CN108051512A - 一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其包括如下检测步骤：1)制备标准储备液；2)制备标准工作液Ⅲ；3)牛乳预处理；4)制备标准曲线；5)牛乳待测实样检测。本发明可快速高效准确地定性定量测定牛奶中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星的药物残留量，其可广泛应用于牛奶样品中氟喹诺酮类药物残留量的批量检测。

Description

一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法
技术领域
本发明涉及药物残留检测领域，特别涉及一种氟喹诺酮类药物残留的检测方法。
背景技术
由于氟喹诺酮类药物(FQs)在动物体内代谢时间较长，环境中不易降解，不可避免地给我们食品安全带来了潜在的危害，因而世界各国为保证食品安全，对氟喹诺酮类药物(FQs)的使用和在食品中的安全限量进行了限制，目前仅在我国、欧盟、日本和中国香港等国家和地区允许有药物残留存在。其中欧盟规定：氟喹诺酮类药物(FQs)在动物肌肉、肝脏和肾脏中残留量不得超过30μg kg-1。为适应国内外的发展，建立灵敏而高效的氟喹诺酮类药物(FQs)检测方法是当务之急。同时由于氟喹诺酮类药物(FQs)在食品中的残留主要以痕量形式存在，因此需要利用富集材料来提高它的浓度，使其在检测样本中的含量达到富集和浓缩的效果，从而用现有的检测手段检测出来就显得非常重要。然而氟喹诺酮类药物(FQs)在水中溶解性很低，在常见的商业ODS固相萃取柱上富集效果不太理想，因此研制出对氟喹诺酮类药物(FQs)具有高吸附容量和高选择性的吸附剂意义重大。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法。
本发明所采取的技术方案是：一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：
1)制备标准储备液：将恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星制成4种终浓度为1mg/mL的标准储备液；
2)制备标准工作液Ⅲ：取以上4种标准储备液各1mL，用甲醇稀释并定容制备终浓度为100μg/mL标准工作液Ⅰ，取1mL标准工作液Ⅰ用甲醇稀释并定容制备终浓度为10μg/mL的标准工作液Ⅱ，取标准工作液Ⅱ用甲醇稀释制备浓度分别为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL的7种标准工作液Ⅲ，存放于4℃冰箱；
3)牛乳预处理：分别吸取1mL牛乳实样于8支15mL离心管中，再分别加入7种标准工作液Ⅲ，其中一支离心管无添加，后置于旋涡混合器上混合30s，静置30min，加入65μL磷酸和4mL甲醇溶液，继续混合30～60s，经水平振荡30min，静置5min，控制速度为6000r/min的条件下离心处理6min，将上清液转移至15mL离心管中，残渣用65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液再提一次后合并上清液，后再加入4mL正己烷，在1000rpm条件下旋涡混匀，静置5min至分层清晰，弃掉上层正己烷层，对下层剩余物进行78℃水浴处理并空气吹干，得牛乳处理样；
4)制备标准曲线：将步骤3)所得牛乳处理样用1mL流动相溶解后吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min，吸取上清液，通过高效液相色谱仪进行色谱分析，求得标准曲线回归方程的线性范围为0.01～1.00μg/mL，相关系数为0.999；
5)牛乳待测实样检测：将牛乳待测实样经预处理后用1mL流动相溶解，吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min，吸取上清液至高效液相色谱仪的棕色自动进样瓶中，上机检测，将检测结果与步骤4)所得标准曲线对比，得出药物残留定性定量结果。
作为上述方案的进一步改进，步骤5)所述预处理为在离心管中加入65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液，继续混合30～60s，后经水平振荡30min，静置5min，控制速度为6000r/min的条件下离心处理6min，将上清液转移至15mL离心管中，残渣用65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液再提一次后合并上清液，后再加入4mL正己烷，在1000rpm条件下旋涡混匀，静置5min至分层清晰，弃掉上层正己烷层，对下层剩余物进行78℃水浴处理并空气吹干，后用1mL流动相溶解，吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min。
作为上述方案的进一步改进，所述流动相为将柠檬酸-乙酸铵混合溶液和乙腈按体积比为85:15混合制成，其中柠檬酸-乙酸铵混合溶液中柠檬酸的浓度为0.05mol/L、乙酸铵的浓度为0.1mol/L。
作为上述方案的进一步改进，所述柠檬酸-乙酸铵混合溶液中还含有三乙胺。
作为上述方案的进一步改进，步骤4)和步骤5)中高效液相色谱仪的色谱条件为4.6×250mm的5μm色谱柱，激发波长为278nm，发射波长为465nm，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，进样量为30μL。
本发明的有益效果是：本发明可快速高效准确地测定牛奶中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星的药物残留量，其可广泛应用于牛奶样品中氟喹诺酮类药物残留量的批量检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：
1)制备标准储备液：将恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星制成4种终浓度为1mg/mL的标准储备液；
2)制备标准工作液Ⅲ：取以上4种标准储备液各1mL，用甲醇稀释并定容制备终浓度为100μg/mL标准工作液Ⅰ，取1mL标准工作液Ⅰ用甲醇稀释并定容制备终浓度为10μg/mL的标准工作液Ⅱ，取标准工作液Ⅱ用甲醇稀释制备浓度分别为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL的7种标准工作液Ⅲ，存放于4℃冰箱；
3)牛乳预处理：分别吸取1mL牛乳实样于8支15mL离心管中，再分别加入7种标准工作液Ⅲ，其中一支离心管无添加，后置于旋涡混合器上混合30s，静置30min，加入65μL磷酸和4mL甲醇溶液，继续混合30～60s，经水平振荡30min，静置5min，控制速度为6000r/min的条件下离心处理6min，将上清液转移至15mL离心管中，残渣用65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液再提一次后合并上清液，后再加入4mL正己烷，在1000rpm条件下旋涡混匀，静置5min至分层清晰，弃掉上层正己烷层，对下层剩余物进行78℃水浴处理并空气吹干，得牛乳处理样；
4)制备标准曲线：将步骤3)所得牛乳处理样用1mL流动相溶解后吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min，吸取上清液，通过高效液相色谱仪进行色谱分析，求得标准曲线回归方程的线性范围为0.01～1.00μg/mL，相关系数为0.999；
5)牛乳待测实样检测：将牛乳待测实样经预处理后用1mL流动相溶解，吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min，吸取上清液至高效液相色谱仪的棕色自动进样瓶中，上机检测，将检测结果与步骤4)所得标准曲线对比，得出药物残留定性定量结果。
进一步作为优选的实施方式，步骤5)所述预处理为在离心管中加入65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液，继续混合30～60s，后经水平振荡30min，静置5min，控制速度为6000r/min的条件下离心处理6min，将上清液转移至15mL离心管中，残渣用65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液再提一次后合并上清液，后再加入4mL正己烷，在1000rpm条件下旋涡混匀，静置5min至分层清晰，弃掉上层正己烷层，对下层剩余物进行78℃水浴处理并空气吹干，后用1mL流动相溶解，吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min。
进一步作为优选的实施方式，所述流动相为将柠檬酸-乙酸铵混合溶液和乙腈按体积比为85:15混合制成，其中柠檬酸-乙酸铵混合溶液中柠檬酸的浓度为0.05mol/L、乙酸铵的浓度为0.1mol/L。
进一步作为优选的实施方式，所述柠檬酸-乙酸铵混合溶液中还含有三乙胺。
具体地，所述流动相的制备方法为：准确称取10.5598g柠檬酸和7.8650g乙酸铵，用去离子水稀释至1000ml，加1ml三乙胺调pH值，用0.22μm微孔膜过滤脱气处理后与乙腈溶液按体积比为85:15混合而成。
由于沙星为两性化合物，在流动相中加入三乙胺可以消除硅羟基的影响，在1L流动相中加入1ml三乙胺用以抑制解离，改善峰形。在本发明中，四种氟喹诺酮类药物都可以得到有效的分离，出峰顺序是环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星，通过色谱结果可得各组分分离度好，色谱峰形好，保留时间合理。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星的最低检测限为10ng/ml。
进一步作为优选的实施方式，步骤4)和步骤5)中高效液相色谱仪的色谱条件为4.6×250mm的5μm色谱柱，激发波长为278nm，发射波长为465nm，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，进样量为30μL。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。

Claims (5)

1.一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：
1)制备标准储备液：将恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星制成4种终浓度为1mg/mL的标准储备液；
2)制备标准工作液Ⅲ：取以上4种标准储备液各1mL，用甲醇稀释并定容制备终浓度为100μg/mL标准工作液Ⅰ，取1mL标准工作液Ⅰ用甲醇稀释并定容制备终浓度为10μg/mL的标准工作液Ⅱ，取标准工作液Ⅱ用甲醇稀释制备浓度分别为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL的7种标准工作液Ⅲ，存放于4℃冰箱；
3)牛乳预处理：分别吸取1mL牛乳实样于8支15mL离心管中，再分别加入7种标准工作液Ⅲ，其中一支离心管无添加，后置于旋涡混合器上混合30s，静置30min，加入65μL磷酸和4mL甲醇溶液，继续混合30～60s，经水平振荡30min，静置5min，控制速度为6000r/min的条件下离心处理6min，将上清液转移至15mL离心管中，残渣用65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液再提一次后合并上清液，后再加入4mL正己烷，在1000rpm条件下旋涡混匀，静置5min至分层清晰，弃掉上层正己烷层，对下层剩余物进行78℃水浴处理并空气吹干，得牛乳处理样；
4)制备标准曲线：将步骤3)所得牛乳处理样用1mL流动相溶解后吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min，吸取上清液，通过高效液相色谱仪进行色谱分析，求得标准曲线回归方程的线性范围为0.01～1.00μg/mL，相关系数为0.999；
5)牛乳待测实样检测：将牛乳待测实样经预处理后用1mL流动相溶解，吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min，吸取上清液至高效液相色谱仪的棕色自动进样瓶中，上机检测，将检测结果与步骤4)所得标准曲线对比，得出药物残留定性定量结果。
2.根据权利要求1所述的一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于：步骤5)所述预处理为在离心管中加入65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液，继续混合30～60s，后经水平振荡30min，静置5min，控制速度为6000r/min的条件下离心处理6min，将上清液转移至15mL离心管中，残渣用65μL磷酸和4mL甲醇溶液的混合溶液再提一次后合并上清液，后再加入4mL正己烷，在1000rpm条件下旋涡混匀，静置5min至分层清晰，弃掉上层正己烷层，对下层剩余物进行78℃水浴处理并空气吹干，后用1mL流动相溶解，吸出至1.5mL离心管中，在速度为12000r/min条件下离心处理6min。
3.根据权利要求1或2所述的一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于：所述流动相为将柠檬酸-乙酸铵混合溶液和乙腈按体积比为85:15混合制成，其中柠檬酸-乙酸铵混合溶液中柠檬酸的浓度为0.05mol/L、乙酸铵的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求3所述的一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于：所述柠檬酸-乙酸铵混合溶液中还含有三乙胺。
5.根据权利要求1所述的一种牛乳中氟喹诺酮类药物残留量的检测方法，其特征在于：步骤4)和步骤5)中高效液相色谱仪的色谱条件为4.6×250mm的5μm色谱柱，激发波长为278nm，发射波长为465nm，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，进样量为30μL。
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