CN108047165A - 一种苯甲酸酯类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种苯甲酸酯类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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CN108047165A CN201711345698.0A CN201711345698A CN108047165A CN 108047165 A CN108047165 A CN 108047165A CN 201711345698 A CN201711345698 A CN 201711345698A CN 108047165 A CN108047165 A CN 108047165A
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Abstract

本发明涉及一种苯甲酸酯类化合物及其制备方法与应用，所述小分子化合物为苯甲酸酯类化合物(E)‑4‑((4‑(4‑(4‑(3‑甲氧基‑3‑氧代丙‑1‑烯基)苯烯基)苯甲酰基)哌嗪甲酰基)哌嗪‑1‑羰基)‑苄氧基)‑苄氧基)‑苯甲酸酯，能有效抑制泛素连接酶Nedd4与泛素结合酶UbCH5c的相互作用，体外泛素化实验也证明该苯甲酸酯类化合物能有效抑制Nedd4底物TMEPAI的体外泛素化，同时MTT实验证明该苯甲酸酯类化合物对人乳腺癌MCF7细胞具有一定的杀伤作用，其IC50值为60μM，可以靶向抑制Nedd4活性并可作为一种全新的抗肿瘤药物。

Description

一种苯甲酸酯类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法与应用，尤其是一种苯甲酸酯类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为危害人类生命与健康的重大疾病之一。世界卫生组织报告显示，2008年全世界约有1270万恶性肿瘤新增患者，760万死于恶性肿瘤。因此，进一步研究肿瘤发生和发展的机制，开发新型抗肿瘤药物，减轻肿瘤对人类生命健康的威胁，是一个重要的研究课题。传统的抗肿瘤药物主要包括细胞毒药物、影响激素平衡的药物和生物反应调节剂等。近年来，随着恶性肿瘤研究的不断深入和抗肿瘤药物研究的发展，出现了许多新型的针对不同靶点的分子靶向药物。例如，美国食品医药管理局(FDA)于2003年批准了应用一种新型的蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib，商品名：万珂Velcade)来治疗多发性骨髓瘤。硼替佐米能够特异性抑制哺乳动物细胞内26S蛋白酶体的类胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin-like)活性，对细胞内一连串的信号转导产生影响，最终导致癌细胞死亡。研究表明，硼替佐米对治疗包括骨髓瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、卵巢癌和前列腺癌在内的多种恶性肿瘤均显示出良好的疗效。但是，这种以蛋白酶体为靶向性的治疗药物的一个显而易见的缺陷就是特异性差，在杀死恶性肿瘤细胞的同时对正常细胞也有很强的毒副作用，因此，需要寻找更为特异的靶点和药物。
蛋白的泛素化调节从生殖、发育、生长到衰老等一系列重要生命活动过程，它的异常将导致严重的疾病，包括神经退行性疾病和癌症等，对此通路的调控已被证明是疾病治疗中的一种革命性新方法。泛素-蛋白酶体系统的底物特异性由E3泛素连接酶决定，它决定底物泛素化的时间性和特异性，因此以E3泛素连接酶为肿瘤治疗靶点比以蛋白酶体为靶点更为理想。E3泛素连接酶受到转录水平上的调节、翻译后磷酸化修饰、与活化子或抑制子结合以及被自身泛素化修饰等一系列精密的调控，以保障细胞中各种蛋白质的“数量”和“质量”都处于最佳生理水平。一旦这些调控机制受到破坏，往往就会导致细胞生理上的病变。许多威胁人类健康的疾病，如癌症和神经退行性疾病都与泛素连接酶功能上的紊乱密切相关。最近有研究发现，以Skp2泛素连接酶为靶点筛选得到的Skp2小分子抑制剂在多种动物肿瘤模型中都表现出良好的抗肿瘤效果。
Nedd4(Neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4)蛋白是一种HECT家族的E3泛素连接酶，最初人们发现Nedd4在小鼠脑的发育过程中表达下调。但随着研究的深入，人们认识到Nedd4在神经细胞和心脏的发育、细胞膜受体蛋白的内吞、T细胞的成熟等过程中都发挥重要作用。更为重要的是，Nedd4与肿瘤的发生和发展密切相关。随着越来越多的Nedd4泛素化底物被鉴定，人们发现Nedd4可以通过多种机制促进肿瘤的发生和发展。研究发现，Nedd4的一个重要底物是PTEN(Phosphatase andtensinhomolog)。PTEN作为一种磷酸酶，可以抵抗PI3K/AKT信号途径，从而抑制细胞增殖。PTEN在人类的多种肿瘤中都发生突变或缺失。Nedd4可以多聚泛素化PTEN并经蛋白酶体途径降解；而单泛素化的PTEN可以入核，并在核质之间穿梭。研究表明，在前列腺癌和膀胱癌中，Nedd4的表达量升高，导致PTEN降解加快并促进PI3K/AKT信号激活，最终导致细胞无限增殖。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种苯甲酸酯类化合物。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述苯甲酸酯类化合物的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述苯甲酸酯类化合物的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种苯甲酸酯类化合物，为(E)-4-((4-(4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯基)苯烯基)苯甲酰基)哌嗪甲酰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)-苄氧基)-苯甲酸酯((E)-methyl4-((4-(4-(4-(3-methoxy-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoyl)piperazinenzoyl)piperazinenzoyl)piperazinenzoyl)piperazinenzoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate)，具有式(I)所示结构：
上述化合物的氢谱和碳谱(如图1和图2)为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.4Hz,2H),7.68(d,J＝16.0Hz,1H),7.57～7.44(m,8H),6.97(d,J＝8.0Hz,2H),6.47(d,J＝16.0Hz,1H),5.14(s,2H),3.86(s,3H),3.81(s,3H),3.74～3,54(m,8H)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ170.2,169.9,167.0,166.7,162.1,143.4,138.6,136.6,136.1,134.8,131.9,131.7,128.3,127.8,127.5,123.6,119.5,114.4,69.4,51.9,51.9。
上述苯甲酸酯类化合物的制备方法，具备步骤如下：
(1)取化合物1叔丁基哌嗪-1-甲酸叔丁酯用二氯甲烷溶解，冰浴搅拌条件下缓慢加入4-氯甲基苯甲酰氯，搅拌后加入三乙胺室温反应，TLC检测反应完全后用饱和氯化铵水溶液/乙酸乙酯萃洗，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝2﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得到化合物2哌嗪-1-甲酸叔丁酯；
(2)取化合物2哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.0g，5.90mmol)并加入DMF溶解，搅拌条件下加入碳酸钾(897mg，6.49mmol)，尼泊金甲酯(988mg，6.49mmol)，室温下反应，TLC检测反应完全后用乙酸乙酯萃取，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝3﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得到化合物3(4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯；
(3)取化合物3 4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯并加入DCM溶解，0℃搅拌条件下加入三氟乙酸与二氯甲烷的混合溶液，室温下反应，TLC检测反应完全，减压旋蒸除去三氟乙酸和二氯甲烷，加入饱和NaHCO3水溶液搅拌至有大量白色固体析出，抽滤并水洗滤饼，真空干燥得到化合物4 4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯；
(4)取化合物4 4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯中加入二氯甲烷溶解，0℃搅拌条件下加入4-溴苯甲酰氯，然后加入三乙胺室温反应12h，TLC检测反应完全，用饱和氯化铵水溶液/乙酸乙酯萃洗，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝1﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得到化合物5 4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯；
(5)取化合物5 4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯与乙酸钾，双苯基膦二氯化钯共置于微波管中，加入DMF，氩气置换，加入丙烯酸甲酯，微波反应，TLC反应完成，硅藻土过滤，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝2﹕1的混合溶液为洗脱剂柱层析得到目标产物化合物6。
具体合成线路如下：
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的制备方法，所述步骤(1)中叔丁基哌嗪-1-甲酸叔丁酯、4-氯甲基苯甲酰氯和三乙胺的质量比为2:2.07:2.17。
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的制备方法，所述步骤(2)中哌嗪-1-甲酸叔丁酯、碳酸钾、尼泊金甲酯的质量比为2:0.897:0.988。
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的制备方法，所述步骤(3)中4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯与三氟乙酸、二氯甲烷的重量体积比按g/ml/ml计为2.4:4:16，
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的制备方法，所述步骤(4)中4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯与4-溴苯甲酰氯、三乙胺的重量比为1.2：0.822:0.689。
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的制备方法，所述步骤(5)中4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯与乙酸钾、双苯基膦二氯化钯、丙烯酸甲酯的重量比为200：73:39:64。
上述苯甲酸酯类化合物作为Nedd4泛素连接酶抑制剂的应用。
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的应用，所述苯甲酸酯类化合物能有效抑制泛素连接酶Nedd4与泛素结合酶UbCH5c的相互作用。
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的应用，所述苯甲酸酯类化合物能有效抑制Nedd4底物TMEPAI的体外泛素化。
上述苯甲酸酯类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
优选的，上述苯甲酸酯类化合物的应用，所述肿瘤为乳腺癌。
上述苯甲酸酯类化合物对人乳腺癌MCF7细胞具有一定的杀伤作用，其IC50值可达到60μM。
本发明的有益效果是：
利用建立的Nedd4小分子抑制剂体外筛选体系对小分子化合物库进行筛选发现一种小分子化合物，所述小分子化合物为苯甲酸酯类化合物，能有效抑制泛素连接酶Nedd4与泛素结合酶UbCH5c的相互作用，体外泛素化实验也证明该苯甲酸酯类化合物能有效抑制Nedd4底物TMEPAI的体外泛素化，同时MTT实验证明该苯甲酸酯类化合物对人乳腺癌MCF7细胞具有一定的杀伤作用，其IC50值为60μM，可以靶向抑制Nedd4活性并可作为一种全新的抗肿瘤药物。
附图说明
图1为化合物6的核磁共振氢谱；
图2化合物6的核磁共振碳谱；
图3为本发明利用建立的Nedd4小分子抑制剂体外筛选系统筛选Nedd4抑制剂的结果，编号112-1的药物即为本发明所述药物。结果说明，编号112-1的药物即为本发明所述药物是利用体外筛选系统筛选得到的有效Nedd4抑制剂；
图4为本发明体外泛素化实验检测本发明所述药物对TMEPAI体外泛素化的结果。结果说明，编号112-1的药物即为本发明所述药物能在体外有效抑制TMEPAI的泛素化。
图5为本发明MTT法检测本发明所述药物抑制MCF7乳腺癌细胞活力的结果。结果说明，编号112-1的药物即为本发明所述药物能有效抑制MCF7乳腺癌细胞的细胞活力，IC50值为60μM。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
(1)小分子化合物的合成
取化合物1(tert-butyl piperazine-1-carboxylate,叔丁基哌嗪-1-甲酸叔丁酯)(2.0g，10.74mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入25mL二氯甲烷溶解，冰浴搅拌条件下缓慢加入4-氯甲基苯甲酰氯(2.07g，11.81mmol)，搅拌5min后加入三乙胺(2.17g，21.48mmol)室温反应12h。TLC检测反应完全，用饱和氯化铵水溶液/乙酸乙酯萃洗，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝2﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得3.17g化合物2，产率87％。
取化合物2(tert-butyl4-(4-(chloromethyl)benzoyl)piperazine-1-carboxylate，4-(4-氯甲基苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯)(2.0g，5.90mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入20mLDMF溶解，搅拌条件下加入碳酸钾(897mg，6.49mmol)，尼泊金甲酯(988mg，6.49mmol)，室温反应12h。TLC检测反应完全，乙酸乙酯萃取，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝3﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得2.38g化合物3，产率89％。
取化合物3(tert-butyl4-(4-((4-(methoxycarbonyl)phenoxy)methyl)benzoyl)piperazine-1-carboxylate,(4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯)(2.4g，5.30mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入12mL DCM溶解，0℃搅拌条件下加入4mL三氟乙酸与16mL二氯甲烷混合溶液，室温反应2h。TLC检测反应完全，减压旋蒸除去三氟乙酸和二氯甲烷，加入饱和NaHCO3水溶液搅拌至有大量白色固体析出，抽滤并水洗滤饼，真空干燥得到1.2g化合物4，产率66％。
取化合物4(methyl4-((4-(piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate,4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯)(1.20g，3.40mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入15mL二氯甲烷溶解，0℃搅拌条件下加入4-溴苯甲酰氯(822mg，3.75mmol)，搅拌5min后加入三乙胺(689mg，6.81mmol)室温反应12h。TLC检测反应完全，用饱和氯化铵水溶液/乙酸乙酯萃洗，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝1﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得1.59g化合物5，产率87％。
取化合物5(methyl4-((4-(4-(4-bromobenzoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate,4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯)(0.20g，0.373mmol)，乙酸钾(73mg，0.747mmol)，双苯基膦二氯化钯(39mg，0.056mmol)于5mL微波管中，加入2mLDMF，氩气置换2min，加入丙烯酸甲酯(64mg，0.747mmol)，微波145℃反应10min。TLC反应完成，硅藻土过滤，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，Na2SO4干燥。以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝2﹕1的混合溶液为洗脱剂柱层析得75mg淡黄色固体化合物6(Methyl(E)-4-((4-(4-(4-(3-methoxy-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate,(E)-4-((4-(4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯)，产率37％。
化合物6氢谱和碳谱(图1和图2)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.4Hz,2H),7.68(d,J＝16.0Hz,1H),7.57～7.44(m,8H),6.97(d,J＝8.0Hz,2H),6.47(d,J＝16.0Hz,1H),5.14(s,2H),3.86(s,3H),3.81(s,3H),3.74～3,54(m,8H)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ170.2,169.9,167.0,166.7,162.1,143.4,138.6,136.6,136.1,134.8,131.9,131.7,128.3,127.8,127.5,123.6,119.5,114.4,69.4,51.9,51.9.
实施例2
(1)Nedd4小分子抑制剂的筛选
①包被：用碳酸盐缓冲液将GST-Nedd4(aa476-aa900)包被于酶标条底部。每孔加入GST-Nedd4蛋白的量大约在大约在100ng-1μg之间。将缓冲液加入到15mL离心管或EP管中，加入一定量的蛋白混匀，每孔100μL分装到酶标孔中，37℃下放置2小时。
②BSA封闭：将酶标板中的液体倒掉，用排枪各个孔加上洗涤缓冲液，立刻倒掉，拍净酶标孔内的液体，重复洗3次，再用排枪在各个酶标孔中加上洗涤缓冲液，静止1-3分钟后倒掉，拍净酶标孔内液体，重复洗涤2次。用PBS缓冲液配制5％的BSA，每孔加入100μL，37℃下放置2个小时。
③加药：将酶标板中的液体倒掉，如步骤②洗涤。用PBS缓冲液稀释小分子药物(1-9：[4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪基]-[4-(对甲酸甲酯苯氧基甲基)苯基]甲酮[4-(4-bromo-benzoyl)-piperazin-yl]-[4-(Methylphenoxymethyl)phenyl]methanone；106-1：4-((4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)苯甲酸4-((4-(4-(4-bromobenzoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoic acid；108-1：4-((4-(4’-甲基-[1,1'-联苯]-4-羰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)苯甲酸甲酯methyl4-((4-(4-(4'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate；108-2：4-((4-(4'-三氟甲基-[1,1'-联苯]-4-羰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)苯甲酸甲酯4-((4-(4-(4'-(trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate；112-1：(E)-4-((4-(4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯基)苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)—苄氧基)-苯甲酸甲酯(E)-methyl 4-((4-(4-(4-(3-methoxy-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate；114-1：4-((4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)苯甲丁酰胺4-((4-(4-(4-bromobenzoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)-N-butylbenzamide；119-1：4-((4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)苯甲酸正丁酯butyl4-((4-(4-(4-bromobenzoyl)piperazine-1-carbonyl)benzyl)oxy)benzoate)到10μM，每孔加入50μL，4℃下放置2-3小时。
④加入His-HA-UbCH5c蛋白：将PBS缓冲液加入到15mL离心管或EP管中，加入His-HA-UbCH5c蛋白混匀，每孔加入的量大约在100ng-1μg之间，每孔加入蛋白缓冲液的积为50μL，震荡混匀，4℃下放置1-2小时。
⑤一抗孵育：将酶标板中的液体倒掉，如步骤②洗涤。每空加入50μL PBS稀释的HA抗体，4℃下放置过夜。
⑥二抗孵育：将酶标板中的液体倒掉，如步骤②洗涤。每空加入100μL PBS稀释的HRP二抗，37℃下放置30分钟-1小时。
⑦显色：将酶标板中的液体倒掉，如步骤②洗涤。每孔加入60μL TMB显色液，待酶标孔中现出蓝后加入等体积的2M的硫酸终止反应，用酶标仪检测每个孔OD450值。实验结果如图3所示，编号112-1的药物即为本发明所述药物是利用体外筛选系统筛选得到的有效Nedd4抑制剂。
(2)体外泛素化实验
按照体外泛素化生化反应体系加入每个成分(Buffer(0.5M Tris-Cl pH7.4,0.1MMgCl2)3μL，10mM DTT 4μL，100mM ATP 1μL，5μg/μL CH3-Ub0.5μL，0.09μg/μL Nedd4 1μL，0.4μg/μL His-HA-TMEPAI 3μL，0.118μg/μL E1 3μL，编号112-1的药物即为本发明所述药物1μL，水15μL)，室温反应2h，之后加入1μL E2(0.75μg/μL)，再恒温水浴锅中30℃反应30min。反应完毕后加入10μL 4*SDS混匀，95℃煮5min以便充分变性蛋白。煮沸后，用混悬振荡器匀，并瞬时离心，样品-20℃保存。最后进行免疫印迹检测，结果如图4所示，编号112-1的药物即为本发明所述药物能在体外有效抑制TMEPAI的泛素化。
(3)MTT实验
①96孔板铺板：收集对数期MCF7乳腺癌细胞，调整细胞悬液的浓度，每孔加入200μL培养基，铺板使待测细胞密度5000个/孔。
②5％CO2，37℃孵育24h，加入编号112-1的药物即本发明所述药物。药物用DMSO溶解，设5个浓度梯度(10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM)，同时设3个复孔。每孔加入1μL药物。对照组加入1μLDMSO。
③5％CO2，37℃孵育48小时，每孔加入20μLMTT(现用现配，用PBS配置成5mg/mL的MTT溶液)继续培养4小时。
④小心洗去孔内的液体，一定不要把沉淀吸走。
⑤每孔加入200μL二甲基亚砜溶解沉淀，振荡10分钟，使结晶充分溶解。
⑥在酶联免疫检测仪490nm处测各孔的吸光度，并利用SPSS软件计算药物对细胞的IC50值。结果如图5所示，编号112-1的药物即本发明所述药物能有效抑制MCF7乳腺癌细胞的细胞活力，IC50值为60μM。
上述参照具体实施方式对该一种苯甲酸酯类化合物及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苯甲酸酯类化合物，其特征在于：为(E)-4-((4-(4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯基)苯烯基)苯甲酰基)哌嗪甲酰基)哌嗪-1-羰基)-苄氧基)-苄氧基)-苯甲酸酯，具有式(I)所示结构：
2.权利要求1所述苯甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：具备步骤如下：
(1)取化合物1叔丁基哌嗪-1-甲酸叔丁酯用二氯甲烷溶解，冰浴搅拌条件下缓慢加入4-氯甲基苯甲酰氯，搅拌后加入三乙胺室温反应，TLC检测反应完全后用饱和氯化铵水溶液/乙酸乙酯萃洗，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝2﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得到化合物2哌嗪-1-甲酸叔丁酯；
(2)取化合物2哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.0g，5.90mmol)并加入DMF溶解，搅拌条件下加入碳酸钾(897mg，6.49mmol)，尼泊金甲酯(988mg，6.49mmol)，室温下反应，TLC检测反应完全后用乙酸乙酯萃取，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝3﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得到化合物3(4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯；
(3)取化合物3 4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯并加入DCM溶解，0℃搅拌条件下加入三氟乙酸与二氯甲烷的混合溶液，室温下反应，TLC检测反应完全，减压旋蒸除去三氟乙酸和二氯甲烷，加入饱和NaHCO3水溶液搅拌至有大量白色固体析出，抽滤并水洗滤饼，真空干燥得到化合物4 4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯；
(4)取化合物4 4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯中加入二氯甲烷溶解，0℃搅拌条件下加入4-溴苯甲酰氯，然后加入三乙胺室温反应12h，TLC检测反应完全，用饱和氯化铵水溶液/乙酸乙酯萃洗，合并有机相用饱和食盐水洗，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝1﹕1的混合溶液为洗脱剂，200～300目硅胶柱层析纯化，得到化合物5 4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯；
(5)取化合物5 4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯与乙酸钾，双苯基膦二氯化钯共置于微波管中，加入DMF，氩气置换，加入丙烯酸甲酯，微波反应，TLC反应完成，硅藻土过滤，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，Na2SO4干燥，以V(己烷)﹕V(乙酸乙酯)＝2﹕1的混合溶液为洗脱剂柱层析得到目标产物化合物6。
3.根据权利要求2所述的苯甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中叔丁基哌嗪-1-甲酸叔丁酯、4-氯甲基苯甲酰氯和三乙胺的质量比为2:2.07:2.17。
4.根据权利要求2所述的苯甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中哌嗪-1-甲酸叔丁酯、碳酸钾、尼泊金甲酯的质量比为2:0.897:0.988。
5.根据权利要求2所述的苯甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中4-((4-(甲氧基羰基)苯氧基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯与三氟乙酸、二氯甲烷的重量体积比按g/ml/ml计为2.4:4:16。
6.根据权利要求2所述的苯甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中4-((4-(哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯与4-溴苯甲酰氯、三乙胺的重量比为1.2：0.822:0.689。
7.根据权利要求2所述的苯甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中4-((4-(4-(4-溴苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苄基)氧基)苯甲酸甲酯与乙酸钾、双苯基膦二氯化钯、丙烯酸甲酯的重量比为200：73:39:64。
8.权利要求1所述苯甲酸酯类化合物作为Nedd4泛素连接酶抑制剂的应用。
9.权利要求1所述苯甲酸酯类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
10.根据权利要求9所述的苯甲酸酯类化合物的应用，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌。
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