CN108026027A - 经取代的丙二酰胺化合物及其作为抗菌药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明揭露一系列具有化学结构(I)的丙二酰胺衍生物、其合成方法、及评估其对细菌细胞、细菌感染的线虫和小鼠的生物活性

Description

经取代的丙二酰胺化合物及其作为抗菌药物的用途
技术领域
本发明是关于丙二酰胺衍生物及其作为抗菌药物的用途。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus，S.aureus)，革兰氏阳性菌的一种，常见于人类的皮肤、皮腺与黏膜，可能造成的各种疾病，从轻微皮肤感染、蜂窝性组织炎与脓肿，甚至于危及生命的菌血症(bacteraemia)、肺炎(pneumonia)、心内膜炎(endocarditis)和骨髓炎(osteomyelitis)。由于金黄色葡萄球菌的致病性强，在已开发国家经常是造成医院或小区感染的主要因素。根据美国统计，金黄色葡萄球菌感染造成的死亡人数高于艾滋病毒、病毒性肝炎、结核病与流行性感冒的死亡人数的总和。起初，乙内酰胺类抗生素(b-lactam antibiotics)能有效治疗金黄色葡萄球菌的感染；然而，1950年代发现的乙内酰胺类抗药性金黄色葡萄球菌株(包括MRSA)，快速地在世界各地许多医院产生大流行。除了乙内酰胺类抗生素，金黄色葡萄球菌逐渐对其他种类的抗生素产生抗药性，包含氨基糖苷类(aminoglycosides)、大环内酯类(macrolides)、林可酰胺类(lincosamides)、氯霉素(chloramphenicol)、磺胺类(sulphonamides)，链霉素(streptomycin)与四环霉素(tetracycline)。此外，过去几年的报导中指出某些金黄色葡萄球菌株对于第二线的抗生素如利奈唑胺(linezolid)、达托霉素(daptomycin)和万古霉素(vancomycin)也具有抗药性。金黄色葡萄球菌对多种抗生素的抗药性加深治疗的困难度，使得病人住院治疗时间加长，死亡率增加。因此，针对金黄色葡萄球菌，尤其是对多种抗生素具有抗药性的菌株研发新型的抗菌剂是刻不容缓的事。
主要由土壤微生物产生的物质鉴定而得到盘尼西林与链霉素的发现，开启了抗生素的黄金时期。然而，由于抗药性菌株的广泛流行以及从天然物中鉴定出新的抗生素逐渐减少，其他来源的新抗菌剂正在研究中。其中一种替代来源是通过开发一群称作“非抗生素”(non-antibiotics)的药物的抗菌活性。非抗生素通常是合成的药物，最初用来治疗非感染性的疾病，但后来发现其具有特定的抗菌活性。例如，他汀类药物(statins)，一种胆固醇合成抑制剂，其具有诱导吞噬细胞(phagocyte)的抗菌活性来抑制金黄色葡萄球菌的毒性。另一个例子是酚噻嗪类药物(phenothiazines)，一种抗精神病药物(antipsychoticagents)，也具有对抗各种细菌的活性。此外，近年来的临床试验显示其中一种酚噻嗪类药物：硫利达嗪(thioridazine)，与抗生素并用有协同作用，可以根除广泛抗药性结核菌(XDRMycobacterium tuberculosis)感染的病人身上的结核菌(TB)。因此，非抗生素药物提供新颖抗菌剂研发一个有效的来源。
新的丙二酰胺衍生物(malonamide derivatives)被发现可以抑制金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌(S.epidermidis)生长，经由我们的努力鉴定出对抗药性金黄色葡萄球菌有高对抗潜力(anti-MRSA potency)且对人体细胞不具有急性细胞毒性的新颖试剂。
发明概要
为了提供读者基本的理解，以下呈现本公开内容的简要概述。本概述不是本公开内容的广泛概述，并且其不界定本发明的重要/关键要素或描绘本发明的范围。其唯一目的是以简化的形式呈现本文公开的一些概念，作为后续呈现的更详细的描述的序言。
在一方面中，本发明涉及一种经取代的丙二酰胺，其具有一化学结构(I)：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
在另一方面中，本发明涉及一种医药组合物，包含：一有效量的一具有化学结构(I)的化合物：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
在另一方面中，本发明涉及一种抑制细菌细胞生长的方法，包含：将该细菌细胞与一有效量的一具有化学结构(I)的化合物接触：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基，或与一有效量的具有化学结构(IV)的化合物接触：
其中R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22及R23独立选自氢、卤素或三卤化甲基。
在另一方面中，本发明涉及一种合成本发明的经取代的丙二酰胺的方法，包含：(a)将一具有化学结构(II)的化合物与一第一取代胺R1-NH2反应，得到一具有化学结构(III)的化合物，
(b)将该具有化学结构(III)的化合物进一步与一第二取代胺R2-NH2反应以得到本发明的经取代的丙二酰胺，其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
附图说明
图1、SC78和SC5005的时间-杀菌动力学(time-kill kinetics)。金黄色葡萄球菌株NCTC 8325在CAMHB培养基中分别以氨比西林(ampicillin)(左上图；最小抑菌浓度(MIC)＝0.25mg/L)、氯霉素(chloramphenicol)(右上图；MIC＝4mg/L)、SC78(左下图；MIC＝0.25mg/L)和SC5005(右下图；MIC＝0.5mg/L)处理，浓度分别为0×MIC(控制组)(实心倒三角形)、2×MIC(实心圆形)、4×MIC(实心方形)和8×MIC(实心三角形)，处理时间为2、4、8和24小时，每个处理期间后细菌在培养基中的活菌数以CFU测定法计算，其结果以CFU/mL表示。每个点所表示的为平均值而误差线表示的为标准偏差(SD)(N＝3)；因为每个点的标准偏差非常小，故图中并未呈现出误差线。图中的水平虚线代表毒杀99％的细菌细胞。AMP：氨比西林；CHL：氯霉素；Ctl：控制组。
图2、SC5005保护秀丽隐杆线虫(C.elegans)免受金黄色葡萄球菌(S.aureus)的感染。SC78和SC5005对于MSSA或MRSA感染的线虫存活率的效果进行评估。以大肠杆菌(OP50)、MSSA(ATCC29213)或MRSA(ATCC33592)喂养glp-4(bn2)线虫，接着置于经SC78或SC5005个别的2倍、4倍、8倍MIC的浓度处理的S-培养基。每日观测线虫的存活率直到研究结束。以大肠杆菌(OP50)喂养且只经DMSO处理的组别当作控制组，以表示秀丽隐杆线虫的正常生命曲线(normal life-span)。
图3、SC5005腹腔内给药(intraperitoneal administration)改善MRSA感染的小鼠的存活率。(A)SC5005腹腔内给药对于MRSA感染的小鼠存活率的效果。C57BL/6雌性小鼠腹腔内接种5×104CFU的MRSA(ATCC 33592)，感染的小鼠分别接受1mg/kg(实心倒三角形)、3mg/kg(实心三角形)和10mg/kg(实心方形)的SC5005或载体(vehicle)(模拟组，实心圆形)的腹腔内注射，每天一次，连续三天。以Kaplan–Meier曲线呈现出仿真组与经SC5005处理组的生存率。*表示处理组与控制组(模拟组)之间的差异P<0.05。(B)载体或经SC5005处理的MRSA感染的小鼠个体体重变化。每条线代表每个小鼠个体，黑线表示存活至研究结束的小鼠；灰线表示研究过程中被安乐死的小鼠。
图4、金黄色葡萄球菌株NCTC 8325对SC78、SC5005和七种常见的抗生素的抗性。将金黄色葡萄球菌株NCTC 8325置于96孔盘的孔洞培养在含有剂量递增的测试试剂的CAMHB培养基中。在37度培养24小时后，将最低抑制浓度以下(sub-MIC)的孔洞的菌取出，以含有剂量递增的测试试剂的新鲜CAMHB培养基1:1000稀释再培养24小时。此实验分别重复30天及200天，以筛选出对(A)七种抗生素、(B)SC78或SC5005具有抗性的菌株。数据是以初始的最小抑菌浓度(MIC)的倍数变化表示。
图5、SC5005和SC5035对金黄色葡萄球菌的大分子生合成(macromoleculesbiosynthesis)的影响。金黄色葡萄球菌的大分子生合成是借由测量以SC5005(2mg/L)、SC5035(1mg/L)的4x MIC处理1小时的细菌细胞对3H-胸腺嘧啶(3H-thymidine)(DNA)、3H-尿嘧啶(uridine)(RNA)、3H-亮氨酸(leucine)(蛋白质)和3H-N-乙酰葡萄糖胺(3H-N-acetylglucosamine)(细胞壁)的摄入来测定。同时，氧氟沙星(ofloxacin)(1mg/L)、利福平(rifampicin)(1mg/L)、红霉素(erythromycin)(2mg/L)和万古霉素(vancomycin)(2mg/L)分别作为DNA、RNA、蛋白质和细胞壁生合成的抑制剂控制组(control inhibitors)。数据是三次独立实验的平均值。误差线(error bars)表示标准偏差(SD)。
图6、以SC5005、SC5035和抗生素处理的金黄色葡萄球菌的细胞内ATP流失(intracellular ATP leakage)。将金黄色葡萄球菌株NCTC 8325以SC5005、SC5035和抗生素在抗金黄色葡萄球菌4×MIC下处理15分钟，然后用ATPlite单步骤试剂盒(ATPlite one-step kit)测量细胞内ATP含量。以ATP含量百分比为数据呈现方式，未处理药物的细菌细胞(untreated bacteria cells)ATP含量当作100％。柱状图表示平均值，误差线表示标准偏差(n＝3)。***：P值<0.001。
图7、SC5005、SC5035和五个常用的抗生素处理后金黄色葡萄球菌的膜完整性(membrane integrity)。金黄色葡萄球菌株NCTC8325以10％的Triton X-100或抗金黄色葡萄球菌4×MIC的测试试剂处理15分钟，随后用LIVE/DEAD Baclight试剂盒进行染色体染色。SYTO9(一种绿色荧光染料)对所有细菌细胞的染色体染色，无论膜的完整性。相反地，碘化丙啶(propidium iodide，PI)(一种红色荧光染料)只会对膜受损的细胞膜染色。因此，有完整膜(intact membrane)的细菌细胞只会染上SYTO9，而膜穿孔(perforated membrane)的细菌细胞将染上两个荧光染料，在合并图像中显示为黄色。
图8、SC5005处理后的金黄色葡萄球菌的穿透式电子显微镜图像(Transmissionelectron microscopy image)。金黄色葡萄球菌株NCTC8325用(A)模拟组或(B)SC5005处理15分钟，随后以戊二醛(glutaraldehyde)(2.5％)固定，并以四氧化锇(osimiumtetraoxide)(1％)染色。以穿透式电子显微镜在100,000x放大倍率下观察膜完整性。外圈黑色环标有CW的代表细胞壁；内圈黑色环标有CM的代表细胞膜。箭头标示金黄色葡萄球菌的细胞膜中形成的孔洞。
图9、SC5005和SC5035对人类红血球细胞的溶血活性(hemolytic activities)。人类红血球细胞以SC5005(A)和SC5035(B)处理1小时，随后以微量盘式分析仪测量红血球(RBC)释放的血红蛋白(hemoglobin)在波长540nm的吸收值。以1％Triton X-100处理的细胞作为阳性对照(P.C.：100％溶血)，并以生理食盐水(normal saline)处理的细胞作为阴性对照(N.C.)。柱状图代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)。
图10、SC5005和SC5035处理后人类细胞的膜完整性。人类细胞株HT-29用SC5005和SC5035处理1小时，随后以LDH释放测定法对膜完整性进行评估。自HT-29细胞释放到培养基的LDH通过CytoTox96非放射性细胞毒性测定来评估。以1％Triton X-100处理的细胞作为阳性对照(positive control)(100％释放)。柱状图表示平均值，及误差线代表标准偏差(n＝3)。
发明详细说明
在以下的详细描述中，为了解释的目的，阐述了许多具体细节以便提供对所公开的实施例的透彻理解。然而，显而易见的是可以在没有这些具体细节的情况下实施一或多个实施例。在其他情况下，为了简化图式，示意性地表示习知的结构和装置。
使用的缩写名称如下所示，CDCl3：氘化氯仿；DMSO-d6：二甲基亚砜-d6；i-PrOH：异丙醇；EtOAc：乙酸乙酯；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；MeOH：甲醇；THF：四氢呋喃；EtOH：乙醇；DMSO：二甲基亚砜；DIPEA：二异丙基乙基胺；DCM：二氯甲烷。
本发明提供一种经取代的丙二酰胺，其具有一化学结构(I)：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
在一较佳实施例中，R1和R2独立选自 R3选自
在一较佳实施例中，R1、R2和R3为疏水性基团(hydrophobic group)。
本发明亦提供一种医药组合物，包含：一有效量的一具有化学结构(I)的化合物：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基；及一医药上可接受载体。
在一较佳实施例中，R1和R2独立选自 R3为
在另一较佳实施例中，其中该具有化学结构(I)的化合物为：
本发明也提供一种抑制细菌细胞生长的方法，包含：将该细菌细胞与一有效量的一具有化学结构(I)的化合物接触：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基，或与一有效量的具有化学结构(IV)的化合物接触：
其中R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22及R23独立选自氢、卤素或三卤化甲基。
在一较佳实施例中，R1和R2独立选自
R3选自
在另一较佳实施例中，该具有化学结构(I)的化合物为：
在另一较佳实施例中，该具有化学结构(IV)的化合物为：
在一较佳实施例中，该细菌细胞为人类致病菌(human pathogenic bacteria)的细胞。该用语“人类致病菌”意指对人类具有致病性的细菌。在另一较佳实施例中，该人类致病菌选自由金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、路邓葡萄球菌(S.lugdunesis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、万古霉素抗性肠球菌(VR-E.faecium)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、困难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonelia Typhimurium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所组成的群组。
在另一较佳实施例中，上述细菌为金黄色葡萄球菌菌株(Staphylococcus aureusstrains)ATCC 12598、ATCC 29213、NCTC 8325；二甲苯青霉素抗药性金黄色葡萄球菌株(methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)strains)ATCC 33952、ATCC49476、一临床分离出的携带SCCmec VT的MRSA菌株、一百株临床分离出的MRSA菌株、一vanA-介导的万古霉素抗药性金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株(SJC1200)以及一临床分离出的万古霉素菌中间性金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus(VISA))菌株、表皮葡萄球菌株ATCC 35984和ATCC 12228、溶血葡萄球菌株ATCC 29970、人葡萄球菌株ATCC 27844、中间葡萄球菌株ATCC 29663、腐生葡萄球菌株ATCC 15305、一临床分离的路邓葡萄球菌株、粪肠球菌株ATCC 19433、屎肠球菌株ATCC35667、ATCC 19434、蜡样芽孢杆菌株ATCC 11778、枯草芽孢杆菌株BCRC10255、白喉杆菌株ATCC 11913、李斯特单胞菌株ATCC 19113、猪红斑丹毒丝菌株ATCC 11913、酿脓链球菌株ATCC 19615、大肠杆菌菌株ATCC 25922、鼠伤寒沙门杆菌菌株ATCC 14028、鲍氏不动杆菌株BCRC 80276、一临床分离的路邓葡萄球菌及万古霉素抗性屎肠球菌(VR-E)。
本发明进一步提供一种合成本发明的经取代的丙二酰胺的方法，包含：(a)将一具有化学结构(II)的化合物与一第一取代胺R1-NH2反应，得到一具有化学结构(III)的化合物，
(b)将该具有化学结构(III)的化合物进一步与一第二取代胺R2-NH2反应以得到本发明的经取代的丙二酰胺，其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
在一较佳实施例中，R1和R2独立选自 R3选自
在又一较佳实施例中，本发明提供一种合成具有化学结构(I)的经取代的丙二酰胺的方法。该方法包括以下步骤：第一、将环丙烷-1,1-二羧酸(cyclopropane-1,1-dicarboxylic acid)与亚硫酰氯(thionyl chloride)反应生成环丙烷-1,1-二羰基二氯2-烯丙基丙二酰氯2-苯甲基丙二烯氯和2-(2-氯乙基)丙二酰氯第二、将环丙烷-1,1-二羰基二氯或2-(2-氯乙基)丙二酰氯与2当量的取代胺(substituted amines)反应以产生具有化学结构(I)的化合物，其中两个取代苯基胺(substituted phenyl amines)具有两个
的取代苯基团(substituted phenylgroup)。在又一方法中，环丙烷-1,1-二羰基二氯或2-(2-氯乙基)丙二酰氯的化合物与第一取代苯基胺反应以产生化学结构为 的化合物，其中第一取代苯基胺具有 的第二取代苯基团(secondsubstituted phenylgroup)。将产生的产物进一步与第二苯基胺反应，其中第二取代苯基胺具有 的第二取代苯基团。
具体实施方式
丙二酰胺衍生物的合成
合成方案I
在上述合成方案I中，R1和R2可以是相同或相异的取代苯基团。R1和R2可为
嘧啶衍生物(pyrimidine derivatives)的一般合成程序如下所述：将环丙烷-1,1-二羧酸(1.0mmol)和亚硫酰氯(4当量)的溶液加热16小时。生成的混合物以旋转蒸发仪(rotavapor pump)蒸馏。将中间产物溶于四氢呋喃(THF)并与取代苯胺(substituted-aniline)反应。待反应完全后，反应混合物水洗后用乙酸乙酯(EtOAc)萃取，有机层以硫酸镁(MgSO4)干燥。利用过滤法和溶剂蒸发将硫酸镁移除，粗产物(crude residue)利用乙酸乙酯/正己烷作为冲提液(33％至45％)以硅胶管柱层析法(硅胶管柱60，0.063–0.200mm或0.040–0.063mm，Merck；基本硅胶)纯化，得到化合物(产率：20-45％)如下。
实施例1：二取代SC5005衍生物的合成
上述化合物的光谱数据(spectral data)详列如下。
N,N'-双(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(5020)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.12(d,J＝2.8Hz,2H),7.78(dd,J＝8.4,2.8Hz,2H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),1.63(s,4H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ171.0,138.9,132.9,129.2(q,J＝31.1Hz),127.5,126.2,124.1(q,J＝270.7Hz),120.8(q,J＝5.6Hz),31.8,17.6ppm。C19H12Cl2F6N2O2(M-H)－的HRMS计算值为：483.0096。实测值为：483.0102。
N,N'-双(3-乙炔基苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(5021)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.75(s,2H),7.53(d,J＝8.0Hz,2H),7.30(t,J＝8.0Hz,2H),7.22(d,J＝8.0Hz,2H),3.48(s,2H),1.62(s,4H)ppm。C21H16N2O2(M-H)－的HRMS的计算值为:327.1128。实测值为：327.1131。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-二苯基丙二酰胺(5022)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.58(d,J＝8.0Hz,4H),7.32(t,J＝8.0Hz,4H),7.12(t,J＝7.2Hz,2H),3.75(t,J＝7.2Hz,1H),3.69(t,J＝6.4Hz,2H),2.48(q,J＝6.4Hz,2H)ppm。C17H17ClN2O2(M-H)－的HRMS计算值为：315.0895。实测值为：315.090。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3-(三氟甲基)苯基)丙二酰胺(5023)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.05(s,2H),7.80(d,J＝8.0Hz,2H),7.51(t,J＝8.0Hz,2H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),3.82(t,J＝7.2Hz,1H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H),2.51(q,J＝6.8Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.4,140.3,132.1(q,J＝32.0Hz),130.7,125.4(q,J＝269.9Hz),124.5,121.8(d,J＝3.6Hz),117.7(d,J＝3.9Hz),54.0,43.2,34.2ppm。C19H15ClF6N2O2(M-H)－的HRMS计算值为：451.0643。实测值为：451.0658。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(4-(三氟甲氧基)苯基)丙二酰胺(5024)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.68(d,J＝8.8Hz,4H),7.22(d,J＝8.8Hz,4H),3.79(t,J＝7.2Hz,1H),3.68(t,J＝6.4Hz,2H),2.48(q,J＝6.4Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.2,146.6,138.4,122.7,122.6,121.93(q,J＝253.6Hz),53.9,43.2,34.3ppm。C19H15ClF6N2O4(M-H)－的HRMS计算值为：483.0541。实测值为：483.0534。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3,5-二氯苯基)丙二酰胺(5025)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.65(s,4H),7.17(s,2H),3.76(t,J＝7.2Hz,1H),3.68(t,J＝6.4Hz,2H),2.46(q,J＝6.4Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.1,140.9,134.1,122.9,117.6,52.4,42.9,31.6ppm。C17H13Cl5N2O2(M-H)－的HRMS计算值为：450.9336。实测值为：450.9354。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3-乙炔基苯基)丙二酰胺(5026)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.75(s,2H),7.58(d,J＝7.6Hz,2H),7.30(t,J＝7.6Hz,2H),7.21(d,J＝7.6Hz,2H),3.76(t,J＝7.6Hz,1H),3.68(t,J＝6.8Hz,2H),3.48(s,2H),2.47(q,J＝6.8Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.2,139.5,130.0,129.0,124.6,124.2,121.8,84.0,78.8,53.9,43.2,34.2ppm。C21H17ClN2O2(M-H)－的HRMS计算值为：363.0895。实测值为：363.0892。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3-氯苯基)丙二酰胺(5027)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.77(s,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(t,J＝8.4Hz,2H),7.11(d,J＝8.4Hz,2H),3.76(t,J＝7.2Hz,1H),3.68(t,J＝6.8Hz,2H),2.47(q,J＝6.8Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.2,140.8,135.4,131.1,125.4,121.2,119.4,54.0,43.2,34.2ppm。C17H15Cl3N2O2(M-H)－的HRMS计算值为：383.0115。实测值为：383.0114。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3-硝苯基)丙二酰胺(5028)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.63(s,2H),8.02(t,J＝8.0Hz,4H),7.60(t,J＝8.0Hz,2H),3.82(t,J＝7.6Hz,2H),2.94(t,J＝7.6Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ166.9,149.8,140.3,130.9,127.7,120.4,116.6,72.0,42.4,40.2ppm。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3-羟基-4-甲苯基)丙二酰胺(5029)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.15(d,J＝2.0Hz,2H),7.01(d,J＝8.0Hz,2H),6.84(dd,J＝8.0,2.0Hz,2H),3.74(t,J＝7.6Hz,2H),2.87(t,J＝7.6Hz,2H),2.14(s,6H)ppm。
N1,N3-双(4-氯-3-羟苯基)-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5030)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.41(s,2H),7.21(d,J＝8.8Hz,2H),6.93(d,J＝8.8Hz,2H),3.72-3.65(m,3H),2.44(q,J＝6.8Hz,2H)ppm。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(3-羟苯基)丙二酰胺(5031)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.18(s,2H),7.11(t,J＝8.0Hz,2H),6.96(d,J＝8.0Hz,2H),6.55(d,J＝8.0Hz,2H),3.72-3.65(m,3H),2.45(q,J＝6.8Hz,2H)ppm。
N1,N3-双(3,5-双(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5032)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.30(s,4H),7.72(s,2H),3.82(t,J＝7.6Hz,2H),2.94(t,J＝7.6Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ167.1,141.1,133.3(q,J＝33.2Hz),124.6(q,J＝270.2Hz),121.7,118.8(q,J＝3.5Hz),71.8,42.3,40.1ppm。
N1,N3-双(五氟硫苯基)-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5033)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91-7.88(m,8H),3.77(t,J＝7.2Hz,2H),2.88(t,J＝7.2Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.0,148.1(q,J＝16.1Hz),141.4,126.6,120.5,71.1,40.3ppm。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-双(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙二酰胺(5034)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.26(s,2H),8.09-8.04(m,4H),3.90(t,J＝6.8Hz,1H),3.73(t,J＝6.4Hz,2H),2.53(q,J＝6.4Hz,2H)ppm。
N1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)-N3-(3,5-二氯苯基)丙二酰胺(5035)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.13(s,1H),7.83(d,J＝8.8Hz,1H),7.65(s,2H),7.55(d,J＝8.8Hz,1H),7.17(s,1H),3.78(t,J＝7.6Hz,1H),3.69(t,J＝6.4Hz,2H),2.48(q,J＝6.4Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.3,169.2,141.7,138.8,136.1,133.0,129.3(q,J＝31.3Hz),127.5,125.5,124.9,124.1(q,J＝270.4Hz),120.0(q,J＝5.5Hz),119.3,54.1,43.2,34.0ppm。
N1-(3,5-双(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)-N3-(3,5-二氯苯基)丙二酰胺(5036)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.25(s,2H),7.67(s,1H),7.65(s,2H),7.16(s,1H),3.82(t,J＝6.8Hz,1H),3.70(t,J＝6.4Hz,2H),2.50(q,J＝6.4Hz,2H)ppm。
2-(2-氯乙基)-N1-(3,5-二氯苯基)-N3-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙二酰胺(5041)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.24(s,1H),8.04(q,J＝8.8Hz,2H),7.63(s,2H),7.14(s,1H),3.85(t,J＝6.8Hz,1H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H),2.49(q,J＝6.8Hz,2H)ppm。
2-烯丙基-N1,N3-双(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙二酰胺(5037)
1H NMR(400MHz,CDCl3-d1)δ9.08(s,2H),7.93(s,2H),7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),5.81-5.73(m,1H),5.19(d,J＝16.8Hz,1H),5.12(d,J＝9.6Hz,1H),3.39(t,J＝7.6Hz,1H),2.79(t,J＝7.6Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.9,138.8,135.4,133.0,129.3(q,J＝31.1Hz),127.4,125.5,124.1(q,J＝270.7Hz),120.0(q,J＝5.4Hz),118.3,56.4,35.9ppm。
2-烯丙基-N1,N3-双(3-乙炔基苯基)丙二酰胺(5038)
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.74(s,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,2H),7.28(t,J＝7.6Hz,2H),7.20(d,J＝7.6Hz,2H),5.93-5.83(m,1H),5.18(d,J＝17.2Hz,1H),5.08(d,J＝10.4Hz,1H),3.54(t,J＝7.2Hz,1H),3.47(s,2H),2.77(t,J＝7.2Hz,2H)ppm。13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ169.9,139.5,135.5,130.0,129.0,124.6,124.2,121.8,118.2,84.0,78.8,56.2,36.3ppm。
2-烯丙基-N1,N3-双(3-乙苯基)丙二酰胺(5039)
1H NMR(400MHz,CDCl3-d1)δ8.83(s,2H),7.37(d,J＝7.6Hz,2H),7.36(s,2H),7.21(t,J＝7.6Hz,2H),6.96(d,J＝7.6Hz,2H),5.87-5.79(m,1H),5.18(d,J＝16.8Hz,1H),5.08(d,J＝10.4Hz,1H),3.39(t,J＝7.2Hz,1H),2.79(t,J＝7.2Hz,2H),2.61(q,J＝7.6Hz,4H),1.20(t,J＝7.6Hz,6H)ppm。
2-烯丙基-N1,N3-双(3,5-二氯苯基)丙二酰胺(5040)
1H NMR(400MHz,CDCl3-d1)δ8.86(s,2H),7.50(d,J＝1.6Hz,4H),7.13(t,J＝1.6Hz,2H),5.81-5.73(m,1H),5.20(d,J＝17.2Hz,1H),5.14(d,J＝10.4Hz,1H),3.35(t,J＝7.2Hz,1H),2.77(t,J＝7.2Hz,2H)ppm。
2-(2-氯乙基)-N1-(3,5-二氯苯基)-N3-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙二酰胺(5041)
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.24(s,1H),8.04(dd,14.2Hz,8.8Hz,2H),7.63(s,2H),7.14(s,1H),3.85(t,6.8Hz,1H),3.70(t,6.4Hz,2H),2.49(q,6.8Hz,2H)ppm。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-二丙基丙二酰胺(5046)
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.89(brs,2H),3.57(t,J＝8.8Hz,2H),3.30(t,J＝10Hz,1H),3.26-3.20(m,4H),2.32(q,J＝8.8Hz,2H),1.61-1.49(m,4H),0.93(t,J＝9.6Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-d1):δ170.1,52.3,42.6,41.6,35.1,22.8,11.5ppm。
N1,N3-二丁基-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5047)
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.92(brs,2H),3.54(t,J＝8.4Hz,2H),3.30-3.21(m,5H),2.29(q,J＝8.4Hz,2H),1.51-1.44(m,4H),1.39-1.27(m,4H),0.91(t,J＝9.6Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-d1):δ170.1,52.2,42.6,39.6,35.1,31.6,20.2,13.9ppm。
2-(2-氯乙基)-N1,N3-二环己基丙二酰胺(5048)
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.61(d,J＝10.4Hz,2H),3.79-3.67(m,2H),3.55(t,J＝8.4Hz,2H),3.18(t,J＝10.4Hz,1H),2.28(q,J＝8.4Hz,2H),1.89-1.84(m,4H),1.72-1.56(m,9H),1.42-1.29(m,4H),1.24-1.10(m,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-d1):δ169.2,52.4,48.6,42.7,35.1,32.9,25.7,24.9ppm。
N1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)-N3-丙基丙二酰胺(5049)
1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.41(s,1H),8.17(d,J＝3.2Hz,1H),7.93(t,J＝7.2Hz,1H),7.82(dd,J＝12,3.2Hz,1H),7.65(d,J＝12Hz,1H),3.60(t,J＝9.2Hz,2H),3.50(t,J＝9.6Hz,1H),3.11-2.94(m,2H),2.24(q,J＝9.2Hz,2H),1.46-1.34(m,2H),0.80(t,J＝9.6Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ168.5,168.0,139.0,132.8,128.8,127.4(q,J＝41Hz),125.2,124.8,121.6,118.7,43.8,41.3,32.4,22.8,11.9ppm。
N1-烯丙基-N3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5050)
1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.49(s,1H),8.18(d,J＝3.2Hz,1H),8.14(t,J＝8Hz,1H),7.83(dd,J＝12,3.2Hz,1H),7.65(d,J＝12Hz,1H),5.84-5.71(m,1H),5.13-4.99(m,2H),3.74-3.68(m,2H),3.63-3.55(m,3H),2.26(q,J＝9.6Hz,2H)ppm。
N1,N3-二烯丙基-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5051)
1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.00(t,J＝7.2Hz,2H),5.83-5.71(m,2H),5.13-5.01(m,4H),3.72-3.67(m,4H),3.52(t,J＝8.8Hz,2H),3.36(t,J＝9.6Hz,1H),2.13(q,J＝8.8Hz,2H)：13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ168.7,135.7,115.7,50.9,43.9,41.7,32.7ppm。
N1-丁基-N3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)丙二酰胺(5052)
1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.40(s,1H),8.16(d,J＝3.6Hz,1H),7.91(t,J＝7.6Hz,1H),7.82(dd,J＝11.6,3.6Hz,1H),7.66(d,J＝11.6Hz,1H),3.59(t,J＝9.2Hz,2H),3.49(t,J＝9.6Hz,1H),3.10-3.02(m,2H),2.23(q,J＝9.2Hz,2H),1.39-1.32(m,2H),1.26-1.19(m,2H),0.81(t,J＝9.6Hz,3H)ppm。
N1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-2-(2-氯乙基)-N3-环己基丙二酰胺(5053)
1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.37(s,1H),8.18(d,J＝3.2Hz,1H),7.85-7.81(m,2H),7.67(d,J＝11.6Hz,1H),3.60(t,J＝9.2Hz,2H),3.49(t,J＝9.2Hz,2H),2.24(q,J＝9.2Hz,2H),1.76-1.66(m,4H),1.53(brs,1H),1.28-1.09(m,5H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ167.8,166.4,138.3,132.2,126.7(q,J＝40.3Hz),124.5,124.1,120.9,117.9(q,J＝7.3Hz),51.4,47.9,43.2,32.2,32.0,31.7,25.2,24.4ppm。
SC78的结构(Structure of SC78)
医药组合物及其医药用途
在一方面中，本发明涉及一种医药组合物。此医药组合物其包含如下所示一有效量的具有化学结构(I)的化合物及一医药上可接受载体。
在另一方面中，本发明涉及到的细菌细胞杀死的方法。该方法包含将该细菌细胞与一有效量的具有上述化学结构(I)的化合物的接触。
在另一方面中，本发明涉及一种治疗的细菌的方法。该方法包含将一有效量的具有化学结构(I)的化合物施予一有需要的个体。上述的细菌包含金黄色葡萄球菌株(Staphylococcus aureus strains)ATCC 12598、ATCC 29213、NCTC8325、二甲苯青霉素抗药性金黄色葡萄球菌菌株(methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)strains)ATCC 33952、ATCC 49476、一临床分离出的携带SCCmec VT的MRSA菌株、一百株临床分离出的MRSA菌株、一vanA-介导的万古霉素抗药性金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株(SJC1200)以及一临床分离出的万古霉素中间性金黄色葡萄球菌菌株(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus(VISA)strain)、表皮葡萄球菌株ATCC 35984和ATCC12228、溶血葡萄球菌株ATCC 29970、人葡萄球菌株ATCC 27844、中间葡萄球菌株ATCC29663、腐生葡萄球菌株ATCC 15305、一临床分离的路邓葡萄球菌株、粪肠球菌株ATCC19433、屎肠球菌株ATCC 35667、ATCC 19434、蜡样芽孢杆菌株ATCC 11778、枯草芽孢杆菌株BCRC 10255、白喉杆菌菌株ATCC11913、李斯特单胞菌株ATCC 19113、猪红斑丹毒丝菌株ATCC 11913、酿脓链球菌株ATCC 19615、大肠杆菌菌株ATCC 25922、鼠伤寒沙门杆菌菌株ATCC14028、鲍氏不动杆菌株BCRC 80276、一个临床分离的路邓葡萄球菌及万古霉素抗性屎肠球菌(VR-E)。
有效的丙二酰胺衍生物的鉴别
为探索丙二酸酯(malonate)衍生物的抗菌活性，将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作为药物筛选(drug screening)的代表。筛选由73个丙二酰胺衍生物组成的数据库(library)对于金黄色葡萄球菌(NCTC8325)和表皮葡萄球菌(ATCC35984)的生长抑制活性。其中，化合物SC5005与其衍生物具有有效的抗金黄色葡萄球菌活性，对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的测试菌株其MICs≤1mg/L(表1)。这些新试剂对所测试的MRSA菌株也具有有效抑制活性，其MICs与二甲苯青霉素敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株相同(表1)。由于这些MRSA菌株已被报导对不同种类的抗生素具有抗药性，此发现显示，这些试剂的作用机制可能与新的抗菌目标有关。
表1、测试试剂对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和MRSA的抗菌活性。
除抗菌活性，对这些丙二酸酯(malonate)对人类癌细胞细胞株(human cancercell lines)的细胞毒性(cytotoxic effects)也进行评估。这些新的试剂，仅化合物SC5005对所有人类癌细胞株有较低的抗增殖效力(antiproliferative potency)，在15至20mg/mL的IC50范围内，使得选择性比率(selectivity ratios)高达40(表2)。
表2、测试试剂的抗葡萄球菌活性(MIC)与抗增殖活性(IC50)的比
a选择性比率(selectivity ratio)＝抗金黄色葡萄球菌的IC50/MIC
化合物SC78和SC5005针对不同葡萄球菌种和临床分离的MRSAs的抗菌图谱(antibacterial spectra)
SC78和SC50052对一个葡萄球菌属病原体(Staphylococcus pathogens)小组进行测试，小组中包含金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、腐生葡萄球菌和路邓葡萄球菌等菌株。如表3所示，除了中间葡萄球菌及溶血葡萄球菌呈现出较低程度的敏感性(susceptivility)之外，化合物SC78和SC50052对这些葡萄球菌属物种的抑制能力与金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的一致。
表3、化合物SC78和SC5005针对葡萄球菌属病原体、VISA、VRSA和临床分离的MRSAs的抗菌活性
a总共测试一百株从台大医院临床分离的MRSA。
b此数值代表对抗临床分离的MRSA的MIC90。
为了进一步研究SC78和SC5005对抗MRSAs的效力，将来自台大医院共一百株临床分离的MRSA菌株(已被鉴定其分别携带II、III、IV或VT型的SCCmec)对这两种化合物的敏感性(susceptivility)进行评估。如结果所示，SC78和SC5005对这些临床分离的MRSA菌株的MIC90(定义为抑制90％测试的细菌菌株的浓度)分别为0.25mg/L和0.5mg/L，此浓度与对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和MRSA等参考菌株的MIC值一致(表3)。
化合物SC78和SC5005对VISA和VRSA的抗菌活性
于1958年被引入后，万古霉素一直是MRSA感染治疗的最后一道防线。然而，在21世纪初，报导了万古霉素中间性金黄色葡萄球菌(VISA)和万古霉素抗药性金黄色葡萄球菌(VRSA)的出现。金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感度降低增加了治疗的难度，并突显了VISA和VRSA感染的新型治疗试剂的迫切需要。为了测试SC78和SC5005是否能够抑制VISA和VRSA的生长，将临床分离的VISA菌株和一株vanA-介导的VRSA菌株(SJC1200)对这两种化合物与万古霉素的敏感性进行测定。如表3中结果所示，VISA菌株显示对万古霉素敏感性中度降低，其MIC值比对万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌(VSSA)(包含MRSA(ATCC33592)、MRSA(ATCC49476)和MRSA(SCCmec VT))增加4倍。而VRSA菌株更呈现对万古霉素的高度抗性，其对万古霉素的敏感性降低超过五百。虽然这两种菌株对万古霉素有不同的抗性，但其对SC78和SC5005的敏感性与VSSA菌株一致，这说明这两个丙二酰胺衍生试剂的抗菌机制与万古霉素不同。以上发现强调这些丙二酰胺衍生物在对多种抗生素(包括万古霉素)具有抗药性的金黄色葡萄球菌菌株引起的感染具有治疗潜力。
SC78和SC5005对不同病原性的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和分支杆菌(Mycobacteria)的抗菌图谱
为了进一步研究这两种试剂是否能抑制金黄色葡萄球菌以外的革兰氏阳性菌，将SC78和SC5005对抗一组革兰氏阳性菌的活性进行评估，该组革兰氏阳性菌包括粪肠球菌(ATCC19433)、屎肠球菌(ATCC35667、ATCC19434)、临床分离的万古霉素抗性屎肠球菌(VR-E)、蜡样芽孢杆菌(ATCC11778)、枯草芽孢杆菌(BCRC10255)、白喉杆菌(ATCC11913)、李斯特单胞菌(ATCC19113)、猪红斑丹毒丝菌(ATCC19414)、酿脓链球菌(ATCC19615)、困难梭状芽孢杆菌(630&R20291)。结果如表4所示，SC78和SC5005可以抑制所有测试的革兰氏阳性菌，其MICs值与金黄色葡萄球菌相同。这些结果说明SC78和SC5005对革兰氏阳性菌具有广效的抗菌活性(broad-spectrum antibacterial activities)。此外，SC78和SC5005对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(H37Ra)也具有抑制效果，其MIC值分别为1mg/L和16mg/L，显示这两种试剂对于分枝杆菌属(Mycobacterium)物种也有功效。
表4、SC78和SC5005对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与分枝杆菌(Mycobacteria)的抗菌活性
除了革兰氏阳性菌，也研究SC78和SC5005对革兰氏阴性菌的抗菌活性。针对大肠杆菌(ATCC25922)、鼠伤寒沙门杆菌(ATCC14028)、鲍氏不动杆菌(BCRC80276)进行SC78和SC5005的MIC测定。如表4的结果，SC78和SC5005对革兰氏阴性细菌没有表现出抑制作用，其MIC超过64mg/L。因此，SC78和SC5005的抗菌活性对于革兰氏阳性菌和分枝杆菌具有专一性。
SC78和SC5005是对抗金黄色葡萄球菌的杀菌剂
如果抗菌试剂能够在施用的24小时内杀死超过99.9％的细菌接种物，此抗菌试剂被视为杀菌剂。否则，被认为只有抑菌作用(bacteriostatic)。针对SC78和SC5005的性质进行研究，将这两种化合物对金黄色葡萄球菌株NCTC8325处理24小时以上的时间杀菌动力学(time-kill kinetics)进行评估。过夜生长的细菌以5×105CFU/ml的浓度接种于CAMHB培养基，接着经个别化合物处理，浓度为各自MIC的2至8倍。如图2所示，SC5005在MIC的4和8倍的浓度下分别可以减少99.91％和99.95％的CFU。相对地，SC78仅于MIC的8倍浓度时降低超过99.9％的菌落(bacterial population)。根据以上的发现，化合物SC78和SC5005可被分类为杀菌剂。
SC5005杀死生物膜(biofilm)中的金黄色葡萄球菌
生物膜是由附着的微生物包覆在一个胞外聚合物基质中而组成。嵌在生物膜中的细菌受保护而免于抗生素介导的毒杀(antibiotic-mediated killing)以及免疫反应(immune response)。报告显示，生物膜的形成是导致皮肤、肺和体内留置医疗装置(indwelling medical devices)(例如导管)感染的一个重要因素。因此，将SC5005对生物膜中的MRSA的效果进行测定。结果显示，SC5005具有比万古霉素、利奈唑胺和达托霉素更优异的生物膜根除活性(biofilm-eradicating activity)，如每一试剂的最小生物膜根除浓度(MBEC)所示(16mg/L分别对比>1024、1024和1024mg/L)如表所示(表5)。
表5.测试试剂对生物膜中MRSA的抗菌活性
SC5005保护线虫免于金黄色葡萄球菌的感染
线虫(Caenorhabditis elegans)已被广泛作为人类感染疾病(包括由金黄色葡萄球菌造成的感染)的模式生物。为了研究SC78和SC5005是否能够抑制金黄色葡萄球菌对线虫的感染，以MSSA ATCC29213或MRSA ATCC33592感染线虫，随后在S培养基中以个别2至8倍MIC浓度的药物处理。控制组是以与药物处理组相同浓度的DMSO(最终浓度为0.1％)处理。结果如图3所示，接受SC78处理的MSSA-或MRSA-感染的线虫的存活并无观察到显著的差异。相对的，SC5005在2倍MIC浓度已经表现出较强的保护作用，经药物处理的线虫与经控制组处理的金黄色葡萄球菌感染的线虫相比存活明显增加(图3(B))。同时，这些试剂对线虫的毒性效果也进行了评估。经喂食大肠杆菌(OP50)的线虫是以在S-培养基中加入浓度递增(escalating doses)的SC78和SC5005处理，每天监控他们的存活。如图3结果所示，经喂食大肠杆菌OP50的线虫经SC78处理后，其存活率显著地降低，这说明SC78在测试的浓度下对线虫是有毒性的。相对地，经SC5005处理并没有影响线虫的存活与其生命周期(图3(B))。因此，这些结果显示，SC5005对线虫不具有急性的毒性，且其抗菌活性能抑制金黄色葡萄球菌对宿主的感染。
SC5005腹腔内给药改善经MRSA感染的C57BL/6小鼠的存活
为了进一步评估SC5005的对MRSA感染的治疗潜力，将近亲交配(inbred)的C57BL/6小鼠以腹膜内注射致死剂量(lethal dose)(5×104CFU)的MRSA(ATCC 33592)，在感染后1小时、24小时和48小时(每组n＝5)以腹腔内给药方式施予载体或SC5005(1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg)(各组N＝5)。经MRSA感染的小鼠快速产生严重感染的迹象，包括体重减轻超过20％、体温显著降低，昏睡(图4(B))。接受载体的小鼠存活时间不超过2天(图4(A))。相对地，接受10mg/kg SC5005组别的三只小鼠存活直到研究结束；只在感染后第1天表现出体重下降，但在2-5天后回到感染前的水平。另外，各组接受1mg/kg或3mg/kg SC5005的小鼠只有一只治疗后依然存活，说明SC5005的效果是剂量依赖性(dose-dependent)且其ED50(定义为存活率50％的有效剂量)接近10mg/kg。总之，这些结果提供了一个概念验证：SC5005在体内(in vivo)呈现出对金黄色葡萄球菌的抗性(anti-Staphylococcus activity)。
丙二酰胺衍生物的构效关系(structure activity relationship)
针对一组金黄色葡萄球菌菌株，包括MSSA 8325、MSSA 29213、MRSA33592及MRSASCCmecVT，进行丙二酰胺衍生物的生长抑制活性的筛选。每个衍生物的MIC是根据临床和实验室标准化研究所(CLSI)的指导方针订定。对于培养基微量稀释法(broth microdilutionmethod)，过夜生长在Luria Bertani(LB；Athena Enzyme Systems,Baltimore,MD)琼脂盘上的细菌以磷酸盐缓冲盐液(PBS)悬浮至600nm的O.D.值为1.0，相当于5×108CFU/ml，然后以阳离子调整Müller Hinton培养基(cation-adjusted Müller Hinton broth，CAMHB；Difco Laboratories,Detroit,MI)稀释成最终浓度为5×105CFU/ml。该细菌悬浮液以剂量递增的测试试剂和氯霉素处理，剂量范围从0.125至64mg/L，在96孔盘中做三重复测试，将96孔盘在37℃培养24小时。每种试剂的MIC定义为观察到细菌没有生长的最低浓度。
对于琼脂稀释法(agar dilution method)，CAMHB中的细菌悬浮液系以每点104CFU接种在含有剂量递增测试试剂的LB琼脂盘，剂量范围从0.125至8mg/L，37℃培养24小时，做三重复测试。每种试剂的MIC定义为观察到细菌没有菌落产生的最低浓度(表6)。
表6.测试试剂对金黄色葡萄球菌的生长抑制活性
金黄色葡萄球菌株NCTC8325对SC78和SC5005的抗药性
为研究金黄色葡萄球菌对SC78和SC5005的抗性，将细菌在抗生素的亚抑制浓度(sub-inhibitory concentration)下连续培养30天。如图4(A)所示，金黄色葡萄球菌在6天、17天和27天内发展出分别对利福平、红霉素和氨比西林超过64倍MIC变化的抗性。对于氧氟沙星和万古霉素也有8倍和4倍MIC变化的抗性。相对地，此段期间并未观察到对氯霉素(chloramphenicol)和四环霉素(tetracycline)的抗性。值得注意的是，即使连续200天暴露在SC78和SC5005的亚致死浓度(sub-lethal concentrations)下也没有观察到抗性的产生(图4)。根据上述结果，金黄色葡萄球菌无法对SC78和SC5005产生抗性。
SC5005和SC5035抑制金黄色葡萄球菌主要大分子生合成
为研究SC5005的作用模式，将一个抗菌活性/细胞毒性有较佳选择性的新衍生物SC5035加入测定中。首先，评估两个化合物对金黄色葡萄球菌NCTC8325的主要大分子(包括DNA、RNA、蛋白质和细胞壁)的生合成的影响。细菌细胞以[3H]胸腺嘧啶培养来评估DNA合成、以[3H]尿嘧啶来评估RNA合成、以[3H]亮胺酸来评估蛋白质合成以及以[3H]N-乙酰基-D-葡萄糖胺来评估细胞壁合成。氧氟沙星、利福平、红霉素和万古霉素分别作为DNA、RNA、蛋白质和细胞壁生合成的控制组抑制剂。生合成途径的抑制定义为细菌中的同位素信号的降低。如图5所示，经SC5005和SC5035处理后细菌的四个大分子生物合成途径的信号都较低，这说明SC5005和SC5035的目标为这些路径的上游。
SC5005和SC5035造成金黄色葡萄球菌的ATP流失(ATP leakage)
报告指出，膜活性抗菌剂(membrane-active antibacterial agent)会抑制细菌中的所有主要大分子的生合成。为研究SC5005和SC5035是否也作用于细菌的细胞膜，利用ATPlite单步骤试剂盒来侦测SC5005、SC5035和抗生素处理15分钟的金黄色葡萄球菌细胞内ATP水平的改变。如图6结果所示，SC5005和SC5035处理后，细菌细胞内的ATP水平显著下降，说明这两种化合物造成细菌的细胞膜损伤，并导致细胞内的成分流失。
SC5005和SC5035破坏金黄色葡萄球菌的膜完整性
为了进一步验证SC5005和SC5035的作用机制，使用两种荧光染剂评估药物处理后金黄色葡萄球菌膜的完整性。碘化丙啶(propidium iodide)染剂只会对膜穿孔的细胞染色，而SYTO9染剂可对所有细胞染色，无论膜是否完整。结果显示，只有当金黄色葡萄球菌经10％Triton X-100、SC5005和SC5035处理时，才会被碘化丙啶染色，表示这两种化合物可以破坏金黄色葡萄球菌的膜完整性(图7)。
SC5005造成金黄色葡萄球菌的膜形成孔洞(pore-formation)
研究SC5005如何改变金黄色葡萄球菌膜的通透性，将细菌细胞以SC5005处理15分钟，随后以戊二醛(2.5％)固定并以四氧化锇(1％)染色。以穿透式电子显微镜(TEM)在100,000倍放大倍率下观察细菌的细胞膜(图8)。外圈黑色环(outer clear black circle)是金黄色葡萄球菌细胞壁，内圈黑色环(inner clear black circle)是金黄色葡萄球菌细胞膜。控制处理组的金黄色葡萄球菌这两个环仍是完整的圈，细胞膜没有损坏。相对的，SC5005处理后大部分细菌细胞膜中可观察到孔洞。此数据指出，SC5005可以使金黄色葡萄球菌的膜形成孔洞。
SC5005和SC5035不会引发人类红血球细胞溶血
如上数据所示，SC5005和SC5035让细菌的细胞膜形成孔洞杀死细菌。为了解这两种化合物的成孔活性(pore-forming activity)是否对细菌的细胞膜有专一性，于是评估这两种化合物对人类红血球细胞的溶血活性(hemolytic activities)。结果如图9所示，经SC5005或SC5035处理的红血球，在浓度直到对抗金黄色葡萄球菌的128倍MIC都没有观察到显著的溶血情形。
SC5005和S5035不破坏人类细胞的膜完整性
为了进一步验证SC5005和SC5035对人类细胞膜的活性，以这两种化合物处理细胞，使用乳酸脱氢酶释放测定(LDH release assay)评估细胞的膜完整性。人类HT-29细胞株以SC5005和SC5035处理1小时，然后测定从细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)。结果显示，经SC5005和SC5035处理的细胞，在浓度直到对抗金黄色葡萄球菌的128倍MIC(图10)，其乳酸脱氢酶水平(LDH level)并无显著增加。由红血球细胞溶血测定(RBChemolysis)和乳酸脱氢酶释放测定(LDH release assay)的结果显示，SC5005和SC5035的成孔活性(pore-forming activity)对细菌细胞膜具有高度专一性。

Claims (13)

1.一种经取代的丙二酰胺，其具有一化学结构(I)：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
2.根据权利要求1所述的经取代的丙二酰胺，其中R1和R2独立选自 R3选自
3.一种医药组合物，包含：
一有效量的一具有化学结构(I)的化合物：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基；及一医药上可接受载体。
4.根据权利要求3所述的医药组合物，其中R1和R2独立选自 R3为
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有化学结构(I)的化合物为：
6.一种抑制细菌细胞生长的方法，包含：将所述细菌细胞与一有效量的一具有化学结构(I)的化合物接触：
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自氢、C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基，或
与一有效量的具有化学结构(IV)的化合物接触：
其中R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22及R23独立选自氢、卤素或三卤化甲基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中R1和R2独立选自 R3选自
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述具有化学结构(I)的化合物为：
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述具有化学结构(IV)的化合物为：
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌细胞为人类致病菌的细胞。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述人类致病菌选自由金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、路邓葡萄球菌(S.lugdunesis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、万古霉素抗性屎肠球菌(VR-E.faecium)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、困难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonelia Typhimurium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所组成的群组。
12.一种合成如权利要求1所述的经取代的丙二酰胺的方法，包含：
(a)将一具有化学结构(II)的化合物与一第一取代胺R1-NH2反应，得到一具有化学结构(III)的化合物，
(b)将所述具有化学结构(III)的化合物进一步与一第二取代胺R2-NH2反应以得到所述经取代的丙二酰胺，
其中R1为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R2为C2-6烷基、C2-6烯基或C3-7环烷基；
R3选自C3环烷基、C2-6烯基或C2-5卤烷基；
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12及R13独立选自C1-5烷基、C2-6烯基、卤素、三卤化甲基、硝基、羟基、三卤化甲氧基或五氟化硫基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中R1和R2独立选自 R3选自
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