达LCAT蛋白,缓解并治疗高脂血症。
本发明提供的高脂血症基因治疗药物,其特征还在于,表达产生的LCAT蛋白还能够有效地预防动脉粥样硬化的发生概率,在治疗高脂血症的同时起到预防动脉粥样硬化的目的。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示:
pHelper质粒,来源于AAV Helper Free System(Agilent Technologies,美国),由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-R2C3B质粒,由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies,美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架,用AAV3B基因组(GenBank ID:AF028705)中外壳蛋白编码序列Cap3B(基因组中第2208至4418位序列)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列,即得pAAV-R2C3B质粒。简要的构建过程为,根据前述思路获得pAAV-R2C3B质粒序列信息,人工合成pAAV-R2C3B质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列,采用标准的分子克隆方法,用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C3B质粒。pAAV-R2C3B质粒包含完整的AAV3B的cap基因和AAV2的rep基因,在三质粒共转染包装制备重组AAV3B病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV3B外壳蛋白。
pAAV-R2C8质粒,由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies,美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架,用AAV8基因组(GenBank ID:AF513852)中外壳蛋白编码序列Cap8(基因组中第2121至4337位序列)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列,即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为,根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息,人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列,采用标准的分子克隆方法,用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因,在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV8外壳蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo(Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10):e13479.)。ITR,invertedterminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter,人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2 pscAAV-HAM载体结构示意图。ITR,inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列。HAM promoter,人为设计合成的启动子,由人肝脏特异性增强子、human alpha-antitrypsin(hAAT)启动子和小鼠细小病毒(minute parvovirus of mice,MVM)内含子组成。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图3 pscAAV-HAM-optLCAT载体结构示意图。ITR,inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列。HAM promoter,人为设计合成的启动子,由人肝脏特异性增强子、human alpha-antitrypsin(hAAT)启动子和小鼠细小病毒(minute parvovirus ofmice,MVM)内含子组成。optLCAT,优化合成的人lcat基因。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图4静脉注射重组病毒后模型大鼠体内人LCAT蛋白表达结果。 4种不同的重组AAV病毒(scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM-optLCAT、scAAV3B-HAM、scAAV8-HAM)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,采用LCAT蛋白ELISA试剂盒(ALPCO Diagnostics)测定血清中LCAT蛋白浓度。
图5静脉注射重组病毒后模型大鼠体内HDL含量检测结果。 4种不同的重组AAV病毒(scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM-optLCAT、scAAV3B-HAM、scAAV8-HAM)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白(HDL)。
图6静脉注射重组病毒后模型大鼠体内TC含量检测结果。4种不同的重组AAV病毒(scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM-optLCAT、scAAV3B-HAM、scAAV8-HAM)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)。
图7静脉注射重组病毒后模型大鼠体内TG含量检测结果。4种不同的重组AAV病毒(scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM-optLCAT、scAAV3B-HAM、scAAV8-HAM)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测甘油三酯(TG)。
图8 高脂血症模型大鼠动脉粥样硬化发生统计结果 4种不同的重组AAV病毒(scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM-optLCAT、scAAV3B-HAM、scAAV8-HAM)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。每种病毒注射3组高脂血症大鼠模型,每组50只模型大鼠。注射病毒28w后,处死模型大鼠,观察动脉中是否出现脂质沉积和早期粥样变化,如果有则判断为发生动脉粥样硬化。统计每种病毒每组高脂血症大鼠模型的动脉粥样硬化发生只数,统计结果以平均值±标准差(n=3)的形式展示。
具体实施方式
本发明公开了一种治疗高脂血症及预防动脉粥样硬化的基因药物,包含药物的设计、小量制备及功能验证,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。其中,如无特殊说明,实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1 质粒载体构建
为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pscAAV-HAM和pscAAV-HAM-optLCAT质粒,我们首先以公司保存的pAAV2neo为基础,用人工合成的缺失AAV2的ITR中trs(terminalresolution site)和D序列的突变ITR序列(命名为ΔITR)(SEQ ID No.1)替换pAAV2neo载体中的一侧ITR序列,用自主设计得到的HAM启动子(SEQ ID No.2)替换pAAV2neo载体中的CMV启动子,得到pscAAV-HAM载体。接下来,将人工合成的optLCAT(SEQ ID No.3)序列克隆入pscAAV-HAM载体的KpnI和EcoRI酶切位点之间,得到pscAAV-HAM-optLCAT载体。
(1)pscAAV-HAM载体构建
以AAV2基因组(GenBank No. AF043303)中的左侧ITR序列为基础,根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列( Wang Z, et al. Gene Ther. 2003;10:2105-2111.),得到ΔITR序列。为了便于克隆操作,将pAAV2neo载体中1392-1668bp之间序列(靠近BGH polyA的ITR和ApaI酶切位点之间序列)同ΔITR序列融合,得到融合序列。在融合序列两端分别添加BamHI和ApaI酶切位点后,由金斯瑞生物科技有限公司合成,克隆入pUC57 simple载体,获得pUC57-ΔITR。BamHI和ApaI分别双酶切消化pUC57-ΔITR载体和pAAV2neo载体(附图1),回收含有ΔITR片段和切去ITR序列的pAAV2neo载体片段。两片段连接后,转化E.coliJM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定获得pscAAV载体。将人Apolipoprotein E/C-I基因的肝脏特异性增强子序列(Dang Q., et al. J Biol Chem. 1995; 270(38): 22577-22585.),人alpha-1-antitrypsin (hAAT) 基因启动子(Nathwani AC, et al. Blood.2006; 107: 2653-2261.)和小鼠细小病毒内含子序列拼接,得到HAM启动子序列,序列信息见SEQ ID No.2。在HAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成,合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57simple载体(金斯瑞生物科技,南京),得到pUC57-HAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-HAM载体和pscAAV载体,回收HAM片段和切去CMV启动子的pscAAV载体片段,两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定后得到含有HAM启动子的pscAAV质粒载体pscAAV-HAM(附图2)。
(2)pscAAV-HAM-optLCAT载体构建
根据人lcat基因的cDNA序列(GenBank ID:NM_000229),由金斯瑞生物科技有限公司根据人密码子偏爱性等原则优化合成得到optLCAT基因(SEQ ID No.3)。将优化合成的optLCAT基因克隆入pUC57 simple载体,得到pUC57-optLCAT载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-optLCAT载体和pscAAV-HAM载体,回收optLCAT片段和线性化的pscAAV-HAM载体片段,两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定得到pscAAV-HAM-optLCAT载体。
实施例2 重组AAV病毒制备及检定
参照文献(Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.),应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地,AAV载体质粒(pscAAV-HAM或pscAAV-HAM-optLCAT)、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-R2C3B或pAAV-R2C8)按照1:1:1的摩尔比混匀后,采用磷酸钙方法转染HEK293细胞,转染48h后,收获细胞和培养上清,应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV3B-HAM、scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM、scAAV8-HAM-optLCAT等4种重组病毒。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下:
在HAM启动子中设计两条引物HAM-Q-F和HAM-Q-R:
HAM-Q-F:5’-ATGGGCAAACATTGCAAGCAGC-3’ (SEQ ID NO.4)
HAM-Q-R:5’-AACCACGCCAGGACAACCTCTG-3’ (SEQ ID NO.5)
以HAM-Q-F和HAM-Q-R为引物特异性地扩增HAM启动子长度为171bp片段,采用SYBRGreen染料结合法,以1μg/μl的pscAAV-HAM质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品,应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂(Takara,大连,中国),使用荧光定量PCR仪(型号:ABI 7500 fast,ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献(Ulrich-Peter R, et al.J Virol Methods. 2002; 106: 81-88.)。
实施例3 大鼠高脂血症模型的建立
参考文献(赵金明,等. 中医药理与临床. 2012;28(1):177-180.),构建大鼠高脂血症模型。首先配制高脂乳剂,将30g自制的猪油在50°C的水浴中融化,搅拌中依次加入5g胆固醇、5g蛋黄粉、1g猪胆酸钠、0.5g丙硫氧嘧啶、5g葡萄糖和2g吐温-80,乳化均匀后,用蒸馏水定容至200mL,得到诱导大鼠高脂血症模型需要的高脂乳剂。从北京华阜康生物科技股份有限公司购买80只SPF级Wistar大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机选择雌雄各10只作为对照组,其余60只为实验组。高脂乳剂以50°C水浴融化并搅拌均匀,实验组每天按照20ml/kg的剂量灌胃给予高脂乳剂,每天灌胃服用一次,空白对照组灌胃给予含有等量吐温-80 的同体积蒸馏水。连续灌服乳剂二周后,大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)血脂四项指标; 继续灌服乳剂二周后 (共四周) ,大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL、LDL血脂四项指标。一旦实验组中大鼠的TC、TG和LDL测定值相比空白对照组检测结果平均值的差异具有统计学意义(P<0.05),即判定高脂血症大鼠模型造模成功。按照此标准,灌服乳剂2周后,实验组60只大鼠有43只可判定为高脂血症模型;灌服乳剂4周后,实验组有57只大鼠可判定为高脂血症模型。选择57只高脂血症模型大鼠作为后续治疗高脂血症研究的备选实验动物。
实施例4 静脉注射给药治疗高脂血症
从实施例3建模得到的57只高脂血症大鼠模型中随机选择40只大鼠,其余15只用于后续研究研究备用。将40只大鼠,随机分为4组,每组10只大鼠。4组大鼠中,分别经尾静脉注射scAAV3B-HAM、scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM或scAAV8-HAM-optLCAT重组病毒,注射剂量为2×1011vg/只。注射完后,继续采用实施例3中高脂乳剂对实验组和对照组进行灌服,灌服剂量和频率同实施例3一致。
在注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w)监测大鼠体内的LCAT蛋白表达情况。玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,采用LCAT蛋白ELISA试剂盒(ALPCODiagnostics)测定血清中LCAT蛋白浓度。检测结果如图4所示。从图4的结果可知,相比于注射不携带optLCAT基因表达的scAAV3B-HAM及scAAV8-HAM病毒组,注射携带optLCAT基因表达的scAAV3B-HAM-optLCAT或scAAV8-HAM-optLCAT病毒的模型大鼠体内的LCAT蛋白表达水平随着时间延长而逐渐升高,至趋于稳定。注射病毒28w仍然能够在模型大鼠体内检测LCAT的高效表达。而且注射scAAV8-HAM-optLCAT病毒组的LCAT表达水平略高于注射scAAV3B-HAM-optLCAT,但两者未见明显差异。结果表明,scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒注射体内后能够有效地表达产生高浓度的LCAT蛋白,为其治疗高脂血症和预防动脉粥样硬化提供了基础。
同时在注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w)监测大鼠体内的TC、TG和HDL浓度变化。在每次检测过程中,大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)血脂三项指标。结果如图5至图7所示。其中图5展示的为HDL测定结果;图6展示的为TC监测结果;图7展示的为TG检测结果。
从图5的结果可知,相比于注射不携带optLCAT基因表达的scAAV3B-HAM及scAAV8-HAM病毒组,注射scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒组高脂血症模型大鼠的HDL含量呈现出随着时间延长逐渐升高,直至稳定的趋势。而且注射scAAV8-HAM-optLCAT病毒组的HDL含量略高于注射scAAV3B-HAM-optLCAT,但两者未见明显差异。结果表明,scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒注射体内后能够有效地提高高脂血症大鼠模型体内的HDL浓度。
从图6的结果可知,相比于注射不携带optLCAT基因表达的scAAV3B-HAM及scAAV8-HAM病毒组,注射scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒组高脂血症模型大鼠的TC含量呈现出随着时间延长逐渐升高,直至稳定的趋势。而且注射scAAV8-HAM-optLCAT病毒组的TC含量略高于注射scAAV3B-HAM-optLCAT,但两者未见明显差异。由于胆固醇是HDL的组成部分,总胆固醇(TC)含量的升高,再次表明,scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒注射体内后能够有效地提高高脂血症大鼠模型体内的HDL浓度。
从图7的结果可知,相比于注射不携带optLCAT基因表达的scAAV3B-HAM及scAAV8-HAM病毒组,注射scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒组高脂血症模型大鼠的TG含量呈现出随着时间延长逐渐降低的趋势。而且注射scAAV8-HAM-optLCAT病毒组的TG含量略低于注射scAAV3B-HAM-optLCAT,但两者未见明显差异。结果表明,scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒注射体内后能够有效地降低高脂血症大鼠模型体内的TG浓度,显示出治疗高脂血症的潜力。
总之,scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒静脉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低模型大鼠体内的TG水平,提高HDL水平,表现出显著的降血脂作用,对高脂血症具有较强的治疗作用。
实施例5静脉注射给药预防高脂血症引起的动脉粥样硬化
按照实施例3的高脂血症大鼠模型制备方法,制备得到高脂血症大鼠模型621只。4种不同的重组AAV病毒(scAAV3B-HAM-optLCAT、scAAV8-HAM-optLCAT、scAAV3B-HAM、scAAV8-HAM)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射至高脂血症模型大鼠中。每种病毒注射3组高脂血症大鼠模型,每组50只模型大鼠。注射完后,继续采用实施例3中高脂乳剂对实验组和对照组进行灌服,灌服剂量和频率同实施例3一致。
注射病毒28w后,处死模型大鼠,观察动脉中是否出现脂质沉积和早期粥样变化,如果有则判断为发生动脉粥样硬化。统计每种病毒每组高脂血症大鼠模型的动脉粥样硬化发生只数,统计结果以平均值±标准差(n=3)的形式展示。统计结果如图8所示。从图8的结果可知,相比于注射不携带optLCAT基因表达的scAAV3B-HAM及scAAV8-HAM对照病毒组,注射scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT病毒组高脂血症模型大鼠出现动脉粥样硬化明显降低,大约为对照病毒的三分之一。结果表明,scAAV3B-HAM-optLCAT和scAAV8-HAM-optLCAT能够有效地降低高脂血症模型大鼠中的动脉粥样硬化发生率,表现出明显的预防高脂血症产生动脉粥样硬化的作用。
SEQ ID
No.1
5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCC-3'
NO.2
5'-CCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATACGCGTGTAAGTTGGCGCCGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTTTTTTACAG-3'
No.3
5'-GCCACCATGGGACCACCTGGAAGCCCATGGCAGTGGGTGACCCTGCTGCTGGGACTGCTGCTGCCACCAGCAGCACCTTTCTGGCTGCTGAACGTGCTGTTTCCTCCACACACCACACCAAAGGCCGAGCTGTCCAATCACACAAGGCCCGTGATCCTGGTGCCTGGATGCCTGGGAAACCAGCTGGAGGCCAAGCTGGACAAGCCAGATGTGGTGAATTGGATGTGCTACAGAAAGACCGAGGACTTCTTTACAATCTGGCTGGATCTGAACATGTTCCTGCCCCTGGGCGTGGACTGCTGGATCGATAACACCAGGGTGGTGTATAATCGCAGCTCCGGCCTGGTGTCTAATGCACCAGGAGTGCAGATCAGGGTGCCCGGATTTGGCAAGACATACAGCGTGGAGTATCTGGACTCTAGCAAGCTGGCCGGCTACCTGCACACCCTGGTGCAGAACCTGGTGAACAATGGCTACGTGCGGGACGAGACAGTGAGAGCAGCACCTTATGATTGGAGGCTGGAGCCAGGACAGCAGGAGGAGTACTATAGAAAGCTGGCAGGACTGGTGGAGGAGATGCACGCAGCCTACGGCAAGCCCGTGTTCCTGATCGGCCACTCTCTGGGCTGTCTGCACCTGCTGTATTTTCTGCTGAGGCAGCCTCAGGCCTGGAAGGACCGCTTCATCGATGGCTTTATCAGCCTGGGAGCACCATGGGGAGGATCCATCAAGCCTATGCTGGTGCTGGCATCCGGCGACAACCAGGGCATCCCTATCATGTCCTCTATCAAGCTGAAGGAGGAGCAGCGGATCACCACAACCTCCCCCTGGATGTTCCCTTCTAGAATGGCCTGGCCAGAGGATCACGTGTTCATCAGCACCCCCTCCTTTAATTACACAGGCCGGGACTTCCAGAGATTCTTTGCCGATCTGCACTTTGAGGAGGGCTGGTATATGTGGCTGCAGAGCAGGGACCTGCTGGCAGGACTGCCAGCACCTGGCGTGGAGGTGTACTGCCTGTATGGAGTGGGACTGCCAACACCAAGGACCTACATCTATGACCACGGCTTCCCATACACCGATCCCGTGGGCGTGCTGTATGAGGATGGCGACGATACAGTGGCCACCAGGTCCACAGAGCTGTGCGGACTGTGGCAGGGCCGCCAGCCTCAGCCAGTGCACCTGCTGCCACTGCACGGCATCCAGCACCTGAACATGGTGTTTTCTAATCTGACCCTGGAGCACATCAATGCCATCCTGCTGGGAGCATACAGACAGGGACCACCTGCATCTCCTACAGCAAGCCCAGAGCCACCCCCTCCAGAGTGATAA-3'
No.4
5'-ATGGGCAAACATTGCAAGCAGC-3'
No.5
5'-AACCACGCCAGGACAACCTCTG-3'
Claims (7)
1.一种优化的人卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶基因表达框,其特征在于,
(Ⅰ)、包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列;
(Ⅱ)、表达框表达产物能够将HDL卵磷脂的C2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇,生成溶血卵磷脂和胆固醇酯。
2.一种重组腺相关病毒载体,其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。
3.根据权利要求1所述基因表达框和权利要求2所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,具有:
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列;或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的互补序列;或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质,但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列;或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有70%同源性的序列。
4.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,包括:
(1)携带基因组可自我互补形成双链DNA分子;和/或
(2)重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10,其中优选的血清型为AAV8和AAV3B。
5.一种基因治疗方式,其特征在于,包括权利要求1所述的基因表达框和权利要求2、3、4所述的重组腺相关病毒载体。
6.根据权利要求5所述的基因治疗方式,其特征在于,给药方式为静脉注射和/或肌肉注射,优选为静脉注射。
7.根据权利要求5和权利要求6所述的基因治疗方式,其特征在于,一次给药可持续降低体内的血脂浓度,从而达到治疗高脂血症和动脉粥样硬化的目的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710329155.3A CN108103082B (zh) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | 一种腺相关病毒介导的lcat基因表达载体及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710329155.3A CN108103082B (zh) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | 一种腺相关病毒介导的lcat基因表达载体及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108103082A true CN108103082A (zh) | 2018-06-01 |
CN108103082B CN108103082B (zh) | 2021-07-13 |
Family
ID=62206155
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710329155.3A Active CN108103082B (zh) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | 一种腺相关病毒介导的lcat基因表达载体及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108103082B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004108922A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-12-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver |
WO2010129799A2 (en) * | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Curna, Inc. | Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene |
CN102994549A (zh) * | 2005-04-07 | 2013-03-27 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 增强腺相关病毒载体功能的方法 |
-
2017
- 2017-05-11 CN CN201710329155.3A patent/CN108103082B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004108922A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-12-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver |
CN102994549A (zh) * | 2005-04-07 | 2013-03-27 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 增强腺相关病毒载体功能的方法 |
WO2010129799A2 (en) * | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Curna, Inc. | Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DONG,X.ETAL: "Cloning vector pAAV2neo-1.3HBV(ayw), complete sequence", 《GENBANK: KX470733.1》 * |
王立峰: "重组腺相关病毒载体介导的人LCAT和/或apoA-I在肌源性细胞中表达", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108103082B (zh) | 2021-07-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Keeler et al. | Recombinant adeno-associated virus gene therapy in light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): where are we, and how did we get here? | |
AU2021203044B2 (en) | Adeno-Associated Virus Vector Delivery Of B-Sarcoglycan And Microrna-29 And The Treatment Of Muscular Dystrophy | |
Drouin et al. | Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development | |
Gao et al. | New recombinant serotypes of AAV vectors | |
Vance et al. | AAV biology, infectivity and therapeutic use from bench to clinic | |
CN108795946A (zh) | 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用 | |
US20220056090A1 (en) | Aav-epo for treating companion animals | |
US20230242905A1 (en) | Method for Engineering Novel Hybrid AAV Capsids Through Hyper Variable Regions Swapping | |
CN106884014A (zh) | 腺相关病毒反向末端重复序列突变体及其应用 | |
CN108103079A (zh) | 一种高尿酸血症的基因治疗药物 | |
CN109762831B (zh) | 用于治疗3a型粘多糖贮积症的基因药物构建体 | |
CN108103103B (zh) | 一种高脂血症的基因治疗药物 | |
JP2024032967A (ja) | ジスフェリン二重ベクターを用いた遺伝子治療 | |
Suoranta et al. | Strategies to improve safety profile of AAV vectors | |
Chen | Adeno-associated virus vectors for human gene therapy | |
CN108611355A (zh) | X染色体连锁肌小管肌病的基因药物 | |
CN108103082A (zh) | 一种腺相关病毒介导的lcat基因表达载体及其用途 | |
WO2022198872A1 (zh) | Aav介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途 | |
CN111084888B (zh) | 一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物 | |
Kuranda et al. | AAV vector-based gene therapy, progress and current challenges | |
AU2021268946A1 (en) | Cross-species compatible adeno-associated virus compositions and methods of use thereof | |
CN108103058A (zh) | 一种i型糖尿病的基因治疗药物 | |
WO2023131345A1 (zh) | 用于x染色体连锁肾上腺脑白质营养不良的基因治疗药物和方法 | |
AU2022301044A1 (en) | Methods and compositions for tau reduction gene therapy | |
WO2023147304A1 (en) | Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200820 Address after: 100176 Beijing Daxing District economic and Technological Development Zone, East Road, No. three Jinghai Road 35, high tech Park 2. Applicant after: Beijing Jinlan Gene Technology Co.,Ltd. Address before: 100176 Beijing Daxing District economic and Technological Development Zone, East Road, No. three Jinghai Road 35, high tech Park 2. Applicant before: BEIJING FIVEPLUS MOLECULAR MEDICINE INSTITUTE Co.,Ltd. |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |