CN108033996B

CN108033996B - 一种可控制备紫杉醇纳米纤维及其制备方法和用途

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Publication number: CN108033996B
Application number: CN201711249268.9A
Authority: CN
Inventors: 陈敏生; 杨志谋; 区彩文; 蔡延滨
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN108033996A

Abstract

本发明提供了一种可控制备紫杉醇纳米纤维及其制备方法和用途，具体公开了一种紫杉醇纳米纤维前体化合物，所述前体化合物为紫杉醇与多肽链通过接头进行偶联；其中，所述的接头为丁二酸、戊二酸；所述的多肽为GGGE、GGEE或GEEE；丁二酸分别与紫杉醇上的羟基以及甘氨酸上的氨基进行偶联。还公开了一种紫杉醇纳米纤维凝胶，其是通过将紫杉醇纳米纤维前体化合物水解得到的。

Description

一种可控制备紫杉醇纳米纤维及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及纳米医药领域，尤其涉及一种可控制备紫杉醇纳米纤维的方法。

背景技术

超分子水凝胶在组织工程、传感器、药物递送、癌细胞抑制和免疫调节方面显示出巨大的潜力。为了触发小分子(凝胶剂)发生自组装，需要施加外部刺激，其中包括加热—冷却过程，pH值调节，增加离子强度，化学反应，酶促反应等。这些方法中，使用(自动)催化或酶促反应吸引越来越多的研究兴趣，它们提供更多的机会来操控水凝胶的性质，并引导生成动态的、耗散的或非平衡的纳米材料。此外，使用酶促反应触发分子自组装可比传统方法产生更多功能的纳米材料。最近的研究表明，反应动力学对所得水凝胶的性质有明显的影响，包括纳米结构的力学性能、外观和形态。利用疏水抗癌药物紫杉醇制备具有纳米纤维结构的紫杉醇水凝胶已有报道，但之前的研究主要集中在改善紫杉醇的疏水性，提高生物利用度。通过理性设计不同紫杉醇亲水前体分子，利用反应动力学影响其表观形貌、力学性能、纳米结构，进而影响紫杉醇水凝胶的抗癌性质。这种可控制备紫杉醇纳米纤维的方法能够提供更复杂和更具功能性的纳米材料。

发明内容

发明目的

发明人发现通过理性设计紫杉醇亲水前体分子，可以达到紫杉醇前体分子酯键自动水解的动力学控制，利用反应动力学控制，实现可控制备紫杉醇纳米纤维的目标，从而影响紫杉醇水凝胶的形态，力学性质，进而影响紫杉醇水凝胶的抗癌性质。

鉴于上述发现，本发明的一个目的是提供三种紫杉醇多肽前体分子，通过改变前体分子中谷氨酸(E)的个数调节紫杉醇多肽前体分子的两亲性，不同的两亲性能够影响紫杉醇分子与多肽之间酯键的水解速率，从而实现紫杉醇水凝胶形成的动力学控制。

本发明的另一个目的是研究所述紫杉醇多肽前体分子制备的紫杉醇水凝胶的形态，力学性能，纳米结构。

本发明的另一个目的是研究所述紫杉醇多肽前体分子制备的紫杉醇水凝胶的抗癌性质。

发明概述

根据本发明的第一方面，本发明提供了三种紫杉醇多肽，其序列为 Taxol-GGGE，Taxol-GGEE和Taxol-GEEE，其中Taxol表示紫杉醇。

本发明中所述氨基酸序列如未特别说明，则对其构型无限制。

所述多肽的结构式如式(1a)，(2a)，(3a)所示，

(1a)Taxol-GGGE

(2a)Taxol-GGEE

(3a)Taxol-GEEE

(b)Taxol

所述多肽经自动水解过程得到紫杉醇分子Taxol，结构式如图式(b)所示,紫杉醇分子(b)发生分子自组装形成水凝胶。

根据本发明的第二方面，本发明提供了所述紫杉醇多肽前体分子制备的紫杉醇水凝胶在形态、力学性能、纳米结构上的表征。

根据本发明的第三方面，本发明提供了所述紫杉醇多肽前体分子制备的紫杉醇水凝胶的抗癌表现。

本发明具体公开了一种紫杉醇纳米纤维前体化合物，所述前体化合物为紫杉醇与多肽链通过接头进行偶联；

其中，所述的接头为丁二酸、戊二酸；

所述的多肽为GGGE、GGEE或GEEE；

丁二酸分别与紫杉醇上的羟基以及甘氨酸上的氨基进行偶联。

在一个具体的技术方案中，紫杉醇纳米纤维前体化合物结构式如1a、2a和 3a所示。

本发明还公开了一种紫杉醇纳米纤维凝胶，其是通过将紫杉醇纳米纤维前体化合物水解得到的。

在一个具体的技术方案中，所述的紫杉醇纳米纤维凝胶是将紫杉醇纳米纤维前体化合物溶解在缓冲溶液中，水解反应至完全得到紫杉醇纳米纤维凝胶；

优选地，所述的缓冲液pH值为7.4。

在一个具体的技术方案中，紫杉醇纳米纤维前体化合物在缓冲溶液中的浓度为2-6毫摩/升，优选为4毫摩/升。

本发明还公开了紫杉醇纳米纤维凝胶在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明还公开了紫杉醇纳米纤维前体在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明所述紫杉醇多肽前体分子均可根据现有技术自制，通过改变多肽分子中谷氨酸(E)的个数可以调节其两亲性，表现出不同的自动水解速率，通过水解反应的动力学控制，可以制备出具有不同表观形貌，不同力学性能和不同纳米纤维结构的多肽水凝胶。通过可控制备的紫杉醇纳米纤维，进而在抗癌应用上表现出了不同的抑制效果。这种可控制备紫杉醇纳米纤维的方法，为开发出更多药效优良的水凝胶抗癌药物提供了新的思路。

附图说明

图1中的A、B、C分别为制备实施例1，实施例2，实施例3通过酯键自动水解过程得到的紫杉醇水凝胶照片。

图2为实施例1，实施例2，实施例3在酯酶自动水解过程中的转化率。

图3为通过流变仪测量三种紫杉醇水凝胶的流体力学性质。图A为 Taxol-GGGE的动态时间扫描；图B为Taxol-GGEE的动态时间扫描；图C为 Taxol-GEEE的动态时间扫描；其中频率设定为0.5转/秒，应力设定为0.5％；图 D为三种紫杉醇水凝胶的动态频率扫描，应力设定为0.5％。

图4：用透射电镜观察三种多肽水凝胶的纳米纤维结构。其中图A为 Taxol-GGGE的透射电镜图；图B为Taxol-GGEE的透射电镜图；图C为 Taxol-GEEE的透射电镜图。

图5为用不同浓度紫杉醇及紫杉醇水凝胶培养肝癌细胞HepG2 48小时后的细胞抑制率图。其中左图为gel1、gel2、gel3和Taxol的细胞抑制率图；右图为通过计算得到四种不同化合物的IC₅₀值。

图6为Taxol，gel1，gel2，gel3，PBS对比组的动物实验结果。其中图A 为各实验组的肿瘤抑制—时间曲线；图B为各实验组的体重变化—时间曲线；图C为第14天时各实验组的活体成像结果。

图7为第14天时各实验组的肿瘤在体积和质量。

具体实施方式

下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发明。

以下实施例中，通过本领域常用的倒置小瓶的方法检验水凝胶的形成与否。

以下实施例中所涉及制剂来源如下：

以下实施例中所涉及设备如下：

高效液相色谱仪(德国Lumtech，HPLC)；

高效液相色谱质谱联用仪(日本岛津，LC-MS 2020)；

透射电子显微镜(Tecnai G2F20系统)；

冷冻干燥机(北京亚泰科隆，LGJ-1-50)；

流变仪(美国TA，AR1500ex)；

全数字核磁共振仪(德国Bruker，Bruker 400M)；

液质联用仪(美国安捷伦，Agilent 6520Q-TOF LC/MS)。

动物活体成像系统(美国，Xenogen IVIS Lumina II)

实施例1合成多肽GGGE和凝胶

根据文献(Nanotechnology,2010,21(22):225606.)，用FMOC-固相合成方法合成多肽GGGE：

1)用二氯甲烷(DCM)将二氯树脂首先在固相合成管中溶胀5分钟。

2)称取第一个Fmoc-氨基酸与相当于其2当量的DIEA，溶解在DCM中加入到固相合成管中室温反应2小时。

3)用适量的甲醇和DIEA封闭二氯树脂，反应15～30min。

4)用DCM清洗5次，再换用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)清洗5次，加入 20％的哌啶反应30min脱除第一个氨基酸上的氨基保护基Fmoc。

5)用DMF清洗残余的哌啶后，加入第二个Fmoc-氨基酸同时加入相同当量的偶联剂HBTU和2当量的DIEA，反应2小时。

6)重复4)和5)的步骤，将每一个氨基酸都加好后，加入20％的哌啶反应30min脱除最后一个氨基酸上的氨基保护基Fmoc，用DMF清洗5次。

7)用DCM洗净树脂中的DMF，加入10mL的95％的TFA反应30分钟以将肽链从树脂上切下来。真空旋转蒸发除去TFA，得到粘稠的液体后加入无水乙醚析出沉淀即为产物。

8)将得到的多肽与丁二酸化的紫杉醇反应得到Taxol-GGGE，产物经高效液相色谱提纯后即可使用，结构式如图式(1a)所示。

所合成多肽Taxol-GGGE的核磁图谱和质谱结果如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07-8.23(m,5H),7.97-8.02(d,2H), 7.84-7.89(d,2H),7.64-7.77(m,3H),7.49-7.58(m,3H),7.43-7.48(t,3H),6.29(s, 1H),5.79-5.86(t,1H),5.50-5.57(t,1H),5.40-5.45(d,1H),5.32-5.38(d,1H), 4.89-4.94(d,1H),4.65(s,1H),4.19-4.26(m,1H),4.07-4.13(m,1H),3.97-4.04(m, 2H),3.66-3.77(m,6H),2.20-2.34(m,7H),2.11(s,3H),1.91-2.01(m,2H),1.77(s, 4H),1.49(s,4H),0.95-1.04(d,6H).HR-MS:calc.M⁺＝1253.45,obsvd.(M+1)⁺＝ 1254.4583.

取1mg上述合成的多肽Taxol-GEEE置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入200微升1×PBS(pH＝7.4)溶液，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，控制最终浓度为4毫摩/升，超声使其全部溶解置于室温下，4分钟后即可成透明的水凝胶gel1 (图1A)。

实施例2合成多肽Taxol-GGEE和凝胶

根据文献(Nanotechnology,2010,21(22):225606.)，用FMOC-固相合成方法合成多肽GGEE，之后将得到的多肽与丁二酸化的紫杉醇反应得到Taxol-GGEE，产物经高效液相色谱提纯后即可使用，结构式如图式(2a)所示。

所合成多肽Taxol-GGEE的核磁图谱和质谱结果如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.27-9.21(d,J＝8.42Hz,1H),8.19-8.27(m, 2H),8.06-8.11(t,1H),7.96-8.04(t,3H),7.83-7.88(d,J＝7.54Hz,2H),7.72-7.77(t, 1H),7.64-7.70(t,2H),7.54-7.59(t,1H),7.42-7.53(m,6H),6.29(s,1H),5.79-5.86(t, 1H),5.50-5.57(t,1H),5.39-5.43(d,J＝5.27Hz,1H),5.32-5.37(d,1H),4.89-4.94(d, 1H),4.65(s,1H),4.29-4.35(m,1H),4.08-4.19(m,2H),3.97-4.04(t,2H),3.72-3.76 (t,2H),3.66-3.70(t,2H),2.57-2.71(m,3H),2.54(s,2H),2.21-2.35(m,8H),2.11(s, 3H),1.87-2.00(m,2H),1.71-1.84(m,6H),1.59-1.67(m,1H),1.45-1.55(m,4H), 0.95-1.06(d,6H).HR-MS:calc.M⁺＝1325.48,obsvd.(M+1)⁺＝1326.4802.

取1mg上述合成的多肽Taxol-GGEE置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入200微升1×PBS(pH＝7.4)溶液，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，控制最终浓度为4毫摩/升，超声使其全部溶解置于室温下，8分钟后即可成乳白色的水凝胶 gel2(图1B)。

实施例3合成多肽Taxol-GEEE和凝胶

根据文献(Nanotechnology,2010,21(22):225606.)，用FMOC-固相合成方法合成多肽GEEE，之后将得到的多肽与丁二酸化的紫杉醇反应得到Taxol-GGGE，产物经高效液相色谱提纯后即可使用，结构式如图式(3a)所示。

所合成多肽Taxol-GEEE的核磁图谱和质谱结果如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.21-9.26(d,J＝8.29Hz,1H),8.13-8.20(m,2H),8.02-8.09(m,2H),7.96-8.01(d,J＝7.38Hz,2H),7.83-7.87(d,J＝7.30Hz,2H), 7.71-7.76(t,1H),7.64-7.70(t,2H),7.54-7.58(t,1H),7.42-7.52(m,6H),7.16-7.23 (m,1H),6.29(s,1H),5.79-5.86(t,1H),5.51-5.57(t,1H),5.39-5.44(d,J＝7.17Hz, 1H),5.32-5.37(d,1H),4.89-4.94(d,1H),4.66(s,1H),4.22-4.31(m,2H),4.15-4.19 (m,1H),3.98-4.04(t,2H),3.71-3.75(m,1H),3.65-3.69(m,1H),2.57-2.71(m,3H), 2.54(s,2H),2.21-2.34(m,10H),2.11(s,3H),1.84-2.01(m,4H),1.72-1.81(m,6H), 1.59-1.67(m,1H),1.47-1.56(m,4H),0.96-1.06(d,6H).HR-MS:calc.M⁺＝1397.50, obsvd.(M+1)⁺＝1398.5008.

取1mg上述合成的多肽Taxol-GGE置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入200微升1×PBS(pH＝7.4)溶液，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，控制最终浓度为4毫摩/升，超声使其全部溶解置于室温下，30分钟后即可成浑浊的水凝胶gel3 (图1C)。

实施例4转化率实验

配置三种多肽分子溶液各2毫升，浓度为4毫摩/升，每隔10分钟取样100 微升样品，并向其中加入100微升甲醇，终止自动水解。用高效液相色谱质谱联用仪(LCMS)进行检测，由于酯键水解前后会发生分子量的变化，在LC图上会出现两个峰，通过积分两个峰的峰面积即可得出转化率。转化率＝产物峰面积 /(产物峰面积+反应物峰面积)。

本发明所述的三种多肽分子即实施例1、实施例2和实施例3可通过酯键的断裂发生自动水解，三种多肽分子的水解速率不尽相同，且与它们各自的成胶时间速度相吻合。如图2所示，Taxol-GGGE的水解速率最快而Taxol-GEEE的水解速率最慢。在1小时这个时间点，Taxol-GGGE，Taxol-GGEE，Taxol-GEEE中水解的Taxol分别为74％，66％，57％。在5小时即300分钟时间点，三种多肽水解得到的Taxol都达到了98％。由于三种多肽中的酯键自动水解速度的不同，导致了Taxol自组装形成水凝胶的速度不同，为制备紫杉醇纳米纤维提供了调控的基础。

实施例5流变实验

流变测试使用AR 2000ex(TA instrument)流变仪完成，配置三种多肽分子的水凝胶各1毫升(浓度为4毫摩/升)，迅速将样品加到测试台上，使用40mm 不锈钢平板圆盘夹具，温度设定为25℃。

动态时间扫描测试：设定扫描频率为0.5rad/s,应力为0.5％，得到胶体弹性模量(G’)和粘性模量(G”)变化曲线如图3A—图3C所示。

动态频率扫描测试：时间扫描结束后，设定应力值为0.5％，扫描频率范围设定为0.1rad/s-100rad/s，测试胶体力学性能随扫描频率的增大而发生的变化，得到胶体弹性模量(G’)和粘性模量(G”)变化曲线如图3D所示。

本发明所述的三种多肽分子即实施例1，实施例2，实施例3可通过酯键的断裂发生自动水解，从流体力学结果观察到三种多肽分子的成胶速度也不尽相同。如图3所示，对于Taxol-GGGE，在大约3分钟时其G’值大于G”值，表明它发生了一个快速的溶胶-凝胶相转变，这一时间与它可观察到的4分钟成胶时间保持一致。对于Taxol-GGEE和Taxol-GEEE，它们的G’值分别在第7分钟和第25分钟开始大于其G”值，这也与二者的成胶时间基本一致。三种多肽的G’值在成胶之后迅速增加，且在3小时达到峰值。从动态频率扫描结果可以看到，三种多肽水凝胶都具有微弱的频率依赖性，表明它们都是高弹性水凝胶。此外， Taxol-GGGE,Taxol-GGEE,Taxol-GEEE最终的G’值分别为3584Pa、2599Pa和 1968Pa，即gel1＞gel2＞gel3，说明除了表观形貌之外，三种多肽水凝胶的力学性质也受到了成胶动力学的影响。

实施例6电镜实验：

本发明所述的三种多肽分子即实施例1，实施例2，实施例3通过酯键发生自动水解形成水凝胶的过程中受到动力学控制，得到了不同的纳米纤维结构，实现了可控制备紫杉醇纳米纤维的目标。图4中的A、B和C分别代表了gel1,gel2, gel3的电镜结果，我们可以看到它们的直径和形貌均不相同。gel1,gel2,gel3中的纳米纤维直径分别为20,28and 34nm，其中gel1中的纳米纤维是柔性可弯曲的，而gel3中的纳米纤维是刚性的。由于gel1中的纳米纤维直径最小，所以在同浓度下三种水凝胶中，gel1中的纳米纤维数量最多，因此gel1表现出了最高的交联密度，导致它具有相对更好的力学强度。此外，由于Taxol-GGEE, Taxol-GEEE比Taxol-GGGE的分子中具有更多的谷氨酸(E)，带有更多的负电荷，所以形成的水凝胶gel2和gel3中的纳米纤维之间具有更强的电荷排斥力，这也是导致它们的机械强度更弱，其纳米纤维形貌更加刚硬的原因。

实施例7细胞毒性实验

将1×10⁴的HepG2(肝癌细胞)铺在96孔板中，用体积比为89％培养基 (DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+1％青链霉素混合液(双抗)的混合培养液进行培养，待细胞长好后，分别加入本专利所述的gel1，gel2，gel3及对照组Taxol (DMSO＜5％)，并即将其由4毫摩/升起始，两倍向下稀释，共10个浓度。培养48小时后，吸出样品，向其中加入还有体积比为10％的MTT溶液，再培养细胞4小时。4小时后，吸出MTT溶液，向其中加入DMSO显色，震荡混匀后，用酶标仪测试495nm处的吸收值。实验组数据的平均值与空白组的平均值之比即为细胞存活率，1-细胞存活率＝细胞抑制率，IC50代表：杀死50％的细胞所需药物的浓度。四种化合物的细胞抑制率和IC₅₀结果如图5所示。从图5右图可知， Taxol、gel1、gel2和gel3的IC₅₀值分别为13.14、6.11、7.39和10.66μM，表明三种多肽水凝胶都具有比Taxol更好的癌细胞抑制能力。

实施例8小鼠肿瘤实验

(1)构建小鼠肿瘤模型

在每只雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫皮下注射2×10⁵个4T1-luciferase(经过荧光素转染)细胞，每隔一天用游标卡尺和电子天平测量小鼠肿瘤大小和体重变化。当肿瘤大小长到50mm³(长×宽²/2)时，将小鼠随机分成5组，每组5只。并开始通过尾静脉注射给药，将第一天给药设为0天，每隔3天注射一次药物。在第12天时停止给药，继续观察肿瘤及体重变化。结果如图6A所示，gel3表现出与

相似的肿瘤抑制效果，而gel1和gel2都表现出比gel3和

更强的肿瘤抑制能力。对于PBS对照组、

组、gel3组、gel2组和gel1组，最终的肿瘤体积比肿瘤的初始体积分别为1114％、950％、793％、648％和565％。此外，如图6B所示，注射Taxol的小鼠在实验期内表现出轻微的体重下降，可能是由于

在临床使用中需要加入有机溶剂助溶，而注射具有纳米纤维结构的紫杉醇水凝胶就没有出现明显的体重下降，说明本发明所述的三种多肽水凝胶成功克服了

在临床应用中的缺陷。

(2)活体荧光成像实验

在注射药物起第14天时，对5组小鼠进行活体成像。在Xenogen IVIS Lumina II系统下观察小鼠体内的荧光成像情况。如图6C所示，接受gel1和gel2治疗的小鼠比其它实验组小鼠体内肿瘤显示出更小的光点，这一结果与图6A中的肿瘤体积结果相一致。

(3)肿瘤质量称量

活体荧光成像实验完成后，将小鼠处死，取出体内肿瘤，进行拍照并称量其质量。结果如图7所示。gel1组和gel2组小鼠体内取出的肿瘤在体积和质量上都要比其它实验组的小鼠更小，进一步说明了gel1和gel2具有更好的肿瘤抑制效果。

本发明通过理性设计不同的水凝胶前体分子，实现了对酯键自动水解过程的动力学控制，从而实现了水凝胶形成的可控性，进而提供了一种可控制备紫杉醇纳米纤维的方法。利用方法制备的紫杉醇水凝胶，表现出不同的表观形貌，力学性能，纳米纤维结构，更重要的在其抗癌应用上表现出了不同的抑制效果。由于水凝胶是一种亚稳态材料，所以在水凝胶形成过程中的动力学变化将会导致最终形成的水凝胶中具有非均衡自组装纳米结构，而通过这种方式构建的材料将会比传统方法获得的材料具备更多的功能。本发明提供了一种能够操控自组装纳米材料性质的有效策略，将引导开发出具有更出色治疗效果的纳米药物。

Claims

1.一种紫杉醇纳米纤维凝胶，其是通过将紫杉醇纳米纤维前体化合物水解得到的，所述紫杉醇纳米纤维前体化合物为紫杉醇与多肽链通过接头进行偶联；

其中，所述的接头为丁二酸；

所述的多肽为GGGE、GGEE或GEEE；

丁二酸分别与紫杉醇上的羟基以及甘氨酸上的氨基进行偶联；

所述紫杉醇纳米纤维前体化合物结构式如1a、2a和3a所示；

2.权利要求1所述的紫杉醇纳米纤维凝胶在制备抗肿瘤药物中的用途。