CN108070027A - 耐涝和增产的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了耐涝和增产的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料。本发明的培育增产和/或耐涝的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入下述蛋白质TaERFVII.1的编码基因TaERFVII.1，得到植物产量和/或耐涝性高于所述受体植物的转基因植物的步骤：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。将TaERFVII.1导入小麦的转基因实验证明，TaERFVII.1过表达的转基因小麦与受体小麦相比，对水涝的耐性明显提高，产量也明显提高，说明TaERFVII.1是与植物水涝耐性和产量相关的蛋白，TaERFVII.1及其编码基因可用于提高植物的耐涝性增加植物产量。

Description

耐涝和增产的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域中耐涝和增产的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料。
背景技术
小麦(Triticum aestivum)是人类赖以生存的四大作物之一，世界上1/3以上的人口以小麦为主食，小麦的产量与品质直接影响着人类的生存与生活质量。近年来，随着全球气候变暖，频繁降雨引起了严重的水涝灾害。同时农田排水系统的落后也加剧了水涝的危害。全球达10％的农业用地遭受水涝，导致15-80％的产量损失。美国、欧洲、澳大利亚和亚洲的小麦生产受到水涝的严重限制。在我国长江中下游麦区和四川麦区，因为实行稻麦互作，水涝对小麦生产的危害尤其严重。因此，培养和种植耐涝的小麦品种是保障小麦高产、稳产的有效途径，对于保证我国小麦生产、粮食安全非常重要。因为小麦是对水涝比较敏感的作物，其水涝耐性由多基因控制，对其遗传基础和分子机制缺乏系统研究。常规育种方法在选育耐涝小麦品种方面的研究进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展为植物耐涝育种开辟了一条新途径。植物耐涝重要基因的分离克隆与功能分析，对阐明植物耐涝机制、有效地进行分子育种研究十分必要，已成为国内外植物科学研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的耐涝性和/或提高植物产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物耐涝性和产量相关的蛋白质。
本发明所提供的与植物耐涝性和产量相关的蛋白质，名称为TaERFVII.1，来源于对水涝表现一定耐性的的小麦品种农林46，是为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物耐涝性和产量相关的由A1)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列2(SEQ ID No.2)由204个氨基酸残基组成。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
上述A3)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第66-680位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述TaERFVII.1相关的生物材料。
本发明所提供的与所述TaERFVII.1相关的生物材料，可为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)-5)中任一所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的第66-680位所示的cDNA分子或DNA分子；
2)序列是SEQ ID No.1的第1-759位所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
4)与2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
5)在严格条件下与1)-4)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中的序列1(SEQ ID No.1)由759个核苷酸组成。
上述编码所述蛋白质的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述蛋白质的核酸分子的核苷酸序列具有80％或者更高同一性且编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1的第66-680位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有80％或更高，或90％或更高，或95％或99％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.1的第66-680位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有80％或更高，或90％或更高，或95％或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述80％或80％以上同一性，可为85％、90％、95％、99％或以上的同一性。
其中，SEQ ID No.1由759个核苷酸组成，其编码序列是第66-680位，编码SEQ IDNo.2所示的蛋白质。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如B2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述蛋白质的DNA。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：玉米Ubiquitin启动子、组成型启动子T7lac、花椰菜花叶病毒的组成型启动子CaMV35S、番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(Small subunit of ribulose-1,5-bisphospate carboxylase,rbcs)基因启动子；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol.120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、T7终止子、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等(1985)，Nature，313:810；Rosenberg等(1987)，Gene,56:125；Guerineau等(1991)，Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)，Cell,64:671；Sanfacon等，Genes Dev.，5:141；Mogen等(1990)，Plant Cell,2:1261；Munroe等(1990)，Gene，91:151；Ballad等(1989)，NucleicAcids Res.17:7891；Joshi等(1987)，Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述生物材料中，可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体,所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的TaERFVII.1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.1的第66-680位所示的DNA；进一步B3)所述重组载体具体可为pA25-TaERFVII.1。所述pA25-TaERFVII.1为将pAHC25载体的SpeI和SacI识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.1的第66-680位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID No.2所示的TaERFVII.1的重组载体。
上述生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。
B5)所述的转基因植物细胞系，B6)所述的转基因植物组织和B7)所述的转基因植物器官可包括植物的繁殖材料，也可不包括植物的繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)-6)中任一种应用：
1)所述蛋白质在调控植物产量和/或植物耐涝性中的应用；
2)所述蛋白质在制备提高植物产量和/或提高植物耐涝性的产品中的应用；
3)所述蛋白质在培育增产植物和/或耐涝植物中的应用；
4)所述蛋白质相关的生物材料在调控植物产量和/或植物耐涝性中的应用；
5)所述蛋白质相关的生物材料在制备提高植物产量和/或提高植物耐涝性的产品中的应用；
6)所述蛋白质相关的生物材料在培育增产植物和/或耐涝植物中的应用；
上述应用中，所述植物产量可为经济产量，即栽培目的所需要的产品的收获量，如小麦产量为小麦籽粒的产量。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦。
上述应用中，所述调控植物产量可为提高植物产量。所述调控植物耐涝性可为提高植物耐涝性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物耐涝和/或增产剂。
本发明所提供的植物耐涝和/或增产剂，含有所述蛋白质。
上述植物耐涝和/或增产剂中，所述植物可为单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育增产和/或耐涝的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育增产和/或耐涝的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到植物产量和/或耐涝性高于所述受体植物的转基因植物的步骤。
上述方法中，所述植物可为单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦。
上述方法中，所述编码基因可为上述1)-5)中任一所示的基因。
其中，所述编码基因可先进行如下修饰，再导入受体小麦中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达，例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaERFVII.1蛋白编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始，例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率，例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
上述方法中，所述编码基因通过含有所述编码基因表达盒的重组表达载体导入所述受体植物中。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
上述方法还包括从导入SEQ ID No.1的第66-680位所示的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因小麦的步骤。
上文中，所述转基因植物理解为不仅包含向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上文中，所述耐涝性可为植物在水涝环境中提高存活率和/或提高叶片叶绿素含量。所述提高植物产量或增产可为提高植物在水涝环境中的产量。
将TaERFVII.1导入小麦的转基因实验证明，TaERFVII.1过表达的转基因小麦与受体小麦相比，对水涝的耐性明显提高，产量也明显提高，说明TaERFVII.1是与植物水涝耐性和产量相关的蛋白，TaERFVII.1及其编码基因可用于提高植物的耐涝性增加植物产量。
附图说明
图1为利用RT-qPCR分析小麦农林46中TaERFVII.1基因受水涝胁迫处理后的表达模式；横坐标为自水涝开始开始计时的时间；纵坐标为相对于胁迫处理前TaERFVII.1基因表达量提高的倍数。
图2为转TaERFVII.1基因小麦T3代植株的PCR检测结果。图2中，Plasmid:pA25-TaERFVII.1；Yangmai16:未转基因扬麦16；OX558,OX560,OX562:T3代PCR阳性转pAHC25-TaERFVII.1植株。
图3为转TaERFVII.1基因小麦T3植株叶片TaERFVII.1基因表达分析。图1中，Yangmai16：未转基因的扬麦16受体；OX558,OX560,OX562:T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因植株；*：转基因株系与未转基因受体有极显著差异(P<0.05)。
图4为T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562和受体扬麦16(Yangmai16)排水恢复5天的表型比较。
图5为T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562、转空载体-扬麦16以及受体扬麦16的粒宽照片。
图6为T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562、转空载体-扬麦16以及受体扬麦16的粒长照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小麦品种农林46,耐水涝胁迫，由江苏省农业种质资源保护与利用平台提供；小麦品种扬麦16,对水涝胁迫敏感，购自江苏里下河地区农业科学研究所。
单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有Sma I和Sac I酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子：(参考文献：Christensen and Quail,1996；Ubiquitin promoter-based vectors for high-levelexpression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants.Transgenic Research，5,213–218)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
实施例1、小麦耐涝和增产相关蛋白TaERFVII.1及其编码基因TaERFVII.1的发现
本发明的发明人利用转录组学和转录表达分析谱,小麦全基因组基因数据挖掘与基因克隆，对耐涝小麦农林46与水涝敏感小麦扬麦16应答水涝胁迫基因差异表达数据进行分析，结合病毒诱导基因沉默(VIGS)分析，从农林46中分离出小麦耐水涝胁迫和增产的重要基因--TaERFVII.1基因。具体克隆方法如下：
取用水涝胁迫处理6天的小麦农林46幼苗的叶片，液氮处理，按照InvitrogenTRIZOL Reagent总RNA提取试剂说明书的方法提取叶片的总RNA。根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板。为了获得TaERFVII.1基因全长的cDNA序列，用设计的引物TaERFVII.1-F:5-ATCGAGCCTTCTCCAGTTAGC-3和TaERFVII.1-R:5-TGAATTCAACAG AACAGAAGGGA-3进行PCR扩增；PCR扩增体系为：2×Taq MasterMix 12.5μl，TaERFVII.1-F(10μM)1.5μl，TaERFVII.1-R(10μM)1.5μl，模板cDNA 2μl，补ddH2O至25μl。PCR扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后95℃10秒，55℃20秒，72℃60秒，共35个循环；再72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增得到一条长度为759bp的片段，将该PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明,该PCR扩增产物具有序列1的序列，其编码序列是序列表中序列1的第66-680位核苷酸；编码序列2所示的蛋白质。
实施例2、TaERFVII.1基因的诱导表达分析
一、水涝胁迫后应答表达分析
用水涝胁迫处理小麦农林46幼苗，分别于处理的0h、1、2、3、6、9天后取小麦叶片组织，液氮速冻后储存于－80℃超低温冰箱，提取RNA。以处理前的农林46叶片作为对照(0h)。
根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用小麦组成型表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaERFVII.1基因的特异引物进行实时定量RT-qPCR分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod.Methods.25:402-408)分析TaERFVII.1基因在水涝胁迫处理下的表达情况，每组样品重复3次。
内参基因actin的引物对：
actin-F：5-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3
actin-R：5-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3
TaERFVII.1基因的特异引物对：
TaERFVII.1-QF:5-TTCGAGGACAGCTACTACCCG-3
TaERFVII.1-QR:5-AGAACAGAAGGGAAAGAGCGA-3
结果见图1。TaERFVII.1基因的转录表达受水涝胁迫的诱导。未受水涝处理时，TaERFVII.1基因的表达量最低；水涝胁迫1天后，TaERFVII.1基因表达量显著增加，在水涝胁迫的2、3、6天，其表达量逐步提高，在9天下降，但仍然略高于未处理的TaERFVII.1基因表达量。结果表明TaERFVII.1可能参与小麦对水涝胁迫的抗性反应。
实施例3、转基因小麦的获得和耐涝性和产量鉴定
一、重组表达载体的构建
1、采水涝胁迫48小时后的小麦农林46叶片，提取RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用TaERFVII.1-transfF和TaERFVII.1-transfR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带SpeI和SacI位点的TaERFVII.1基因)。
TaERFVII.1-transfF:5-ATCACTAGTATGTGCGGCGGCGCCA-3(下划线标注SpeI酶识别位点)；TaERFVII.1-transfR:5-ATCGAGCTCTCAGAGCCCCAGAGGC-3(下划线标注SacI酶识别位点)PCR反应程序：先94℃预变性3min；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min，15个循环；94℃30s，58℃30s，72℃1min，20个循环；最后72℃10min。
2、回收PCR扩增产物，与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，得到重组载体pT-TaERFVII.1。
3、用限制性内切酶SpeI和SacI酶切重组载体pT-TaERFVII.1，回收615bp的片段。
4、用限制性内切酶SpeI和SacI酶切单子叶植物表达载体pAHC25，回收载体骨架。
5、将步骤3回收的片段和步骤4回收的载体骨架连接，得到连接产物。
6、将连接产物进行测序，测序结果表明得到了重组质粒pA25-TaERFVII.1。pA25-TaERFVII.1为将pAHC25载体的SpeI和SacI识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.1的第66-680位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID No.2所示的TaERFVII.1的重组载体。
重组质粒pA25-TaERFVII.1的结构：骨架载体为pAHC25，在SpeI和SacI酶切位点之间插入了序列表中序列1的5′末端的第66位至第680位核苷酸所示的TaERFVII.1基因；TaERFVII.1基因受Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。
二、转基因植物的获得
1、将2000块扬麦16的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pA25-TaERFVII.1轰击到愈伤组织。
2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。
3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB1 1mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。
4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养；获得了28株再生植株。
5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆,在移栽到温室3周以后，有28株植株成活。
6、分子鉴定
在4叶期，每株成活的再生植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用载体Ubiquitin启动子特异的一段序列作为上游引物(TaERFVII.1-ZJF),TaERFVII.1基因ORF序列特异的一段序列作为下游引物(TaERFVII.1-ZJR)，进行PCR。以重组表达质粒pA25-TaERFVII.1为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为361bp。
TaERFVII.1-ZJF：5-TTTTGTCGATGCTCACCCTGT-3；
TaERFVII.1-ZJR：5-GCGCCGGGATGTAGTCGT-3。
PCR扩增体系(20μl)：2×TaqMasterMix12.5μl，，TaERFVII.1-ZJF(10μM)1.5μl，TaERFVII.1-ZJR(10μM)1.5μl，模板DNA 100ng，补ddH2O至25μl。
PCR扩增程序：94℃/8min,(94℃/30s,55℃/30s,72℃/30s)*35个循环，72℃/8min，16℃保存。
PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。
结果表明28株植株(T0代)中，PCR阳性植株(即PCR产物有361bp片段的转pAHC25-TaERFVII.1植株)13株。从该13株PCR阳性转pAHC25-TaERFVII.1植株中随机取3株(分别命名为OX558,OX560,OX562)分别自交后得到T1代单株，将T1代单株自交后得到T2代单株，将T2代单株自交后得到T3代单株，对OX558,OX560,OX562的T3代单株进行下述检测。
7、T1代单株及其分子鉴定
(1)PCR检测
将步骤6获得的OX558,OX560,OX562的T3代单株按照步骤6的方法进行PCR检测，结果表明OX558,OX560,OX562的T3代单株均得到361bp的PCR产物，部分植株PCR检测结果如图2。
(2)转基因小麦的RT-qPCR
将步骤6获得的OX558,OX560,OX562的T3代种子和受体小麦扬麦16的种子种植于花盆中，花盆放置于大容积的水容器中。在小麦幼苗期，容器中注入自来水。水涝胁迫处理期间，水平面保持在土表面以上1-2厘米。分别于水涝胁迫处理第0、3和6天，取1个叶片提取总RNA，利用RT-qPCR分析OX558,OX560,OX562转基因小麦株系中TaERFVII.1基因的相对表达量，使用的引物为上述TaERFVII.1-QF和TaERFVII.1-QR。actin作为内参基因，内参基因actin的引物对为上述actin-F和actin-R。结果如图3，结果表明，未进行水涝胁迫处理时，转基因小麦株系中TaERFVII.1基因的相对表达量明显高于未转基因小麦，但转基因小麦各株系间表达量也有所差异，TaERFVII.1在OX560中表达量最高，约为受体的3.36倍。水涝胁迫处理6天后，转基因小麦植株中TaERFVII.1的表达量显著提高，OX560的表达量是未转基因小麦的12.73倍。
三、转空载体植物的获得
用载体pAHC25代替重组质粒pA25-TaERFVII.1，其它同步骤二，得到T3代转空载体植株，命名为转空载体-扬麦16，作为转基因植株的对照。
四、转基因植物的耐涝性鉴定
1、耐涝胁迫处理
实验重复三次，每次重复实验如下：将步骤二获得的OX558,OX560,OX562的T3代种子、步骤三获得的转空载体-扬麦16的T3代种子和受体小麦扬麦16的种子种植于花盆中，各个处理的种植密度均相同，花盆放置于大容积的水容器中。在小麦幼苗期，容器中注入自来水。每个株系选择5-6盆，每个株系每盆5株进行水涝胁迫处理。水涝胁迫处理期间，水平面保持在土表面以上1-2厘米。水涝胁迫处理25天后，排水恢复5天，调查存活率、叶片叶绿素含量。待收获时调查产量。
2、水涝耐性鉴定
水涝胁迫处理后，T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性植株的存活率显著提高，结果见表2和图4。T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562的植株存活率分别为73.6％、81.6％和74.1％，平均存活率为76.43％。而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的存活率均为20.5％。表明转TaERFVII.1基因可提高植株水涝中的存活率。表2中，株系编号为OX558、OX560和OX562的植株为T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因植株；株系编号为扬麦16的植株为扬麦16野生型植株(受体植株)，株系编号为转空载体-扬麦16的植株为T3代转空载体植株。
表2.各株系的水涝存活率调查结果
株系 存活率(％)
OX558 73.6**
OX560 81.6**
OX562 74.1**
扬麦16 20.5
转空载体-扬麦16 20.5
注:**分别表示转基因株系与未转化扬麦16(受体)有极显著差异(P<0.01水平)。
同时，对各个株系的叶绿素含量进行了测定。利用SPAD计(SPAD 502PLUS,KonicaMinolta,Japan)测量叶片中部，以测量值反映叶片叶绿素含量。结果如表3所示。T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562的SPAD值分别为34.5、36.7和28.8，平均值为33.33。而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的SPAD值均为11.5。表明转TaERFVII.1基因可提高水涝胁迫中小麦叶片的叶绿素含量。表3中，株系编号为OX558、OX560和OX562的植株为T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系植株；株系编号为扬麦16的植株为扬麦16野生型植株(受体植株)，株系编号为转空载体-扬麦16的植株为T3代转空载体植株。
表3.各株系叶绿素含量(SPAD)调查的结果
株系 SPAD
OX558 34.5**
OX560 36.7**
OX562 28.8**
扬麦16 11.5
转空载体-扬麦16 11.5
注:**分别表示转基因株系与未转化扬麦16(受体)有极显著差异(P<0.01水平)。
3.产量的鉴定
待小麦植株生长至成熟、收获。对其产量的主要组成因素，如粒宽、粒长、千粒重、单株籽粒数量和单株籽粒重量进行调查。结果如图5(粒宽)、图6(粒长)和表4所示。T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562的粒宽分别为2.84毫米、2.85毫米和2.92毫米，平均值为2.87毫米，而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的粒宽值分别为2.49毫米和2.51毫米。转基因株系OX558、OX560和OX562的粒长分别为6.15毫米、6.16毫米和6.19毫米，平均值为6.17毫米，而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的粒宽值分别为5.37毫米和5.36毫米。转基因株系OX558、OX560和OX562的千粒重分别为24.80g、25.00g和27.76g，平均值为25.85g，而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的千粒重分别为21.50g和21.28g。单株籽粒数量值分别为28.83、31.14和28.15，平均值为29.37。而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的单株籽粒数量值分别为17.8和17.5。T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系OX558、OX560和OX562的单株籽粒重量分别为0.71g、0.86g和0.74g，平均值为0.77g。而野生型扬麦16和T3代转空载体-扬麦16的单株籽粒重量均为0.38g。可见，转基因株系OX558、OX560和OX562在粒宽、粒长、千粒重、单株籽粒数量和单株籽粒重量这些产量的主要组成因素方面均极显著高于野生型扬麦16。表明转TaERFVII.1基因可提高水涝胁迫中小麦的产量。表4中，株系编号为OX558、OX560和OX562的植株为T3代转pAHC25-TaERFVII.1PCR阳性转基因株系植株；株系编号为扬麦16的植株为扬麦16野生型植株(受体植株)，株系编号为转空载体-扬麦16的植株为T3代转空载体植株。
表4.各株系的产量
注：**分别表示转基因株系与未转化扬麦16(受体)有极显著差异(P<0.01水平)。
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<160> 2
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<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 小麦（Triticum aestivum）
<220>
<221> CDS
<222> (66)..(680)
<400> 1
atcgagcctt ctccagttag cctttcccgc cacctaaaaa aggcacccca cgtctccatc 60
catccatgtg cggcggcgcc atcatctacg actacatccc ggcgcaccgc cgccgggtgt 120
ccaccgccga cttctggccc gacgccgacc attccgacgc ccacagcgcc gcccccgaca 180
aagcgccgcg cgcgaagcgg gggcggacga accagtaccg cggcatccgg cagcggccgt 240
ggggcaagtg ggcggcggag atccgcgacc ccgtgaaggg cgtccgcgtc tggctcggca 300
cctaccccac cgccgaggcc gccgcgcgcg cctacgaccg cgccgcgcgc cgcatcaggg 360
gcgccaaggc caaggtcaac ttccccaacg agatcctggt cggcgcgccc gcgcacgagg 420
ccccgtgcac gatggcggcc gtgctccctt cccccaagaa agaggaggag cccgcggcgt 480
gctcctgcga ggaggtgaag gcgctctccg aggagctgat ggcgtacgag agctacatga 540
gcttcctcgg ggtcccctac atggagggcg ggtccgcggc cgcgaccgcc cctgccgccg 600
tcggtgtcgc cgccgaggat gcaccggccg agctatggag cttcgaggac agctactacc 660
cggggcctct ggggctctga ttgtgtcgtg ctcgtagtct cctgccagtc gcagaaaaca 720
gagtcgattc gctctttccc ttctgttctg ttgaattca 759
<210> 2
<211> 204
<212> PRT
<213> 小麦（Triticum aestivum
<400> 2
Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Tyr Asp Tyr Ile Pro Ala His Arg Arg
1 5 10 15
Arg Val Ser Thr Ala Asp Phe Trp Pro Asp Ala Asp His Ser Asp Ala
20 25 30
His Ser Ala Ala Pro Asp Lys Ala Pro Arg Ala Lys Arg Gly Arg Thr
35 40 45
Asn Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala
50 55 60
Glu Ile Arg Asp Pro Val Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Pro Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Arg Arg
85 90 95
Ile Arg Gly Ala Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asn Glu Ile Leu Val
100 105 110
Gly Ala Pro Ala His Glu Ala Pro Cys Thr Met Ala Ala Val Leu Pro
115 120 125
Ser Pro Lys Lys Glu Glu Glu Pro Ala Ala Cys Ser Cys Glu Glu Val
130 135 140
Lys Ala Leu Ser Glu Glu Leu Met Ala Tyr Glu Ser Tyr Met Ser Phe
145 150 155 160
Leu Gly Val Pro Tyr Met Glu Gly Gly Ser Ala Ala Ala Thr Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Val Gly Val Ala Ala Glu Asp Ala Pro Ala Glu Leu Trp Ser
180 185 190
Phe Glu Asp Ser Tyr Tyr Pro Gly Pro Leu Gly Leu
195 200

Claims (10)

1.下述1)-6)中任一种应用：
1)蛋白质在调控植物产量和/或植物耐涝性中的应用；
2)蛋白质在制备提高植物产量和/或提高植物耐涝性的产品中的应用；
3)蛋白质在培育增产植物和/或耐涝植物中的应用；
4)蛋白质相关的生物材料在调控植物产量和/或植物耐涝性中的应用；
5)蛋白质相关的生物材料在制备提高植物产量和/或提高植物耐涝性的产品中的应用；
6)蛋白质相关的生物材料在培育增产植物和/或耐涝植物中的应用；
1)-6)中，所述蛋白质为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物耐涝性和产量相关的由A1)衍生的蛋白质；
与所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦。
3.植物耐涝和/或增产剂，其特征在于：所述植物耐涝和/或增产剂含有权利要求1中所述的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的植物耐涝和/或增产剂，其特征在于：所述植物为小麦。
5.一种培育增产和/或耐涝的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因，得到植物产量和/或耐涝性高于所述受体植物的转基因植物的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为小麦。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述编码基因为如下1)-5)中任一所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的第66-680位所示的cDNA分子或DNA分子；
2)序列是SEQ ID No.1的第1-759位所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
4)与2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
5)在严格条件下与1)-4)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
8.权利要求1中所述的蛋白质，为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物抗病性相关的由A1)衍生的蛋白质。
9.与权利要求8所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码权利要求8所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)-5)中任一所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的第66-680位所示的cDNA分子或DNA分子；
2)序列是SEQ ID No.1的第1-759位所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求8所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
4)与2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求8所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
5)在严格条件下与1)-4)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求8所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
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