TW202339708A - 抗微生物組合物、醫藥組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明所請係一種抗微生物組合物以及相關方法。藉由其組合物中醯胺化合物及脂肪酸的協同作用，不但能以更少用量的醯胺化合物達到針對抗藥性細菌的抗菌效果，更能夠有效並快速地根除微生物的持久性細胞及生物膜。

Description

抗微生物組合物、醫藥組合物及其用途
本發明係關於一種抗微生物組合物及相關方法，特別係關於一種抗微生物組合物、包含其之醫藥組合物以及其用途；然而本發明並不以此為限。
人類疾病的病原體五花八門，且對於全球公共衛生有著巨大的影響；其中最為常見的便為具致病性的細菌以及真菌。尤其，金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)係現階段已開發國家中最為常見的傳染性病原體之一；其能引發多種疾病，從皮膚感染到致命的肺炎及敗血症皆有所見。再者，金黃色葡萄球菌能夠形成耐抗生素的持久性細胞及生物膜，進而導致慢性和復發性感染；又，金黃色葡萄球菌已對多數抗生素發展出抗藥性，更進一步使其治療的難度及複雜度更為提升。
有鑑於此，先前技術中不乏各種針對多重抗藥性金黃色葡萄球菌的抗菌手段。舉例而言，本案發明人先前發現，原先作為抗癌藥物的酪氨酸激酶抑制劑-索拉非尼(Sorafenib)之衍生物藉由去極化和穿透細菌膜，對於複數菌株皆具有效的抗菌活性(中華民國發明專利證書號：TW I675817B)。另亦有研究顯示索拉非尼之相似物PK150在亞微莫耳濃度下能治療多種病原體菌株，並且具有口服生物利用性及體內藥效(Le, P et al. Nat. Chem. 12, 145–158 (2020))。
基於先前技術的內容，本案發明人在開發過程中進一步發現，特定的醯胺化合物與特定脂肪酸的共同使用下，得以產生協同的殺菌效果；搭配脂肪酸不但能令所述醯胺化合物在更少的用量下達到針對抗藥性菌株的治療效果，更能夠有效並快速地消滅微生物的持久性細胞及生物膜。
具體而言，本發明一方面提供一種抗微生物組合物，其包括：一醯胺化合物；以及一脂肪酸；其中，該脂肪酸係一具有16至22個碳原子之順式不飽和脂肪酸。
根據本發明之一實施例，該醯胺化合物係一具有化學結構(I-1)或(I-2)之化合物： (I-1)， (I-2)； 其中R 1及R 2分別為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 ，且R 1及R 2非同時為 或 ； R 3為氫、甲苯、 、 、 或 ； R 4為氫或氟。
根據本發明之一實施例，R 1為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ，而R 2為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 。
根據本發明之一實施例，該醯胺化合物係一具有化學結構(II)之化合物： (II)； 其中R 1為 、 或 ； R 2為 、 、 、 、 、 、 或 。
根據本發明之一實施例，該醯胺化合物係具有化學結構(III)至(VII)中任一者的化合物： (III)， (IV)， (V)， (VI)， (VII)。
根據本發明之一實施例，該脂肪酸係一具有16至22個碳原子之順式單不飽和脂肪酸或順式多不飽和脂肪酸。
根據本發明之一實施例，該脂肪酸係一棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
根據本發明之一實施例，該脂肪酸之含量大於該醯胺化合物之含量。
本發明另一方面提供一種醫藥組合物，其包含上述抗微生物組合物以及至少一醫藥上可接受之載體。
本發明又另一方面提供上述抗微生物組合物之用途，其用於製備用於抑制微生物細胞以及微生物生物膜生長的藥劑。
根據本發明之一實施例，該微生物細胞為人類致病菌的細胞。
根據本發明之一實施例，該人類致病菌係選自由金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌( S. haemolyticus)、人葡萄球菌( S. hominis)、中間葡萄球菌( S. intermedius)、腐生葡萄球菌( S. saprophyticus)、路鄧葡萄球菌( S. lugdunesis)、豬紅斑丹毒絲菌( Erysipelothrix rhusiopathiae)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、萬古黴素抗性屎腸球菌( VR-E. faecium)、蠟樣芽孢桿菌( Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、白喉桿菌( Corynebacterium diphtheriae)、李斯特單胞菌( Listeria monocytogenes)、釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、困難梭狀芽孢桿菌( Clostridium difficile)、大腸桿菌( Escherichia coli)、鼠傷寒沙門桿菌( Salmonelia Typhimurium)、鮑氏不動桿菌( Acinetobacter baumannii)、結核桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)及耐萬古黴素金黃色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)所組成的群組。
根據本發明之一實施例，該微生物生物膜為人類治病細菌或真菌的生物膜。
根據本發明之一實施例，該人類致病細菌或真菌係選自由溶血葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus)、克雷伯氏肺炎菌( Klebsiella pneumoniae)、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌( Escherichia coli)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、白色念珠菌 ( Candida albicans)及金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)所組成的群組。
據此，本發明所提供之抗微生物組合物以及相關方法藉由其中醯胺化合物及脂肪酸的協同作用，不但能以更少用量的醯胺化合物達到針對抗藥性細菌的抗菌效果，更能夠有效並快速地根除微生物的持久性細胞及生物膜。
術語
本說明書中所使用的通常在本發明的範圍內，且每個術語的具體上下文與其在相關領域的一般含義相同。在本說明書中說明本發明時所使用的具體術語，將會在下文或本說明書的其他地方說明，以幫助業界人士理解本發明的相關說明。在同一上下文中，相同術語具有相同的範圍和含義。此外，由於表達同一事物的方式不止一種；因此，本說明書中所討論的術語可以用替代術語和同義詞替換，而且在本說明書中是否指定或討論一個術語並沒有任何特殊含義。本說明書雖然提供一些術語的同義詞，但是使用一或多個同義詞並不表示排除其他同義詞的使用。
如本說明書中使用情況，除上下文另有明確說明外，「一」和「該」也可解釋為複數。此外，在本說明書及隨附專利申請範圍中，用以界定本發明的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或一範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，是本發明所屬領域中具有通常知識者的考量而定。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。再者，說明為便於閱讀可能附有標題和副標題，但這些標題並不影響本發明的範圍。
如本文所用，術語「組合物」意欲包括包含該等指定成份(若有表示指定量，且為指定量)的產物，以及指定量之從該等指定成份之組合直接或間接形成的任何產物。
如本文所用，術語「脂肪酸」係指由疏水性碳鏈及親水性羧基組成的兩性分子。碳鏈中沒有雙鍵的脂肪酸被稱為飽和脂肪酸，而帶有雙鍵的脂肪酸則係不飽和脂肪酸；依據雙鍵數量則可進一步區分為單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸。所述雙鍵可為順式或反式，其導致不同的物理性質。在自然界中，大多數的不飽和脂肪酸係為順式脂肪酸，而反式脂肪酸則大多係經由氫化產生。
如本文所用，術語「醯胺化合物」係指具有通式為R 1C(=O)NR 2R 3之化合物；其中R 1、R 2及R 3為取代基，其分別可係氫原子或有機基團。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係表示其包含一活性成分及一醫藥上可接受之載體；以本案而言，該活性成分係為本發明所提供之抗微生物組合物。詳言之，該醫藥組合物根據需求可包含醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。
如本文所用，術語「醫藥上可接受」係指其所指定的稀釋劑、賦形劑或載體必須與該調配物的其他成份相容，且對其接受者無害。
進一步而言，術語「醫藥上可接受之載體」在本技術領域已受認可且包括適於將本發明抗微生物組合物投予哺乳動物的醫藥上可接受之材料、組成物或賦形劑。 抗微生物組合物
本發明提供一種抗微生物組合物，其包括：一醯胺化合物；以及一脂肪酸；其中，該脂肪酸係一具有16至22個碳原子之順式不飽和脂肪酸。
根據本發明一些實施例，該醯胺化合物係一丙二醯胺衍生物；較佳地，其係一具有化學結構(I-1)或(I-2)之化合物： (I-1)， (I-2)；其中R 1及R 2分別為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 ，且R 1及R 2非同時為 或 ；R 3為氫、甲苯、 、 、 或 ；R 4為氫或氟。
較佳地，R 1為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ，而R 2為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 。
根據本發明一些實施例，該醯胺化合物係一含尿素(碳醯胺)化合物；較佳地，其係一二苯基脲之類似物。具體而言，該醯胺化合物係一具有化學結構(II)之化合物： (II)； 其中R 1為 、 或 ； R 2為 、 、 、 、 、 、 或 。
較佳地，該醯胺化合物係具有化學結構(III)至(VII)中任一者的化合物： (III)， (IV)， (V)， (VI)， (VII)。
根據本發明一些實施例，該脂肪酸係一具有16至22個碳原子之順式單不飽和脂肪酸或順式多不飽和脂肪酸。具體而言，該脂肪酸具有16、17、18、19、20、21或22個碳原子。較佳地，該脂肪酸係一棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
根據本發明一些較佳的實施例，該脂肪酸之含量大於該醯胺化合物之含量。 醫藥組合物及用途
醫藥組合物
本發明之醫藥組合物包含上述抗微生物組合物以及至少一醫藥上可接受之載體。根據需求，該醫藥組合物可包含醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。
該醫藥上可接受載體包括液態或固態填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊材料，其牽涉到將活性成分從一個器官或身體一部分攜帶或輸送至另一器官或身體的另一部分。各種載體必須是在可與調配物其他成份相容且不傷病患之意義上而「可接受」者。作為醫藥上可接受之載體的某些實例包括：糖類，諸如乳糖、葡萄糖與蔗糖；澱粉類，諸如玉米澱粉與馬鈴薯澱粉；纖維素與其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素與乙酸纖維素；粉末狀黃蓍樹膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂與栓劑蠟；油類，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油與大豆油；二醇類，諸如丙二醇；多元醇類，諸如甘油、山梨醇、甘露醇與聚乙二醇；酯類，諸如油酸乙酯與月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂與氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質水；等滲壓鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；以及其他用於藥學調配物中無毒性可相同物質。
濕潤劑、乳化劑與潤滑劑(諸如月桂基硫酸鈉與硬脂酸鎂)以及著色劑、脫模劑、塗覆劑、甜味劑、調味與加香劑、防腐劑與抗氧化劑亦可存在該醫藥組合物中。
醫藥上可接受之抗氧化劑實例包括：水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鈉等；油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基羥基甲氧苯(BHA)、二丁基經基甲苯(BHT)、卵磷脂、五倍子酸丙酯、α-生育酚等；以及金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本發明之醫藥組合物包括適於口服、鼻腔、局部、經皮、經頰、舌下、直腸、陰道及/或非經腸投藥者。該醫藥組合物可便利地以單位劑量形式存在，且可以藥學技術中任何為人熟知之方法製備。可與載體材料結合以製造單一劑量形式的活性成份之量通常為產生療效的量。通常，每100%中，該量為約1%至約99%活性成份，較佳為約5%至約70%，最佳為約10%至約30%。
製備該醫藥組合物之方法包括結合本發明抗微生物組合物與載體，及隨意地一或多種輔助成份。通常，該醫藥組合物係藉由均勻且緊密結合本發明組合物與液態載體或細碎的固態載體或此二者，然後視需要令該產物成形而製備。
適於口服投藥可為膠囊、扁囊劑、丸劑、錠劑(使用經調味主藥，通常為蔗糖與阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠)、粉劑、小顆粒，或為在水性或非水性液體中之溶液或懸浮液，或為水包油型或油包水型液態乳液，或為酏劑或糖漿，或為軟錠劑(使用惰性基質，諸如明膠與甘油，或蔗糖與阿拉伯樹膠)及/或為潄口水等形式，各含有預定量之本發明抗微生物組合物作為活性成份。本發明之醫藥組合物亦可以球劑、舐劑或糊劑投藥。
在本發明之口服投藥的固態劑量形式(膠囊、錠劑、丸劑、糖衣錠、粉劑、小顆粒等)中，該活性成份係與一或多種醫藥上可接受之載體混合，該等載體係諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣及/或下列任一者：填料或增量劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；黏合劑，諸如接甲基纖維素、褐藻酸酯、明膠、聚乙烯四氫吡咯酮、蔗糖及/或阿拉伯樹膠；保濕劑，諸如甘油；崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或樹薯澱粉、褐藻酸、特定矽酸鹽，與碳酸鈉；溶液滯凝劑，諸如石蠟；吸收促進劑，諸如四級銨化合物；濕潤劑，諸如鯨蠟醇與一硬脂酸甘油酯；吸收劑，諸如高嶺土與膨土；潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態聚乙二醇、月桂基硫酸鈉與其混合物，以及著色劑。在膠囊、錠劑與丸劑情況下，該藥學組成物亦可包含緩衝劑。相似類型之固態組成物亦可作為使用賦形劑(諸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等)之軟與硬填充明膠膠囊的填料。
錠劑可藉由隨意地與一或多種輔助成份壓縮或模製而製得。壓縮錠劑可使用黏合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如澱粉羥乙酸鈉或交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性或分散劑。模製錠劑可藉由在適用機器中模製以惰性液態稀釋劑濕潤之粉末狀化合物的混合物而製得。
該等錠劑與本發明醫藥組合物之其他固態劑量形式(諸如糖衣錠、膠囊、丸劑與小顆粒)可隨意地劃痕或製備塗層與外殼，諸如腸溶塗層與製藥技術中廣為人知之其他塗層。彼等亦可使用例如不同比例以提供所需之釋放曲線之羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質、脂質體及/或微球體加以調配，以便提供緩慢或受控制釋放其中之活性成份。彼等可藉由例如經由保留細菌之過濾器過濾、或藉由混入呈可溶解在滅菌水中之滅菌固態組成物形式的滅菌劑，或某些其他在使用前可注入之滅菌介質而滅菌。醫藥組合物亦可隨意地含有乳濁劑，且可為僅在或較佳係在腸胃特定部分中隨意地以延緩方式釋放該(等)活性成份。可使用之包埋組成物實例包括聚合物質與蠟。該活性成份亦可呈微膠囊化形式，若情況適當，具有一或多種上述賦形劑。
本發明醫藥組合物之口服投藥用液態劑量形式包括藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿與酏劑。除了活性成份之外，該液態劑量形式可含有本技術中常用之惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑、助溶劑與乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油與芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇與山梨醇酐之脂肪酸酯，以及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，該口服組成物亦可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化與懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、香料與防腐劑。除了該等活性化合物之外，懸浮液可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇與山梨醇酐酯、微結晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨土、瓊脂與黃蓍樹膠，及其混合物。
供直腸或陰道投藥之本發明醫藥組合物的調配物可呈栓劑狀，其可藉由混合一或多種本發明之化合物與一或多種適用之非刺激性賦形劑或載體而製備，該等賦形劑或載體包含例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，且其在室溫下呈固態但在體溫下呈液態，因此會在直腸或陰道腔中熔融並釋放該活性化合物。適用於陰道投藥之本發明調配物亦包括含有如本技術領域中習知適當之載體的陰道栓劑、棉塞、乳霜、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧調配物。
本發明醫藥組合物之局部或經皮投藥的劑量形式包括粉劑、噴霧、油膏、糊劑、乳霜、洗劑、凝膠、溶液、貼布與吸入劑。本發明之抗微生物組合物可在滅菌條件下與醫藥上可接受之載體，及與任何可能需要之防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。除了活性成分之外，該油膏、糊劑、乳霜與凝膠可含有賦形劑，諸如動物與植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍樹膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨土、矽酸、滑石與氧化鋅，或其混合物。
經皮貼片具有提供受控制輸送本發明之抗微生物組合物至身體的附加優點。此種劑量形式可藉由將該組合物溶解或分散於適當介質中而製得。亦可使用吸收加強劑以提高該化合物穿過皮膚的通量。此種通量率可藉由提供速率控制薄膜或將該組合物分散在聚合物基質或凝膠中而加以控制。
眼科調配物、眼用油膏、粉劑、溶液等亦被視為在本發明範圍內。
適於非經腸投藥之本發明醫藥組合物包含一或多種本發明之抗微生物組合物與一或多種醫藥上可接受之滅菌等滲壓水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，或可在使用前才重新組成滅菌注射溶液或分散劑的滅菌粉末，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、可使該調配物與計劃中之受試對象的血液等滲壓之溶質，或懸浮劑或增稠劑。
可用於本發明醫藥組合物之適用水性與非水性載體實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)與其適用混合物、植物油(諸如橄欖油)與可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。適當流性可藉由例如使用塗覆材料(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需之粒子大小，以及藉由使用界面活性劑而加以維持。
醫藥組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑與分散劑。藉由包括各種抗菌與抗黴菌劑(例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等)而確保避免微生物之作用。亦可能需要將等滲壓劑，諸如糖、氯化鈉等包括入該組成物。此外，可藉由包括延緩吸收之藥劑(諸如一硬脂酸鋁與明膠)而使注射藥學形式具有長期吸收性。
在一些實施例中，為了延長藥物之效果，需要減緩從皮下或肌內注射之藥物的吸收。此可以藉由使用具有不良水溶性之結晶或非晶材料的液態懸浮液而達成。然後，該藥物的吸收速率係視其溶解速率而定，因此可視結晶大小與結晶形而定。或者，非經腸投藥之藥物形式的延緩吸收可藉由將該藥物溶解或懸浮在油性賦形劑中而達成。
注射貯存形式(injectable depot form)可藉由將本發明醫藥組合物之微膠囊基質形成於可生物降解聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)中而製得。藥物釋放速率可視藥物對聚合物之比率以及所使用之特定聚合物的性質而加以控制。其他可生物降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)與聚(酐)。貯存注射調配物亦可藉由將該藥物裹於與體組織可相容之脂質體或微乳液中而製備。
不論所選用投藥途徑為何，本發明之抗微生物組合物(其可以適用水合形式使用)及/或本發明之醫藥組合物係藉由熟悉本技術之人士習知的慣用方法調配成藥學上可接受之劑量形式。
本發明醫藥組合物中之活性成份的實際劑量水準可改變，以便獲得對病患無毒性之有效獲致特定病患所需之治療反應的活性成份之量、組成物，與投藥模式。
該選用劑量水準會視各式因素而定，該等因素包括本發明所使用之特定化合物或其酯、鹽或醯胺的活性、投藥途徑、投藥時間、所使用之特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所使用特定化合物併用之其他藥物、化合物及/或材料、接受治療之病患之年齡、性別、體重、狀態、一般健康、與先前病史等醫藥技術中為人熟知的因素。
具有本技術領域中具有通常知識之醫生或獸醫可迅速判定並指示所需醫藥組合物的有效量。例如，該醫生或獸醫可以低於獲得所需治療效果所需之水準作為該醫藥組合物中所使用之本發明化合物劑量開始，並逐漸提高該劑量直到獲致所需效果為止。
用途
本發明進一步提供上述抗微生物組合物之用途，其用於製備用於抑制微生物細胞以及微生物生物膜生長的藥劑。
根據本發明一些實施例，該微生物細胞為人類致病菌的細胞。更具體而言，該人類致病菌係選自由金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌( S. haemolyticus)、人葡萄球菌( S. hominis)、中間葡萄球菌( S. intermedius)、腐生葡萄球菌( S. saprophyticus)、路鄧葡萄球菌( S. lugdunesis)、豬紅斑丹毒絲菌( Erysipelothrix rhusiopathiae)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、萬古黴素抗性屎腸球菌( VR-E. faecium)、蠟樣芽孢桿菌( Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、白喉桿菌( Corynebacterium diphtheriae)、李斯特單胞菌( Listeria monocytogenes)、釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、困難梭狀芽孢桿菌( Clostridium difficile)、大腸桿菌( Escherichia coli)、鼠傷寒沙門桿菌( Salmonelia Typhimurium)、鮑氏不動桿菌( Acinetobacter baumannii)、結核桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)及耐萬古黴素金黃色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)所組成的群組。
根據本發明一些實施例，該微生物生物膜為人類治病細菌或真菌的生物膜。更具體而言，該人類致病細菌或真菌係選自由溶血葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus)、克雷伯氏肺炎菌( Klebsiella pneumoniae)、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌( Escherichia coli)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、白色念珠菌 ( Candida albicans)及金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)所組成的群組。 實施例
在本節中，將透過以下實施例來詳細說明本發明的內容。這些案例僅作為說明之用，而本案所屬技術領域具有通常知識者得以很容易知悉各種修改例和變化例。因此，下面將詳細說明本發明的各種實施例，然而本發明並不限於本說明書中列出的該各種實施例。 材料與方法
細胞
將老鼠巨噬細胞系RAW264.7 (BCRC)以及人類子宮頸上皮癌細胞系HeLa (BCRC)培養在含有10%加熱非活化的FBS (Gibco-BRL)的Dulbecco 改良培養基(DMEM; Gibco-BRL) 中。人類胚胎腎細胞系HEK-293 (BCRC)及永生化的非致瘤性角質形成細胞系HaCaT(來自國立台灣大學的 Yung-Chiy Chang 博士)培養在添加10%加熱非活化FBS 的RPMI培養基(RPMI; Gibco-BRL)中。細胞在75T細胞培養瓶中以37°C 和 5% CO 2環境中培養。
試劑
將醯胺化合物樣本合成並溶解在DMSO中以產生儲備溶液(10 g/L)。將氨芐青黴素(10g/L；USB)、苯唑西林(10g/L；Sigma-Aldrich)、氧氟沙星(1g/L；Bio Basic)及萬古黴素(10g/L；GoldBio)溶解於無菌去離子水中製備儲備溶液。花生四烯酸、二十碳五烯酸、反油酸、芥酸、貢多酸、α-亞麻酸、亞油酸、肉荳蔻油酸、神經酸、油酸、棕櫚油酸及硬脂酸係購自Cayman Chemical，皆溶於95% 乙醇中以製成儲備溶液(10g/L)。將二十二碳六烯酸(DHA，40g/L；Santa Cruz)、紅黴素(10 g/L；Bio Basic)和四環素(10 g/L；Bio Basic)溶解在95% 乙醇中製成儲備溶液。將環丙沙星(10 g/L；Sigma-Aldrich)、達托黴素(10 g/L；Sigma-Aldrich)、利奈唑胺(10 g/L；Santa Cruz)、利福平(10 g/L；Bio Basic)及索拉非尼(10 g/L；拜耳製藥公司友情提供)溶解在DMSO中製成儲備溶液。
抗菌活性測定
於此，抗菌活性係基於MIC以及MBC二指標；MIC係指最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration)，而MBC係指最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration)。於此係根據CLSI指南使用微量肉湯稀釋法測定個別試劑對MRSA USA300菌株的MIC。簡言之，將LB培養基中的過夜細菌培養物在新鮮LB培養基中以1:50稀釋，並在37°C下培養直至達到OD 600為0.5至0.6。將細菌懸浮液在新鮮CAMHB中稀釋至最終濃度為5*10 5cfu/mL，然後在37℃下在96孔板中以增加劑量一式三份暴露於每種測試劑24小時。每種藥劑的MIC定義為不具可見細菌生長之最低濃度。MBC則係藉由在CAMHB瓊脂板上以37°C繼代培養5 μL等於或高於MIC之稀釋度的肉湯稀釋液24小時所測定的；MBC的定義為不具活細菌的最低肉湯稀釋度。
為了評估脂肪酸對醯胺化合物之抗菌活性的影響，將細菌懸浮液在含有指定濃度脂肪酸的新鮮CAMHB中稀釋至最終濃度為5*10 5cfu/mL；接著使用上述方案測定個別藥劑的MIC和MBC。然後，通過計算它們相應的分數抑制濃度指數(FICI)來測量每種組合的協同作用，公式為ΣFIC (FICi) = FIC A+ FIC B= (Comb A/MIC A) + (Comb B/MIC B)，其中MIC A和MIC B分別為A藥和B藥單獨的MIC，Comb A及Comb B分別為A藥和B藥組合的濃度。具有協同作用定義為FICI ≤ 0.5；無相互作用定義為0.5 ＜ FICI ≤ 4.0，拮抗作用定義為 FICI ＞ 4。
抗增殖試驗
利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)測定法評估醯胺化合物及脂肪酸對哺乳動物細胞活性的影響，每個實驗組重複6次。簡而言之，將細胞以每孔10 4個細胞接種到96孔盤中，培養24小時，然後暴露於濃度範圍為5-30mg/L的醯胺化合物或醯胺化合物與脂肪酸組合24小時。對照組使用與實驗組處理細胞相同濃度的DMSO及乙醇。處理結束時，將培養基更換為含0.5 g/L MTT的培養基，將細胞在CO 2培養箱中於37°C再培養1.5小時。從孔中取出上清液，將還原的MTT染料溶解在DMSO中，接著使用VersaMax微量盤檢測儀(Molecular Devices，USA)測量每個孔在570 nm 處的吸光值。
持久性細胞消除試驗
將對數期細菌調整至OD 600= 0.2，然後在37°C下用16×MIC的萬古黴素處理12小時。在4°C下以4000×g離心10分鐘收集細菌，用冰冷的PBS洗滌，並將測試試劑懸浮在PBS中。對照組用與藥物處理細菌相同濃度的DMSO和乙醇處理。在指定時間，在PBS中連續稀釋100 μL等分細菌懸浮液，然後將其塗抹在LB瓊脂板上以評估活細菌的數量。 在37°C培養18-24小時後，計數菌落數係以cfu/mL表示。
生物膜清除試驗
如上所述，評估達托黴素、萬古黴素、實驗醯胺化合物及實驗醯胺化合物與脂肪酸組合對微生物之生物膜的根除活性。簡而言之，細菌在胰蛋白酶大豆肉湯(Becton Dickinson，美國)中生長，並在96孔盤以5x10 5cfu/mL浸沒在細菌培養物中的蓋子的釘子上形成生物膜。24小時後，用PBS洗滌釘子兩次，然後轉移到新的96孔盤中，每個孔中含有濃度範圍為0.125 mg/L至1024 mg/L的測試試劑。在37°C下培養24小時後，洗滌釘蓋，將其置於新的96孔盤中，每孔裝有新鮮的CAMHB，並以超音波處理5分鐘以破壞釘子上的生物膜，接著利用cfu測定法檢測每個孔中的活細菌以評估數量。同時，為了確定最低生物膜清除濃度，將96孔盤蓋上新蓋並在37°C下培養24小時，然後使用cfu測定法對每個孔中的活細菌進行計數。
統計分析
數據表示為平均值±SD。使用Prism軟體(v6.0，GraphPad，USA)以單因素方差分析和Dunnett比較計算組平均值之間的差異，並且P值＜0.05則為顯著差異。 結果
醯胺化合物與各式脂肪酸結合之協同作用
於此採用之醯胺化合物為SC5005(結構如下文所示)，其與不同脂肪酸結合使用，並進一步測定其結合後對於MRSA USA300菌株之抗菌活性；結果如表1及表2，分別呈現SC5005與不同脂肪酸結合後對於MRSA USA300菌株之MIC及MBC。
SC5005之結構：
表1
脂肪酸 (mg/L) MIC (mg/L)
脂肪酸 SC5005 (協同效應)
0 4 8 16
肉荳蔻酸 (C14:1n5c) 512 0.25 0.25 (NI) 0.25 (NI) 0.25 (NI)
棕櫚油酸 (C16:1n7c) 64 0.25 0.0625 (Syn) 0.03125 (Syn) 0.03125 (Syn)
硬脂酸 (C18:0) 512 0.25 0.25 (NI) 0.25 (NI) 0.25 (NI)
反油酸 (C18:1n9t) ＞ 1024 0.25 0.25 (NI) 0.25 (NI) 0.25 (NI)
油酸 (C18:1n9c) 512 0.25 0.03125 (Syn) 0.03125 (Syn) 0.03125 (Syn)
亞油酸 (C18:2n6c) 1024 0.25 0.0156 (Syn) 0.0078 (Syn) 0.0078 (Syn)
α-亞麻酸 (C18:3n3c) 256 0.25 0.0625 (Syn) 0.0625 (Syn) 0.0156 (Syn)
貢多酸 (C20:1n9c) 512 0.25 0.125 (NI) 0.25 (NI) 0.25 (NI)
花生四烯酸(C20:4n6c) 128 0.25 0.0625 (Syn) 0.0625 (Syn) 0.03125 (Syn)
二十碳五烯酸(C20:5n3c) 64 0.25 0.0625 (Syn) 0.0625 (Syn) 0.03125 (Syn)
芥酸 (C22:1n9c) 128 0.25 0.125 (NI) 0.25 (NI) 0.25 (NI)
二十二碳六烯酸(C22:6n3c) 1024 0.25 0.03125 (Syn) 0.000015 (Syn) 0.0000038 (Syn)
神經酸 (C24:1n9c) 128 0.25 0.25 (NI) 0.25 (NI) 0.25 (NI)
表2
脂肪酸 (mg/L) MBC (mg/L)
脂肪酸 SC5005 (combination effect) b
0 4 8 16
肉荳蔻酸 (C14:1n5c) ＞1024 2 1 (NI) 1 (NI) 1 (NI)
棕櫚油酸 (C16:1n7c) 512 2 0.0625 (Syn) 0.03125 (Syn) 0.03125 (Syn)
硬脂酸 (C18:0) ＞1024 2 2 (NI) 2 (NI) 2 (NI)
反油酸 (C18:1n9t) ＞1024 2 1 (NI) 1 (NI) 0.5 (NI)
油酸 (C18:1n9c) ＞1024 2 0.125 (Syn) 0.0625 (Syn) 0.0625 (Syn)
亞油酸 (C18:2n6c) ＞1024 2 0.0625 (Syn) 0.03125 (Syn) 0.03125 (Syn)
α-亞麻酸 (C18:3n3c) 1024 2 0.5 (Syn) 0.25 (Syn) 0.125 (Syn)
貢多酸 (C20:1n9c) ＞1024 2 0.125 (Syn) 0.25 (Syn) 0.25 (Syn)
花生四烯酸(C20:4n6c) 1024 2 0.5 (Syn) 0.0625 (Syn) 0.03125 (Syn)
二十碳五烯酸(C20:5n3c) 1024 2 1 (Syn) 0.5 (Syn) 0.0625 (Syn)
芥酸 (C22:1n9c) 1024 2 0.25 (Syn) 0.25 (Syn) 0.25 (Syn)
二十二碳六烯酸/DHA (C22:6n3c) 1024 2 0.03125 (Syn) 0.0078 (Syn) 0.0039 (Syn)
神經酸 (C24:1n9c) ＞1024 2 2 (NI) 2 (NI) 2 (NI)
表1及表2當中，單個脂肪酸的結構用 CA:DnEF 的形式表示，其中 A 是碳原子數，D 是雙鍵數，E 是從甲基端到雙鍵中最接近甲基末端的第一個碳的碳數，F 表示雙鍵的幾何性質(c：順式或 t：反式)。通過計算相應的分數抑制濃度指數(FICI)來測量組合效果。協同作用 (Syn) 定義為 FICI ≤ 0.5，無相互作用 (NI) 定義為 FICI ＞ 0.5 且 ≤ 4.0，拮抗作用 (Ant) 定義為 FICI ＞ 4。
根據表1及表2可見，SC5005與順式不飽和脂肪酸有協同作用。詳言之，儘管與油酸具有相同的碳鏈長度，然而飽和硬脂酸(C18:0)與SC5005對MRSA USA300並未顯示協同作用；反油酸(C18:1n9t)也具有18個碳原子，然而同時具有一個反式雙鍵，故亦未顯示協同作用。據此可見，順式雙鍵對於醯胺化合物及脂肪酸的協同抗菌性相當重要。另一方面，表1及表2之結果顯示，SC5005及16碳順式單不飽和脂肪酸棕櫚油酸(C16:1n7c)之結合具有協同作用；20碳及22碳順式單不飽和脂肪酸貢多醣酸(C20:1n9c)及芥酸(C22:1n9c)分別與SC5005顯示出協同性的殺菌作用，然而對於MIC沒有影響。又，24碳神經酸 (C24:1n9c)及14碳肉荳蔻腦酸(C14:1n5c)皆未顯示與SC5005的任何協同活性。據此， SC5005與碳鏈長為16至22個碳原子範圍內的順式不飽和脂肪酸具有協同抗菌活性。
接續，SC5005與亞油酸(C18:2n6c)結合的抗菌活性優於油酸(C18:1n9c)及α-亞油酸(C18:3n3c)。另，雖然花生四烯酸(C20:4n6c)及二十碳五烯酸(C20:5n3c; EPA)具有不同數量的雙鍵，然而兩者對SC5005抗菌活性的影響係為相同的。由此可見，不飽和脂肪酸碳鏈中雙鍵的數量與其與SC5005的協同抗菌活性無關。
脂肪酸與各式醯胺化合物之協同作用
於此呈現不同醯胺化合物結合固定濃度之脂肪酸時，對於MRSA USA300菌株之抗菌活性變化；其中所採用之脂肪酸為二十二碳六烯酸(DHA)，結果如表3所示。
表3
    + 8 μg/ml DHA
MIC (μg/ml) MBC (μg/ml) MIC (μg/ml) MBC (μg/ml)
Sorafenib (索拉非尼) ＞64 ＞64 0.5 1
SC5005 0.25 2 0.0000038 0.0078
SC5010 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5015 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5020 ＞64 ＞64 0.125 0.125
SC5021 ＞64 ＞64 64 64
SC5022 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5023 ＞64 ＞64 16 16
SC5024 ＞64 ＞64 8 8
SC5025 16 32 2 2
SC5026 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5027 ＞64 ＞64 64 ＞64
SC5032 8 32 0.5 0.5
SC5033 64 64 2 2
SC5034 16 32 1 1
SC5035 16 32 1 2
SC5037 1 2 0.0039 0.0078
SC5038 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5040 1 2 0.0039 0.125
SC5041 0.5 2 0.0625 0.0625
SC5042 2 16 0.125 0.125
SC5043 2 4 0.0156 0.0156
SC5044 0.5 2 0.000975 0.0078
SC5045 0.25 1 0.0625 0.0625
SC5048 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5049 ＞64 ＞64 8 8
SC5050 ＞64 ＞64 8 16
SC5052 ＞64 ＞64 1 2
SC5053 ＞64 ＞64 1 2
SC5178 0.25 2 0.00012 0.00156
SC5101 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5102 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64
SC5103 0.25 2 0.0039 0.0078
SC5104 0.5 4 0.0078 0.0078
SC5105 ＞64 ＞64 0.125 0.125
SC5106 ＞64 ＞64 0.25 0.5
SC5107 ＞64 ＞64 0.0625 0.125
PK150 0.0625 2 0.00049 0.00098
3-006 0.125 1 0.0078 -
1-164 0.25 4 0.03125 -
1-159 32 64 0.125 -
由表3之內容可見，複數個醯胺化合物樣本皆與DHA有協同的抗菌活性(亦即加入DHA之後的MIC小於其原本之MIC的1/4)，包括索拉非尼、PK150及其相似物等。
組合物對於耐抗生素金黃色葡萄球菌之抗菌活性
本實施例之組合物的醯胺化合物係採用索拉非尼、SC5005以及PK150，而其脂肪酸係採用DHA。於此評估SC5005與DHA之組合物對一系列耐抗生素金黃色葡萄球菌菌株的抗菌活性；結果如表4所示。
表4
細菌菌株 抗藥性 MIC (mg/L)
DHA 索拉非尼 SC 5005 PK-150 + 8 mg/L DHA (協同作用)
索拉非尼 SC5005 PK150
S. aureusATCC29213 - 1024 64 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.0039 (Syn) 0.0039 (Syn)
S. aureusNCTC8325 - 1024 4 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.0000019 (Syn) 0.000035 (Syn)
MRSA USA300 AMP, ERY, OXA, OFX, CIP 1024 ＞64 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.000015 (Syn) 0.00049 (Syn)
MRSA ATCC33591 AMP, ERY, OXA, TET, 1024 ＞64 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.000061 (Syn) 0.000061 (Syn)
MRSA ATCC33592 AMP, ERY, OXA, TET, RIF 1024 ＞64 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.00049 (Syn) 0.00098 (Syn)
MRSA ATCC43300 AMP, ERY, OXA 1024 ＞64 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.00024 (Syn) 0.00098 (Syn)
MRSA ATCC49476 AMP, ERY, OXA, TET 1024 ＞64 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.00000095 (Syn) 0.000015 (Syn)
MRSA SCCmec V T AMP, ERY, OXA, OFX 1024 ＞64 0.25 0.125 0.5 (Syn) 0.0000019 (Syn) 0.00098 (Syn)
VRSA SJC1200 VAN 1024 ＞64 0.25 0.125 0.5 (Syn) 0.0000019 (Syn) 0.00012 (Syn)
S.aureusDAP-NS AMP, ERY, TET, OFX, CIP 1024 32 0.25 0.0625 0.5 (Syn) 0.0000019 (Syn) 0.0156 (Syn)
表4中，AMP係指氨芐青黴素(ampicillin)；ERY係指紅黴素(erythromycin)；OXA係指苯唑西林(oxacillin)；TET係指四環素(tetracycline)；OFX係指氧氟沙星(ofloxacin)；CIP係指環丙沙星(ciprofloxacin)；LZD係指利奈唑胺(linezolid)；RIF係指立汎黴素(rifampicin)；VAN係指萬古黴素(vancomycin)。
根據表4的內容，儘管對於各式抗生素具有抗藥性，然而所有測試的細菌菌株對於單獨DHA及單獨SC5005皆分別表現出相同的敏感性，MIC分別為1024 mg/L 和0.25 mg/L。相對之下，即便個別菌株對SC5005及DHA之組合物的敏感性不盡相同，然而整體結果顯示SC5005和DHA的組合物對所有測試的細菌菌株皆顯示出協同抗菌作用。
組合物對於哺乳動物細胞之細胞毒性
於此，本發明人採用SC5005作為醯胺化合物，並採用DHA作為脂肪酸，進一步評估了SC5005在DHA濃度不斷升高的情況下對四種不同哺乳動物細胞系的抗增殖活性；結果如表5所示。所述哺乳動物細胞系為老鼠巨噬細胞(RAW264.7)、人類子宮頸癌上皮細胞(HeLa)、人類角質形成細胞(HaCaT)以及人類腎胚胎細胞(HEK-293)。由表5可見，即便在存在16 mg/L DHA的情況下，SC5005對各個細胞系的細胞毒性亦未有顯著變化。據此，該結果顯示本發明之組合物的協同作用係針對病原菌，而不會對哺乳動物細胞造成傷害。
表5
DHA (mg/L) SC5005的CC 50(mg/L)
RAW264.7 HeLa HaCaT HEK-293
0 19.5 ± 0.6 22.5 ± 0.7 18.0 ± 1.7 14.1 ± 1.4
4 22.6 ± 0.8 24.2 ± 3.6 19.5 ± 1.7 15.6 ± 0.6
8 19.7 ± 2.5 21.9 ± 1.6 20.5 ± 0.3 14.9 ± 1.6
16 21.2 ± 2.3 21.4 ± 1.4 18.1 ± 1.6 14.0± 0.8
組合物消除持久性細胞
於此，本發明人評估SC5005、DHA及其組合對金黃色葡萄球菌NCTC8325及MRSA USA300的殺菌動力學(time-kill kinetics)；結果如圖1所示。由圖1可見，SC5005在24小時內殺死了超過99.9%的細菌。相較之下，8 mg/L的DHA在治療初期僅對金黃色葡萄球菌NCTC8325的生長有中度抑製作用，隨後細菌生長反彈至與對照組相同的程度。值得注意的是，SC5005和DHA的結合在10分鐘內完全消滅了所有細菌，表示SC5005和DHA的協同抗菌活性具有很強的殺菌作用。另一方面，金黃色葡萄球菌可以進入非生長狀態(即所謂的持久性細胞)，並對抗生素治療產生耐受性而導致細菌反覆感染。為了分離出金黃色葡萄球菌持久性細胞，我們在PBS緩衝液中以殺菌濃度的抗生素萬古黴素處理12小時以消除非持久性細胞。如圖所示，剩餘的細菌細胞對萬古黴素和另一種殺菌抗生素達托黴素的殺傷活性具有耐受性，表示這種細菌細胞亞群由持久性細胞組成。再次參照圖1可見，SC5005及其與DHA的結合在殺死持久細胞方面非常有效，並且持久性細胞分別在24小時和30分鐘內被根除。此一發現顯示SC5005和DHA結合的作用機制(MoA)與細菌代謝活動無關。
組合物清除金黃色葡萄球菌生物膜
當金黃色葡萄球菌附著在醫療植入物或宿主組織上時，它可以建立生物膜，提供有利於形成持久性細胞的環境，並且通常與慢性感染和治療失敗有關。為了確定SC5005和DHA可以根除金黃色葡萄球菌生物膜，本發明人單獨使用濃度遞增的SC5005或者與8 mg/L DHA一併處理細菌生物膜24小時；結果如圖2所示。根據圖2之內容，SC5005與達托黴素和萬古黴素相比表現出優異的生物膜清除活性。然而，8 mg/L DHA並沒有增強SC5005的生物膜根除活性，甚至對MRSA USA300生物膜有拮抗作用；這表示主要由多醣、蛋白質和核酸組成的生物膜基質可能會干擾SC5005和DHA的協同作用。接著將DHA的濃度提高到80 mg/L，便觀察到SC5005的生物膜根除活性增加了32倍。除此之外，由圖2亦可見，1 mg/L SC5005和80 mg/L DHA的結合在1分鐘內去除了生物膜中近99%的細菌，且在長達60分鐘內對RAW264.7細胞未產生可檢測到的細胞毒性。總體來說，與二線抗生素相比，SC5005和DHA之結合對金黃色葡萄球菌生物膜均表現出優異和快速的殺菌活性。
本發明具體實施例已經揭露，但並非旨在限制本發明。本案所屬技術領域具有通常知識者均能夠理解，在未偏離本發明原理和精神的情況下，可以做出各種變更例和修飾例，因此本發明的保護範圍應當以隨附的專利申請範圍中所限定的範圍為基礎。
無
為使本發明上述及其他目的、特徵、優點及實施例更加明顯易懂，因此針對圖式說明如下：
圖1： S. aureusNCTC8325(左上圖)和MRSA USA300(右上圖)係在暴露於 SC5005(4x MIC，1 mg/L；實心方塊)、DHA(8 mg/L；實心倒三角形)、SC5005 與 DHA(實心三角形)以及萬古黴素(VAN；4x MIC，4 mg/L；實心圓圈)後所測定，再藉由cfu測定法計算每個暴露期後肉湯中的活菌數，並表示為cfu/mL；圖中顯示的數據係為個別獨立之實驗的平均值±SD。 S. aureusNCTC8325 (左下圖) 和 MRSA USA300(右上圖)係在PBS中首先使用萬古黴素 (VAN; 16x MIC, 16 mg/L) 處理 12 小時以觸發持久性，接著洗滌細菌細胞後再分別暴露於 SC5005(16x MIC，4 mg/L；實心方塊)、DHA(8 mg/L；實心倒三角形)、SC5005 與 DHA 結合(實心三角形)、萬古黴素(VAN；16x MIC，16 mg/ L；實心圓)及達托黴素(DAP；16x MIC，16 mg/L；實心星形) 所測定，再藉由cfu測定法計算每個暴露期後肉湯中的活菌數，並表示為cfu/mL；圖中顯示的數據係為三個獨立實驗的平均值±SD(每組 n = 3)。由於每個點的標準偏差非常小，故圖中並未呈現出誤差線。圖中的水平虛線代表毒殺99%的細菌細胞。除此之外，圖1當中的空白對照皆係以實心菱形表示。
圖2： S. aureusNCTC8325 (左上圖) 和 MRSA USA300 (右上圖) 的生物膜用濃度遞增的空白對照(Mock)、DHA、達托黴素 (DAP)、萬古黴素 (VAN)、SC5005 和 SC5005 與 DHA 結合處理 24 小時；收取生物膜中的細菌，並於CAMHB 中再培養 24 小時；接著使用 cfu 測定法確定活細菌的數量。數據代表個別獨立的實驗，並顯示為平均值 ± SD(每組 n = 3)。 ns表示不顯著， p ＞ 0.05； *表示 p ＜ 0.05； **表示p ＜ 0.01； ***表示p ＜ 0.001。 (左下圖)MRSA USA300 的生物膜用空白對照(Mock)或者SC5005 和 80 mg/L DHA 處理 1、3 或 10 分鐘，並使用 cfu 測定法收集和計數生物膜中的活細菌；數據代表個別獨立的實驗，並顯示為平均值 ± SD(每組 n = 3)。ns表示不顯著， p ＞ 0.05； *表示 p ＜ 0.05； **表示p ＜ 0.01； ***表示p ＜ 0.001。 (右下圖) 將 RAW264.7 細胞暴露於空白對照(Mock)或者濃度不斷增加的 SC5005 和 80 mg/L DHA 中 10、30 或 60 分鐘，並使用 MTT 測定法確定細胞的活性，再表示為相對於對照組(DMSO 和乙醇)處理的細胞的百分比。顯示的數據是平均值 ± SD(每組 n = 3)。
無

Claims (14)

  1. 一種抗微生物組合物，其包括： 一醯胺化合物；以及 一脂肪酸； 其中，該脂肪酸係一具有16至22個碳原子之順式不飽和脂肪酸。
  2. 如請求項1所述之抗微生物組合物，其中該醯胺化合物係一具有化學結構(I-1)或(I-2)之化合物： (I-1)， (I-2)； 其中R 1及R 2分別為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 ，且R 1及R 2非同時為 或 ； R 3為氫、甲苯、 、 、 或 ； R 4為氫或氟。
  3. 如請求項2所述之抗微生物組合物，其中R 1為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ，而R 2為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 。
  4. 如請求項1所述之抗微生物組合物，其中該醯胺化合物係一具有化學結構(II)之化合物： (II)； 其中R 1為 、 或 ； R 2為 、 、 、 、 、 、 或 。
  5. 如請求項1所述之抗微生物組合物，其中該醯胺化合物係具有化學結構(III)至(VII)中任一者的化合物： (III)， (IV)， (V)， (VI)， (VII)。
  6. 如請求項1所述之抗微生物組合物，其中該脂肪酸係一具有16至22個碳原子之順式單不飽和脂肪酸或順式多不飽和脂肪酸。
  7. 如請求項1所述之抗微生物組合物，其中該脂肪酸係一棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
  8. 如請求項1所述之抗微生物組合物，其中該脂肪酸之含量大於該醯胺化合物之含量。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗微生物組合物以及至少一醫藥上可接受之載體。
  10. 一種如請求項1至8中任一項抗微生物組合物之用途，其用於製備用於抑制微生物細胞以及微生物生物膜生長的藥劑。
  11. 如請求項10所述之用途，其中該微生物細胞為人類致病菌的細胞。
  12. 如請求項11所述之用途，其中該人類致病菌係選自由金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌( S. haemolyticus)、人葡萄球菌( S. hominis)、中間葡萄球菌( S.intermedius)、腐生葡萄球菌( S. saprophyticus)、路鄧葡萄球菌( S. lugdunesis)、豬紅斑丹毒絲菌( Erysipelothrix rhusiopathiae)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、萬古黴素抗性屎腸球菌( VR-E.faecium)、蠟樣芽孢桿菌( Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、白喉桿菌( Corynebacterium diphtheriae)、李斯特單胞菌( Listeria monocytogenes)、釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、困難梭狀芽孢桿菌( Clostridium difficile)、大腸桿菌( Escherichia coli)、鼠傷寒沙門桿菌( Salmonelia Typhimurium)、鮑氏不動桿菌( Acinetobacter baumannii)、結核桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)及耐萬古黴素金黃色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)所組成的群組。
  13. 如請求項10所述之用途，其中該微生物生物膜為人類治病細菌或真菌的生物膜。
  14. 如請求項13所述之用途，其中該人類致病細菌或真菌係選自由溶血葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus)、克雷伯氏肺炎菌( Klebsiella pneumoniae)、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌( Escherichia coli)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、白色念珠菌 ( Candida albicans)及金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)所組成的群組。
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