CN108096244A - 1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了1‑氢‑2‑吲哚酮‑3‑苄基/取代苄基‑3‑甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐在制备腺苷酸环化酶激动剂中的应用。活性测试结果表明，本发明所述化合物对8型腺苷酸环化酶高表达细胞显示出良好的选择激动活性，可用于腺苷酸环化酶相关疾病的药物开发。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及化合物1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐在制备腺苷酸环化酶激动剂中的应用。特别是1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯在制备8型腺苷酸环化酶(AC8)选择性激动剂中的应用。
背景技术
腺苷酸环化酶是(Adenylylcyclase，AC)是G蛋白偶联受体(GPCR)下游的关键信号分子，胰岛素、肾上腺素等蛋白质及儿茶酚胺类激素均需通过腺苷酸环化酶系统的传递来发挥作用，是许多细胞跨膜信号转导最终的效应酶。AC催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)脱去焦磷酸而合成得到环磷酸腺苷(cAMP)。cAMP是细胞内信号转导过程中一种重要的第二信使，能够激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节下游多种蛋白质(包括转录因子)的活性，影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学进程，从而调节细胞反应。目前发现在哺乳动物细胞中表达的共有9个跨膜亚型(AC1-AC9)和一个可溶性亚型(AC10)，各亚型在不同组织及细胞中的分布、活性及表达水平不尽一致，使得cAMP信号途径具有不同的调节机制并且参与不同的生理进程。
研究显示AC8在大脑、胰岛等细胞、组织中均有分布，在成人大脑中呈现出高水平表达，由Ca2+/CaM调控的AC8是一个纯Ca2+传感器。有研究表明AC8也存在于豚鼠、小鼠和大鼠的心脏窦房结细胞中。为探索AC8所参与的生理进程，相关研究结果不断涌现。AC1/AC8基因双敲除研究中发现，小鼠对酒精、可卡因、鸦片敏感化作用的神经反应减弱，大脑神经退化增强；降低了吗啡诱导的兴奋性运动；此外，双基因敲除后老鼠出现了记忆、学习功能障碍。在AC8单基因敲除的研究中，压力状态下的老鼠表现出异常焦虑；冒险行为异常活跃，类似于情绪障碍。也有研究表明，AC8还参与了葡萄糖稳态及下丘脑对高脂膳食适应度的调节。由此，AC8的基因多态性可能与情感障碍、抑郁症和酒精中毒等神经精神疾病及葡萄糖稳态疾病相关联。
目前，AC8的激活可通过内源性物质G-蛋白(Gαs)及钙离子刺激实现，但已知的激动剂化合物只有佛司可林(Forskolin)及其衍生物，尚未有其他化合物选择性激活AC8的任何相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐作为活性成分在制备腺苷酸环化酶激动剂中的应用，特别是1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯在制备8型腺苷酸环化酶(AC8)选择性激动剂中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐在制备腺苷酸环化酶激动剂中的应用，结构式如下所示：
其中R1、R2相同或不同，代表H、卤素基团或C1-C6的烷基，R3代表C1-C6的烷基。
优选的，所述R1、R2相同或不同，代表H、F、Cl、Br或I。
优选的，所述R1、R2为2，4位取代。
本发明的一个优选的技术方案，所述化合物为1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯，
优选的，上述腺苷酸环化酶为8型腺苷酸环化酶。
本发明所述的化合物可以作为腺苷酸环化酶激动剂用于治疗心脑血管系统疾病(如高血脂症)、呼吸系统疾病(如哮喘、COPD)、神经精神疾病(如情感障碍、抑郁症和酒精中毒)或者与葡萄糖稳态疾病(如糖尿病)。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物，含有本发明所述1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐，结构式如下所示：
其中R1、R2相同或不同，代表H、卤素基团或C1-C6的烷基，R3代表C1-C6的烷基。优选的，所述R1、R2相同或不同，代表H、F、Cl、Br或I。优选的，所述R1、R2为2，4位取代。本发明的一个优选的技术方案，所述化合物为1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯。
所述药物组合物，还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明所述药物组合物可以为口服制剂或者注射剂。所述口服制剂为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂或酏剂，所述注射剂为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。
本发明考察了所述化合物在HEK293+hAC1、hAC2、hAC5、hAC8细胞上的激动作用，实验结果数据显示，本发明所述化合物AC8细胞有激动选择性，HEK293+hAC8细胞在发明化合物的作用下，cAMP浓度随着化合物浓度的增加而增加，其激动活性值EC50为0.1052±0.03806μM。提示本发明所述化合物能够作为腺苷酸环化酶激动剂用于治疗与腺苷酸环化酶有关的疾病。
附图说明
图1本发明化合物分别对人胚肾HEK293+hAC1、hAC2、hAC5、hAC8细胞的激动作用初筛信号图。
图2本发明化合物对人胚肾HEK293+hAC8细胞的激动量效曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本发明以1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯为例说明对8型腺苷酸环化酶激动活性。本发明化合物购自荷兰specs公司(网址：http://www.specs.com/)，其编号为：AI-204/31729001。
实施例1：1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯对腺苷酸环化酶细胞的激动作用
1、实验仪器与材料
1.1仪器
1.2主要试剂和药物
(1)本发明化合物；
(2)阳性对照：Forskolin:FSK标准品-SIGMA(HPLC>98％)；
(3)其他试剂：
1.3药物配置
FSK：用DMSO稀释为50mM或10mM母液于-20°冰箱冻存，使用时按照试剂盒的要求，用stimulation buffer稀释为所需浓度。
1.4实验细胞
人胚肾细胞HEK293(hAC1、hAC2、hAC5、hAC8)基因稳定表达细胞株和对照稳转株(puro)委托深圳市百恩维生物科技有限公司构建。HEK93+hAC细胞生长于高糖培养基(含谷氨酰胺)，辅之以10％的血清，2ug/ml的Puromycin，并在37℃恒温箱中以加湿5％的二氧化碳空气保持在恒温箱中。
处理细胞后加入配好的Stimulation buffer(HBSS 1X,HEPES 1M,250mM IBMX,BSA Stabilizer 7.5％)重悬，调整至所需细胞浓度进行实验。
2、实验方法
2.1构建稳转细胞株
分别合成基因hAC1-myc、hAC2-myc、hAC5-myc、hAC8-myc(C端带Myc-tag)→分别构建到慢病毒载体pLVX-CMV-PGK-puro上→酶切，测序鉴定→大提质粒→转染293T细胞包装慢病毒→慢病毒的纯化和滴度的测定→3个慢病毒分别感染HEK293细胞→puro筛选转入外源基因的稳转细胞株→各挑选3株单克隆pcr鉴定HEK-293稳转株→Qpcr检测单克隆细胞株中目的基因的表达情况。
2.2初筛
设置3个组，分别为对照组(control组)，50μM FSK阳性对照组，50μM化合物初筛组，具体操作如下：
(1)配置stimulation buffer；
(2)处理细胞，离心之后用Buffer重悬，并调整密度为5*10^4/ml(即每孔500cells,可根据实验调整)；
(3)用stimulation buffer将药物浓度稀释为100μM(终浓度为50μM)进行初筛；
(4)取10μl细胞和药物于Topsealtm-A-96板中，共20μl体系，孵育30min(封口)；
(5)分别加入10ulEu-cAMP tracer和10ul ULight-anti-cAMP工作液孵，孵育60min(避光+封口)；
(6)使用酶标仪测量荧光信号值(615和665nm)，通过标准曲线将荧光信号值转换为cAMP浓度
3、实验结果
使用LANCE Ultra cAMP Detection Kit对本发明化合物进行小分子激动剂高通量筛选，测定化合物分别在HEK293+hAC1、hAC2、hAC5、hAC8细胞上的激动作用，实验结果数据显示，本发明化合物对AC8细胞有激动选择性，在初筛终浓度为50μM时，在HEK293+hAC8细胞上的cAMP浓度显著升高，与阳性对照化合物FSK的cAMP浓度接近，初筛信号图见附图1。
实施例2：1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯对8型腺苷酸环化酶(AC8)细胞的激动活性
1、实验仪器与材料
同实施例1
2、实验方法
根据实施例1初筛所得信号值强弱，适当调整所用的细胞数，以获取量效曲线，如下操作：(1)取50mM母液5μl，加入495μl Buffer中稀释为500μM，接着按照protocol依次系列稀释(1nM-100μM)；
(2)取10μl系列稀释药物和细胞至Topsealtm-A-96板中，共20μl体系，孵育30min(封口)；
(3)分别加入10ulEu-cAMP tracer和10ul ULight-anti-cAMP工作液孵，孵育60min(避光+封口)；
(4)使用酶标仪测量荧光信号值(615和665nm)，通过标准曲线将荧光信号值转换为cAMP浓度。
3、实验结果
HEK293+hAC8细胞在1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯的作用下，cAMP浓度随着化合物浓度的增加而增加，其激动活性值EC50为0.1052±0.03806μM，相应FSK在HEK293+hAC8细胞上的EC50为0.0937±0.03757μM，量效曲线图见附图2。
Claims (10)
1.1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐在制备腺苷酸环化酶激动剂中的应用，结构式如下所示：
其中R1、R2相同或不同，代表H、卤素基团或C1-C6的烷基，R3代表C1-C6的烷基。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述R1、R2相同或不同，代表H、F、Cl、Br或I。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述R1、R2为2，4位取代。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述化合物为1-氢-2-吲哚酮-3-(2,4-二氯苄基)-3-甲酸乙酯。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述腺苷酸环化酶为8型腺苷酸环化酶。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述腺苷酸环化酶激动剂为治疗心脑血管系统疾病、呼吸系统疾病、神经系统疾病、精神疾病或者与葡萄糖稳态疾病有关的药物。
7.一种药物组合物，其特征在于含有1-氢-2-吲哚酮-3-苄基/取代苄基-3-甲酸酯类化合物及其药学上可成的盐，结构式如下所示：
其中R1、R2相同或不同，代表H、卤素基团或C1-C6的烷基，R3代表C1-C6的烷基。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为口服制剂或者注射剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述口服制剂为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂或酏剂，所述注射剂为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。
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