CN108026585A - 多基因检测 - Google Patents
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Abstract
提供了体外确定乳腺纤维上皮性肿瘤类型的方法。所述方法包括以下步骤：获得选自所述样品内下述基因中的一个或多个基因的表达谱：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；确定一个或多个基因相对于对照的差异活性；使一个或多个基因相对于对照的差异活性相关联，以获得p‑评分；以及基于p‑评分，确定纤维上皮性肿瘤的类型，其中p‑评分小于0.5表示纤维腺瘤，而p‑评分为0.5和高于0.5表示叶状肿瘤。具体地，使用包括PRAME、FN1、CCL19、ABCA8和APOD的五个基因的表达谱例证了所述方法。还提供了用于管理患有乳腺纤维上皮性肿瘤的患者治疗的方法，以及用于本发明方法中的试剂盒。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月12日提交的新加坡临时申请号10201501928T的优先权。据此，出于所有目的，通过引用并入该申请的全部内容。
技术领域
本发明涉及乳腺肿瘤检测，特别是用于区分良性乳腺纤维上皮性肿瘤和恶性乳腺纤维上皮性肿瘤的检测。具体而言，本发明涉及使用通过活检或切除获得的样品进行的多基因检测，以及管理患有乳腺纤维上皮性肿瘤患者的治疗的方法。还提供了试剂盒。
背景技术
纤维上皮性肿瘤是由上皮组织和基质组织构成的两相肿瘤。在乳腺中，纤维上皮性肿瘤代表一组范围为良性到恶性的异质肿瘤。在这些肿瘤中，纤维腺瘤占良性纤维上皮性肿瘤的比例很高，而叶状肿瘤(PT)的范围从良性到恶性，并且具有不可预测的临床后果。
纤维上皮性肿瘤的异质性相当于各种不同的临床特征和病理特征。因此，为了指导有关乳腺肿瘤切除术过程中的刃带宽度和适当临床管理的外科决策，区分纤维腺瘤与PT非常重要。
然而，明确诊断纤维腺瘤与PT并不总是可能的。纤维腺瘤和PT共有一些重叠的形态，并且用于诊断的活检材料或切除材料可能有限。此外，恶性的形态预测指标，如有丝分裂活性、浸润性边界、肿瘤坏死、切缘阳性和肿瘤大小等，并不是恶性的确定性标志物。
因此，需要一种方法来区分纤维腺瘤和PT，从而能够明确诊断PT，而PT的明确诊断进而会指导患者的临床管理。
发明概述
一方面，提供了一种确定体外生物样品中乳腺纤维上皮性肿瘤的方法，包括：
获得所述样品中的一个或多个基因的表达谱，所述一个或多个基因选自由以下组成的组：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；
获得用作对照的一个或多个归一化基因的表达谱；
基于一个或多个基因的表达谱和一个或多个归一化基因的表达谱，确定一个或多个基因相对于对照的差异活性；
使一个或多个基因相对于对照的差异活性相关联，以获得p-评分；以及
基于p-评分确定纤维上皮性肿瘤的类型，其中p-评分小于0.5表示纤维腺瘤，而p-评分为0.5和p-评分高于0.5表示叶状肿瘤。
一方面，提供了一种管理患有乳腺纤维上皮性肿瘤患者治疗的方法，包括：
获得从所述患者获得的生物样品中的一个或多个基因的表达谱，所述一个或多个基因选自由以下组成的组：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；
获得用作对照的一个或多个归一化基因的表达谱；
基于一个或多个基因的表达谱和一个或多个归一化基因的表达谱，确定一个或多个基因相对于对照的差异活性；
使一个或多个基因相对于对照的差异活性相关联，以获得p-评分；
基于p-评分，确定纤维上皮性肿瘤的类型，其中p-评分小于0.5表示纤维腺瘤，而p-评分为0.5以及p-评分高于0.5表示叶状肿瘤；以及
基于纤维上皮性肿瘤的类型和p-评分，选择患者的治疗。
一方面，提供了一种用于权利要求1-15中任一项所述的方法中的试剂盒，包含：
用于扩增一个或多个基因的引物对，所述一个或多个基因选自由以下组成的组：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1。
定义
本文所用术语“生物材料”或“生物样品”是指包括本文所定义的分析物的任何材料或样品。这类样品可以包括例如来源于或包含以下的样品：大便、全血、血清、血浆、眼泪、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖液、乳液、奶液(milk)、初乳、胎盘液、羊水、汗液(perspirate)、滑液、腹水、脑脊液、胆汁、胃液、房水、玻璃体液、胃肠液、分泌液(exudate)、渗出液、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道液体、腹膜液、从免疫应答部位收集的液体、从集中收集部位收集的液体、支气管灌洗液、尿液，例如来自所有合适器官的活检材料，例如肺、肌肉、脑、乳腺、肝脏、皮肤、胰腺、胃等，有核细胞样品、与粘膜表面相关联的液体、头发或皮肤。
术语“聚合酶链式反应(PCR)”是指用于扩增具体靶向DNA序列的酶介导的反应。通过扩增DNA模板中的靶向DNA序列，然后能产生数百万甚至更多拷贝的靶向DNA序列。当生物样品仅含有小量DNA时，这是有用的。在含有DNA聚合酶、一对引物(正向引物和反向引物)以及4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的混合物中，在热循环仪的帮助下，进行PCR。PCR反应循环通常包括产生单链DNA分子的变性步骤、允许引物与DNA分子退火的退火步骤、允许合成新DNA互补链的延伸/伸长步骤。重复PCR反应循环以允许靶向DNA的扩增。
本文所用术语“循环阈值”或“Ct”是指，在检测到靶向DNA之前所需要的PCR反应循环的循环数。Ct水平与样品中靶向DNA的量成反比。
在缺少本文未具体公开的任一要素或多种要素、一种限制或多种限制的情况下也可以合适地实施本文说明性地描述的本发明。因此，例如术语"包含"、"包括"、"含有"等应当展开且没有限制地理解。此外，本文所用的术语和措辞被用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这类术语和措辞时，没有意图排斥所示和所述特征或其部分的任何等同物，且应当认识到，在请求保护的本发明的范围内进行各种修饰是可能的。因此，应当理解到，尽管通过优选的实施方案和可选特征具体描述了本发明，但是本领域技术人员可以采取本文所体现的发明的修改以及变型，并且这类修改、和变型视为落入本发明的范围内。
本文已经广泛且上位地描述了本发明。每一落入上位公开的狭窄类别和下位分类也形成了本发明的一部分。这包括具有从上位概念中除去任何主题的负限制或附带条件的本发明的上位描述，不管本文是否具体叙述了删除的材料。
其他实施方案在下述权利要求和非限制性实例的范围内。此外，如果本发明的特征和方面用马库什群组进行了描述，则本领域技术人员应当认识到，本发明还因此可以用马库什群组的任何单个成员或成员亚组来描述。
附图的简要说明
当连同非限制性实例和附图一起考虑时，参考详细描述会更好地理解本发明，在附图中：
图1.在48个样品中被选出来用于归一化的5个基因的表达值。在48个样品中选择具有最少可变表达的5个基因，用于归一化。所选的基因是RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45。
图2.针对每个基因所生成的100个RF树的精确度平均降低量的箱形图。用随机森林(RF)分类器算法(R版)分析46个样品中所有23个基因的ΔCt值，给区分纤维腺瘤和叶状肿瘤的基因的重要性排等级。精确度平均降低量衡量每个基因对于分类的重要性。
图3.算法在预测230个核心活检的独立组的诊断中的性能。(A)算法的灵敏度为94.7％，特异性为82.9％。算法的阳性预测值(PPV)为77.3％，而算法的阴性预测值(NPV)为96.2％。(B)算法对230个核心活检的独立组的性能的ROC曲线。
发明详述
在第一方面，本发明涉及体外确定生物样品中乳腺纤维上皮性肿瘤的方法。所述方法可以包括：获得选自所述样品内下述基因中的一个或多个基因的表达谱：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；获得用作对照的一个或多个归一化基因的表达谱；基于一个或多个基因的表达谱和一个或多个归一化基因的表达谱，确定一个或多个基因相对于对照的差异活性；使一个或多个基因相对于对照的差异活性相关联，以获得p-评分；以及基于p-评分确定纤维上皮性肿瘤的类型，其中p-评分小于0.5表示纤维腺瘤，而p-评分为0.5和高于0.5表示叶状肿瘤。
一个或多个基因可以选自PRAME、TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2以及APOD。在一实施方案中，2个、3个、4个或5个或更多个基因可以选自PRAME、TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2以及APOD。在优选的实施方案中，一个或多个基因可由PRAME、FN1、CCL19、ABCA8以及APOD组成。
可以将一个或多个基因与一个或多个参照基因进行比较。参照基因是用作与目的基因进行比较的基础的基因。本领域技术人员应当理解，可以针对一个或多个参照基因，将目的基因的表达水平归一化，以获得目的基因相对于参照基因的表达水平。目的基因针对一个或多个参照基因的表达水平的归一化允许比较样品内和/或样品间多个目的基因的表达水平。
参照基因可以是管家基因或归一化(normalized)或归一化(normalization)基因。可以单独或联合使用一个或多个参照基因。管家基因在本领域内是公知的，指在正常的生理条件下在生物体的所有细胞内组成性表达的基因。管家基因的实例包括但不限于β-肌动蛋白、GAPDH以及18S。归一化基因是表达变化在所有样品间最小的基因。可以基于变异系数(平均值/标准偏差)的最小值选择归一化基因。归一化基因可以是管家基因或表达变化在所有样品间最小的任何其他基因。
在一实施方案中，一个或多个归一化基因可以选自RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45。在优选的实施方案中，一个或多个归一化基因可以由RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45组成。
在一实施方案中，使一个或多个基因相对于对照的差异活性相关联以获得p-评分的步骤包括计算一个或多个基因的ΔCt(Δ阈值循环)值。通常应该理解的是，ΔCt值是一个基因相对于一个或多个归一化基因进行归一化后的Ct值。在一实例中，待检测的基因的ΔCt可以是相对于一个或多个归一化基因进行归一化的基因的Ct值。在优选的实例中，待检测的基因的ΔCt可以是按如下相对于几何平均数(5个归一化基因的Ct)进行归一化的基因的Ct值：
检测基因的ΔCt＝检测基因的Ct-几何平均数(5个归一化基因的Ct)
通常应当理解，ΔCt计算可以使用一个、两个、三个、四个、五个或更多个归一化基因。
ΔCt值可以用于利用预测算法计算p-评分。例如，预测算法可以是：
在一实施方案中，生物样品可以选自器官、组织、部分(fraction)以及细胞。组织样品可以从选自冷冻组织、组织活检、循环肿瘤细胞、体液或其他生物样品的肿瘤组织中获得。
生物样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的样品。在一实施方案中，生物样品可以是福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)。
在一实施方案中，体液可以选自腹水、积液、脑脊液和尿液。
在一个实施方案中，生物样品可以是恶性肿瘤样品。在另一个实施方案中，生物样品可以是良性肿瘤样品。在另一优选实施方案中，肿瘤样品可以是来自乳腺的样品。
在一实施方案中，可以从生物样品中提取RNA，以获得一个或多个基因和一个或多个归一化基因的表达谱。在另一个实施方案中，从样品生物样品获得一个或多个基因和一个或多个归一化基因的表达谱。还在另一个实施方案中，可以通过定量PCR方法获得一个或多个基因和一个或多个归一化基因的表达谱。
另一方面，本发明涉及管理患有乳腺纤维上皮性肿瘤患者治疗的方法。所述方法可以包括：获得选自从所述患者获得的生物样品内下述基因中的一个或多个基因的表达谱：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；获得用作对照的一个或多个归一化基因的表达谱；基于一个或多个基因的表达谱和一个或多个归一化基因的表达谱，确定一个或多个基因相对于对照的差异活性；使一个或多个基因相对于对照的差异活性相关联，以获得p-评分；基于p-评分，确定纤维上皮性肿瘤的类型，其中p-评分小于0.5表示纤维腺瘤，而p-评分为0.5和高于0.5表示叶状肿瘤；以及基于纤维上皮性肿瘤的类型和p-评分，选择患者的治疗。
通常可以理解，基于恶性叶状肿瘤或良性纤维腺瘤的适应症，可以定制患有乳腺纤维上皮性肿瘤的患者的治疗。
在第三方面，本发明涉及用于本文所述方法中的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于扩增选自下述基因中的一个或多个基因的引物对：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1。
在一实施方案中，一个或多个基因可以选自PRAME、TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2以及APOD。在另一实施方案中，一个或多个基因可以由PRAME、FN1、CCL19、ABCA8以及APOD组成。
在一实施方案中，试剂盒还可以包含选自RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45中的一个或多个归一化基因的引物对。在优选的实施方案中，一个或多个归一化基因可以由RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45组成。
在缺少本文未具体公开的任一要素或多种要素、一种限制或多种限制的情况下也可以合适地实施本文说明性地描述的本发明。因此例如术语"包含"、"包括"、"含有"等应当展开且没有限制地理解。此外，本文所用的术语和措辞被用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这类术语和措辞时，没有意图排斥所示和所述特征或其部分的任何等同物，且应当认识到，在请求保护的本发明的范围内进行各种修饰是可能的。因此，应当理解到，尽管通过优选的实施方案和可选特征具体描述了本发明，但是本领域技术人员可以采取其中所体现的发明的修改以及变型，并且这类修改、和变型视为落入本发明的范围内。
本文已经广泛且上位地描述了本发明。每一落入上位公开的狭窄类别和下位分类也形成了本发明的一部分。这包括具有从上位概念中除去任何主题的负限制或附带条件的本发明的上位描述，不管本文是否具体叙述了删除的材料。
其他实施方案在下述权利要求和非限制性实例的范围内。此外，如果本发明的特征和方面用马库什群组进行了描述，则本领域技术人员应当认识到，本发明还因此可以用马库什群组的任何单个成员或成员亚组来描述。
实施例部分
实施例1
研究群体
本研究获得机构审查委员会的批准。从新加坡总医院病理科数据库中选出了48个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的纤维腺瘤(FA)和叶状肿瘤(PT)样品(表1)。重新获得并检查苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片。对核心活检样品的诊断在相应的切除中得到了证实。
表1来自38例患者的训练组(training cohort)的临床特征
a 5个成对的核心活检和外科切除物；b 4个成对的核心活检和外科切除物；c 1个成对的核心活检和外科切除物
实施例2
基因表达谱分析
样品制备和RNA提取
鉴别并标记代表性肿瘤区域。从相同FFPE肿瘤块的10μm切片中获得3-7个切片。换两次二甲苯，每次2分钟，然后换三次无水乙醇，每次1分钟，从而使切片脱蜡。立即进行宏观解剖以重新获得肿瘤区域。使用RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen，德国)，根据制造商的实验方案并作稍微修改，从宏观解剖组织中提取RNA。简而言之，在从组织中除去所有乙醇后，加入缓冲液PKD和蛋白酶K。将组织混合物在56℃孵育过夜，而不是如实验方案中所述的15分钟，然后在80℃下孵育15分钟，随后在冰上孵育3分钟。加入DNase I和DNase Booster Buffer，室温孵育15分钟，然后加入缓冲液RBC调节结合条件。加入无水乙醇，然后将全部裂解物通过滤筒，并用缓冲液RPE按照制造商的说明书洗涤。最后，将RNA在30μl不含核酸酶的水中洗脱，并立即储存在-80℃。
提取的RNA的质量评估
利用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific,USA)，对提取的RNA进行定量。利用100ng通过如下方法进行质量评估：利用Green RNA-to-CTTM1-Step试剂盒(Life Technologies,USA)，在CFX96TM实时PCR仪(Bio-Rad Laboratories,USA)上，实时扩增RPL13A基因(正向引物5’-CACTTGGGGACAGCATGAG-3'(SEQ ID NO:1)，反向引物5’-TAACCCCTTGGTTGTGCAT-3’(SEQ ID NO:2))，阈值循环(Ct)低于29的样品通过质量评估可用于后续实验。
利用全基因组DASL HT检测进行表达谱分析
向新加坡科技研究局(A*Star)的生物城共享设施(Biopolis SharedFacilities)提交1μg RNA,进行表达谱分析。样品在使用全基因组DASL(Whole-GenomeDASL,WG-DASL)HT检测(Illumina,Inc.,USA)进行表达谱分析前，于生物分析仪上进行进一步质量评估。所述检测利用HumanHT-12v4BeadChip询问了29,377个特征。递送了利用预分析的分位数归一化基因表达数据。
归一化基因的选择
基于所有样品中变异系数(平均值/标准偏差)的最小值选择归一化基因。选择具有最小可变表达的5个基因。所述基因是RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45(图1)。
潜在的差异基因的选择
利用微阵列的显著性分析(SAM，R版本3.1.1)来选择在叶状肿瘤(PT)和纤维腺瘤(FA)之间差异表达的重要基因。然后，基于以下标准过滤基因：1)q值小于0.05；2)平均表达差异高于500；3)高于1.5的R倍(对于在PT中高度表达的基因)或小于0.67(对于在FA中高度表达的基因)。在应用标准后的基因列表如表2所示。从列表中选出43个基因，用于下游应用。
表2在纤维腺瘤和叶状肿瘤之间差异表达的重要基因。
*具有成功为定量聚合酶链式反应(qPCR)检测所设计的引物的基因
实施例3
通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测验证所选的基因
引物设计
利用Primer-BLAST(NCBI)设计了具有表3所列登录号的引物。用于设计的qPCR引物的标准如下：1)扩增子大小为50-80个碱基对(bp)；2)至少一个引物跨越外显子-外显子边界；3)至少7个碱基必须与连接点的5'和3'侧退火。表3显示了所设计的引物的列表。
表3为潜在差异基因和归一化基因所设计的引物
*指同一基因的不同变体
归一化基因
cDNA合成和qPCR检测
利用大容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedLife Technologies,USA)，在热循环仪上，根据制造商的实验方案，由1μg RNA合成cDNA。随后将cDNA稀释10倍，用于随后的qPCR检测。
在CFX96仪上进行qPCR检测。每一qPCR反应的组成为1X PowerGreen PCRMaster Mix(Life Technologies,USA)、0.5μM正向引物和0.5μM反向引物，以及1μl作为模板的稀释cDNA，总体积为10μl。非模板对照充当阴性对照。利用解链曲线分析检查扩增子的特异性。
为了验证在WG-DASL阵列上观察到的表达，用6个代表性样品作为每一检测的潜在基因的初步操作试验(pilot run)。
数据分析
获得来自qPCR的用阈值循环(Ct)表示的表达数据。高于40的Ct视为低于检测的限度，并将其转变为40。德耳塔Ct(ΔCt)量化如下：
检测基因的ΔCt＝Ct-几何平均数(5个归一化基因的Ct)
将ΔCt数据转化为2-ΔCt，作为用于与DASL表达值进行比较的正线性比例。用皮尔森(Pearson)相关性检验，分析相关显著性。表4显示了初步操作试验的结果。具有良好相关性值(r≥0.6)的基因在其余40个样品进行检测。在WG-DASL表征后，2个样品没有用于qPCR检测的足够RNA，因此没有包括在本分析中。
表4.所选基因在WG-DASL上的表达值与所选基因qPCR结果的相关性
*被选择用于对40个样品进行全面运行(full-scale run)的基因
实施例4
基于46个样品的qPCR检测结果研发算法模型
利用随机森林(Random Forest)进行变量选择
用随机森林(RF)分类器算法(R版本)分析46个样品的所有23个基因的ΔCt值，以便给区分纤维腺瘤和叶状肿瘤的基因的重要性排等级。所生成的100RF树的结果显示于图2中。
利用逻辑回归研发算法模型
用前7个基因(TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2、APOD、PRAME)进行逻辑回归建模。利用glmulti包(R版本)，包括相互作用项，筛选所有可能的模型，以发现最佳模型。基于最低AIC(Akaike信息准则)值选择最佳模型。表5显示了所生成的最佳模型的系数。模型的AIC为14.2。
表5.在预测46个样品组的诊断中最佳模型的系数
实施例5
对独立组验证预测算法
利用230个核心活检样品(189个纤维腺瘤样品和41个叶状肿瘤样品)的独立组来评估算法的性能。提取RNA，并按照上文的实验方案合成cDNA。根据上文的实验方案获得ΔCt值。每个样品是纤维腺瘤还是叶状肿瘤的概率(p)按下述方式计算：
当p为0.5和0.5以上时，样品被预测为叶状肿瘤。否则，样本被预测为纤维腺瘤。将多基因检测的结果与相应外科切除的最终诊断进行比较。随后没有外科切除的病例至少两年不再发展病情，而基于初始核心活检所做的诊断被用来作为参照。五基因检测的总体准确度为92.6％(图3)，灵敏度为82.9％，特异性为94.7％。阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)为77.3％和96.2％。
实施例6
对乳腺纤维上皮病变分类的多基因检测实验方案
设备
1.实时PCR仪
2.Nanodrop分光光度计
3.加热块/水浴/混匀仪
4.切片机
材料
1.RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen,目录号：73504)
2.PowerGreen RNA-to-CTTM1-Step试剂盒(Applied目录号：4389986)
3.二甲苯
4.无水乙醇
消耗品
1.1.5ml和2.0ml微量离心管(microtube)
2.载玻片
3.无菌手术刀
实验方案
1.由病理学家鉴别肿瘤区域。将5个10μm的组织切片分别引至5个载玻片上。
2.以二甲苯2次交换和无水乙醇3次交换，使组织脱蜡。用无菌手术刀刮肿瘤区域，并将组织转移到含有500μl无水乙醇的1.5ml微量离心管中。利用Qiagen RNeasy FFPE试剂盒提取RNA。
3.用Nanodrop分光光度计量化RNA。
4.按下文表6(表6由PowerGreen RNA-to-CTTM1-Step试剂盒实验方案修改而来)为每一孔制备10μl反应。对于非模板对照(NTC)，应当用无核糖核酸酶的水替换RNA模板。表8显示了引物序列。
5.按如下表7(表7由PowerGreen RNA-to-CTTM1-Step试剂盒实验方案修改而来)设置实时PCR仪。
6.检查解链曲线温度(参考表8)，确保扩增期望的产物。读取每一孔ABCA8、APOD、CCL19、FN1以及FRAME的Ct.。按如下量化每一孔：
每个基因的ΔCt＝Ct–几何平均数(RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA45以及SNORA61的Ct)
7.按如下进行计算，以得出概率评分。
8.如果p为0.5和高于0.5，则检验的结果是叶状肿瘤。如果p小于0.5，则检验的结果是纤维腺瘤。
表6.PCR反应成分
| 成分 | 体积(μl) |
| Power Sybr Green RT-PCR混合物(2x) | 5 |
| 正向和反向引物*(200nM)final) | 2 |
| RT酶混合物(125x) | 0.08 |
| 无核糖核酸酶的水 | 可变 |
| RNA模板(100ng) | 可变 |
表7.实时PCR的热循环条件
表8.引物序列和解链曲线温度
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 多基因检测
<130> 9869SG3699
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
cacttgggga cagcatgag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
taaccccttg gttgtgcat 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cctggcggac aggaaagtat t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gaagagcccg cgcactttag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
tcgcattaag atggtggctg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccacgtggtc atctgtgtga 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gttcgcatta agatggtggc tg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ctgcatccag gccaactact c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
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<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
aacgagaagc acctgttcca a 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gctttattct catcaacggc ca 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ggcccagcta aggaaactca t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ctcctggaag ctgatttcgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
acctcagcca agatgaagcg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
cctctgcacg gtcataggtt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
atggagttct tcgtgtggca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cttgtggaag gtgcggtaca 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ctctttgacc tcaccccttg g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
ttccaggaac attgcatggc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cttgccggga acctcctatg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
aattcagacc ctcgcagcaa 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ggtggtggac ctgtataatg ga 22
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 24
gtctcgacca ggcactcct 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
cttcaccagg tatcctgatg tgc 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
catacaaggc agacggtccc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
cgcactggag aagctcaact a 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
gggtttttga tgcgccatgt 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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ggatcacgag tgaccgcctt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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tcgtcattca cgatcctccc 20
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<223> 引物
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tcgcagcttc gagatcagtg 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gacgcttgtg gaatgtgtcg 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
tcatctgtgt gaaatatgag ttggc 25
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
ggctctacgt agcgtcttgg 20
<210> 35
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 35
ctgccacggc cactatgta 19
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 36
ccagccactt taagtctccg t 21
<210> 37
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 37
acctctaagg atccgaggca 20
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<220>
<223> 引物
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accacgtaca cgttggactc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ttccaggatt ccaagcaggt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
gcaaatcttg ccccgataca c 21
<210> 41
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 41
cttcctttcc aggggatgtg g 21
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ccctcttcgg tagacgcac 19
<210> 43
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
atctcaggtt agaaaacgaa aagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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<220>
<223> 引物
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<220>
<223> 引物
<400> 46
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
gctttcagtt tcttagccct gtg 23
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 49
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<223> 引物
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<223> 引物
<400> 51
tgcagttaga gaacatggag actt 24
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 52
aggcatgggc caaaacattt c 21
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<220>
<223> 引物
<400> 53
ttgcagctta caggaaactc ttg 23
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 54
ctggtgaaac tgagtcgggt 20
<210> 55
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 55
ctggagcgag gcaatagcg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
gtgggaggga caccttgaac 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
atggggactg gaaatgacac c 21
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
atcctcagat aaccccaaaa gagt 24
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
tccagagaca acttcgcgg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 60
ccacgcacgt ctgagagtaa ta 22
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 61
cctgacagag atagagcacc tg 22
<210> 62
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 62
ccctgtagga cttgcagacg 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ttcatcttag cagtgtccag gc 22
<210> 64
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 64
gttcacattg cgagtcaggg 20
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
cctcttctcc cgcaagactt tta 23
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
ctgtaatggg acgagagccc 20
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
tcggcagtgc ccatctacg 19
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
acaaacacgg agccaacaat g 21
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
taccaagtgc acatctctca cc 22
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
aggccctaaa aagtccacac a 21
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
cctgcctgcg aagcattgtc 20
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
tcgaaaagtg ccagttcgtc c 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gcccccttca gagatgtacg 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
acgtattggg ttcggtgcat 20
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
tgttccacat gtacgactcg g 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
gctcctcgac cacatttcga t 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
agcagcaagt ttcggacagt 20
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
cgaaacgggc gcttcgta 18
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
attgcagcat tgtcaggatc tgg 23
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
gatcgcatgt cgaaattgct ca 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
aggagtgtgg caaagtcttc tt 22
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
ctcctgctgc ctgtgagttt 20
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
aagcagacta tgctgtctca ct 22
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
atcccgttgc ctttgttgac 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
ggcaaaaggc tacagcagga 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
tcagggaagg cagaaatccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
tacgacgact acccggagaa 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
ggacgtccct ggagttcatc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
cagagagtgc cacgtgcata 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
tacgcttctt ggcggacttt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
agaggtgtac cggcatttcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
gtagggtttg gtgtggctgt 20
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
accggctcaa caaggttatc a 21
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
ctgggcaatg acgtcttcaa 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
tcctgatccc tttcccatcg 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
tcctcctttt acgaccacca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
cttgtcctgg tgtgctagag t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
cccccaccag tgaatcaaga 20
Claims (22)
1.一种确定体外生物样品中的乳腺纤维上皮性肿瘤的方法，包括：
获得所述样品中的一个或多个基因的表达谱，所述一个或多个基因选自由以下组成的组：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；
获得用作对照的一个或多个归一化基因的表达谱；
基于所述一个或多个基因的表达谱和所述一个或多个归一化基因的表达谱，确定所述一个或多个基因相对于所述对照的差异活性；
使所述一个或多个基因相对于所述对照的差异活性相关联，以获得p-评分；以及
基于所述p-评分，确定所述纤维上皮性肿瘤的类型，其中p-评分小于0.5表示纤维腺瘤，p-评分为0.5以及p-评分大于0.5表示叶状肿瘤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个基因选自由PRAME、TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2以及APOD组成的组。
3.如权利要求2所述的方法，其中2个、3个、4个或5个或更多个基因选自由PRAME、TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2以及APOD组成的组。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个基因由PRAME、FN1、CCL19、ABCA8以及APOD组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个归一化基因选自由RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45组成的组。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一个或多个归一化基因由RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中相关联步骤包括计算所述一个或多个基因的ΔCt(Δ阈值循环)值。
8.如权利要求7所述的方法，其中利用所述ΔCt值在预测算法中计算所述p-评分。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述预测算法是：
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10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自由器官、组织、部分和细胞组成的组。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述生物样品是恶性肿瘤样品。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述生物样品是良性肿瘤样品。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述肿瘤样品是乳腺样品。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，还包括从所述样品中提取RNA，用于获得所述一个或多个基因的表达谱和所述一个或多个归一化基因的表达谱。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述一个或多个基因的表达谱和所述一个或多个归一化基因的表达谱从同一生物样品获得。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述一个或多个基因的表达谱和所述一个或多个归一化基因的表达谱通过定量PCR方法获得。
17.一种用于管理患有乳腺纤维上皮性肿瘤的患者的治疗的方法，包括：
获得从所述患者获得的生物样品中的一个或多个基因的表达谱，所述一个或多个基因选自由以下组成的组：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1；
获得用作对照的一个或多个归一化基因的表达谱；
基于所述一个或多个基因的表达谱和所述一个或多个归一化基因的表达谱，确定所述一个或多个基因相对于所述对照的差异活性；
使所述一个或多个基因相对于所述对照的差异活性相关联，以获得p-评分；
基于所述p-评分，确定所述纤维上皮性肿瘤的类型，其中p-评分小于0.5表示纤维腺瘤，而p-评分为0.5以及p-评分高于0.5表示叶状肿瘤；以及
基于所述纤维上皮性肿瘤的类型和p-评分，选择所述患者的治疗。
18.一种用于权利要求1-17中任一项所述方法中的试剂盒,包含用于扩增一个或多个基因的引物对，所述一个或多个基因选自由以下组成的组：PRAME、ADH1B、CTHRC1、NPTX2、NEFL、ABCA8、DAPL1、TP63_v2、COL17A1、GCNT2、CCL19、MMP3、FN1、TRERF1、TRIM29、TESC、KIF20A、UHRF1、HEPACAM2、APOD、SERHL2、KIF15、HOXD13、GAGE2B、CALML5、C2orf40、ADH1C、CYP1B1、SPAG11B、GRB7、UBE2C、SYNGAP1、TP63_v1、LAMB1、OR5P3、SPC25、SHISA2、SCARA5、LHX2、RORC、DPYSL4、CH25H以及CHST1。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述一个或多个基因选自由PRAME、TRIM29、FN1、CCL19、ABCA8、NPTX2以及APOD组成的组。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述一个或多个基因由PRAME、FN1、CCL19、ABCA8以及APOD组成。
21.如权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，还包含用于一个或多个归一化基因的引物对，所述一个或多个归一化基因选自由RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45组成的组。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述一个或多个归一化基因由RMRP、RPL18、RPLP2、SNORA61以及SNORA45组成。
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