CN108060204A - 一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统 - Google Patents

一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域,公开了一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,包括:1)初步筛选:将巨噬细胞和乳腺癌细胞混合培养,分析药物对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞活性的抑制作用,得到初筛阳性药物;2)二次筛选:将初筛阳性药物加入到单独培养的巨噬细胞和乳腺癌细胞中,分析判断后,筛得能将TAM从M2表型重新塑造为M1表型或能干扰/阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物。本发明的筛选系统能够通过单独培养及共同培养小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1来筛选将巨噬细胞重塑至M1表型或能干扰/阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物。

Description

一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选 系统
技术领域
本发明涉及生物医药领域,尤其涉及一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统。
背景技术
2015年,美国新发的女性乳腺癌病例估计达332,420例,其中69.7%的患者被诊断为侵袭性乳腺癌(恶性),60,290例患者死于该病。大多数癌症都是侵袭性的(转移性癌症),癌细胞生长到周围组织中,最终常常侵入其他器官,包括肝,肺和脑。由于缺乏有效的治疗疗法,被诊断为转移性乳腺癌的患者的生存率很低。对于转移性乳腺癌的治疗目前更侧重于生活质量而非生存时间。
许多研究表明,肿瘤微环境(TME)将调节肿瘤进展和转移,从而为癌症治疗提供了一个极具吸引力的治疗靶点。骨髓谱系细胞是TME的关键成员。这些细胞是先天免疫系统的一部分,具有可塑性特性。巨噬细胞在癌组织浸润后成为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),并且有助于癌细胞的侵袭,转移和肿瘤复发。证据还表明,TAMs也是肿瘤细胞进行抗化疗和放疗的主要保护者。在人处于健康状态下,巨噬细胞的可塑性是卓越的机制,如当机体需要对抗感染时,巨噬细胞则促进炎症性质以御外敌,而在感染后需要修复器官时巨噬细胞则抑制炎症性质。
据报道,肿瘤相关巨噬细胞处于M2表型,其可增强血管生成,并具有抗炎特性。相比之下,经典活化的巨噬细胞被认为是M1表型,具有促炎症和抗肿瘤能力。此外,M1表型巨噬细胞是身体的一道防线,用以作为杀死或去除具有威胁性的细胞。目前,巨噬细胞的可塑性,M1到M2表型的相互转换机制研究尚不明确,较为成熟的研究是肿瘤细胞分泌CSF-1,巨噬细胞分泌EGF,将相互促进生长增值。但将巨噬细胞的可塑性作为潜在的抗癌药物治疗靶点是完成可行的,完全可根据将TAM从之前的M2表型重新塑造为抗肿瘤的M1表型来设计新型抗癌药物。
由于机制尚不明确,对已获批的非抗癌药物进行筛选,从中发掘能将TAM从M2表型重新塑造为M1表型的潜力药物,研究其作用机制,使之成为治疗侵袭性和转移性乳腺癌的新药,具有非常重大的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,本发明的筛选系统能够通过单独培养及共同培养小鼠巨噬细胞RAW264.7 和小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1来筛选将巨噬细胞重塑至M1表型或能干扰/阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物。
本发明的具体技术方案为:一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,包括以下步骤:
1)初步筛选:建立药物库,将所有药物分别稀释到统一浓度,将巨噬细胞和乳腺癌细胞混合培养,分析药物在混合培养条件下对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞活性的抑制作用,根据需求设定一个临界值,将细胞活力抑制率大于等于临界值的药物定义为初筛阳性药物,进入第二次筛选。
2)二次筛选:计算并对初筛阳性药物进行梯度稀释,加入到单独培养的巨噬细胞和乳腺癌细胞中,分析判断药物的抑癌作用是源自于:a、对巨噬细胞或乳腺癌细胞的单独抑制作用;b、对两种细胞的共同抑制作用;c、能重塑巨噬细胞表型而抑制混合培养下的乳腺癌细胞;d、能干扰或阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路;最后筛得能将TAM从M2表型重新塑造为M1表型的药物以及能干扰或阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物,可为其机制研究提供明确的方向。
其中,系统深入研究前初步的判断方法本领域技术人员通过资料、专利、论文查询很容易设计实验验证,优选如下:a、对巨噬细胞或乳腺癌细胞的单独抑制作用;b、对两种细胞的共同抑制作用。只需要检测单独培养条件下药物对两种细胞活力的抑制情况。对于已定义为阳性药物的情况下,如何判断是c还是d,可通过追加简单的验证实验,初步比较癌细胞单培养和癌细胞共培养中在第一天或第二天的数据细胞活力数据。若阻断,则理论上癌细胞无法获得巨噬细胞的促生长作用,故两者数据应相近;若再极化,则理论上前几天时,癌细胞在共培养条件下的细胞活力将低于其单培养条件下的细胞活力。
在二次筛选中,对于在初步筛选中获得的每个阳性结果,本发明人检查了它是抑制单独培养下的4T1乳腺癌细胞和RAW264.7巨噬细胞的生长,还是只抑制混合培养下的4T1乳腺癌细胞。因为在本发明的筛选系统中,只要药物能抑制癌细胞或是巨噬细胞的生长,其均能通过初步筛选,而本发明最感兴趣的药物是它们在单培养中既不影响4T1乳腺癌细胞也不影响RAW264.7巨噬细胞,但唯独影响混合培养条件下的4T1乳腺癌细胞。这时我们的假设是,这种药物可能具有治疗功效,以将巨噬细胞从M2前肿瘤状态重新编程为M1杀肿瘤状态或干扰/阻断了两者之间的信号通路,使巨噬细胞展现抑癌作用或不再展现促癌作用。尽管筛选系统对于单培养中杀死4T1细胞或RAW264.7巨噬细胞的药物不感兴趣,但此类数据在筛选抗癌药物时,仍是极具价值的(有的非抗癌药物虽然不能重塑巨噬细胞,但能有抗癌作用),甚至能发现一些药物的副作用(有的药物促进癌症生长,有的药物对巨噬细胞毒性很大,故这些数据患者治疗时的药物选择上同样十分重要)。
总之,本发明建立的高通量药物筛选系统的目的是筛选出两类目的药物:1.药物将TAM 从M2表型重塑为M1表型;2.药物能干扰/阻断肿瘤细胞和巨噬细胞的相互联系。这类药物对于肿瘤细胞和巨噬细胞之间的作用机制研究极具价值,从而推动新型药物的发明研发。
作为优选,本发明采用小鼠细胞模型建立药物筛选系统。
采用小鼠细胞模型建立药物筛选系统原因在于细胞操作培养相对简单且一旦获得感兴趣的候选药物,即可直接进行荷瘤小鼠动物实验。
作为优选,所述巨噬细胞为RAW264.7小鼠巨噬细胞,所述乳腺癌细胞为4T1三阴性乳腺癌细胞。
作为优选,步骤1)中,所述统一浓度为抗乳腺癌药物LAPATINIB对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞的IC50值。
选择LAPATINIB的原因在于:1.其是较为主流的抗乳腺癌药物,2.其是EGFR的抑制剂,目前乳腺癌和巨噬细胞间EGF和CSF2的信号回路研究较为充分,但后期实验结果表明LAPATINIB对乳腺癌细胞和巨噬细胞均能抑制单独培养下的4T1乳腺癌细胞和RAW264.7巨噬细胞的生长。
作为优选,步骤1)中,所述临界值的抑制率为50%。
抑癌效果大于临界值则粗略的表明其抑癌效果优于抗乳腺癌药物LAPATINIB。
作为优选,步骤1)中,混合培养中采用检测细胞表达的荧光素酶方法来定量细胞活力。
作为可选方案之一,在后续的重复验证实验中,两种细胞,小鼠巨噬细胞RAW264.7和三阴性乳腺癌细胞4T1均采用慢病毒稳定转染,使它们能分别表达两种不同的荧光素酶,Red FireFly luciferase和Renilla luciferase。因此能够通过荧光素酶的产生水平来定量测量 4T1-GR乳腺癌细胞活力及RAW264.7-RL巨噬细胞活力。这样,我们不仅可以测量单独培养的4T1细胞、RAW264.7细胞活力,还可以分别测定共培养中的4T1-GR细胞和RAW264.7-RL细胞活力。
而在第一次筛选时,由于药物数量多,故不检测共培养中的巨噬细胞细胞活力,只检测乳腺癌细胞单独培养、巨噬细胞单独培养和共培养中的乳腺癌细胞细胞活力。但在得到阳性药物后,可使用转染的巨噬细胞,通过不同的荧光蛋白酶检测共培养中两种细胞分别的细胞活力。因此,筛选药物时可以采用未转染的RAW264.7,也可以是使用转染的。
作为优选,步骤2)中,单独培养中采用MTT法或采用检测细胞表达的荧光素酶方法来定量细胞活力。
作为优选,步骤2)中,将初筛阳性药物分别稀释为6-10个梯度浓度,浓度范围为0.0001-10μM。
作为优选,在第二次筛选中得到的阳性药物,通过测定以下6-10个浓度的IC50及EC50 来验证药效及药理,并再次从独立第三方来源重新购买此药物,重复测定检验。
作为优选,在经过二次筛选后,对筛选出的候选药物,采用BMDM和人乳腺癌细胞进行重复实验来验证筛选结果。
在两次确认候选药物后,采用BMDM和人乳腺癌细胞进行重复实验,进一步验证抑癌药效是否显著,使用BMDM和人乳腺癌细胞的原因是其更能模拟我们身体中真正的肿瘤微环境。
与现有技术对比,本发明的有益效果是:
本发明的筛选系统能够通过单独培养及共同培养小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1来筛选将巨噬细胞重塑至M1表型或能干扰/阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物。
本发明建立高通量药物筛选系统的目的是筛选出两类目的药物:1.药物将TAM从M2 表型重塑为M1表型;2.药物将干扰/阻断肿瘤细胞和巨噬细胞的相互联系。这类药物对于肿瘤细胞和巨噬细胞之间的作用机制研究极具价值,从而推动新型药物的发明研发。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,采用小鼠细胞模型。包括以下步骤:
培养基:
采用RPMI培养基(含10%L-谷氨酰胺(LG)、10%青霉素和链霉素P/S及10%胎牛血清FBS)。
细胞荧光转染:
待4T1乳腺癌细胞生长至80%,加入含有Green Fluorescent Protein荧光蛋白+RedFireFly luciferase荧光蛋白酶基因的慢病毒悬液,37℃培养;培养24小时后,替换入新鲜培养基,继续培养,期间可通过荧光显微镜观察,确认基因转入情况,转染的3-4天后加入抗性筛选药物,得到稳转Green Fluorescent Protein荧光蛋白+Red FireFly luciferase荧光蛋白酶的乳腺癌细胞4T1-GR。扩增培养并留种冻存。
药物筛选准备:
显微镜下观察,待细胞生长至80%以上后收获细胞。4T1-GR采用胰酶消化收获,RAW264.7 采用细胞刮收获,各得细胞悬液11mL用于铺板进行药物筛选。
混匀细胞悬液,并取50μL,加入等量台盼蓝后混合均匀(稀释比=2),以区分死/活细胞。采用细胞计数器(hemocytometer)对细胞进行计数,即显微镜下对1-4方格内的活细胞数计数,计算细胞悬液的细胞浓度cells/mL。
根据计算结果种板:
根据计算,取含有相应细胞数的悬液加入50rnL离心管中并稀释至种板浓度,混合均匀得到相应的单独培养细胞稀释液及共培养细胞稀释液。(种板浓度为30000个4T1-GF细胞/1mL 和90000个RAW264.7细胞/1mL)
种板,向96孔板中加入100μL细胞稀释液,得到肿瘤细胞单独培养96孔板(3000cells/well)、巨噬细胞单独培养96孔板(3000cells/well)及共培养96孔板(3000:9000cells/well)。
过夜培养后,显微镜下观察,确保各孔细胞生长无异常且分布均匀。对所有的96孔板进行洗板,以去除血清(血清内的蛋白常与药物反应,从而影响药效筛选,且本发明人发现癌细胞在巨噬细胞的促生长作用下,可以在无血清条件下生长)。
用新鲜的无血清培养基洗板,每次每孔加入90μL无血清RPMI培养基,重复三次。显微镜下观察,确保细胞未被洗去,标记细胞有异常的孔并弃用。
初步筛选:
建立药物库,将所有药物分别稀释到统一浓度(抗乳腺癌药物LAPATINIB的IC50值),将RAW264.7小鼠巨噬细胞和4T1三阴性乳腺癌细胞混合培养,每孔加入一种药物,即每个96孔板可一次筛选96个药物,由于药物的数量多,故不进行单独培养试验,只进行共培养试验,分析药物在混合培养条件下对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞活性的抑制作用,将细胞活力抑制率大于等于50%的药物定义为初筛阳性药物,进入第二次筛选。
其中,混合培养采用检测乳腺癌细胞表达的特定荧光素酶方法来定量细胞活力。针对乳腺癌细胞活力采用荧光检测:
药物过夜处理后,除去96孔板各孔内的上清液,每孔加入50μl的1X lysis buffer,震荡15分钟。取25μl细胞裂解液至新的96孔板各孔中,并每孔加入25μl的FLAR(FireflyLuciferase Assay Reagent)。反应5-10分钟(由于每板都设置有对照,所以每次的放置时间无需一致)。发光酶标仪上检测荧光发光强度。
二次筛选:
计算并对初筛阳性药物进行梯度稀释(每孔加入10μL药物,每个药物8个梯度浓度,浓度范围为0.0001-10μM,96孔板一次可筛选12个药物,提供了较大的通量,减少试验浓度个数可增大通量),加入到单独培养的巨噬细胞和乳腺癌细胞中,分析判断药物的抑癌作用是源自于:a、对巨噬细胞或乳腺癌细胞的单独抑制作用;b、对两种细胞的共同抑制作用;c、能重塑巨噬细胞表型而抑制混合培养下的乳腺癌细胞;d、能干扰或阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路;最后筛得能将TAM从M2表型重新塑造为M1表型的药物以及能干扰或阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物。
其中,单独培养中采用MTT法来定量细胞活力。对巨噬细胞单独培养采用MTT法检测细胞活力:
每孔加入50μl的MTT reagent(5mg/mL),孵育3小时,去除上清,加入100μl DMSO溶解沉淀,震荡15分钟。每孔加入50μL二甲基亚砜(DMSO),振荡15分钟,使沉淀结晶物充分溶解。发光酶标仪测量570nm处的光密度(OD)值。
重复实验验证:
对筛选出的候选药物,从第三方供应商购买再进行重复实验至少3次,验证筛选结果。
对筛选出的候选药物,采用BMDM和人乳腺癌细胞进行重复实验来验证筛选结果。
数据处理:
即可计算药物针对乳腺癌细胞、巨噬细胞及受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞的抑制情况,作图计算IC50及EC50。以EC50作为参考数据,IC50作为主要对比数据,对比药物对乳腺癌细胞单培养、巨噬细胞单培养及受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞的IC50值。理论上,药物对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞的IC50值越小,对乳腺癌细胞单培养、巨噬细胞单培养的IC50值越大,则该药物在抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活方面能力越强,其后续的机理研究优先级越高。但由于相比单独培养,在共培养条件下,巨噬细胞和乳腺癌细胞能促进彼此的生长并为彼此提供抗药性,故若得到某一个药物,其对乳腺癌细胞单培养、巨噬细胞单培养及受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞的IC50值都近似,那么我们也将其定义为阳性药物,但后续的机理研究优先级越低。
本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于包括以下步骤:
1)初步筛选:建立药物库,将所有药物分别稀释到统一浓度,将巨噬细胞和乳腺癌细胞混合培养,分析药物在混合培养条件下对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞活性的抑制作用,根据需求设定一个临界值,将细胞活力抑制率大于等于临界值的药物定义为初筛阳性药物,进入第二次筛选;
2)二次筛选:计算并对初筛阳性药物进行梯度稀释,加入到单独培养的巨噬细胞和乳腺癌细胞中,分析判断药物的抑癌作用是源自于:a、对巨噬细胞或乳腺癌细胞的单独抑制作用;b、对两种细胞的共同抑制作用;c、能重塑巨噬细胞表型而抑制混合培养下的乳腺癌细胞;d、能干扰或阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路;最后筛得能将TAM从M2表型重新塑造为M1表型的药物以及能干扰或阻断乳腺癌细胞与巨噬细胞间信号回路的药物。
2.如权利要求1所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,采用小鼠细胞模型建立药物筛选系统。
3.如权利要求1或2所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,所述巨噬细胞为RAW264.7小鼠巨噬细胞,所述乳腺癌细胞为4T1三阴性乳腺癌细胞。
4.如权利要求1所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,步骤1)中,所述统一浓度为抗乳腺癌药物LAPATINIB对受巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞的IC50值。
5.如权利要求1或4所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,步骤1)中,所述临界值的抑制率为50%。
6.如权利要求1所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,步骤1)中,混合培养中采用检测细胞表达的荧光素酶方法来定量细胞活力。
7.如权利要求1或6所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,步骤2)中,单独培养中采用MTT法或采用检测细胞表达的荧光素酶方法来定量细胞活力。
8.如权利要求1所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,步骤2)中,将初筛阳性药物分别稀释为6-10个梯度浓度,浓度范围为0.0001-10μM。
9.如权利要求1所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,对筛选出的候选药物,从第三方供应商购买再进行重复实验至少3次,验证筛选结果。
10.如权利要求1或9所述的一种抑制巨噬细胞刺激乳腺癌细胞存活的高通量药物筛选系统,其特征在于,在经过二次筛选后,对筛选出的候选药物,采用BMDM和人乳腺癌细胞进行重复实验来验证筛选结果。
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