CN108042492B - 一种苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒的制备方法，操作流程为：将由胆固醇、蛋黄卵磷脂和PEG‑DSPE混合而成的脂质材料溶解于无水乙醇中，持续搅拌后得水相溶液；将苦荞黄酮和纳米粒载体混合后共溶于乙腈中，再对溶液进行超声使其溶解，超声以超声2～3min停歇1min为一个周期，得油相溶液；在搅拌条件下缓慢将油相溶液滴加到水相溶液中，油相与水相的体积比为1：10～20，然后将其混合经过冰浴探针超声、持续搅拌、过滤后得TBFs/LPNs溶液，将TBFs/LPNs溶液在真空条件下冷冻干燥4～5h得纳米粒。采用本发明的方法所制备出的纳米粒，可有效解决苦荞黄酮生物利用度低以及活性成分不能被机体很好吸收的技术难题。

Description

一种苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米粒制备技术领域，具体涉及一种苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒及其制备方法。
背景技术
荞麦作为一种健康食品资源已引起很多国家的重视，我国苦荞麦的开发利用历史悠久，由于其具有特殊的营养保健功能，目前已成为保健食品研究的热点。我国传统的苦荞麦食品有面条、烙饼、及荞麦粥等，其中荞麦面条及烙饼较为普遍。随着苦荞麦开发利用的深入，苦荞麦酒、苦荞麦酱油、苦荞麦醋、苦荞麦咖啡、苦荞麦功能饮料、苦荞麦高活性膳食纤维等苦荞麦食品得到不同程度的开发研究。
近年来，苦荞麦生物类黄酮的研究在国内外也是一热点；例如：日本研制的 PMP(polyphenolic mixture of plant)是将从普通苦荞麦中精制的生物类黄酮与环状糊精、食物纤维等混合压片而得到的生物类黄酮药品；我国也有用苦荞提取物中的黄酮类成分来制造黄酮散、黄酮胶囊、黄酮软膏、黄酮牙膏和化妆品等。但是，目前对于苦荞麦的开发利用来说，未能做到物尽所用，尽善尽美，主要原因就是其生物利用度低，活性成分未能被机体很好吸收。
发明内容
针对上述现有现有技术，本发明要解决苦荞黄酮生物利用度低以及活性成分不能被机体很好吸收的技术难题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒制备方法，包括以下步骤：
(1)按4～5：1(mg/ml)的固液比将脂质材料溶于无水乙醇中，再将溶液与65～70℃的温水按1：15～20的体积比混合，以400～500rmp的速度持续搅拌 15～20min，得水相溶液；其中，脂质材料由胆固醇、蛋黄卵磷脂和PEG-DSPE 按1～2：1：1的质量比混合而成；
(2)将苦荞黄酮和纳米粒载体按照质量比为1～2:1混合后溶于乙腈中，然后在30～35℃条件下对溶液进行超声使其充分溶解，超声以超声2～3min停歇1min 为一个周期，总共进行4～5个周期，得油相溶液；溶解时固液比为10～15： 1(mg/ml)；
(3)在搅拌条件下将油相溶液按照2～3滴/s的速度滴加到水相溶液中，先冰浴探针超声5～10min，再以400～500rmp的速度持续搅拌2～3h，然后过0.45μm 微孔滤膜，得TBFs/LPNs溶液；其中，油相与水相的体积比为1：10～20；
(4)将TBFs/LPNs溶液在真空条件下冷冻干燥4～5h，得纳米粒。
在上述技术方案的基础上，本发明的制备方法还可以做如下改进。
进一步，纳米粒载体为生物可降解材料。
进一步，纳米粒载体为PLGA。
进一步，步骤(2)中超声溶解时超声功率为400～500w；步骤(3)中冰浴探针超声时超声功率为500～600w。
进一步，所有搅拌均为磁力搅拌；步骤(1)中搅拌时，维持水相溶液的温度为65～70℃。
进一步，步骤(4)中真空冷冻干燥在-80～-100℃，真空度为2～8Pa的条件下进行。
本发明的有益效果是：
1.聚乳酸-羟基乙酸PLGA可作为生物可降解的高分子材料，在药物释放的载体方面显示了巨大的应用潜力，具有较高的强度和良好的生物相容性；而脂质体作为一种新型的纳米胶囊制备技术，可用于药物和功能性成分的载体，将脂质体作为载体对水溶性差的药物进行包埋，可大大改善药物的水溶性、靶向性和生物利用度，亦可保护被包埋的药物。本发明中的苦荞黄酮提取物存在水溶性差，生物利用度低的不足，所以将其包埋在脂质聚合物纳米材料中可以显著克服其现有的弊端。
2.本发明采用超声辅助溶剂挥发法制备苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒，能够使难溶于水的苦荞黄酮更好地包裹于纳米材料中；相比其他制备方法，此法可明显提高其包封率与载药量。
3.将苦荞黄酮提取物与现代纳米技术相结合，苦荞黄酮提取物的生物利用度提高，而且苦荞黄酮中的活性成分能够更好的被机体吸收。
4.脂质材料由胆固醇、蛋黄卵磷脂和PEG-DSPE混合而成。其中，蛋黄卵磷脂作为增溶剂，可增大胆固醇与PEG-DSPE的溶解度；胆固醇作为乳化剂，含有亲水基和亲油基两个功能基团，可以使脂质颗粒均匀分散到液体中，增加溶液的稳定性，制备出的纳米粒颗粒尺寸也更加均匀；PEG-DSPE可以在脂质体表面形成一层水化膜，阻止脂质体之间的相互影响，脂质体可以在溶液中长时间稳定存在。脂质材料先用无水乙醇溶解，其中不溶于水或难溶于水的物质先均匀分散到无水乙醇中，然后再将溶液与水混合，脂质材料以粒子状态悬浮在水溶液中，不仅脂质材料的溶解度增大，而且后期制得的纳米粒更加均匀。
5.苦荞黄酮和纳米粒载体溶于乙腈后，再用超声进行震荡，不仅苦荞黄酮和纳米粒载体的溶解度增加，而且它们混合更加均匀，所制备出的纳米粒子合格率更高。超声震荡采用间歇方式进行，超声阶段，苦荞黄酮和纳米粒载体在溶液中进行混合，静止阶段，苦荞黄酮和纳米粒载体一起沉降，在重力作用下，苦荞黄酮和纳米粒载体在沉降物中重新分布；经过超声和静止交替处理后，苦荞黄酮与纳米粒载体混合更加充分，使所有制备出的纳米粒子中包含基本相同的苦荞黄酮，纳米粒子的品质大幅度提高。
附图说明
图1为载药微粒的透射电镜图；
图2为红外光谱分析图；
图3为载药微粒的Zeta电位图；
图4为载药颗粒的红外光谱图。
具体实施方式
本发明中所用苦荞黄酮从苦荞粉末中提取得到，提取工艺为：将苦荞粉末放入索氏提取器中，然后用体积分数为75％的乙醇溶液进行抽提；苦荞粉末与乙醇溶液的料液比为m苦荞粉末:V乙醇＝1:40(g/mL)，抽提时间60min。最终所得苦荞黄酮中芦丁含量为7.66±0.47mg/g。
下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一
将2mg胆固醇、1mg蛋黄卵磷脂和2mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 70℃的水中，控制磁力搅拌器的温度为70℃、转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与10mg PLGA材料共溶于2ml乙腈中，然后在35℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为500w，超声以超声3min停歇1min为一个周期，总共进行4个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴探针超声10min，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
实施例二
将2mg胆固醇、1mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入15ml 70℃的温水中，控制磁力搅拌器的温度为70℃、转速为400rmp，持续搅拌20min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与5mg PLGA 材料共溶于1.5ml乙腈中，然后在30℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为400w，超声以超声2min停歇1min为一个周期，总共进行5个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴探针超声5min，超声功率为600w，再以400rmp的速度持续搅拌3h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45 μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-80℃、真空度为8Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
实施例三
将2mg胆固醇、2mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 70℃的温水中，控制磁力搅拌器的温度为70℃、转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与10mg PLGA 材料共溶于2ml乙腈中，然后在35℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为500w，超声以超声3min停歇1min为一个周期，总共进行4个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴超声10min，超声功率为500w，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45 μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
实施例四
将2mg胆固醇、2mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 65℃的温水中，控制磁力搅拌器的温度为65℃、转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与5mg PLGA 材料共溶于1ml乙腈中，然后在35℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为500w，超声以超声3min停歇1min为一个周期，总共进行4个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴探针超声10min，超声功率为500w，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过 0.45μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
实施例五
将2mg胆固醇、2mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 70℃的温水中，控制磁力搅拌器的温度为70℃、转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与10mgPACA 的混合物共溶于2ml乙腈中，然后在35℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为500w，超声以超声3min停歇1min为一个周期，总共进行4个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴超声10min，超声功率为500w，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45 μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
对比例一
将2mg胆固醇、2mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 70℃的温水中；控制磁力搅拌器的温度为70℃、转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与10mg PLGA 溶于2ml丙酮中，然后在35℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为500w，超声以超声3min停歇1min为一个周期，总共进行4个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴超声10min，超声功率为500w，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45 μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
对比例二
将2mg胆固醇、2mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 70℃的温水中，控制磁力搅拌器的温度为70℃、转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与10mg PLGA 溶于2ml乙腈中，搅拌后得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴超声10min，超声功率为500w，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45 μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
对比例三
将2mg胆固醇、2mg蛋黄卵磷脂和1mg PEG-DSPE溶于1ml无水乙醇中，再将溶液缓慢滴加入20ml 25℃的温水中，控制磁力搅拌器的转速为500rmp，持续搅拌15min，得水相溶液。将5mg苦荞黄酮与10mg PLGA溶于2ml乙腈中，然后在35℃条件下对溶液进行超声，使其充分溶解，超声功率为500w，超声以超声3min停歇1min为一个周期，总共进行4个周期，得油相溶液。
将油相溶液以2～3滴/s的速度滴入水相溶液中，冰浴超声10min，超声功率为500w，再以500rmp的速度持续搅拌2h，挥发掉残余的有机溶剂，过0.45 μm滤膜，得到泛淡蓝色乳光的TBFs/LPNs溶液。将TBFs/LPNs溶液放入真空干燥器中，在-100℃、真空度为2Pa的条件下进行干燥，得纳米粒颗粒，4℃保存。
结果分析
通过透射电镜观察各组实施例中载药微粒的外观形状，发现载药微粒成规则的球形，表面光滑，大小均匀，如图1所示；同时测量了纳米粒子的粒径和 Zeta电位，并绘制成分布曲线，其中，图2为纳米粒子粒径分布曲线图，从图中可以看出，纳米粒径多分布在65～75nm范围内；图3为纳米粒子Zeta电位分布曲线图，可以看出，Zeta电位多分布在-25～-30mv范围内。
分别测定上述各实验组制备出的纳米粒的包封率、载药量、纳米半径、DPPH 清除率以及ABTS清除率，结果列于表1。其中：
包封率＝纳米粒中苦荞黄酮质量/苦荞黄酮总投入量×100％；
载药量＝纳米粒中苦荞黄酮质量/(纳米粒中苦荞黄酮质量+载体材料质量)×100％；
DPPH清除率测定方法为：称取3mg DPPH溶于100ml无水乙醇中，在517 nm处调节吸光度，使其在0.6～0.8之间；取2ml DPPH溶液和2ml无水乙醇混合，在517nm处测得空白溶液吸光度；取空白脂质聚合物纳米粒溶液2ml与2 ml DPPH溶液混合，在517nm处测得空白脂质聚合物纳米粒的吸光度；分别取芦丁浓度相同的苦荞提取物溶液与苦荞提取物脂质聚合物纳米粒溶液0.25、0.5、 0.75、1.0、1.25ml于10ml容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，再分别取2ml与 2ml DPPH溶液混合，在517nm处测得样品吸光度。按照公式：清除率 (％)＝[(AControl-ASample)/AControl]×100％，计算DPPH自由基的清除率，并通过 SPSS17.0软件包进行统计学处理得到半数抑制率IC50值。
ABTS自由基清除实验原理同上。
表1结果分析
Figure RE-GDA0001586240920000091
从表1中可以看出，采用本发明的方法所制备的纳米粒，具有较高的包封率和载药量，纳米粒径也较为稳定，变化范围不大，同时对DPPH以及ABTS 的清除率也较高。对比例一与实施例相比，油相有机溶剂由乙腈改为丙酮；对比例二与实施例相比，区别点在于：制备油相溶液时，未采用间歇超声震荡；对比例三与实施例相比，水相温度变为常温。对比例制备出的纳米粒与实施例所制备出的纳米粒相比性质差别较大，表明油相中有机溶剂的种类、间歇超声以及水相温度在纳米粒的制备中具有重要作用。
为了研究包裹在脂质聚合物纳米材料中的苦荞黄酮的化学结构变化，利用红外光谱对实施例一中的苦荞黄酮纳米粒进行了系统分析。如图4-B所示，苦荞黄酮特征峰在3412、2924、1655、1505、1458、1296、1170和1063cm-1，与其主要活性物质芦丁的结构基本保持一致。分别对特征峰进行指证，认为 3412cm-1为OH的伸缩振动峰；2924cm-1为CH的伸缩振动峰；1655cm-1非常明显为C＝O的伸缩振动峰；1505cm-1为黄酮类苯环C＝C的伸缩振动峰；1458cm-1为CH弯曲变形振动、1296cm-1为＝C-O-C。脂质聚合物纳米材料红外光谱的扫描结果如图4-A所示，六个主要吸收峰的位置分别是3439、2929、1736、1467、 1242、1113和960cm-1。分别对特征峰进行指证，认为3439cm-1是胆固醇中的-OH 吸收峰；2929cm-1和1647cm-1属于-CH2伸展振动和CH3反对称变形振动； 1736cm-1是蛋黄卵磷脂中的-C＝O伸展振动；960cm-1是C-C-N+的特征谱带。苦荞黄酮与空白纳米材料物理混合的谱图如图4-C所示，与苦荞黄酮的特征峰相似，并没有表现出明显的结构变化；而纳米粒在指纹区(1300-600cm-1)的特征峰有一些变化，如图4-D所示，是由于苦荞黄酮与磷脂酰胆碱之间有化学键形成，可能是氢键与范德华力的作用，表明最终生成的纳米粒并不是将苦荞黄酮与空白纳米材料进行了简单地物理混合，而是发生了化学变化。
利用上面实施例中制备出的纳米粒以及苦荞黄酮分别在小鼠体内进行免疫试验，具体操作为：将60只昆明种小鼠随机分为对照空白组、模型组、阳性药组、空白纳米组、苦荞黄酮组、纳米粒组，每组10只。除空白对照组外，各组均腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg)0.1ml/10g构建免疫抑制模型，1d/次，共5d。模型成功后阳性药给予盐酸左旋咪唑(30mg/kg)，苦荞黄酮组和纳米粒组均以芦丁量(10mg/kg)给药，空白对照组和模型组给予等量生理盐水；灌胃给药，1d/次，共14d。
末次给药24h，对小鼠称量，然后小鼠尾静脉注射印度墨汁(0.01ml/g)，分别在注射5min，15min后摘眼球采血，并迅速加入2ml 0.1％Na2CO3溶液中，充分混匀10min并以Na2CO3溶液作为空白对照校对，最后在650nm下测定吸光值(OD)。采血结束后，剖解小鼠取脾脏和胸腺，称其质量，计算脾脏指数(A)、胸腺指数(B)、碳粒廓清指数(K)和校正廓清指数(α)。A＝脾脏(mg)/体质量(g)；B ＝胸腺(mg)/体质量(g)；K＝(lgOD1－lgOD2)/T，α＝K1/3×体质量/(肝质量+脾质量)，T为两次采血的时间间隔10min。试验结果如表2所示。
表2纳米粒对免疫抑制小鼠的免疫增强作用
组别 碳粒廓清指数(K) 吞噬指数(α) 脾脏指数(％) 胸腺指数(％)
空白组 0.029±0.011 5.274±1.264 5.972±1.157 2.451±0.865
模型组 0.007±0.003<sup>#</sup> 3.796±0.430<sup>#</sup> 4.752±0.440<sup>#</sup> 1.534±0.446<sup>#</sup>
阳性药组 0.012±0.008<sup>*</sup> 4.233±0.539<sup>*</sup> 5.932±0.954<sup>**</sup> 2.090±0.289<sup>*</sup>
空白纳米组 0.007±0.004 3.985±0.921 4.875±1.315 1.465±0.637
苦荞黄酮组 0.013±0.009<sup>*</sup> 4.177±1.387<sup>*</sup> 5.673±1.479<sup>**</sup> 1.889±0.454<sup>*</sup>
纳米粒组 0.022±0.015<sup>*▲</sup> 5.100±0.906<sup>*▲</sup> 5.816±1.207<sup>*▲</sup> 2.377±0.662<sup>*▲</sup>
注：与空白组相比：#P<0.05；与模型组相比：*P<0.05；苦荞黄酮组与TBFs/LPNs组相比：▲P<0.05
小鼠免疫抑制实验结果显示：在进食量基本一致的情况下，与对照组相比，模型组的体重和脾脏胸腺的重量显著降低，说明其免疫器官出现明显萎缩；其K 值和α值与对照组相比亦有显著降低，说明其巨噬细胞的吞噬能力明显减弱。苦荞黄酮组和纳米粒组比较具有统计学意义，说明相对于苦荞黄酮而言，其纳米制剂能够更好地提高小鼠的免疫功能。

Claims (5)

1.一种苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)按4～5：1(mg/ml)的固液比将脂质材料溶于无水乙醇中，再将溶液与65～70℃的温水按1：15～20的体积比混合，以400～500rmp的速度持续搅拌15～20min，得水相溶液；其中，脂质材料由胆固醇、蛋黄卵磷脂和PEG-DSPE按1～2：1：1的质量比混合而成；
(2)将苦荞黄酮和PLGA纳米粒载体按照质量比为1～2:1混合后溶于乙腈中，然后在30～35℃条件下对溶液进行超声使其充分溶解，超声以超声2～3min停歇1min为一个周期，总共进行4～5个周期，得油相溶液；溶解时固液比为10～15：1(mg/ml)；
(3)在搅拌条件下将油相溶液按照2～3滴/s的速度滴加到水相溶液中，先冰浴探针超声5～10min，再以400～500rmp的速度持续搅拌2～3h，然后过0.45μm微孔滤膜，得TBFs/LPNs溶液；其中，油相与水相的体积比为1：10～20；
(4)将TBFs/LPNs溶液在真空条件下冷冻干燥4～5h，得纳米粒。
2.根据权利要求1所述的苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒的制备方法，其特征是：步骤(2)中超声溶解时超声功率为400～500w；步骤(3)中冰浴探针超声时超声功率为500～600w。
3.根据权利要求1所述的苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒的制备方法，其特征是：所有搅拌均为磁力搅拌；步骤(1)中搅拌时，维持水相溶液的温度为65～70℃。
4.根据权利要求1所述的苦荞黄酮脂质聚合物纳米粒的制备方法，其特征是：步骤(4)中真空冷冻干燥在-80～-100℃，真空度为2～8Pa的条件下进行。
5.如权利要求1～4中任意一项所述的纳米粒制备方法所制备的纳米粒。
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