CN108096634A - 一种人工骨移植材料及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人工骨移植材料。它由聚已内酯/聚卡普隆纳米复合材料与多肽构建而成。本发明中的人工骨移植材料，植入体内后可有效促进细胞粘附、增殖，血管长入和骨组织再生，具有明显促进骨缺损修复的生物功能。

Description

一种人工骨移植材料及其用途
技术领域
本发明属于医用生物材料领域，尤其涉及一种人工骨移植材料及其用途。
背景技术
当前，植入骨移植材料是临床上治疗骨缺损最常见的手段。自体骨被认为是“骨移植材料的黄金标准”，具有优异的骨诱导能力、骨传导能力、成骨能力和组织相容性，但是存在来源有限、供区易出现并发症等局限。而来源丰富的异体骨在临床应用中缺乏显著的骨诱导活性，同时存在易传染疾病、生物力学性能较差及免疫排斥等诸多问题。人工骨移植材料应运而生，可实现大规模生产和可控性修饰改性使其成为最有希望替代传统自体和异体骨的移植材料。其中骨水泥、生物陶瓷及组织工程骨等人工骨移植材料已在临床试验中取得不错的进展，但遗憾的是，血管化范围有限和血管化进程缓慢等问题致使人工骨移植材料在临床上的应用仍然受限。
目前，关于促进人工骨移植材料血管化的研究和应用主要集中在：①将人工骨材料植入体内使其内部长有血管后再取出以供植入；②先在人工骨上种植内皮细胞(ECs)或间充质干细胞(MSCs)等，以在体外实现人工骨的预血管化，再将人工骨植入骨缺损处以促进骨缺损部位血管化；③将一定浓度的生物陶瓷或铜离子、锌离子等金属离子与生物材料进行复合制备复合材料以促进VEGF生成进而促进血管新生(或血管生成)；④向人工骨中引入VEGF等基因；⑤将促血管因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和骨形态发生蛋白(BMPs)等与人工骨进行复合。但是这些方法仍未完全解决关于人工骨移植材料的快速血管化问题，且存在生产成本昂贵、制备周期较长及治疗副作用较大等缺陷。
综上所述，开发制备过程简便、生产成本合理且生物安全，同时能实现快速血管化的人工骨移植材料是运用骨移植材料修复骨缺损的关键，同时也是目前亟待解决的问题。
目前，一些多肽(如WKYMVm、SP及CAG等)已被证明具有诱导血管组织新生的能力。因此，现有技术中也有将这些多肽与人工骨材料结合以实现对其进行修饰，再来植入以实现快速血管化。然而，目前采用多肽对人工骨材料进行修饰的方法主要存在以下技术问题：一方面，多肽对人工骨材料的亲和性差，形成的结合不稳定、结合力小、结合率低，进入人体内后，多肽会很快脱落、流失、降解掉，另一方面，进行修饰所需要的条件不利于维护多肽的生物活性，在修饰反应过程中，多肽的促血管新生能力会大大减弱甚至丧失。对此，目前现有技术中，主要采用一些起桥梁作用的多肽，将其先与上述多肽反应以实现将二者结合，之后再用所制得的多肽产品对人工骨材料进行修饰，以实现植入。然而，这一方法依然存在以下技术难题：1、两种多肽之间具有较高的相互选择性，若选择不好，则会导致二者在功能上相互抑制，进而导致与人工骨材料无法结合或结合不稳定，或者在与人工骨材料结合后无法发挥促生长作用。2、多肽产品与人工骨材料选择搭配不好，也会阻碍多肽的促生长功能的发挥，致使多肽产品无法赋予人工骨材料以理想的诱导血管新生的能力。3、制备多肽产品的反应过程，以及多肽产品对人工骨材料的修饰过程，都分别需要通过复杂的化学反应实现。在制备反应过程中若控制不好，则既会导致所得的多肽产品的促血管新生能力大大减弱甚至丧失，也会导致多肽产品对人工骨材料的亲和性差，形成的结合不稳定、结合力小、结合率低，进入人体体内后，会很快脱落、流失、降解掉的难题。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种人工骨移植材料，该人工骨移植材料植入体内后可有效促进细胞粘附、增殖和血管长入，具有明显促进血管新生的生物功能。
本发明的另一目的在于提供上述人工骨移植材料的用途。
本发明的第一目的具体通过以下技术方案来实现：
一种人工骨移植材料，其特征在于：它由聚已内酯(PCL)/聚卡普隆(PGC)纳米复合材料与多肽构建而成。
作为进一步明确，上述PCL/PGC纳米复合材料，是通过以下步骤制备得到的：
将PCL和PGC溶于六氟异丙醇(HFIP)以制备得到聚合物纺丝溶液，其中各组分的重量含量分别为：PCL 6％～7％，PGC 2％～3.5％，其余为HFIP；然后将所得的聚合物纺丝溶液，经常规的静电纺丝技术制备成PCL/PGC纳米复合材料。
作为再进一步明确，上述PCL/PGC纳米复合材料，具体是通过以下步骤制备得到的：
(1)取PCL和PGC溶于六氟异丙醇(HFIP)中，以制备聚合物纺丝溶液，其中各组分重量含量为：PCL 6％～7％，PGC 2％～3.5％，其余为HFIP；
(2)将所得聚合物纺丝溶液在电压为15kV，注射速率为1.0ml/h，注射器针头内径为0.8mm，收集装置(即滚筒)与注射器针头的间距为15cm，滚筒转速为250rpm的条件下，采用静电纺丝仪制备成PCL/PGC纳米复合材料。
作为再进一步明确，上述PCL/PGC纳米复合材料的平均直径为415.507±88.150nm。
上述多肽，选用序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽，其中，SCNSSSYSWYCWFGGSSPS为PGA-binding peptide motif短肽序列，它对作为人工血管材料的PCL/PGC纳米复合材料有很高的选择性和很强的亲和性，WKYMVm-NH2可促进血管形成。
作为进一步明确，上述序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽，具体是通过以下步骤制备得到的：
1、称取1000～5000mg FMOC-RINK AMIDE MBHA RESIN树脂置于多肽合成反应器的反应柱中，向其中加入二氯甲烷(DCM)浸没树脂，保持30min使树脂膨胀以达到活化树脂的目的，之后压滤除去DCM；
2、加入15ml六氢吡啶，氮气吹沸反应5min，压滤除去六氢吡啶，之后再次加入15mL六氢吡啶，氮气吹沸反应15min，压滤除去六氢吡啶，先后分别使用异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂各三次，每次15毫升；
3、向1000～1500mg FMOC-D-MET-OH、500～1000mg O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中，先后依次加入0.8～2ml 1-羟基苯并三唑(HOBt)、10～20mlDMF、0.1～1ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)配成反应液，再将该反应液加入反应柱中并于室温环境下用氮气吹沸反应3h；反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂两次，然后用DMF洗涤树脂三次；FMOC-D-MET-OH连接到树脂后，取浓度为1moI/l的乙酸酐和0.3moI/l乙胺各2ml加入15ml DMF中，混和均匀，加入连有第一个氨基酸的树脂复合物中，氮气吹沸充分反应120～150min以封闭树脂上的活性位点；
4、依次重复第2、3步骤各一次，直至接到最后一个氨基酸Fmoc-Ser-OH；
5、最后分别用DMF、DCM、甲醇各洗三次收干树脂；
6、用氮气将所得的树脂复合物吹干，加入50ml烧瓶中，随后加入体积比为80：5：5：5：3：2的三氟乙酸(TFA)/苯酚/水/苯硫基甲烷/1,2-乙二硫醇(EDT)/三异丙基硅烷(TIS)的混合溶液，于0～5℃下密闭磁力搅拌反应3～5h后，经砂芯漏斗过滤入20～30倍体积量的冰乙醚中，放置冰箱2h；离心收集沉淀，沉淀用超纯水溶解，再放置冰箱冷冻；然后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机，冻干至恒重即得粗肽；所得的粗肽经质谱仪检测和高效液相色谱仪分离纯化。
作为再进一步明确，上述人工骨移植材料，是将所述PCL/PGC纳米复合材料经体积比为75％的酒精浸泡和紫外辐照杀菌后，采用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲溶液)漂洗3次，之后再浸泡于浓度为50～500μmol/L的所述序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽溶液中，于4℃无菌环境中静置1～24h，其后再经PBS缓冲溶液漂洗3次以除去未粘附的多肽分子而制得的。
上述多肽溶液，是向所述多肽中先后加入适量的无菌三蒸水和PBS缓冲溶液配制而成的。
本发明还提供了上述人工骨移植材料在制备用于治疗骨缺损疾病的医用材料中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种人工骨移植材料，它植入体内后可有效促进细胞粘附、增殖和血管长入，具有明显促进血管新生和骨组织再生的生物功能。具体来说：
1、通过静电纺丝技术制备的PCL/PGC纳米复合材料具有类似于骨组织中天然细胞外基质(ECM)的复杂的三维网架结构，其植入体内后有效地促进了细胞粘附、增殖，血管长入和骨组织再生；
2、所用多肽合成简单、易提纯、纯度高(纯度达>95％)、合成价格低廉，且相对于其他多肽分子，对PCL/PGC纳米复合材料具有很高的亲和性，在4℃环境下，2h内即可与PCL/PGC纳米复合材料进行快速、高效的非共价结合，而无需通过复杂、耗时的化学反应过程，因此，该多肽在修饰PCL/PGC纳米复合材料方面更快更简单更高效；
3、所用多肽与人工骨材料选择搭配性好，所得人工骨移植材料在临界骨缺损模型中体现了促进血管化和骨缺损修复的优异性能：在临界骨缺损模型中植入该材料1月后，骨缺损区域出现大量微血管；植入2月后，骨缺损区域出现了明显的骨组织再生和骨缺损修复的现象，且其治疗无副作用、生物安全，解决了人工骨移植材料在促骨缺损修复过程中难以血管化的问题。
附图说明
图1为本发明实施例中所述人工骨移植材料的构造示意图。
图2为本发明实施例中所得PCL/PGC纳米复合材料的SEM示意图。
图3为本发明实施例中将所述人工骨移植材料植入骨缺损处1月后，对缺损组织区域行冰冻切片，其后对冰冻切片进行免疫组织荧光染色，最后在荧光显微镜下观察到的缺损处血管新生的效果图。
图4为本发明实施例中将所述人工骨移植材料植入骨缺损处2月后缺损处的micro-CT图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种人工骨移植材料，它由聚已内酯(PCL)/聚卡普隆(PGC)纳米复合材料与序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽构建而成；所述多肽中，SCNSSSYSWYCWFGGSSPS为PGA-binding peptide motif短肽序列，它对作为人工骨材料的PCL/PGC纳米复合材料有很高的选择性和很强的亲和性，WKYMVm-NH2可促进血管形成。
上述PGA-binding peptide motif短肽序列，在期刊：Annals of BiomedicalEngineering,Vol.38,No.6,June 2010，pp.1965–1976，文章名：Peptide InterfacialBiomaterials Improve Endothelial Cell Adhesion and Spreading on SyntheticPolyglycolic Acid Materials，作者：Xin Huang,Stefan Zauscher等的文章中，已明确公开其作为桥梁肽的应用。
其PCL/PGC纳米复合材料，具体是通过以下步骤制备得到的：
称取0.45g聚已内酯(PCL)和0.15g聚卡普隆(PGC)固体颗粒，并加入透明玻璃瓶，向玻璃瓶中加入6ml六氟异丙醇(HFIP)并持续搅拌3天以制备稳定、均匀的聚合物纺丝溶液；将配制好的聚合物纺丝溶液在电压为15kV，注射速率为1.0ml/h，注射器针头内径为0.8mm，收集装置(即滚筒)与注射器针头的间距为15cm，滚筒转速为250rpm的工作条件下，采用静电纺丝仪制备成PCL/PGC纳米纤维；所得PCL/PGC纳米纤维置于通风处7天以充分挥发有机溶剂。
附图2中分别给出了：(A)FESEM下PCL/PGC纳米复合材料的形貌。(B)PCL/PGC纳米复合材料的直径分布。根据其所示内容可知：本发明中的PCL/PGC纳米复合材料为直径为100-500nm的纤维，具有与骨组织中天然细胞外基质相仿的结构和形貌。经测算，其平均直径为415.507±88.150nm。
该序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽，具体是通过以下步骤制备得到的：
1、称取1000～5000mg FMOC-RINK AMIDE MBHA RESIN(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：GL-F1907)树脂置于多肽合成反应器的反应柱中，向其中加入二氯甲烷(DCM)浸没树脂，保持30min使树脂膨胀以达到活化树脂的目的，之后压滤除去DCM；
2、加入15ml六氢吡啶，氮气吹沸反应5min，压滤除去六氢吡啶，之后再次加入15mL六氢吡啶，氮气吹沸反应15min，压滤除去六氢吡啶，先后分别使用异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂各三次，每次15毫升；
3、向1000～1500mg FMOC-D-MET-OH(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：35602)、500～1000mg O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：00705)中，先后依次加入0.8～2ml 1-羟基苯并三唑(HOBt)(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：00602)、10～20ml DMF、0.1～1ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：90600)配成反应液，再将该反应液加入反应柱中并于室温环境下用氮气吹沸反应3h；反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂两次，然后用DMF洗涤树脂三次；FMOC-D-MET-OH连接到树脂后，取浓度为1moI/l的乙酸酐和o.3moI/l乙胺各2ml加入15ml DMF中，混和均匀，加入连有第一个氨基酸的树脂复合物中，氮气吹沸充分反应120～150min以封闭树脂上的活性位点。
4、依次重复第2、3步骤各一次，直至接到最后一个氨基酸Fmoc-Ser-OH(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：36101)；
5、最后分别用DMF、DCM、甲醇各洗三次收干树脂；
6、用氮气将所得的树脂复合物吹干，加入50ml烧瓶中，随后加入体积比为80：5：5：5：3：2的三氟乙酸(TFA)/苯酚/水/苯硫基甲烷/1,2-乙二硫醇(EDT)/三异丙基硅烷(TIS)的混合溶液，于0～5℃下密闭磁力搅拌反应3～5h后，经砂芯漏斗过滤入20～30倍体积量的冰乙醚中，放置冰箱2h；离心收集沉淀，沉淀用超纯水溶解，再放置冰箱冷冻；然后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机，冻干至恒重即得粗肽；所得的粗肽经质谱仪检测和高效液相色谱仪分离纯化。
上述人工骨移植材料，是将所述PCL/PGC纳米复合材料经体积比为75％的酒精浸泡和紫外辐照杀菌后，采用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲溶液)漂洗3次，之后再浸泡于浓度为50～500μmol/L的所述序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽溶液中，于4℃无菌环境中静置1～24h，其后再经PBS缓冲溶液漂洗3次以除去未粘附的多肽分子而制得的。其中，多肽溶液是将所述多肽粉末先后用适量的无菌三蒸水和PBS缓冲溶液配制而成。
经测试，结合了序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽的PCL/PGC纳米复合材料新增了N元素。
此外，本实施例中还应用了所制得人工骨移植材料进行了以下检测实验：
(1)临界颅骨骨缺损模型的构建和移植材料的植入
购买6只8周龄的SD大鼠(220～250g)，具体手术操作为：首先按照1～1.5mL/只的剂量腹腔注射水合氯醛溶液(10wt％)麻醉大鼠，待大鼠被麻醉后固定大鼠的四肢和头部。头部剃毛，并用碘伏进行局部消毒，铺洞巾。无菌条件下，用手术刀沿枕骨到额骨沿中线切开皮肤2cm，用镊子和手术刀片将贴在颅骨上的软组织分离，暴露颅骨。用环形电钻在大鼠左右两侧颅骨钻孔以各制备一个直径为5mm的全层颅骨缺损。钻孔过程中适当用生理盐水冷却，钻孔完毕用生理盐水冲洗以清除残留骨渣，于大鼠颅骨右侧缺损处植入本发明所制得的人工骨移植材料，最后依次缝合骨膜及头皮，碘伏消毒创口。术后当日及其后的两天注射20万单位青霉素以防感染。动物在清洁级动物房中进行单独分笼饲养，提供充足的食物和水。
(2)术后骨缺损处血管新生的检测
术后1月，腹腔过量注射水合氯醛溶液(20wt％)对2只大鼠进行无痛处死。切开皮肤，取出整个颅骨，用生理盐水漂洗干净后立即置于4％多聚甲醛中于4℃环境中固定24h。后在室温下用脱钙液脱钙7d，其后先后用PBS溶液和双蒸水洗涤颅骨组织终止脱钙。最后进行冰冻切片。所得切片进行通透15min处理后在37℃条件下用10％山羊封闭血清封闭30min，之后用50μL的一抗溶液anti-CD31(货号：ab119339，来源公司：Abcam)在4℃环境下孵育过夜，之后在37℃环境下与50μL的带FITC标记的山羊抗兔IgG溶液(货号：ab6717，来源公司：Abcam)结合，细胞核用DAPI溶液(货号：C1006，来源公司：碧云天)进行染色。切片最后在荧光显微镜下随机选取5个视野(10x)拍照。
根据图3所示的术后1月骨缺损处血管新生的荧光图像显示，可知：术后1月，植入本发明人工骨移植材料的骨缺损区有大量CD31+阳性表达细胞，表明该处有大量血管样组织，相比之下，未植入材料的骨缺损区CD31表达较弱，这表明植入本发明人工骨移植材料可显著促进缺损区血管新生。
(3)术后骨缺损修复效果的检测
术后2月，过量注射麻醉剂对剩余的4只大鼠进行无痛处死。切开皮肤，取出整个颅骨，用生理盐水漂洗干净后立即置于4％多聚甲醛中于4℃环境中固定24h。对固定好的大鼠颅骨标本使用Micro-computed tomography(Micro-CT)进行扫描和三维重建以检测其骨缺损修复情况。
根据图4可知：micro-CT显示在术后2月在4周时骨密度值(BMD)达到0.6937g/cm2，骨体积分数(BV/TV)达到34.4506％，显著高于未植入材料组，这表明本发明人工骨移植材料可显著促进骨组织再生和骨缺损修复。

Claims (6)

1.一种人工骨移植材料，其特征在于：它由聚已内酯/聚卡普隆纳米复合材料与多肽构建而成。
2.如权利要求1所述人工骨移植材料，其特征在于，所述聚已内酯/聚卡普隆纳米复合材料，是通过以下步骤制备得到的：
将聚已内酯和聚卡普隆溶于六氟异丙醇以制备得到聚合物纺丝溶液，其中各组分的重量含量分别为：聚已内酯 6%～7%，聚卡普隆 2%～3.5%，其余为六氟异丙醇；然后将所得的聚合物纺丝溶液，经静电纺丝技术制备成聚已内酯/聚卡普隆纳米复合材料。
3.如权利要求1或2所述人工骨移植材料，其特征在于：所述多肽，选用序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽。
4.如权利要求1-3任一所述人工骨移植材料，其特征在于：它是将所述聚已内酯/聚卡普隆纳米复合材料经杀菌后，采用磷酸盐缓冲液漂洗3次，之后再浸泡于浓度为50～500μmol/L的所述多肽溶液中，于4℃无菌环境中静置1～24h，其后再经磷酸盐缓冲液漂洗3次以除去未粘附的多肽分子而制得的。
5.如权利要求5所述人工骨移植材料，其特征在于：所述多肽溶液，是向所述多肽中先后加入适量的无菌三蒸水和磷酸盐缓冲液配制而成的。
6.如权利要求1-5任一所述人工骨移植材料在制备用于治疗骨缺损疾病的医用材料中的应用。
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