CN108025031A - 锡生藤提取物治疗登革热的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及锡生藤(Cissampelos pareira)提取物，其药物组合物，及其在预防和治疗登革热中的治疗用途。其也涉及制备这些提取物的方法。

Description

锡生藤提取物治疗登革热的用途
发明领域
本发明涉及锡生藤(Cissampelos pareira)提取物，其药物组合物，及其在预防和治疗登革热中的治疗用途。其也涉及制备这些提取物的方法。
背景技术
登革热疾病在世界上仍然是主要的公共卫生问题。近几十年来，登革热的发病率在世界各地急剧增长。全球登革热发生在热带和亚热带地区，主要集中在城市和近郊地区。严重登革热是许多亚洲和拉丁美洲国家儿童重大疾病和死亡的头号原因。根据世界卫生组织(WHO)的估计，全球约有25亿人处于登革热风险之中，每年全球约有5000万感染者。登革热通过伊蚊(Aedes mosquitoes)作为致病病毒的携带者，传播给人类。有四种登革病毒血清型(DENV-1，-2，-3和-4)，属于黄病毒科(Flaviviridae)。从一种登革病毒血清型的感染中恢复提供针对该特定血清型的终身免疫性。然而，恢复后对其他血清型的交叉免疫性只是部分和暂时的。其他血清型的后续感染会增加发生严重登革热的风险。DENV感染可能无症状，或可能导致一系列临床症状，从轻度登革热(DF)到严重且可能致命的登革出血热(DHF)以及登革热休克综合征(DSS)。轻度登革热的临床症状包括高热，严重头痛，眼后疼痛，肌肉和关节疼痛，恶心，呕吐，肿胀的腺体和皮疹。在受感染的蚊子叮咬后4-10天的潜伏期后，症状通常持续2-7天。由于血浆渗漏，积液，呼吸窘迫，严重出血或器官损伤，出现严重登革热的临床症状。尽管对人类健康和全球经济造成了令人震惊的影响，但目前还没有登革热的具体治疗方法。尽管正在开发一些减毒登革热疫苗，但登革热疫苗研发面临的挑战依然很高。
因此迫切需要一种有效的登革热治疗方法，其可以缩短病程，减轻常见症状的严重程度，防止严重并发症的发生，且易于配制。此外，非常需要开发能够在早期减少病毒载量的登革热治疗，这样可以潜在地预防登革热以及危及生命的严重形式的登革热。
本发明通过提供有效的患者顺应的登革热治疗来满足这种未满足的需求。锡生藤提取物有助于有效预防和治疗登革病毒疾病。本发明人已经发现，锡生藤(Cissampelospariera Linn)的提取物(Cipa提取物)是基于细胞的测定法中的所有四种DENV的有效抑制剂，根据利用ELISA检测的病毒NS1抗原分泌以及基于空斑测定法检测的病毒复制进行评估。病毒产量减少测定显示，锡生藤提取物使病毒滴度降低一个数量级。使用AG129小鼠模型，锡生藤提取物赋予了针对DENV感染的统计学显著的保护。令人惊讶的是，已经发现，锡生藤提取物对于广泛的病毒载量(包括初期病毒载量)普遍具有效力，其随后可以防止危及生命的严重形式的登革热。此外，本发明人已经确定，锡生藤提取物和扑热息痛(paracetamol)在降低体温方面显示出协同作用。同样，登革热疾病使某些患者容易出血，并且往往与血小板计数降低有关。因此，评估锡生藤提取物是否对红细胞和血小板有任何不良影响也是非常重要的。本发明人已确定，锡生藤提取物对血小板计数或红细胞活力没有任何可察觉的影响。他们还已确定该提取物还具有下调促炎细胞因子特别是TNF-α和IL-1β分泌的能力。此外，锡生藤的提取物没有显示毒性迹象。
发明内容
本发明提供了锡生藤提取物，其药物组合物，及其在预防和治疗登革热中的治疗用途。其也涉及制备这些提取物的方法。进一步提供了这些提取物在哺乳动物中对抗登革病毒的活性。此外，还提供了锡生藤提取物与扑热息痛组合的协同解热作用。还提供了锡生藤提取物的抗炎作用，其对血小板计数和红细胞活性没有不利影响。此外，这些提取物没有显示任何毒性作用。
附图简要说明
图1：抗病毒筛选测定的示意图。
图2：通过处理甲醇提取物抑制DENV抗原和病毒产生。
图3：预孵育时间对甲醇提取物的抗病毒活性的影响。
图4：评估甲醇提取物的体内保护效力。
图5：扑热息痛和甲醇提取物之间相互作用的分析。
图6：甲醇提取物对血小板的影响。
图7：甲醇提取物对RBC的影响。
发明详述
本发明的第一个方面提供了用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的锡生藤提取物。
本发明的第二个方面提供了用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的药物组合物，其包含锡生藤提取物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
本发明的第三个方面提供了用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的药物组合物，其包含：
(a)锡生藤提取物；和
(b)扑热息痛
其中(a)和(b)作为单一药物组合物一起给予或者同时或依次共同给予。
本发明的第四个方面提供了治疗哺乳动物中登革病毒感染的方法，包括给予药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)锡生藤提取物；和
(b)扑热息痛
其中(a)和(b)作为单一药物组合物一起给予或者同时或依次共同给予。
本发明的第五个方面提供了锡生藤提取物，以在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量。
本发明的第六个方面提供了在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期阶段降低病毒载量的方法，包括给予锡生藤提取物。
本发明的第七个方面提供了用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的锡生藤提取物，其中所述提取物显示血小板保护作用。
本发明的第八个方面提供了治疗哺乳动物中登革病毒感染的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示血小板保护作用。
本发明的第九个方面提供了用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的锡生藤提取物，其中所述提取物显示红细胞保护作用。
本发明的第十个方面提供了治疗哺乳动物中登革热感染的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
本发明的第十一个方面提供了锡生藤提取物，以在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量，其中所述提取物显示出血小板保护作用。
本发明的第十二个方面提供了在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示血小板保护作用。
本发明的第十三个方面提供了锡生藤提取物，以在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
本发明的第十四个方面提供了在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示红细胞保护作用。
本发明的第十五个方面提供了一种药物组合物，其包含锡生藤提取物和一种或多种药学上可接受的赋形剂，以在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量，其中所述提取物显示出血小板保护作用。
本发明的第十六个方面提供了一种药物组合物，其包含锡生藤提取物和一种或多种药学上可接受的赋形剂，以在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
在上述方面的一个实施方式中，该提取物是醇提取物，水醇提取物或水性提取物。在优选的实施方式中，该提取物是醇提取物。在一个更优选的实施方式中，该提取物是甲醇提取物。甲醇提取物中的甲醇可以通过蒸发完全去除以获得干燥的提取物。可以将干燥的提取物冻干以形成粉末，然后将其填充到合适尺寸的胶囊中。
在上述方面的另一个实施方式中，锡生藤提取物用于预防登革病毒感染。
锡生藤属于防已科(Menispermaceae)，是一种分布在亚洲，东非和南北美洲温暖地区的攀缘灌木，并且在印度和斯里兰卡很常见。它也被称为绒毛叶(Velvet Leaf)或Patha或Ambasthaki。它在印度的热带和亚热带地区高达海拔约1500米的温暖且干燥的地区很常见。发现它存在于喜马偕尔邦，恰塔那格浦尔，比哈尔邦，西孟加拉邦，旁遮普邦，拉贾斯坦邦，尤其是阿拉瓦利东部，马拉斯瓦达山脉，康坎山脉，德干山，迈索尔巴巴布登山和泰米尔纳德邦(《印度阿育吠陀药典》(Ayurvedic Pharmacopoeia of India)，第1版，第1部分，第1卷，第92-93页；印度政府，卫生和家庭福利部，印度系统医学和顺势疗法部，新德里；《印度财富，印度原材料和工业产品字典》(The Wealth of India，A Dictionary ofIndian Raw Materials and Industrial Products，Raw Materials)，原材料，新德里科学和工业研究委员会，第二卷；《阿育吠陀中使用的药用植物数据库》(Database onMedicinal Plants Used In Ayurveda)，第二卷，阿育吠陀和悉达中央研究委员会，印度系统医学和顺势疗法部，新德里)。
扑热息痛在化学上是N-(4-羟基苯基)乙酰胺。它也被通常称为对乙酰氨基酚。这是一种已经使用了多年的众所周知的退烧药。本发明提供了扑热息痛与锡生藤提取物的协同解热作用。本发明包括安全有效地使用扑热息痛与锡生藤提取物组合来治疗或预防登革病毒感染。扑热息痛和锡生藤提取物可以作为单一药物组合物一起给予，或者可以同时或依次共同给予。
如本文所用，术语“醇提取物”包括任何基于醇的提取物，例如锡生藤的甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇或叔丁醇提取物。具体而言，醇提取物是甲醇提取物。
如本文所用，术语“水醇提取物”包括通过使用醇和纯化水的混合物制备的提取物。醇的示例是甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇和叔丁醇。具体地，使用醇和纯化水的1∶1混合物。
如本文所用，术语“水性提取物”包括锡生藤的纯化水提取物。
锡生藤提取物通过用选自甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，叔丁醇，纯化水及其混合物中的一种或多种溶剂对锡生藤的植物质进行提取，浓缩提取物并干燥提取物来制备。
本文使用的术语“锡生藤的植物质”是指包括地上部分，例如果实，花，叶，枝，茎皮，茎，种子或心材，和根的整个植物。
本文使用的术语“最小致死剂量(MLD)”是指在攻击后3-4周可引起临床症状和90％至100％死亡的剂量。
如本文所用的术语“药物组合物”包括能够将锡生藤提取物有效递送至期望的作用部位以治疗或预防登革病毒感染的任何组合物。组合物可以通过任何合适的给药途径递送，例如口服，经鼻，肺部，透皮或直肠。该药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。口服药物组合物可以是粉末，丸粒，颗粒，球体，小片，囊片，片剂或胶囊的形式。粉末可以是与药学上可接受的赋形剂填充到适当大小的胶囊中的冻干粉末的形式。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括稀释剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，助流剂，聚合物，调味剂，表面活性剂，防腐剂，抗氧化剂，缓冲剂和张力调节剂。
稀释剂的示例包括微晶纤维素，粉状纤维素，淀粉，预明胶化淀粉，葡聚糖，乳糖醇，果糖，可压缩糖，糖果，右旋糖，乳糖，磷酸氢钙，磷酸三钙，硫酸钙及其混合物。
粘合剂的示例包括水溶性淀粉，例如，预明胶化淀粉；多糖，例如，琼脂，阿拉伯树胶，糊精，海藻酸钠，黄蓍胶，黄原胶，透明质酸，果胶，或硫酸软骨素钠；合成聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，羧基乙烯基聚合物，聚丙烯酸类聚合物，聚乳酸，或聚乙二醇；纤维素醚，例如，甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，或羟丙基甲基纤维素；及其混合物。
崩解剂的示例包括碳酸钙，羧甲基纤维素或其盐，例如，交联羧甲基纤维素钠，交联聚维酮，低取代羟丙基纤维素，和羟基乙酸淀粉钠。
润滑剂/助流剂的示例包括滑石，硬脂酸镁，氢化植物油，硬脂酰富马酸钠，硬脂酸钙，胶体二氧化硅，硬脂酸，月桂基硫酸钠，苯甲酸钠，聚乙二醇，氢化蓖麻油，脂肪酸的蔗糖酯，微晶蜡，黄色蜂蜡，白色蜂蜡及其混合物。
调味剂的示例包括合成调味油和调味芳香剂；天然油或来自植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。这些可以包括肉桂油，冬青油，薄荷油，月桂油，茴香油，桉树油，百里香油，香草，柑橘油，包括柠檬、橙、青柠和葡萄柚油，以及水果香精，包括苹果，香蕉，葡萄，梨，桃，草莓，覆盆子，樱桃，李子，菠萝和杏子。
表面活性剂的示例包括阴离子表面活性剂，例如，磺酸或其盐，如苯磺酸，十二烷基苯磺酸或十二烷磺酸；烷基硫酸盐，例如十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠；阳离子表面活性剂，例如，四烷基铵盐如四烷基卤化铵，苄索氯铵，苯扎氯铵，或氯化十六烷基吡啶鎓；非离子型表面活性剂，例如，(聚)氧乙烯脱水山梨糖醇长链脂肪酸酯，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，例如，聚山梨酸酯；两性表面活性剂，例如甘氨酸化合物如十二烷基-二-(氨基乙基)甘氨酸，甜菜碱化合物如甜菜碱或二甲基十二烷基羧基甜菜碱，和磷脂酸衍生物如卵磷脂；聚合物型表面活性剂，例如，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇如或泊洛沙姆；及其混合物。
缓冲剂的示例包括磷酸盐缓冲剂如磷酸二氢钠，柠檬酸盐缓冲剂如柠檬酸钠，葡甲胺，三(羟甲基)氨基甲烷及其混合物。
张力调节剂的示例包括氯化钠，甘露醇，右旋糖，葡萄糖，乳糖，蔗糖及其混合物。
用于制备药物组合物的溶剂的示例包括水；水可混溶的有机溶剂，例如，异丙醇或乙醇；偶极非质子溶剂；二氯甲烷；丙酮；聚乙二醇；聚乙二醇醚；甘油单酯或甘油二酯的聚乙二醇衍生物；缓冲剂；有机溶剂；及其组合。
虽然向本发明的某些实施方式提供了下面的实施例，但是这些并不意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：锡生藤的甲醇提取物的制备
将粉碎的锡生藤地上部分(100kg)装入提取器中。加入甲醇(500升)，在室温至溶剂沸点的温度范围内进行约16小时的提取。将提取物过滤，然后储存在容器中。用300升甲醇重复提取和过滤步骤两次。过滤的提取物储存在容器中。将三种甲醇提取物合并，并在低温减压下尽可能最大程度地浓缩。将提取物倒入不锈钢盘中，然后在高真空烘箱中在室温下干燥约16小时至18小时。
产率＝6％至15％w/w
将干燥的提取物冻干形成粉末。然后将该粉末填充到合适尺寸的胶囊中。
实施例2：锡生藤的水醇(1∶1甲醇：纯化水)提取物的制备
将粉碎的锡生藤地上部分(100kg)装入提取器中。加入甲醇和纯化水的混合物(250升：250升)，在室温至溶剂沸点的温度范围内进行约16小时的提取。将提取物过滤，然后储存在容器中。提取和过滤步骤用甲醇：纯化水(150升：150升)重复两次。过滤的提取物储存在容器中。将三种水醇提取物合并，并在低温减压下尽可能最大程度地浓缩。将提取物倒入不锈钢盘中，然后在高真空烘箱中在室温下干燥约16小时至18小时。
产率＝10％至25％w/w。
实施例3：锡生藤的水性提取物的制备
将粉碎的锡生藤地上部分(100kg)装入提取器中。加入纯化水(500升)，并在室温至溶剂沸点的温度范围内进行约16小时的提取。将提取物过滤，然后储存在容器中。用300升纯化水重复提取和过滤步骤两次。过滤的提取物储存在容器中。将三种水性提取物合并，并在低温减压下最大程度地浓缩。将提取物倒入不锈钢盘中，然后在高真空烘箱中在室温下干燥约16小时至18小时。
产率＝15％至30％w/w。
实施例4：生物学活性
(a)空斑测定
在含病毒样品(250μl/孔)的系列10倍稀释液(在达氏改良伊氏培养基(DMEM)+2％热灭活胎牛血清(ΔFCS)中制备)中设双复孔感染6孔板中的LLCMK2单层。空白感染使用等体积的病毒稀释剂平行进行。两小时后，感染的单层(抽吸出病毒接种物后)用含有1％甲基纤维素(2mL/孔)的DMEM+6％ΔFCS覆盖，然后孵育6天(37℃，5％CO2)。感染后第6天，除去覆盖层，用4％甲醛溶液(1mL/孔)固定细胞。洗涤固定的细胞，然后用在20％乙醇中的0.05％(w/v)结晶紫溶液染色。计数显示的噬菌斑以确定病毒滴度，表示为噬菌斑形成单位(PFU)/ml。
(b)用于抗病毒筛选的基于细胞的生物测定
(i)1型测定：在命名为1型测定的初始抗病毒筛选测定中，将LLCMK2细胞提前一天接种于24孔板中(5×105个细胞/孔)。将DENV-1，-2，-3和-4(各100PFU)分别与本发明提取物的连续稀释液(对应于0μg/mL至100μg/mL终浓度)在300μl体积中预孵育，4℃过夜。预孵育混合物用等体积的培养基(DMEM+2％ΔFCS)稀释并用于在24孔板中感染LLCMK2细胞(每种浓度3个孔，200μl/孔)。在培养箱(37℃，5％CO2)中吸附2小时后，用含甲基纤维素的生长培养基覆盖感染的细胞，然后如空斑测定(a)所述进行处理。在不存在DENV感染的情况下将细胞暴露于本发明的提取物(在相同的浓度范围内)以评估任何潜在的细胞毒性。平行进行另外的对照实验，其包括在不存在本发明提取物的情况下用DENV感染的细胞(阳性对照)或空白感染的细胞(阴性对照)。参照阳性对照，将每种提取物针对每种DENV血清型的半数最大抑制浓度(IC50值)(其代表100％感染(或0％抑制))定义为导致空斑计数的50％抑制的提取物的浓度(μg/ml)。
(ii)2型测定：将24孔板中的LLCMK2细胞用DENV(感染复数(MOI)＝0.002)感染，而不用提取物预孵育。吸附2小时后，吸出病毒接种物，漂洗单层，然后加入含有本发明提取物的完全培养基(对应于0μg/mL-200μg/mL终浓度)。暴露于本发明的提取物24小时后，吸出单层，然后用含有甲基纤维素的生长培养基覆盖并在6天后形成斑块。
(iii)3型测定：使用Vero细胞进行3型测定。除了在将细胞依次暴露于DENV和本发明的提取物之后，用液体生长培养基而非甲基纤维素覆盖物馈给细胞以外，所述测定设计与2型测定相似。将培养上清液的等分试样定期取出达9天，以估计NS1抗原水平(使用商业ELISA试剂盒)和病毒滴度(通过空斑试验，如(a)所述)。
图1提供了抗病毒筛选测定的示意图。显示了三种类型的筛选测定(由数字1，2和3指示)的概况。多色球体代表DENV，并且带有绿色液体的Eppendorf管代表本发明的提取物。在加入单层之前将这两者预孵育(1)，或者依次加(2，3)至单层。在测定1和2中，处理过的单层用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。底部显示的是1型和2型测定的可能结果。“×”标记表示进入细胞失败。在测定3中，加入液体生长培养基而非甲基纤维素覆盖物，然后分析NS1和释放到培养上清液中的病毒。
(c)确定细胞毒性_
在两种细胞系，LLCMK2(其中测定提取物的抗病毒活性)和HepG2(用于体外细胞毒性测试的常用肝细胞代用物)中评估了细胞毒性。将接种在96孔板中的细胞暴露于宽浓度范围的本发明的提取物(1μg/mL-200μg/mL)持续3天。参照未暴露于本发明的提取物的对照细胞，使用市售MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)测定试剂盒评估细胞活力。参照代表100％细胞活力(或0％细胞毒性)的阳性对照(未处理的细胞)，提取物的半数最大细胞毒性浓度(CC50值)，定义为导致50％的细胞毒性的提取物的浓度，单位为μg/ml。提取物的选择性指数(SI)被定义为使用LLCMK2细胞系获得的CC50与IC50值之比。
(d)抑制感染性病毒和病毒抗原的分泌
在3型测定中分析本发明的提取物的病毒抑制动力学。如图2所示，在几天期间定期取出等份的培养物上清液，并分析病毒NS1抗原和感染性病毒的存在。在其中感染的细胞未暴露于提取物的对照实验中，NS1抗原从第2天开始检测到，之后在实验过程期间升高。在平行实验中，细胞对于提取物的暴露对NS1抗原分泌具有剂量依赖性抑制作用。虽然暴露于低剂量的提取物所致的抑制作用在感染后第4天表现出来，但较高剂量的抑制作用较早出现并具有较高的量级(图2A)。事实上，在该实验中测试的提取物的最高剂量(100μg/ml)下，整个实验期间的NS1抗原的抑制接近完全。该实验所显示的对病毒抗原合成的抑制显示，病毒的产生也将受到类似的影响。如图2B所示，在上述实验过程中通过确定培养物上清液中的病毒滴度证实了这一观点。在对照实验中，病毒滴度稳步增加，在感染后第3天达到平台期。如NS1分泌所见，本发明的提取物以剂量依赖性方式降低病毒滴度。因此，在所用提取物的最低浓度下，从第4天起，病毒滴度的降低变得明显。值得注意的是，早至感染后第3天，提取物剂量的小幅增加导致病毒滴度＞1log的降低。在测试的提取物的最高剂量(100μg/ml)下，病毒滴度下降约2log。重要的是，病毒滴度的降低持续几天。令人惊讶的是，与病毒滴度相比，基于NS1水平的抑制幅度似乎更大。数据显示提取物对NS1抗原合成和释放可能具有某些作用，所述作用不同于其对病毒复制的影响。
图2描绘了在不存在(空心黑圈)和存在22μg/ml(实心蓝圈)，66μg/ml(空心红方块)和200μg/ml(实心绿方块)浓度的甲醇提取物的情况下释放到培养物上清液中的NS1抗原(A)和感染性病毒(B)的动力学。
(e)确定预孵育时间和病毒剂量对抗-DENV活性的影响_
为了评估本发明的提取物的预孵育持续时间对在1型测定形式中的DENV抗病毒活性的影响，使用约50PFU的DENV-3测试0-24小时的预孵育时间。
为了评估DENV剂量的大小在预温育步骤(在4℃，过夜)中对本发明的提取物的抗-DENV功效的影响，使用从50到5000PFU的DENV-3进行1型测定。针对浓度范围为0μg/mL至200μg/mL的提取物测定每种剂量的DENV-3。
在感染(1型测定)和覆盖之前，将DENV-3与递增浓度的本发明的提取物预孵育不同的时间段。在实验结束时获得的空斑计数揭示了本发明的提取物对DENV-3的剂量和时间依赖性的杀病毒作用，如图3所示。进行了相反的实验，同样以1型形式进行，以确定提取物对DENV-3储备物的抑制功效，该储备物滴度变化超过2log。对应于50、500和5000PFU的DENV-3剂量的甲醇提取物的IC50值分别为9.92、12.5和44.45μg/ml。由此得出的结论是甲醇提取物对于宽范围的病毒载量普遍具有抗病毒效力。
图3提供了预孵育时间对本发明的甲醇提取物的抗病毒活性的影响。将DENV-3(50PFU)与11μg/ml(实心红圈)，33μg/ml(空心蓝方块)和100μg/ml(实心黑方块)的提取物预孵育不同的时间(2至24小时)，随后在1型测定中测定抗病毒活性。
(f)确定体内保护效力_
为了确定体内功效，在组织培养中，DENV-2(NGC)在AG129(颅内接种106PFU)和C6/36细胞之间交替传代。经过4至5个这样的传代周期后，在AG129小鼠中测试病毒以确定腹膜内注射的最小致死剂量(MLD)。将如此获得的攻击病毒原液滴定，等分，并储存在液氮中直至使用。为了测试本发明的提取物的保护效力，用106PFU(每只小鼠，0.4mL，腹腔注射)的攻击性DENV-2原液攻击AG129小鼠(9-12周龄，20-24g体重)。
将被攻击的小鼠分组(n＝6)，并单独用载剂(0.25％甲基纤维素)或用两种不同剂量的本发明的提取物中的一种(以125mg和250mg/kg体重)口服处理。通过蒸发完全除去给予小鼠的甲醇提取物中的甲醇。将所得不含甲醇的糊状物充分重悬于0.25％甲基纤维素水中，并口服给予感染的小鼠。根据每只动物的体重(10mL/Kg/剂量)调整口服剂量的体积，并由训练有素的兽医使用装有刻度1mL的一次性注射器的专门设计的小鼠喂食器针头给予。感染后2小时开始治疗，连续5天每天继续两次。每天监测动物的临床症状和死亡率两次，持续35天。也平行测试未经病毒攻击但接受本发明的提取物(250mg/kg)的对照组。在实验结束时，使用存活率数据绘制卡普兰-迈耶存活曲线，并使用GraphPad Prism 5软件通过对数秩检验(Mantel-Cox检验)来分析统计学显著性。
本发明人已经发现，攻击后5天用提取物(无甲醇)口服处理的受攻击的小鼠的中值存活时间(MST)以剂量依赖性方式增加。存活率数据见图4。受攻击的小鼠的MST在实验条件下为19天。以125mg/Kg的剂量，每天两次给药持续5天，存活率为50％并且MST为28天(p＝0.1)。当剂量加倍时，这增加到约67％。与安慰剂处理(0.25％甲基纤维素)组相比，250mg/Kg剂量所提供的保护水平具有统计学显着性(p＝0.021)。
图4提供了体内甲醇提取物的保护效力的评估。将AG129小鼠(9-12周龄)腹膜内注射106PFU脑传代的DENV-2。
用0.25％甲基纤维素(实心红方块)或125mg(空心蓝圈)和250mg/kg体重(实心蓝圈)的甲醇提取物口服治疗感染的小鼠。治疗在前5天每天进行两次。采用没有病毒感染，但口服接受较高剂量的甲醇提取物(实心绿方块)的对照组进行平行测试。每天监测小鼠的死亡率，并将所得数据绘制成卡普兰-迈耶存活曲线。用对数秩检验确定评价甲醇提取物处理组和安慰剂(0.25％甲基纤维素)处理组之间在第35天存活率的统计学显著性的p值。
(g)确定扑热息痛的作用_
扑热息痛和本发明的提取物之间的相互作用使用1型测定形式进行体外评估。将DENV-3(约50PFU)和本发明的提取物(浓度范围为0μg/mL至50μg/mL)在4℃在100μl的体积中预孵育过夜，并用于感染24孔板中的LLCMK2细胞。除了DENV和本发明的提取物以外，使用含扑热息痛(1μg/mL-100μg/mL)的预孵育混合物建立平行感染。也平行建立和分析空白感染和仅DENV的感染(在没有提取物和扑热息痛的情况下)。
使用Wistar大鼠发热模型评估本发明的提取物在存在和不存在扑热息痛下的体内作用。使用任意性别的Wistar大鼠(体重180-220g)。使用数字直肠温度计测量大鼠的基础温度；然后用20％啤酒酵母(brewer′s yeast，10mL/Kg体重)皮下(在肩胛内区域)注射大鼠，并使其禁食过夜，可自由饮水。在注射后18小时，再次记录直肠温度以鉴定体温上升≥0.7℃的动物以包括在研究中。发热大鼠组(n＝7至9)口服给予扑热息痛(200mg/Kg)或本发明的提取物(200mg/Kg)或两者。对照组中的大鼠只接受载剂(0.5％甲基纤维素)。随后以30分钟间隔记录直肠温度持续3小时。
来自对甲醇提取物和扑热息痛的研究的数据描述于图5。进行1型测定，其中将DENV-3与连续稀释的甲醇提取物一起预孵育。观察到随着甲醇提取物浓度增加，DENV-3感染性被逐渐抑制，IC50值为6.1μg/mL。在DENV-3/甲醇提取物预孵育混合物中加入高达100μg/mL扑热息痛不会显著影响提取物的抑制特性。在1、10、和100μg/mL的扑热息痛存在下计算的IC50值分别为8.4、7.4、和8.5μg/mL(图5A)。扑热息痛本身在所测试的所有浓度下对DENV感染性没有任何影响(单独DENV-3和DENV-3加100μg/mL扑热息痛获得的空斑计数分别为43±3和45±4；n＝3)。下一个实验使用Wistar大鼠发热模型研究了甲醇提取物对扑热息痛的解热活性的影响。令人惊讶的是，这个实验显示甲醇提取物具有固有的解热作用(图5B)。当通过皮下注射啤酒酵母引起发热的大鼠用甲醇提取物处理时，发热被抑制的效率与扑热息痛相当。令人惊讶的是，甲醇提取物与扑热息痛的共同给予具有协同作用，导致体温下降更为显着。
图5提供了扑热息痛和甲醇提取物之间相互作用的分析。
(A)在没有(实心黑菱形)或存在1μg/mL(实心蓝菱形)，10μg/mL(实心红圈)，或100μg/mL(实心绿圈)的扑热息痛的情况下，用甲醇提取物在4℃下过夜预孵育DENV-3(50PFU)，然后分析1型测定中的病毒抑制。
(B)将发热Wistar大鼠用空白处理(空心红圈)或用扑热息痛(实心蓝圈)，甲醇提取物(空心绿方块)或两者的组合(实心黑方块)处理，然后在处理后3小时定期监测它们的直肠温度。
对照组和治疗组之间的直肠温度采用单向ANOVA，然后进行Dunnett′s多重比较检验进行比较(单星和双星表示处理组相对于对照组的显著差异，分别对应于≤0.05和≤0.01的p值)。
(h)确定对血小板和红细胞的作用_
对于离体研究，在离心(1500×g，5分钟)中使红细胞从新鲜收集的肝素化人血液中沉淀下来，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)彻底清洗，并用于制备PBS中的1％细胞悬浮液。将浓度范围为12.5mg/L至400mg/L的本发明的提取物加入到红细胞悬浮液中，然后在37℃下孵育1小时。此后，将样品离心，并在576nm处测量上清液的吸光度以确定红细胞裂解的程度。其中红细胞与单独的缓冲液(0％裂解)，单独的DMSO和0.1％曲通X-100(100％裂解)一起孵育的对照平行进行处理。使用Beckman Coulter血液分析仪测定在新鲜收集的肝素化血液和用DMSO(载剂)或本发明的提取物(2μg/mL至10μg/ml)预孵育不同持续时间(1至4小时)的血液中的基础血小板计数。
对于体内研究，四组(n＝5)Wistar大鼠禁食过夜，然后口服给予载剂(0.25％甲基纤维素)或三种不同的剂量(100，300和1000mg/Kg体重)的本发明的提取物。在刚好给予提取物之前(0小时)和给予后1小时和4小时收集血液。使用ADVIA-120血液分析仪测量血液学参数。
图6提供了甲醇提取物对血小板的作用。收集来自人类志愿者的全血并在与甲醇提取物混合之前和之后1至4小时获得血小板计数。结果示于图6A。在与载剂(盐水)混合的血液的对照样品中，血小板计数随时间稳定下降。甲醇提取物处理的血液样品在血小板计数方面相对于其同源对照在2小时内没有表现出统计学显着的变化(p＞0.05)。与相应的盐水处理的对照相比，在4小时时，甲醇提取物处理的样品显示明显更高的(p＜0.05)血小板计数。在2μg/mL和10μg/mL甲醇提取物浓度下观察到类似的结果，表明甲醇提取物不会不利地影响血小板。还使用Wistar大鼠在体内实验中评估甲醇提取物对血小板的作用。在这个实验中，从测定已经口服给予甲醇提取物的大鼠的血液中的血小板计数。图6B中显示的结果显示，处理后长达4小时，甲醇提取物(高达1000mg/kg体重)不显着影响血小板计数(在最高剂量的甲醇提取物处理4小时时p＞0.05)。
图6(A)：将新鲜收集的人血与盐水(白色条)或甲醇提取物(2μg/mL：蓝色条；10μg/mL：红色条)一起孵育长达4小时。在指定的时间抽取等分试样以测定血小板计数。
图6(B)：Wistar大鼠口服给予含有0.25％甲基纤维素的甲醇提取物，范围为0-1000mg/Kg体重。
分析在给予后0小时(白色条)，1小时(蓝色条)和4小时(红色条)从这些大鼠采集的新鲜血液的血小板计数。对于两个组图，显示的数据是平均值(n＝5)；竖线代表标准偏差(SD)。
甲醇提取物对红细胞的作用也在体外和体内测定中进行评估，如同对上述血小板所做的那样。图7提供了甲醇提取物对RBC的作用。新鲜收集的人类红细胞与高达400μg/L浓度的甲醇提取物孵育不会造成明显的溶血(图7A)。还分析了从Wistar大鼠(给予甲醇提取物，如上所述)取出的血液样品的红细胞计数。该分析再次揭示了甲醇提取物(浓度高达1000mg/Kg体重)在给予后4小时不影响Wistar大鼠血液中的红细胞计数(图7B)。处理和未处理的大鼠之间的红细胞计数差异是统计学不显著的(p＞0.05)。本发明人还分析了经甲醇提取物处理的Wistar大鼠(描述于图6B和7B)的血液中的总白细胞和差异计数，并且没有发现显著差异。
图7(A)：将来自新鲜收集的人血的红细胞在37℃下用不同浓度的甲醇提取物(0μg/mL-400μg/ml)孵育1小时，随后在576nm测量溶血。TX-100代表对照，其中用曲通X-100处理等量的红细胞以实现完全裂解。
图7(B)：分析在给予后0小时(白色条)，1小时(蓝色条)和4小时(红色条)从甲醇提取物处理的Wistar大鼠收集的新鲜血液的RBC计数。显示的数据是平均值(n＝5)；竖线代表SD。
(i)细胞因子释放测定
将新鲜收集的肝素化血液用等量的RPMI 1640培养基稀释，然后在FicollHypaque 1077上分层，然后在室温下以2500rpm离心25分钟。弃去上层，收集相间的松散层，冲洗，然后以5×105个细胞/mL重新悬浮于RPMI 1640中以获得人外周血单核细胞(PBMC)。将新鲜收集的PBMC接种于96孔板(105个细胞/孔)中，并用不同稀释度(在RPMI 1640中)的本发明的提取物处理，然后在室温下在旋转振荡器(200rpm)中孵育30分钟。接下来，将孔用50μl(4μg/mL)脂多糖处理，并使其在室温下进一步孵育30分钟。使用RPMI+10％FCS将每孔的体积补足至200μl，并将平板在37℃下在CO2培养箱中孵育过夜。平行采用阴性对照(不含脂多糖处理)。将板离心(3000rpm，10分钟)以获得澄清的上清液，用于使用商业ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-1β。
甲醇提取物能高效抑制TNF-α和IL-1β的分泌，IC50值分别为6.1±1.3和5.7±2.7μg/mL。MTT测定显示，在这些浓度下，甲醇提取物在两种测试的细胞系中都没有明显的细胞毒性(CC50在HepG2中为78.9μg/ml；在LLCMK2中为＞200μg/ml)。这些数据显示甲醇提取物的抗炎活性。
(j)毒理学
5只成年Wistar大鼠组每天一次口服给予4mL 0.25％甲基纤维素(赋形剂)/Kg或4mL含有400mg-2000mg本发明的提取物的载剂/kg，持续7天(根据OECD准则-407)。在此期间，每天监测食物摄入量，体重和临床体征。在实验结束时，将动物安乐死，随后测定血液学参数(Hb，WBC计数，RBC计数，血小板计数和血细胞比容)和生化参数(SGOT，SGPT，总蛋白，血清白蛋白，总胆固醇，尿素，肌酸酐和随机糖)。进行尸检。记录器官重量并进行组织病理学检查。
结果显示，与载剂处理的对照相比，用高达2000mg/kg体重处理的动物在这些参数中的任一个中都没有显示出任何显著变化。

Claims (22)

1.一种用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的药物组合物，包含：
(a)锡生藤(Cissampelos pareira)提取物；和
(b)扑热息痛
其中(a)和(b)作为单一药物组合物一起给予或者同时或依次共同给予。
2.一种治疗登革病毒感染的方法，包括给予权利要求1所述的药物组合物。
3.一种锡生藤提取物，用于在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量。
4.一种在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量的方法，包括给予锡生藤提取物。
5.一种用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的锡生藤提取物，其中所述提取物显示出血小板保护作用。
6.一种治疗哺乳动物中登革病毒感染的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示出血小板保护作用。
7.一种用于治疗哺乳动物中登革病毒感染的锡生藤提取物，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
8.一种治疗哺乳动物中登革感染的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
9.如权利要求1、3、5或7中任一项所述的提取物，其中所述提取物选自醇提取物、水醇提取物、或水性提取物。
10.如权利要求9所述的提取物，其中所述醇提取物选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、和叔丁醇提取物。
11.如权利要求2、4、6或8中任一项所述的方法，其中所述提取物选自醇提取物、水醇提取物、或水性提取物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述醇提取物选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、和叔丁醇提取物。
13.一种锡生藤提取物，用于在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量，其中所述提取物显示出血小板保护作用。
14.一种在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示出血小板保护作用。
15.一种锡生藤提取物，用于在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
16.一种在哺乳动物中治疗登革病毒感染的早期降低病毒载量的方法，包括给予锡生藤提取物，其中所述提取物显示出红细胞保护作用。
17.一种药物组合物，其包含权利要求13、14、15或16所述的提取物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自稀释剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，助流剂，聚合物，调味剂，表面活性剂，防腐剂，抗氧化剂，缓冲剂，和张力调节剂。
19.如权利要求13或15所述的提取物，其中所述提取物选自醇提取物、水醇提取物、或水性提取物。
20.如权利要求14或16所述的方法，其中所述提取物选自醇提取物、水醇提取物、或水性提取物。
21.如权利要求19所述的提取物，其中所述醇提取物选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、和叔丁醇提取物。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述醇提取物选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、和叔丁醇提取物。
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