CN108072763A - 一种检测水中微囊藻毒素的微流控芯片及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，包括有机玻璃制成的基片和盖片，所述盖片热键合于所述基片上，所述基片上刻有微流路，所述微流路依次包括试剂通道、圆形检测池和废液排出通道，所述试剂通道包括免疫磁珠通道、PBST缓冲溶液通道、微囊藻毒素抗体通道、荧光素标记二抗通道、空白样品通道、水样通道和抗原抗体解离剂通道，所述检测池内通过微型电路及磁铁固定有免疫磁珠，所述免疫磁珠表面偶联有微囊藻毒素。本发明还公开了利用上述微流控芯片检测水中微囊藻毒素的检测方法。该分析方法具有检测速度快、灵敏度高、试剂耗量少、系统高度集中、自动化程度高、操作简单、费用低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及环境监测领域，尤其涉及一种检测水中微囊藻毒素的微流控芯片及检测方法。
背景技术
随着社会工业化进程的加快，人类在工农业生产及日常生活中，向水体排入大量含氮、磷的污染物，加速了湖泊的富营养化(Eutrophication)，藻类(Algae)由此而获取丰富的营养而大量繁殖。
在20世纪80年代对全国范围内的水源水质进行过全面的调查，结果表明34个湖泊中有一半以上的湖泊面积处于富营养状态。进入20世纪90年代，全国淡水水体富营养化日益严重，涉及范围不断扩大。
世界上25％～70％的蓝藻水华污染可产生藻毒素，在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素(Microcystins,MC)是目前已知的一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。
微囊藻毒素是由蓝藻的部分属产生的具有肝毒性的环肤化合物，是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素。蓝藻水华污染所带来的主要危害之一是藻毒素的产生。在已发现的各种藻毒素中，微囊藻毒素(microcystin，简称MC)的毒性较大，分布广，危害最严重。微囊藻毒素是胞内毒素，在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性。对生物体微囊藻毒素主要表现为肝脏毒性和神经毒性，此外这种毒素对性腺、肾、肾上腺、肺及胃等也有不同程度的损害。
由于未及时地检测水质情况的污染变化及采取相应的控制措施，致使这些毒素富集于鱼类或贝类中并通过食物链传递，直接存在于饮用水或娱乐用水中，严重威胁人类的健康，全球已经发生了多起有关藻毒素中毒并引起死亡的事故。近年来淡水藻类污染已成为一个全球性的环境问题。
因此，水体中MCs的含量已经被多个国家和组织作为衡量水质标准的一个重要指标。世界卫生组织及许多发达国家制定的引用水标准和规范中规定，MC-LR的含量不得超过1.0μg/L，我国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)也规定饮用水中的MC-LR不得超过1.0μg/L。
目前对水体中藻毒素的检测技术研究还比较落后。大多数藻毒素使用价格昂贵、体积庞大的HPLC-MS或GC-MS检测，样品制备过程复杂、耗时长，需要专业技术人员操作，检测费用很高。因此限制了常规监测次数。
因此，本领域的技术人员致力于建立一种高效、快速、自动检测水中微囊藻毒素的方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，包括有机玻璃制成的基片和盖片，所述盖片热键合于所述基片上，其特征在于，所述基片上刻有微流路，所述微流路依次包括试剂通道、圆形检测池和废液排出通道，所述试剂通道包括免疫磁珠通道、PBST缓冲溶液通道、微囊藻毒素抗体通道、荧光素标记二抗通道、空白样品通道、水样通道和抗原抗体解离剂通道，所述检测池内通过微型电路及磁铁固定有免疫磁珠，所述免疫磁珠表面偶联有微囊藻毒素。
优选地，所述微流路刻制包括如下步骤：(1)基片依次用浓硫酸、异丙醇与丙酮混合溶液及乙醇处理后去离子水冲洗，氮气枪吹干，烘箱中去除剩余水分；
(2)在玻璃基片表面镀一层Cr，用甩胶机均匀的覆盖一层光胶；将RZJ一340正性光刻胶旋转涂覆在经过处理的基片上，热板上前烘，以蒸发掉光刻胶中残留的溶剂；
(3)对基片进行紫外曝光、显影、腐蚀；腐蚀前，将玻璃片浸入铬的刻蚀液中进行刻蚀并坚膜，腐蚀在室温下进行，腐蚀液为含HF和HNO3的刻蚀液，采用了多次坚膜腐蚀；
(4)刻蚀达到要求的深度后，用发烟硝酸去除光刻胶。
优选地，所述基片和所述盖片键合包括如下步骤：依此用水、丙酮、超纯水、硫酸、超纯水将盖片和刻蚀后的基片用超声波清洗器彻底洗净后,在超纯水环境中将盖板和基片直接贴合，取出放进真空干燥箱干燥进行预键合，将预键合后的基片和盖片平放在高温炉中，完成键合。
优选地，所述微囊藻毒素包被原为MC-LR-OVA。
优选地，所述磁珠与所述包被原的偶联包括如下步骤：将20μL的摩尔浓3.0mM NHS和20μL的摩尔浓度为3.0mM EDC加入至2.0mL的质量体积浓度为0.5mg/mL的纳米级Fe3O4微粒的水溶液中反应1h，然后离心分离并用PBS洗3次，将12.0μl质量体积浓度为1.0mg/mL的MC-LR-OVA加入上述所得溶液中反应过夜；然后加入20μL的摩尔浓度为3.0mM乙醇胺水溶液中反应2h，最后用PBS缓冲溶液洗2次，并用PBS配置成2ml的MC-LR-OVA-磁珠溶液。
优选地，所述MC-LR-OVA的制备包括如下步骤：取EDC 100mg,用pH＝7.0的10mmol/L PBS液2.5ml使之充分溶解；取MC-LR 10mg,用2ml去离子水溶解，取血卵清蛋白25mg,溶于pH＝7.0、10mmol/L的PBS液中,将MC-LR溶液与卵清蛋白溶液混合，在磁力搅拌下逐滴加入EDC液2ml，室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下EDC溶液，4℃搅拌12小时并静置10小时，用蒸馏水使之充分透析约48小时，得MC-LR-OVA。
本发明还公开了一种基于微流控芯片的微囊藻毒素检测方法，采用上述微流控芯片，检测包括如下步骤：(1)清洗：首先用PBST溶液清洗整个芯片，直至PMT读数趋近于0且稳定；
(2)抗原固定：将磁铁通电，并泵入偶联有微囊藻毒素的磁珠，在磁铁磁力作用下，磁珠被固定于圆形检测池内；
(3)抗体结合反应：泵入空白溶液及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；
(4)空白检测：通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，此时读数为F0；
(5)磁珠再生：通入抗原抗体解离剂，使得磁珠表面抗体与抗原解离，磁珠可以重生利用；
(6)水样检测：泵入水样及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，检测水样中微囊藻毒素与抗体反应读数F；
(7)计算：按照公式F′＝(F0-F)/F0，计算F′，并对照不同浓度C-F′曲线公式，得到相应水样中的微囊藻毒素浓度C。
优选地，所述微囊藻毒素抗体制备方法包括如下步骤：选取健康的新西兰大耳兔，将经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后制备得到的完全抗原于皮下注射，初次免疫剂量1ml/只，皮下分点注射；3次追加免疫剂量均为0.2ml/只，不加佐剂，最后一次免疫后8天颈动脉放血法采血分离血清，最后得到纯化的兔抗微囊藻毒素抗体作为捕获抗体。
优选地，所述完全抗原制备方法包括如下步骤：(1)将0.5mg MC-LR溶于2mL，0.1mol/L pH＝9的碳酸盐缓冲液；称取170.4mgβ-巯基乙胺加入到上述溶液中，充分振荡摇匀，50℃水浴1-1.5h。待反应完毕后溶液温度降到室温，加入与β-巯基乙胺等摩尔的乙酸溶液终止反应,得到H2N-etMC-LR；
(2)H2N-etMC-LR溶于3m L 0.01mol/L pH＝7.4的PBS，加入1.25％的戊二醛溶液500μL，避光剧烈震荡反应3h以上；按BSA:H2N-etMC-LR＝10:1加入10mg/m L BSA 0.5m L，充分振荡混合后，4℃振荡过夜使反应完全；使用分子量为30,000Da的超滤管过滤，上清溶液为制备的完全抗原，将偶联的MC-LR-BSA经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后得到免疫原。
本发明具有以下有益效果：
本发明中的水质微囊藻毒素在线监测仪将将免疫分析和微流控技术结合，建立一种高效、快速、自动检测水中微囊藻毒素的方法。该分析方法具有检测速度快、灵敏度高、试剂耗量少、系统高度集中、自动化程度高、操作简单、费用低等优点。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的微流控芯片的结构示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的检测方法的标准曲线图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
如图1所示的用于检测水中微囊藻毒素的微流控芯片，包括有机玻璃制成的基片和盖片，盖片热键合于基片上，基片上刻有微流路，微流路依次包括试剂通道、圆形检测池8和废液排出通道9，试剂通道包括免疫磁珠通道1、PBST缓冲溶液通道2、微囊藻毒素抗体通道3、荧光素标记二抗通道4、空白样品通道5、水样通道6和抗原抗体解离剂通道7，通过微型泵阀及各个微通道将试剂泵入检测池中，在检测池中进行抗原抗体结合反应，二抗标记反应等。所有试剂通过一条废液排出通道9排出芯片。检测池8上附有微电路及通电磁铁，通过微型电路及磁铁固定有免疫磁珠，免疫磁珠表面偶联有微囊藻毒素。检测池8底部附有微型温控系统，可以对检测系统进行温度控制。芯片检测池8上方有荧光检测系统，对检测池8内反应信号进行检测。芯片与微流系统、磁铁控制系统、温控系统、检测系统结合，成为一个完整的自动检测系统。该系统为自动检测系统。
实施例1(微流控芯片的制备)
玻璃基片依次用浓硫酸、异丙醇与丙酮(1:1)混合溶液及乙醇处理后去离子水冲洗，氮气枪吹干，烘箱中去除剩余水分。在玻璃基片表面镀一层Cr，用甩胶机均匀的覆盖一层光胶；将RZJ一340正性光刻胶旋转涂覆在经过处理的基片上，热板上前烘，以蒸发掉光刻胶中残留的溶剂。对基片进行紫外曝光、显影、腐蚀。腐蚀前，将玻璃片浸入铬的刻蚀液中进行刻蚀并通过坚膜以提高光刻胶和牺牲层的附着力，湿法腐蚀在室温下进行，腐蚀液为含HF和HNO3的刻蚀液。为了延长光刻胶在腐蚀液中的耐受时间，采用了多次坚膜腐蚀的方法。刻蚀达到要求的深度后，用发烟硝酸去除光刻胶，打孔后和玻璃盖片键合。
依此用水、丙酮、超纯水、硫酸、超纯水将玻璃盖片和加工好的基片用超声波清洗器彻底洗净后,在超纯水环境中将盖板和基片直接贴合，取出放进真空干燥箱干燥。将预键合后的基片和盖片平放在高温炉中，完成键合，得到完整的微流控芯片。
实施例2(微囊藻毒素的偶联)
在本实施例中，磁珠表面的微囊藻毒素通过包被原MC-LR-OVA(MC-LR(微囊藻毒素-LR)与OVA(卵清蛋白)的偶联物)进行偶联。MC-LR-OVA的制备方法包括如下步骤：取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)100mg,用pH＝7.0的10mmol/L PBS液2.5ml使之充分溶解；取MC-LR 10mg,用2ml去离子水溶解，取血卵清蛋白25mg,溶于pH＝7.0、10mmol/L的PBS液中,将MC-LR溶液与卵清蛋白溶液混合，在磁力搅拌下逐滴加入EDC液2ml，室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下EDC溶液，4℃搅拌12小时并静置10小时，用蒸馏水使之充分透析约48小时，得MC-LR-OVA。
将制得的MC-LR-OVA与免疫磁珠偶联，偶联包括如下步骤：(1)将5.2g FeCl3·6H2O和2.77g FeSO4·7H2O溶解在0.5mol/L HCl溶液中，注入100mL的三颈瓶中，55℃水浴恒温，在充分搅拌氮气保护下，加入一定量的1.0mol/L氢氧化钠溶液，持续滴加至pH＝10-11，然后在集热式磁力搅拌器中恒温反应1.5h。磁座过滤，用去离子水清洗至pH＝7，从而值得纳米级Fe3O4微粒(即免疫磁珠)真空干燥备用。(2)将20μL的摩尔浓3.0mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和20μL的摩尔浓度为3.0mM EDC加入至2.0mL的质量体积浓度为0.5mg/mL的纳米级Fe3O4微粒的水溶液中反应1h，然后离心分离并用PBS洗3次，将12.0μl质量体积浓度为1.0mg/mL的MC-LR-OVA加入上述所得溶液中反应过夜；然后加入20μL的摩尔浓度为3.0mM乙醇胺水溶液中反应2h，最后用PBS缓冲溶液洗2次，并用PBS配置成2ml的MC-LR-OVA-磁珠溶液。
本发明还公开了一种基于微流控芯片的微囊藻毒素检测方法，采用上述微流控芯片，该检测流程中所需试剂包括PBST(PBS+吐温20)缓冲溶液、偶联微囊藻毒素包被原的磁珠、微囊藻毒素抗体、荧光素标记商品化二抗、水样、空白溶液及抗原抗体解离剂。
实施例3(微囊藻毒素抗体的制备)
微囊藻毒素抗体制备方法包括如下步骤：(1)将0.5mg MC-LR溶于2mL，0.1mol/LpH＝9的碳酸盐缓冲液；称取170.4mgβ-巯基乙胺加入到上述溶液中，充分振荡摇匀，50℃水浴1-1.5h。待反应完毕后溶液温度降到室温，加入与β-巯基乙胺等摩尔的乙酸溶液终止反应；
(2)H2N-MC-LR溶于3m L 0.01mol/L pH＝7.4的PBS，加入1.25％的戊二醛溶液500μL，避光剧烈震荡反应3h以上；按BSA:H2N-et-MC-LR＝10:1加入10mg/m L BSA 0.5m L，充分振荡混合后，4℃振荡过夜使反应完全；使用分子量为30,000Da的超滤管过滤，上清溶液为制备的完全抗原，将偶联的MC-LR-BSA经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后得到免疫原；
(3)选取健康的新西兰大耳兔，将经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后制备得到的完全抗原于皮下注射，初次免疫剂量1ml/只，皮下分点注射；3次追加免疫剂量均为0.2ml/只，不加佐剂，最后一次免疫后8天颈动脉放血法采血分离血清，最后得到纯化的兔抗微囊藻毒素抗体作为捕获抗体。
实施例4(二抗的选择)
选用二抗为FITC荧光基团标记的羊抗兔IgG。FITC为荧光基团,最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长为520～530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。如果FITC标记的二抗与一抗结合并通过磁珠固定于芯片检测池内，去除没有结合一抗的FITC标记的二抗及非固定抗原复合物，就可以直接进行荧光读数，产生的荧光信号就代表固定抗原-一抗-二抗结合物的量。
实施例5
检测包括如下步骤：(1)清洗：首先用PBST溶液清洗整个芯片，直至PMT(光电倍增管)读数趋近于0且稳定；
(2)抗原固定：将磁铁通电，并泵入偶联有微囊藻毒素的磁珠，在磁铁磁力作用下，磁珠被固定于圆形检测池内；
(3)抗体结合反应：泵入空白溶液及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；
(4)空白检测：通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，此时读数为F0；
(5)磁珠再生：通入抗原抗体解离剂，使得磁珠表面抗体与抗原解离，磁珠可以重生利用；
(6)水样检测：泵入水样及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，检测水样中微囊藻毒素与抗体反应读数F；
(7)计算：按照公式F′＝(F0-F)/F0，计算F′，并对照不同浓度C-F′曲线公式，得到相应水样中的微囊藻毒素浓度C。
芯片可以多次重复使用，需要再生处理即可。芯片再生：磁珠重复利用100次后，磁铁断电，通入PBST溶液清洗，将磁珠冲出芯片。
实施例6
检测定量曲线
(1)制备一系列不同浓度梯度微囊藻毒素溶液，0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.20、0.25、0.30、0.4、0.5、0.8、1.0、2.0μg/L。
(2)首先用PBST溶液清洗整个芯片，直至PMT读数趋近于0且稳定
(3)将磁铁通电，并泵入磁珠与磁珠-抗原偶联物，在磁铁磁力作用下，磁珠-抗原偶联物被固定于圆形检测池内。
(4)泵入空白溶液及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min。通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，此时读数为F0。
(5)通入抗原抗体解离剂，使得磁珠表面抗体与抗原解离，磁珠可以重生利用。
(6)泵入水样及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，检测以上不同浓度微囊藻毒素F′值，并建立浓度C-F′曲线图，如图2所示，通过数据拟合得到相应公式。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，包括有机玻璃制成的基片和盖片，所述盖片热键合于所述基片上，其特征在于，所述基片上刻有微流路，所述微流路依次包括试剂通道、圆形检测池(8)和废液排出通道(9)，所述试剂通道包括免疫磁珠通道(1)、PBST缓冲溶液通道(2)、微囊藻毒素抗体通道(3)、荧光素标记二抗通道(4)、空白样品通道(5)、水样通道(6)和抗原抗体解离剂通道(7)，所述检测池(8)内通过微型电路及磁铁固定有免疫磁珠，所述免疫磁珠表面偶联有微囊藻毒素。
2.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述微流路刻制包括如下步骤：(1)基片依次用浓硫酸、异丙醇与丙酮混合溶液及乙醇处理后去离子水冲洗，氮气枪吹干，烘箱中去除剩余水分；
(2)在玻璃基片表面镀一层Cr，用甩胶机均匀的覆盖一层光胶；将RZJ一340正性光刻胶旋转涂覆在经过处理的基片上，热板上前烘，以蒸发掉光刻胶中残留的溶剂；
(3)对基片进行紫外曝光、显影、腐蚀；腐蚀前，将玻璃片浸入铬的刻蚀液中进行刻蚀并坚膜，腐蚀在室温下进行，腐蚀液为含HF和HNO3的刻蚀液，采用了多次坚膜腐蚀；
(4)刻蚀达到要求的深度后，用发烟硝酸去除光刻胶。
3.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述基片和所述盖片键合包括如下步骤：依此用水、丙酮、超纯水、硫酸、超纯水将盖片和刻蚀后的基片用超声波清洗器彻底洗净后,在超纯水环境中将盖片和基片直接贴合，取出放进真空干燥箱干燥进行预键合，将预键合后的基片和盖片平放在高温炉中，完成键合。
4.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述微囊藻毒素通过包被原MC-LR-OVA偶联于磁珠表面。
5.如权利要求4所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述磁珠与所述包被原的偶联包括如下步骤：将20μL的摩尔浓3.0mM NHS和20μL的摩尔浓度为3.0mM EDC加入至2.0mL的质量体积浓度为0.5mg/mL的纳米级Fe3O4微粒的水溶液中反应1h，然后离心分离并用PBS洗3次，将12.0μl质量体积浓度为1.0mg/mL的MC-LR-OVA加入上述所得溶液中反应过夜；然后加入20μL的摩尔浓度为3.0mM乙醇胺水溶液中反应2h，最后用PBS缓冲溶液洗2次，并用PBS配置成2ml的MC-LR-OVA-磁珠溶液。
6.如权利要求4所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述MC-LR-OVA的制备包括如下步骤：取EDC 100mg,用pH＝7.0的10mmol/L PBS液2.5ml使之充分溶解；取MC-LR 10mg,用2ml去离子水溶解，取血卵清蛋白25mg,溶于pH＝7.0、10mmol/L的PBS液中,将MC-LR溶液与卵清蛋白溶液混合，在磁力搅拌下逐滴加入EDC液2ml，室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下EDC溶液，4℃搅拌12小时并静置10小时，用蒸馏水使之充分透析约48小时，得MC-LR-OVA。
7.一种基于微流控芯片的微囊藻毒素检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述微流控芯片，检测包括如下步骤：(1)清洗：首先用PBST溶液清洗整个芯片，直至PMT读数趋近于0且稳定；
(2)抗原固定：将磁铁通电，并泵入偶联有微囊藻毒素的磁珠，在磁铁磁力作用下，磁珠被固定于圆形检测池内；
(3)抗体结合反应：泵入空白溶液及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；
(4)空白检测：通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，此时读数为F0；
(5)磁珠再生：通入抗原抗体解离剂，使得磁珠表面抗体与抗原解离，磁珠可以重生利用；
(6)水样检测：泵入水样及微囊藻毒素抗体、荧光标记二抗，37℃孵育20min；通入PBST溶液清洗，直至PMT读数稳定，检测水样中微囊藻毒素与抗体反应读数F；
(7)计算：按照公式F′＝(F0-F)/F0，计算F′，并对照不同浓度C-F′曲线公式，得到相应水样中的微囊藻毒素浓度C。
8.如权利要求7所述的微囊藻毒素检测方法，其特征在于，所述微囊藻毒素抗体制备方法包括如下步骤：选取健康的新西兰大耳兔，将经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后制备得到的完全抗原于皮下注射，初次免疫剂量1ml/只，皮下分点注射；3次追加免疫剂量均为0.2ml/只，不加佐剂，最后一次免疫后8天颈动脉放血法采血分离血清，最后得到纯化的兔抗微囊藻毒素抗体作为捕获抗体。
9.如权利要求8所述的微囊藻毒素检测方法，其特征在于，所述完全抗原制备方法包括如下步骤：(1)将0.5mg MC-LR溶于2mL，0.1mol/L pH＝9的碳酸盐缓冲液；称取170.4mgβ-巯基乙胺加入到上述溶液中，充分振荡摇匀，50℃水浴1-1.5h。待反应完毕后溶液温度降到室温，加入与β-巯基乙胺等摩尔的乙酸溶液终止反应，得到H2N-etMC-LR；
(2)H2N-etMC-LR溶于3m L 0.01mol/L pH＝7.4的PBS，加入1.25％的戊二醛溶液500μL，避光剧烈震荡反应3h以上；按BSA:H2N-etMC-LR＝10:1加入10mg/m L BSA 0.5m L，充分振荡混合后，4℃振荡过夜使反应完全；使用分子量为30,000Da的超滤管过滤，上清溶液为制备的完全抗原，将偶联的MC-LR-BSA经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后得到免疫原。
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