CN108084187A - 苯并二氮杂*类氢化物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种式(I)所示化合物及其制备方法和应用。所述化合物可用于制备抗心律失常及心脑血管药物。(I)。

Description

苯并二氮杂*类氢化物

技术领域

本发明涉及一种苯并二氮杂类氢化物及其制备方法，及式(I)所示化合物作为抗心律失常药物在心脑血管药物组合物制剂中的应用。

背景技术

苯并二氮杂草类药物在临床上广泛用于抗焦虑、镇静和催眠。作为第一个水溶性苯并二氮杂草类衍生物，咪达唑仑已经广泛用于临床镇静、催眠、镇痛、抗癫痫、抗焦虑和全身麻醉。当咪达唑仑作为麻醉药输入人体后，可被细胞色素P450同工酶氧化为α-羟基咪达唑仑。该氧化物仍具有药理活性，因而麻醉作用时间长，苏醒慢。因此研发麻醉诱导时间快、维持时间短的新型苯并二氮杂草类水溶性衍生物一直为药物化学家所重视。

式(II)化合物的化学名为3-[(4S)-8-溴-1-甲基-6-(2-吡啶基)-4H-咪唑 [1,2-a][1,4]苯并二氮杂卓-4-基]丙酸甲酯，

其中，R为氢、甲基、乙基、异丙基。

专利EP1183243中报道该类化合物是短效中枢神经系统(CNS， Central NervousSystem)抑制剂，具有包括镇静催眠、抗焦虑、肌肉松弛和抗惊厥作用。可用于以下临床治疗方案中的静脉给药:如手术期间中的手术前镇静、抗焦虑和遗忘用途；在短期诊断、手术或内窥镜程序期间的清醒性镇静；在施用其它麻醉剂和止痛剂之前和/或同时，作为用于全身麻醉的诱导和维持的组分；ICU镇静等。该化合物代谢迅速，不依赖于细胞P450酶代谢，可通过多种器官代谢，且其代谢产物活性很低，减少了药物之间的相互作用，同时也为代谢器官功能受损患者的使用提供了可能。

但是，式(II)所示化合物极不稳定，在强制降解的影响因素试验中，很容易产生降解杂质，这些降解杂质有的含量很少，需要长时间的分离富集进行结构鉴定，至今为止，尚未见到有关这些降解杂质的分离、结构确认及其用途研究的相关报道。

发明内容

我们在对式(II)进行稳定性研究时，发现该化合物很不稳定，可产生较多的降解杂质。因此，将式(II)所示化合物与苯磺酸或对甲苯磺酸成盐以增加其稳定性，发现其苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐比其碱基的稳定性大大增强，但在强制降解的稳定性研究中仍会产生降解杂质，但这些杂质在此之前均未发现有文献报道过。我们花费一年多的时间，通过制备型液相将这些杂质进行了分离，并进行了结构确认，发现其中有一个降解杂质的结构式如式(I)所示结构：

其中，R为氢、甲基、乙基、异丙基。

随后，我们对该杂质的结构进行了合成研究。

因此，本发明的目的在于提供一种式(II)所示化合物的降解杂质，具有式(I)所示结构。

本发明的另一目的在于提供一种式(I)所示结构的合成方法，其特征在于将式(II)所示化合物与还原剂在极性溶剂中进行还原反应得到。

进一步，所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、水、四氢呋喃、乙醚任一种或其组合。

进一步，所述的还原剂为硼氢化钠、四氢铝锂、氢气。

进一步，所述的还原剂的催化剂为钯碳、氯化亚铜、三氟乙酸、三氟化硼、乙酸、碘、氯化锌、氯化铝、氯化钯中的一种或几种。

进一步，所述的水解反应溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、水任一种或其组合。

进一步，所述的酯化反应的催化剂选自硫酸、氯化亚砜的任一种或其组合。

进一步，所述的酯化反应的溶剂为甲醇。

进一步，所述的水解反应的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化钡、碳酸钠、碳酸钾的任一种或其组合。

进一步，式(II)所示化合物与过碱发生水解反应的温度为0℃～100℃。

进一步，所述的还原反应的温度为-10℃～100℃。

进一步，式(I)所示化合物的分离、纯化方法选自柱层析、重结晶或制备型液相分离纯化中的任一种或其组合。

进一步，所述的重结晶方法为式(I)所示化合物的有机酸盐在甲醇、乙醇、丙酮、2-丁酮的任一种或其组合中进行。

进一步，所述的式(I)所示化合物的有机酸盐是指草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐。

进一步，所述的柱层析分离精制的条件为，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯-正己烷的任一种或其组合，进行等度或梯度洗脱，收集产品流份，浓缩或冻干干燥，即得。

进一步，所述的制备型液相分离精制的条件为，流动相为甲醇-乙腈、甲醇-乙腈-水、甲醇-水的任一种或其组合，进行等度或梯度洗脱，收集产品流份，浓缩或冻干干燥，即得。

进一步，式(I)所示化合物用作标准品或对照品的应用。

进一步，所述组合物中含有有效量的权利要求1所述的式(I)所述的化合物。

进一步，所述的式(I)所示化合物或权利要求10所述抗心律失常组合物用于制备心脑血管药物中的应用。

本发明的式(I)所示化合物用作标准品或对照品在药物分析的应用。

发明人通过对式(I)所示化合物的研究发现，本发明的式(I)所示化合物具有较好的抗心律失常活性，并对其毒性进行了初步的研究。因此，本发明的另一目的在于提供式(I)所述的化合物或其组合物在抗抗血栓药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种新型的抗心律失常组合物，组合物中含有有效剂量的式(I)所示的化合物。

附图说明

图1式(I)所示化合物(R为甲基)的HPLC图，

图2式(I)所示化合物(R为甲基)的¹H-NMR图

图3式(I)所示化合物(R为甲基)的质谱图([M-H]⁺)

图4式(I)所示化合物(R为氢)的质谱图([M-H]⁺)

图5式(I)所示化合物(R为乙基)的质谱图([M-H]⁺)

图6式(I)所示化合物(R为异丙基)的质谱图([M-H]⁺)

图7高脂模型大鼠心电参数变化情况(n＝6，mean±SD)

图7A为对照组以及高脂模型组大鼠心电图；图7B为对照组以及高脂 模型组大鼠的心电图以及心率柱状图；图7C为对照组以及高脂模型组大鼠 的QT间期变化；图7D为对照组以及高脂模型组大鼠的QTc变化；图7E为 对照组以及高脂模型组大鼠的PR间期变化；图7F为对照组以及高脂模型 组大鼠的QRS间期变化；

图8为式(I)所示化合物对高脂模型大鼠心电的影响(n＝6，mean± SD)；

图8A为各组大鼠的心电图；图8B为各组大鼠心率柱状图；图8C为各组大鼠的QT间期变化；图8D为各组大鼠的QTc变化；图8E为各组大鼠的 PR间期变化；图8F为各组大鼠的QRS间期变化；

图9为式(I)所示化合物对高脂模型大鼠心肌细胞动作电位时程和静息膜电位的影响(n＝8，mean±SD)；

图9A为各组大鼠心肌细胞动作电位时程代表图；图9B为各组大鼠心肌细胞动作电位时程统计结果；图9C为各组大鼠心脏的静息膜电位统计结果；

图10为式(I)所示化合物对高脂模型大鼠心肌细胞内向整流钾电流的影响(n＝8，mean±SD)。

图10A为各组大鼠心肌细胞内向整流钾电流代表图；图10B和10C为各组大鼠内向整流钾电流密度统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例中未注明的具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

在本发明的实施例中，

HPLC：

柱：YMC ODS-AQ,250x 4.6mm，3μm粒径

流动相：A：0.01％三氟乙酸水溶液

B：0.01％三氟乙酸的乙腈溶液

梯度：

时间(min)	A％	B％
			0	75	25
20.0	60	40
			30.0	20	80
32.5	75	25
			40	75	25

流速：1.0ml/min

柱温：40℃

检测：230nm的UV

进样体积：10μl

¹H-NMR：AVANCE III 500M全数字化超导核磁共振谱仪

质谱：Bruker APEX IV傅立叶变换回旋共振质谱仪

实施例1式(I)所示化合物(R为甲基)的制备

将6g式(II)所示化合物(R为甲基)溶于50ml甲醇中，降温至0℃，加入20.3g，分批加入硼氢化钠2g，加毕，保持反应温度10～20℃搅拌至反应完成，用稀盐酸水溶液洗涤pH至6～7，用200ml二氯甲烷萃取，二氯甲烷层用无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚＝1： 15)，洗脱液减压浓缩，残留物用少量乙醇加热至60℃，加入1g草酸，搅拌30min，降温至0～5℃搅拌析晶，过滤，滤饼用碳酸氢钠中和，干燥，得式(I)所示化合物0.72g，HPLC面积归一化法，测得其含量为98.7％。

Mp：203.2℃～205.1℃

MS：441.3[M+H]⁺

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)

δ：2.32(s，3H)，2.57～2.64(m，1H)，2.69～80(m，3H)，3.66(s， 3H)，3.94(s，3H)，4.42～4.43(d，1H)，4.64～4.65(d，1H)，5.36(d， 1H)，7.67～7.73(m，1H)，7.86～7.87(m，1H)，8.03～8.04(m，1H)，8.053～8.055 (m，1H)，8.06～8.064(m，2H)，8.11～8.13(m，1H)8.59～8.60(m，1H)。

实施例2式(I)所示化合物(R为氢)的制备

将10g式(II)所示化合物(R为氢)溶于35ml乙醇中，降温至0～20 ℃，滴加5％氢氧化钾水溶液调pH至10～12，并保持该温度进行保温反应，反应完毕加入200ml二氯甲烷，用乙酸水溶液洗涤pH至6～7，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩。

将浓缩物用无水四氢呋喃100ml溶解，降温至-10～0℃，分批加入四氢铝锂3g，0～10℃反应至完毕，缓慢滴加3ml水，然后滴加3ml15％的氢氧化钠溶液，室温搅拌1.5h，垫硅藻土过滤，滤液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，浓缩物加入甲醇，降低至0℃，滴加氯化亚砜3g，20～30℃至反应完全，减压浓缩。

浓缩物过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：正己烷＝1：20)，洗脱液减压浓缩，残留物用少量2-丁酮加热至45℃，加入1.6g马来酸，搅拌30min，降温至 0～5℃搅拌析晶，过滤，滤饼用碳酸氢钠中和，干燥，得式(I)所示化合物0.56g。

Mp：183.9℃～186.1℃

MS：427.2[M+H]⁺

实施例3式(I)所示化合物(R为乙基)的制备

将5g式(II)所示化合物(R为乙基)溶于60ml乙醇中，加入氯化亚铜0.2g，降温至-10～5℃，分批加入硼氢化钠1.5g，室温搅拌至反应完成，加入200ml二氯甲烷，用稀盐酸溶液洗涤pH至6～7，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚＝1：10)，洗脱液减压浓缩，残留物用制备型液相进行分离，流动相为甲醇：乙腈：水：三乙胺＝45：25：30： 0.01，接收馏分并浓缩，得式(I)所示化合物1.13g。

Mp：207.3℃～209.1℃

MS：455.4[M+H]⁺

实施例4式(I)所示化合物(R为异丙基)的制备

将5g式(II)所示化合物(R为异丙基)溶于50ml正丁醇和10ml水中降至0℃，分批加入三氟乙酸0.08g，5％钯碳0.5g，80～100℃搅拌至反应完成，过滤，滤液加入200ml二氯甲烷，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，浓缩，过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：环己烷＝1：15)，洗脱液减压浓缩，残留物用少量甲醇加热至50℃，加入1.6g富马酸，搅拌30min，降温至0～5℃搅拌析晶，过滤，滤饼用碳酸氢钠中和，得式(I)所示化合物0.48g。

Mp：212.1℃～214.2℃

MS：469.4[M+H]⁺

实施例5式(I)所示化合物(R为甲基)的制备

将10g式(II)所示化合物(R为甲基)溶于45ml甲醇和5ml水中，加入5g碳酸钾，80～100℃进行保温反应，反应完毕加入200ml二氯甲烷，用乙酸水溶液洗涤pH至6～7，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩。

将浓缩物用无水乙醚100ml溶解，加入10％钯碳1g，乙酸0.3g，通入氢气，60～75℃反应至完毕，垫硅藻土过滤，滤液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，浓缩物加入甲醇，降低至0℃，滴加硫酸1g，50～60℃至反应完全，减压浓缩。

浓缩物过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：正己烷＝1：20)，洗脱液减压浓缩，残留物用少量丙酮加热至45℃，加入1.6g苹果酸，搅拌30min，降温至0～5 ℃搅拌析晶，过滤，滤饼用碳酸氢钠中和，干燥，得式(I)所示化合物0.56g。

实施例6式(I)所示化合物(R为乙基)的制备

将5g式(II)所示化合物(R为乙基)溶于50ml甲醇中，室温加入氯化锌0.5g，50～60℃搅拌至反应完成，降温，加入300ml二氯甲烷，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，残留物用20ml甲醇溶解，加入3g酒石酸成盐，并用丙酮重结晶，用饱和碳酸氢钠溶液中和至中性，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用制备型液相进行分离，流动相为甲醇：乙腈：水：三乙胺＝45：25：30：0.03，接收馏分并浓缩，，得式(I)所示化合物0.54g。

实施例7式(I)所示化合物(R为氢)的制备

将5g式(II)所示化合物(R为氢)溶于50ml异丙醇中，室温加入三氟化硼乙醚溶液1.5ml，60～75℃搅拌至反应完成，用盐酸水溶液洗涤pH至 6～7，加入300ml二氯甲烷，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，残留物用20ml 乙醇溶解，加入2g丙二酸成盐，并用乙醇重结晶，用饱和碳酸氢钠溶液中和至中性，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用制备型液相进行分离，流动相为甲醇：乙腈：水：三乙胺＝45：25：30：0.01，接收馏分并浓缩，，得式(I)所示化合物0.42g。

实施例8式(I)所示化合物(R为异丙基)的制备

将5g式(II)所示化合物(R为异丙基)溶于50ml乙醇中，室温加入氯化钯0.3g，通入氢气，40～50℃搅拌至反应完成，降温，加入300ml二氯甲烷，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，残留物用20ml乙醇溶解，加入2g丙二酸成盐，并用乙醇重结晶，用饱和碳酸氢钠溶液中和至中性，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用制备型液相进行分离，流动相为甲醇：水：三乙胺＝70：30：0.01，接收馏分并浓缩，，得式(I) 所示化合物0.38g。

实施例9式(I)所示化合物(R为乙基)的制备

将10g式(II)所示化合物(R为乙基)溶于45ml异丙醇和5ml水的混合液中，加入2g氢氧化锂和1g氢氧化钙混合物，45～60℃进行保温反应，反应完毕加入200ml二氯甲烷，用乙酸水溶液洗涤pH至6～7，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩。

将浓缩物用无水乙醚100ml溶解，加入10％钯碳1g，氯化铝0.3g，通入氢气，60～75℃反应至完毕，垫硅藻土过滤，滤液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，浓缩物加入甲醇，降低至0℃，滴加硫酸1g，50～60℃至反应完全，减压浓缩。

浓缩物过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：正己烷＝1：20)，洗脱液减压浓缩，残留物用少量丙酮加热至45℃，加入1.6g苹果酸，搅拌30min，降温至0～5 ℃搅拌析晶，过滤，滤饼用碳酸氢钠中和，干燥，得式(I)所示化合物0.76g。

实施例10式(I)所示化合物(R为异丙基)的制备

将10g式(II)所示化合物(R为异丙基)溶于40ml丁醇和5ml水的混合液中，加入2g氢氧化钡和1.5g碳酸钠混合物，30～45℃进行保温反应，反应完毕加入200ml二氯甲烷，用乙酸水溶液洗涤pH至6～7，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩。

将浓缩物用无水甲醇100ml溶解，加入氯化钯0.3g，分批加入硼氢化钠，30～40℃反应至完毕，垫硅藻土过滤，滤液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，浓缩物加入甲醇，降低至0℃，滴加氯化亚砜1g，40～50℃至反应完全，减压浓缩。

浓缩物过柱(洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚＝1：20)，洗脱液减压浓缩，残留物用少量丙酮加热至45℃，加入1.6g草酸，搅拌30min，降温至0～5 ℃搅拌析晶，过滤，滤饼用碳酸氢钠中和，干燥，得式(I)所示化合物0.87g。

实施例11式(I)所示化合物(R为甲基)对抗心律失常的药效学研究 1实验方法：

通过高脂饲料喂养的方法建立大鼠高脂血症模型。其中，除对照组按照20g/只/天给予普通饲料喂养外，其余各组按照20g/只/天给予高脂饲料喂养，自由饮水。连续喂养4周，建立高脂血症模型。模型建立成功后，开始灌胃给药式(I)所示化合物(100mg/kg)或阿托伐他汀(7.2mg/kg)，对照组和高脂模型组以纯水灌胃处理，每日灌胃一次。每次给药体积根据大鼠体重，按照1mL/100g计算，共给药6周。给药期间，对照组仍给予普通饲料喂养，其他各组仍给予高脂饲料喂养，自由饮水。分别在造模4周和给药6周后监测大鼠心电变化。戊巴比妥钠麻醉大鼠后，使用生物机能实验系统BL-420，连接标准II导联监测心电。应用全细胞膜片钳技术分别记录大鼠心肌细胞动作电位时程(APD)和内向整流钾电流(IK1)。

2实验结果：

高脂饲料喂养四周后，检测大鼠心电变化。结果见图7所示，与对照组相比，高脂大鼠心率显著减慢(图7A、7B所示，P<0.001)，QT间期延长(图 7C所示，P<0.01)，QTc延长(图7D所示，P<0.05)，PR间期和QRS间期无显著变化(图7E、7F所示)。表明高脂血症大鼠心电异常，QT间期延长。式(I)所示化合物给药6周后，如图5所示，与高脂组比较，式(I)所示化合物给药后，大鼠心率趋向正常(图8A、8B所示)，QT间期和QTc显著缩短(图8C、8D所示，P<0.05)；而阿托伐他汀给药后，大鼠心率、QT间期和QTc无显著变化(图8C、8D所示)。表明式(I)所示化合物给药6周可改善高脂饮食引起的心电异常，而阿托伐他汀对高脂饮食引起的心电异常没有改善作用。PR间期和QRS间期无显著变化(图8E、8F所示).

动作电位是心肌细胞膜受到刺激后，引起特定离子通道的开放及带电离子的跨膜运动，从而引起膜电位的波动，使膜电位由负变正又变负的电位逆转过程。动作电位时程与QT间期密切相关。如图9A-C所示所示，与对照组相比，高脂大鼠心肌细胞APD90显著延长，静息膜电位(RMP)去极化 (P<0.01)，与高脂组比较，式(I)所示化合物能够显著抑制APD90延长和静息膜电位去极化(P<0.05)；但是阿托伐他汀给药对APD90延长和静息膜电位去极化没有显著抑制作用。表明式(I)所示化合物能够纠正高脂血症引起的大鼠心肌细胞APD延长，而阿托伐他汀无此作用。

高脂大鼠动作电位时程延长，是多种离子通道共同作用的结果。内向整流钾电流(IK1)是心肌细胞主要的外向电流，对于稳定细胞静息膜电位和动作电位复极末期具有重要意义。因此，我们检测了大鼠心肌细胞内向整流钾电流的变化。结果见图10A-C所示，与对照组相比，高脂大鼠心肌细胞IK1密度显著减小，与高脂组比较，式(I)所示化合物给药6周能够增加高脂大鼠心肌细胞IK1电流密度，但是阿托伐他汀给药后，高脂大鼠心肌细胞IK1密度无显著变化。表明式(I)所示化合物能够改善高脂大鼠心脏IK1电流密度改变，而阿托伐他汀没有此作用。

通过本试验表明，式(I)所示化合物可通过纠正QT间期延长以及心肌细胞动作电位时程延长，增加IK1电流密度，达到预防和治疗心律失常的目的。

R为氢、乙基、异丙基时也得到相似结果。

实施例12式(I)所示化合物(R为甲基)的遗传毒性研究

Ames试验：试验菌株为鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株TA97、 TA98、TA100、TA102、TA1535。设式(I)的浓度为5、1、0.2、0.04、0.008mg/ 皿作为供试品组，同时设自发回复突变对照组、阳性对照组(表1)。按如下方法进行试验：1.取无菌条件下适量的式(I)所示化合物，用无菌生理盐水配制为50mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.4mg/ml和0.08mg/ml备用； 2.制备底层培养皿，将平皿置于37℃生化培养箱中培养过夜；3.增菌：于试验前一天晚上8点左右将保存于菌种平板上的菌株用接种环接种于已消毒的装有营养肉汤培养基的三角烧瓶内；4.配制表层培养基,消毒后置于 45℃水浴中。同时准备供试品、阳性对照品及S9混合液；5.从水浴中取出表层试管，分别用移液器依次加入测试菌株菌液0.1ml，受试药物0.1mL(阳性对照组加入相应的阳性药物0.1ml)，需活化时最后加S9混合液0.5mL，每个试验组做3个平行皿。自发对照组只加相应的测试菌液0.1ml或测试菌液0.1ml和S9混合液0.5mL；6.混匀表层培养基，迅速沿加样方向将表层培养基内容物倾入底层平皿上，转动平皿使表层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化。倒置于37℃生化培养箱内培养48h后观察结果，计数培养皿上的回变菌落数；7.试验重复一次。

得到的试验结果显示：在加或不加肝微粒体酶S9的条件下，TA97、TA98、 TA100、TA102、TA1535的自发回变菌落数均在正常范围内，各菌的阳性对照回变菌落数均高于相应的自发回变菌落数两倍以上，各菌式(I)各剂量组回变菌落数均未超过相应菌株自发回变菌落数的两倍，且无剂量反应关系。本试验结果表明：在本试验室条件下，式(I)浓度为5、1、0.2、0.04、 0.008mg/皿时，加或不加肝微粒体酶(S9)均未见引起TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535试验菌株基因突变，即Ames试验阴性。

表1本试验选用的阳性对照药物

表2各剂量组给药浓度(受试药物单位为mg/ml,阳性对照单位为μg/ml)

表3 Ames试验(第一次)结果(－S9)

表4 Ames试验(第二次)结果(－S9)

表5 Ames试验(第一次)结果(+S9)

表6 Ames试验(第二次)结果(+S9)

小鼠骨髓微核试验：将50只小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为式(I)1500mg/kg、1000mg/kg、500mg/kg三个供试品组、阴性对照组和阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg)。式(I)经灌胃给药，每天1 次，连续4天，最后一次给药24小时后与阴性对照组同时取骨髓制片；阳性对照组于供试品组最后一次给药时一次性腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，给药24小时后取骨髓制片。用姬姆萨染色法染片，油镜下观察，每只小鼠计数2000个多染红细胞，计算微核发生率(‰)，同时计数500个骨髓细胞，求出多染红细胞/正染红细胞的比值。试验结果显示：各组多染红细胞/正染红细胞的比值在正常范围(0.6～1.2)内，表明式(I)对小鼠骨髓细胞无明显抑制作用；阴性对照组小鼠骨髓细胞微核发生率为1.72±1.16，在本实验室的正常范围内；阳性对照组小鼠骨髓细胞微核发生率高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；式(I)各剂量组小鼠骨髓细胞微核发生率与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。试验结果表明：在本实验室条件下，式(I)为1500mg/kg、1000mg/kg、500mg/kg时，小鼠骨髓微核试验阴性。

表7小鼠骨髓微核试验结果(n＝10)

体外CHL细胞染色体畸变试验：直接法，设式(I)浓度为0.46mg/ml、 0.23mg/ml、0.12mg/ml，同时设阳性对照(丝裂霉素C 0.25μg/ml)和阴性对照组(生理盐水)；代谢活化法，设式(I)浓度为0.40mg/ml、0.20mg /ml、0.10mg/ml，同时设阳性对照(环磷酰胺20μg/ml)和阴性对照组 (生理盐水)。给药结束时收集细胞，依次进行低渗、固定、制片、染色处理，显微镜下观察中期相细胞染色体数目和结构的改变。直接法试验结果显示：细胞培养时间为24、48h时，阴性对照组细胞染色体畸变率分别为 2.1％和0.4％,阳性对照组细胞染色体畸变率分别为22.9％、20.1％，与阴性对照组细胞染色体畸变率的差异具有统计学意义(P<0.05)。式(I)作用 24、48h时，各浓度组细胞染色体畸变率均<5％，试验结果为阴性。代谢活化法试验结果显示：细胞培养时间为24、48h时，阴性对照组细胞染色体畸变率分别为1％和1.5％,阳性对照组细胞染色体畸变率分别为21％、20.5％，与阴性对照组细胞染色体畸变率的差异具有统计学意义(P<0.05)。式(I) 作用24、48h时，各浓度组细胞染色体畸变率均<5％，试验结果为阴性。试验结果表明：在本实验室条件下，加或不加代谢活化系统，式(I)CHL细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

表8体外CHL细胞染色体畸变试验结果(直接法)

表9体外CHL细胞染色体畸变试验结果(代谢活化法)

综合以上三个试验的结果得出以下结论：在本实验室条件下，式(I) Ames试验、小鼠骨髓微核试验和体外中国仓鼠肺成纤维(CHL)细胞染色体畸变试验均为阴性结果。故认为式(I)无致突变性。

R为氢、乙基、异丙基时也得到相似结果。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (19)

1.一种苯并二氮杂类氢化物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体，具有式(I)所示结构：

其中，R为氢、甲基、乙基、异丙基。

2.一种制备权利要求1所述式(I)所示化合物的方法，其特征在于，将式(II)所示化合物与还原剂在极性溶剂中进行还原反应得到

其中，R为氢、甲基、乙基、异丙基。

3.一种制备权利要求1所述式(I)所示化合物的方法，其特征在于，将式(II)所示化合物通过水解、还原、酯化反应得到。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、水、四氢呋喃、乙醚任一种或其组合。

5.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，所述的还原剂为硼氢化钠、四氢铝锂、氢气。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的还原剂的催化剂为钯碳、氯化亚铜、三氟乙酸、三氟化硼、乙酸、碘、氯化锌、氯化铝、氯化钯中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述的水解反应溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、水任一种或其组合。

8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述的酯化反应的催化剂选自硫酸、氯化亚砜的任一种或其组合。

9.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述的酯化反应的溶剂为甲醇。

10.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述的水解反应的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化钡、碳酸钠、碳酸钾的任一种或其组合。

11.根据权利要求7或8中所述的任一合成方法，其特征在于，式(II)所示化合物与过碱发生水解反应的温度为0℃～100℃。

12.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，所述的还原反应的温度为-10℃～100℃。

13.根据权利要求2或3所述的任一合成方法，其特征在于，式(I)所示化合物的分离、纯化方法选自柱层析、重结晶或制备型液相分离纯化中的任一种或其组合,优选的，所述的重结晶方法为式(I)所示化合物的有机酸盐在甲醇、乙醇、丙酮、2-丁酮的任一种或其组合中进行。

14.根据权利要求12或13所述的合成方法，其特征在于，所述的式(I)所示化合物的有机酸盐是指草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐。

15.根据权利要求12所述的合成方法，其特征在于，所述的柱层析分离精制的条件为，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯-正己烷的任一种或其组合，进行等度或梯度洗脱，收集产品流份，浓缩或冻干干燥，即得。

16.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述的制备型液相分离精制的条件为，流动相为甲醇-乙腈、甲醇-乙腈-水、甲醇-水的任一种或其组合，进行等度或梯度洗脱，收集产品流份，浓缩或冻干干燥，即得。

17.权利要求1所述的式(I)化合物用作标准品或对照品的应用。

18.一种抗心律失常组合物，所述组合物中含有有效量的权利要求1所述的式(I)所述的化合物。

19.权利要求1所述的式(I)所示化合物或权利要求18所述抗心律失常组合物用于制备心脑血管药物中的应用。