CN108103072A

CN108103072A - 一种甘薯紫外光受体uvr8基因及其克隆方法

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Publication number: CN108103072A
Application number: CN201711350987.XA
Authority: CN
Inventors: 李国良; 邱永祥; 邱思鑫; 林赵淼; 许泳清; 刘中华; 张鸿; 李华伟; 纪荣昌; 罗文彬; 汤浩
Original assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2018-06-01

Abstract

本发明提供一种甘薯紫外光受体UVR8基因及其克隆方法。所述甘薯紫外光受体UVR8基因，核苷酸序列如SEQ.NO.4所示，其克隆方法包括以下步骤：(1)cDNA第一链的合成；(2)UVR8保守序列的同源克隆；(3)UVR8 3’端的扩增；(4)UVR8 5’端的扩增；(5)序列拼接。采用这种方法不需要亲缘关系较近的物种，只要有同源基因，就可以通过设计多个兼并碱基完成核心片段的克隆，该方法同样适用于其它植物的基因克隆。而且在5端克隆中，不需要用磷酸化酶去除mRNA的磷酸集团，再在连接酶连接接头引物，而是根据M‑MuLV逆转录酶的特性，在逆转录RNA时在3’端加上3‑5个C，然后设计引物末端加上3‑5个G与之配对，完成逆转录过程。这种方法简便，节约时间和成本，成功率较高。

Description

一种甘薯紫外光受体UVR8基因及其克隆方法

技术领域

本发明涉及一种光受体UVR8基因及其克隆方法，尤其涉及一种甘薯紫外光受体UVR8基因及其克隆方法。

背景技术

光是自然界中影响植物生长和发育最重要的环境因子之一,不仅可以为植物进行光合作用提供辐射能量,而且可以作为信号分子调控其生长发育过程(高荣孚等,2002)。植物体内的光受体可以感受光照并产生信号传递,目前已经发现的植物光受体包括感受红光和远红光的光敏色素(phytochromes,phyA-E),感受蓝光/UV-A的隐花色素(cryptochromes,cry1和cry2)和向光色素(phototropins,phot1和phot2)以及感受中波紫外线(UV-B)的受体UVR8(UV RESISTANCE LOCUS 8)(Quail,2002；Banerjee andBatschauer,2005；Jenkins,2014；Sharrock and Clack,2002)。

21世纪以前,科学家们始终没有找到吸收UV-B的光受体及其信号转导途径,直到2002年,Kliebenstein等(2002)发现一株对UV-B超敏感的拟南芥突变体uvr8-1,突变体内查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)的基因表达量降低,类黄酮合成受阻。2011年,Rizzini等(2011)从拟南芥分离到UVR8蛋白,证实UVR8就是UV-B的光受体。目前，仅在少数植物基因组中分离到UVR8基因。

目前还没有甘薯UVR8基因相关报道，克隆甘薯UVR8基因的全序列是相当有必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于提供一种甘薯紫外光受体UVR8基因及其克隆方法。

本发明是这样实现的：

本发明首先提供了一种甘薯紫外光受体UVR8基因，核苷酸序列如SEQ.NO.4所示。

用于克隆所述甘薯紫外光受体UVR8基因的引物组序列如下：

本发明还提供了所述甘薯紫外光受体UVR8基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)cDNA第一链的合成

对样本进行处理，抽提样本RNA，采用Thermo Fisher RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一链；

(2)UVR8保守序列的同源克隆

根据NCBI公布的植物UVR8序列,采用codehop方法设计简并引物F1、R1，以步骤(1)得到的甘薯cDNA为模板进行扩增，得到DNA片段回收纯化后,连接到pMD18-T载体,转化鉴定后测序，得到核心基因片段；

(3)UVR8 3’端的扩增

根据已知植物的UVR8基因片段和3’RACE原理,以步骤(1)得到的甘薯cDNA为模板进行COP1 3’端的巢式扩增，设计第一对PCR引物为F3和oligodT18，巢式引物为F2、F3，取第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的模板，将扩增到的DNA片段连接到T载体、转化鉴定后测序，得到3端序列；

(4)UVR8 5’端的扩增

按照5’RACE原理，设计引物5'oligo dG代替随机引物，采用Thermo FisherRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以步骤(1)同步骤处理的样本RNA为模板，利用M-MuLV逆转录酶合成甘薯cDNA第一链；然后以该cDNA为模板进行扩增，设计特异性引物5'adapter、R2，将扩增到的DNA片段连接到T载体、转化鉴定后测序，得到5端序列；

(5)序列拼接

将所述核心基因片段、3端序列和5端序列进行序列比对，拼接，得到甘薯UVR8基因序列。

更具体地：

所述植物UVR8序列选自但不限于以下其中一种植物：拟南芥、番茄、烟草、马铃薯。

所述核心基因片段的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。

所述3端序列如SEQ.NO.2所示。

所述5端序列如SEQ.NO.3所示。

本发明具有如下优点：

1、本发明方法首次获得甘薯UVR8基因的全序列，同时通过一种克隆甘薯UVR8的引物组和克隆方法，它能快速准确地克隆甘薯UVR8基因的全序列，为后续甘薯UVR8基因分子研究提供了理论基础。

2、与现有克隆技术相比，采用这种方法不需要亲缘关系较近的物种，只要有同源基因，就可以通过设计多个兼并碱基完成核心片段的克隆，该方法同样适用于其它植物的基因克隆。

3、与现有克隆技术相比，采用这种方法在5端克隆中，不需要用磷酸化酶去除mRNA的磷酸集团，再在连接酶连接接头引物，而是根据M-MuLV逆转录酶的特性，在逆转录RNA时在3’端加上3-5个C，然后设计引物末端加上3-5个G与之配对，完成逆转录过程。这种方法简便，节约时间和成本，成功率较高。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为甘薯UVR8的蛋白三维结构图。

具体实施方式

1材料与方法

1.1试验材料

福菜薯23号,(来源于福建省农科院作物研究所甘薯种质资源圃，文献出处：李国良等，光温对叶菜型甘薯叶片花青素合成及相关酶基因表达的影响。2017)系福建省农科院作物研究所选育的叶菜用甘薯新品种,种植于科研育种基地内。取田间正常生长的甘薯叶片,液氮速冻后,保存于-80℃冰箱中。

TransStart Top Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物科技有限公司。RNA提取试剂、D2000marker、pMD18-T载体和RACE试剂盒等购自Takara公司。OligodT18引物购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR扩增引物和DNA测序由上海生工生物科技有限公司完成。其他常规化学药品及试剂,除特别说明外,均购自Sigma公司或国产AR级试剂。

1.2试验方法

1.2.1甘薯cDNA第一链的合成

液氮研磨后,参照TAKARA RNAiso plus提取甘薯叶片的RNA。采用Thermo FisherRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一链,逆转录的程序为：42℃孵育60min,72℃变性5min,-20℃保存。

1.2.2 ibUVR8保守序列的同源克隆

根据NCBI公布的马铃薯UVR8序列,采用codehop方法设计简并引物(F1、R1)。以福菜薯23号cDNA为模板进行扩增,PCR反应程序：94℃预变性5min,94℃变性30s，55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环,最后再72℃延伸10min。扩增得到DNA片段回收纯化后,连接到pMD18-T载体,转化鉴定后测序，序列如SEQ.NO.1所示，得到核心基因片段。

1.2.3 ibUVR8 3’端和5’端的扩增

根据已知UVR8基因片段和3’RACE原理,以福菜薯23号cDNA为模板进行COP1 3’端的扩增,设计的两条巢式引物UVR8-F2，UVR8-F3。PCR反应条件：94℃预变性4min,94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环,最后再72℃延伸5min。以UVR8-F3和oligodT18为引物扩增,取1μL第一轮PCR产物作为第二轮PCR反应的模板,将扩增到的DNA片段连接到T载体、转化鉴定后测序，序列如SEQ.NO.2所示，得到3端序列。

按照5’RACE原理,设计引物5'oligo dG代替随机引物，采用Thermo FisherRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一链,逆转录的程序为：42℃孵育60min,72℃变性5min,-20℃保存。

设计特异性引物5'adapter，UVR8-R2，采用PCR：94℃变性30s,72℃延伸3min,共5个循环,94℃变性30s,70℃退火30s,72℃延伸3min,共20个循环。将扩增到的DNA片段连接到T载体、转化鉴定后测序，序列如SEQ.NO.3所示，得到5端序列。

1.2.4序列拼接

采用引物拼接软件lasergene-seqman将核心基因片段、3端序列和5端序列进行序列比对，拼接，拼接结果如SEQ.NO.4所示，得到甘薯UVR8基因序列。

经过ncbi数据库序列对比，发现甘薯UVR8与马铃薯、拟南芥、芜菁等序列相似性达到80％以上。采用生物信息学软件模拟甘薯UVR8，如图1所示，可以发现其同样由7个片状的β-螺旋纵向排列成环形结构,中空形成流水通道，具有高度保守的GWRHT区域，W233、W285和W337位于其中，是甘薯UVR8发色团的主要氨基酸，证明拼接所得基因序列即为甘薯紫外光受体UVR8的基因序列。

由于甘薯为六倍体植物，尚没有完整的基因组序列公布，本实施例以近似物种的同类基因序列为参考，采用同源克隆的方法得到甘薯完整的UVR8基因。该方法同样适用于其它植物的基因克隆。

以上各步骤涉及到的引物序列如表1所示。

表1实验中所涉及到的引物及其核苷酸序列

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的任何修改、等同替换和改进等，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 福建省农业科学院作物研究所

<120> 一种甘薯紫外光受体UVR8基因及其克隆方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 344

<212> DNA

<213> （甘薯Ipomoea batatas）

<400> 1

cagcagtcag agccatagta tgtctccacc cgcccagcag tcagagccat agtatgtcgc 60

catccacatg ccaccattac catcttttct ccctgtatag ctgaaacttt ttcaggaact 120

aagcgatcat ttcggtcacc taaacccaga ttaccatatc gaccccagcc ccaaccataa 180

agctcgccat cttctgtcac agcagctgta tgttcagcac cagcagcaac cattttcaca 240

ggaactccct gaaatgtttc aattttctga ggtacaagtg aatcctctat agtgccaaga 300

cccagttgac cattctgatt acgtccccaa gattgaactt ctcc 344

<210> 2

<211> 1004

<212> DNA

<213> （甘薯Ipomoea batatas）

<400> 2

cgagctttat ggttggggct ggggtcgata tggtaatctg ggtttaggtg accgaaatga 60

tcgcttagtt cctgaaaaag tttcagctat acagggagaa aagatggtaa tggtagcatg 120

tggatggcga catacaatat ctgtttcttc ctctggttct ttatatactt atggctggag 180

caaatatggt caacttggac acggggattt tgaagaccac cttgttccct gtaagcttga 240

aaccttgcat ggcgatttta tttctcagat ttcaggtgga tggagacaca ccatggcact 300

tacaactgat ggcaagcttt atggttgggg atggaataag tttggacaag ttggtgttgg 360

tgacaatgtt gatcactgtt cacccataca agtcaaattt ccacatgatc agaaagtagt 420

tgcaatctca tgtggttgga ggcatacact atctgttact gaaaggcaaa atgtgtattc 480

ttggggtaga ggcacaaatg gacagttagg ccatggagaa tctgctgaca ggaatgcccc 540

aaagatcata gaatcattga gcatggatgg atcaagaaac ctacagattg aagctccaaa 600

gtccaaccca tctacagctg aaaaaaattg ggtttcgcca acacagagat acgcagttgt 660

tccagatgag aatgtgacag acaacggaaa tgatgtgaat gtcccagaaa acgatgtgaa 720

gaggatgcga gtgtgaaata tatccttgca cagttgcacg aagctaacat tgagtctgga 780

atatgacctt ccttgtaaca atcatgccat atatttatga ttgcttgcag ttgtactatc 840

ctctccatct actcggtgtt tgaaatttct tttgcatgta agcaaaataa agaatatttg 900

ccttttttct tttacccata ttctctgtat agaaactatt acatatttgg gtttttcgaa 960

atgatcgata tctctggact taactacaaa aaaaaaaaaa aaaa 1004

<210> 3

<211> 437

<212> DNA

<213> （甘薯Ipomoea batatas）

<400> 3

ccaagaccca gttgaccatt ctgattccgc ccccaacttt ggacttctcc ttccatggta 60

acagctaaac aatggctgtc cccacaagca atttgcttta tctgtacccc atgcaatgcc 120

ttgattggtt gaggaataaa caagtcgcta gagtttccat ggcccaacct tccaaagtca 180

ccccatcccc aactgtacac ctgcatgagt gactccgagt aagctgttgt atgatcagca 240

ccacaaataa cagatactac ttcctggcca tctaatgcgc tcacttgagt aggtaaaaac 300

ctatcatcag catccccatg gccaagctgc ccatcctctc ctctccccca tgcgaaaaca 360

acatttccag cgaggagagc aacggagtgg ctggctccgg cggagatgag aagcactcta 420

cgaatcgcgg cccgcgt 437

<210> 4

<211> 1162

<212> DNA

<213> （甘薯Ipomoea batatas）

<400> 4

ggagaagttc aatcttgggg acgtaatcag aatggtcaac tgggtcttgg cactatagag 60

gattcacttg tacctcagaa aattgaaaca tttcagggag ttcctgtgaa aatggttgct 120

gctggtgctg aacatacagc tgctgtgaca gaagatggcg agctttatgg ttggggctgg 180

ggtcgatatg gtaatctggg tttaggtgac cgaaatgatc gcttagttcc tgaaaaagtt 240

tcagctatac agggagaaaa gatggtaatg gtagcatgtg gatggcgaca tacaatatct 300

gtttcttcct ctggttcttt atatacttat ggctggagca aatatggtca acttggacac 360

ggggattttg aagaccacct tgttccctgt aagcttgaaa ccttgcatgg cgattttatt 420

tctcagattt caggtggatg gagacacacc atggcactta caactgatgg caagctttat 480

ggttggggat ggaataagtt tggacaagtt ggtgttggtg acaatgttga tcactgttca 540

cccatacaag tcaaatttcc acatgatcag aaagtagttg caatctcatg tggttggagg 600

catacactat ctgttactga aaggcaaaat gtgtattctt ggggtagagg cacaaatgga 660

cagttaggcc atggagaatc tgctgacagg aatgccccaa agatcataga atcattgagc 720

atggatggat caagaaacct acagattgaa gctccaaagt ccaacccatc tacagctgaa 780

aaaaattggg tttcgccaac acagagatac gcagttgttc cagatgagaa tgtgacagac 840

aacggaaatg atgtgaatgt cccagaaaac gatgtgaaga ggatgcgagt gtgaaatata 900

tccttgcaca gttgcacgaa gctaacattg agtctggaat atgaccttcc ttgtaacaat 960

catgccatat atttatgatt gcttgcagtt gtactatcct ctccatctac tcggtgtttg 1020

aaatttcttt tgcatgtaag caaaataaag aatatttgcc ttttttcttt tacccatatt 1080

ctctgtatag aaactattac atatttgggt ttttcgaaat gatcgatatc tctggactta 1140

actacaaaaa aaaaaaaaaa aa 1162

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> （人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)

<223> n =a或g或c或t

<400> 5

ggagaagttc aatcttgggg amgnaaycar aa 32

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

cagcagtcag agccatagta tgtckccanc cncc 34

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

tgtgaaaatg gttgctgctg g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

cgagctttat ggttggggct 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

ccaagaccca gttgaccatt ct 22

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

Claims

1.一种甘薯紫外光受体UVR8基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ.NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的甘薯紫外光受体UVR8基因，其特征在于：用于克隆所述甘薯紫外光受体UVR8基因的引物组序列如下：

3.如权利要求2所述的甘薯紫外光受体UVR8基因的克隆方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)cDNA第一链的合成

对样本进行处理，抽提样本RNA，采用Thermo Fisher RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit合成甘薯cDNA第一链；

(2)UVR8保守序列的同源克隆

(3)UVR8 3’端的扩增

(4)UVR8 5’端的扩增

按照5’RACE原理，设计引物5'oligo dG代替随机引物，采用Thermo Fisher RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit，以步骤(1)同步骤处理的样本RNA为模板，利用M-MuLV逆转录酶合成甘薯cDNA第一链；然后以该cDNA为模板进行扩增，设计特异性引物5'adapter、R2，将扩增到的DNA片段连接到T载体、转化鉴定后测序，得到5端序列；

(5)序列拼接

4.根据权利要求3所述的甘薯紫外光受体UVR8基因的克隆方法，其特征在于：步骤(2)所述植物UVR8序列选自但不限于以下其中一种植物：拟南芥、番茄、烟草、马铃薯。

5.根据权利要求3所述的甘薯紫外光受体UVR8基因的克隆方法，其特征在于：所述核心基因片段的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。

6.根据权利要求3所述的甘薯紫外光受体UVR8基因的克隆方法，其特征在于：所述3端序列如SEQ.NO.2所示。

7.根据权利要求3所述的甘薯紫外光受体UVR8基因的克隆方法，其特征在于：所述5端序列如SEQ.NO.3所示。