JP2018522849A - デング熱を治療するためのシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）抽出物の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物、その医薬組成物、並びにデング熱の予防及び治療におけるその治療的使用に関する。本発明はまた、これらの抽出物の調製方法に関する。

Description

本発明は、シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物、その医薬組成物、並びにデング熱の予防及び治療におけるその治療的使用に関する。本発明はまた、これらの抽出物の調製方法に関する。

デング熱は依然として世界の主要な公衆衛生上の懸念である。デング熱の発生率は、近年世界中で劇的に増加している。デング熱は、世界中の熱帯及び亜熱帯の気候で、主に都市部及び準都市部で発生する。重度のデング熱は、多くのアジア及びラテンアメリカ諸国の子供の間での深刻な疾患及び死亡の主因である。世界保健機関（ＷＨＯ）の推計によると、世界中の約２５億人の人々がデング熱の危険にさらされており、世界中で毎年約５千万件の感染がある。デング熱は、病気を引き起こすウイルスの保因者として働くヤブカを介してヒトに伝染する。フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属する４種の血清型のデングウイルス（ＤＥＮＶ−１、−２、−３、及び−４）が存在する。１つの血清型のデングウイルスによる感染からの回復は、その特定の血清型に対する生涯免疫を提供する。しかしながら、回復後の他の血清型に対する交差免疫は部分的且つ一時的にすぎない。他の血清型によるその後の感染は、重度のデング熱を発症するリスクを増加させる。ＤＥＮＶによる感染症は無症候性である、又は軽度のデング熱（ＤＦ）から重度及び潜在的に致死性のデング出血熱（ＤＨＦ）並びにデングショック症候群（ＤＳＳ）までの範囲の臨床症状をもたらし得る。軽度のデング熱の臨床症状には、高熱、重度の頭痛、目の後ろの痛み、筋肉及び関節の痛み、吐き気、嘔吐、腫れた腺、並びに発疹が含まれる。症状は通常、感染した蚊の刺咬後４〜１０日間の潜伏期間の後、２〜７日間持続する。重度のデング熱の臨床症状は、血漿漏出、体液蓄積、呼吸困難、重度の出血、又は臓器障害により現れる。ヒトの健康と世界経済の両方に驚くべき影響を与えているにもかかわらず、デング熱の具体的な治療法はまだ入手可能でない。いくつかの生きた弱毒化デング熱ワクチンが開発されているが、デング熱ワクチン開発で直面する課題は依然として高いままである。

従って、病気の持続時間を短縮し、一般的な症状の重症度を減少させ、重篤な合併症の発症を予防し、製剤化し易い有効なデング熱治療が緊急に必要とされている。更に、デング熱及び生命を脅かす重度の型のデング熱を潜在的に防ぐことができるように初期にウイルス負荷を減少させることができるデング熱治療を開発することが非常に望ましい。

本発明は、有効で患者に適合したデング熱治療を提供することによって、この満たされていない必要性を満たす。シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）抽出物は、デングウイルス疾患を有効に予防及び治療するのに役立つ。本発明者らは、シサムペロス・パレイラ・リン（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ Ｌｉｎｎ）の抽出物（Ｃｉｐａ抽出物）が、ＥＬＩＳＡを用いたウイルスＮＳ１抗原分泌及びプラークアッセイに基づくウイルス複製に関して評価される、細胞に基づくアッセイにおいて４種全てのＤＥＮＶの強力な阻害剤であることを見出した。ウイルス収量減少アッセイは、シサムペロス・パレイラの抽出物がウイルス力価を１桁減少させることを示した。シサムペロス・パレイラの抽出物は、ＡＧ１２９マウスモデルを用いてＤＥＮＶ感染からの統計学的に有意な保護を与えた。驚くべきことに、シサムペロス・パレイラ抽出物の効力は、生命を脅かす重度の型のデング熱をその後予防することができる初期段階のウイルス負荷を含む広範なウイルス負荷に及ぶことが発見された。更に、本発明者らは、シサムペロス・パレイラ抽出物とパラセタモールの両方が、体温を低下させることにおいて相乗効果を示すと決定した。また、デング病は、ある患者に出血症状を呈しやすくし、血小板数の低下に関連する傾向がある。そのため、シサムペロス・パレイラ抽出物が赤血球及び血小板に対する望ましくない効果を有するかどうかを評価することも重要となる。本発明者らは、シサムペロス・パレイラ抽出物が、血小板数にも赤血球生存率にも何ら識別可能な効果を有さないと決定した。本発明者らはまた、抽出物が前炎症性サイトカイン、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの分泌を下方制御する能力も有していることを決定した。更に、シサムペロス・パレイラの抽出物は毒性の証拠を示さなかった。

発明の概要
本発明は、シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物、その医薬組成物、並びにデング熱の予防及び治療におけるその治療的使用を提供する。本発明はまた、これらの抽出物の調製方法に関する。本発明は更に、哺乳動物におけるデングウイルスに対するこれらの抽出物の活性を提供する。更に、本発明は、パラセタモールと組み合わせたシサムペロス・パレイラ抽出物の相乗的解熱効果を提供する。本発明はまた、血小板数及び赤血球生存率に悪影響を及ぼさないシサムペロス・パレイラ抽出物の抗炎症効果を提供する。更に、これらの抽出物はいかなる毒性効果も示さなかった。

抗ウイルススクリーニングアッセイの概略図である。 メタノール抽出物の処理によるＤＥＮＶ抗原及びウイルス産生の阻害を示す図である。 メタノール抽出物の抗ウイルス活性に対するプレインキュベーション時間の効果を示す図である。 メタノール抽出物のインビボ保護有効性の評価を示す図である。 パラセタモールとメタノール抽出物との間の相互作用の分析を示す図である。 血小板に対するメタノール抽出物の効果を示す図である。 ＲＢＣに対するメタノール抽出物の効果を示す図である。

本発明の第１の態様は、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するための、シサムペロス・パレイラの抽出物を提供する。

本発明の第２の態様は、シサムペロス・パレイラの抽出物と１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するための医薬組成物を提供する。

本発明の第３の態様は、（ａ）シサムペロス・パレイラの抽出物；及び（ｂ）パラセタモール；を含み、（ａ）及び（ｂ）が、単一医薬組成物として一緒に投与される、又は同時に若しくは連続的に併用される、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するための医薬組成物を提供する。

本発明の第４の態様は、（ａ）シサムペロス・パレイラの抽出物；及び（ｂ）パラセタモール；を含む医薬組成物を投与することを含み、（ａ）及び（ｂ）が、単一医薬組成物として一緒に投与される、又は同時に若しくは連続的に併用される、哺乳動物におけるデングウイルス感染症を治療する方法を提供する。

本発明の第５の態様は、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるための、シサムペロス・パレイラの抽出物を提供する。

本発明の第６の態様は、シサムペロス・パレイラの抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させる方法を提供する。

本発明の第７の態様は、血小板保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するためのシサムペロス・パレイラの抽出物を提供する。

本発明の第８の態様は、血小板保護効果を示すシサムペロス・パレイラの抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症を治療する方法を提供する。

本発明の第９の態様は、赤血球保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するためのシサムペロス・パレイラのを提供する。

本発明の第１０の態様は、赤血球保護効果を示すシサムペロス・パレイラの抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデング熱感染症を治療する方法を提供する。

本発明の第１１の態様は、血小板保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるためのシサムペロス・パレイラの抽出物を提供する。

本発明の第１２の態様は、血小板保護効果を示すシサムペロス・パレイラの抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させる方法を提供する。

本発明の第１３の態様は、赤血球保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるためのシサムペロス・パレイラの抽出物を提供する。

本発明の第１４の態様は、赤血球保護効果を示すシサムペロス・パレイラの抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させる方法を提供する。

本発明の第１５の態様は、血小板保護効果を示すシサムペロス・パレイラの抽出物と、１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるための医薬組成物を提供する。

本発明の第１６の態様は、赤血球保護効果を示すシサムペロス・パレイラの抽出物と、１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるための医薬組成物を提供する。

上記態様の一実施形態では、抽出物がアルコール抽出物、水アルコール抽出物、又は水性抽出物である。好ましい実施形態では、抽出物がアルコール抽出物である。より好ましい実施形態では、抽出物がメタノール抽出物である。メタノール抽出物中のメタノールを蒸発によって完全に除去して乾燥抽出物を得ることができる。乾燥抽出物を凍結乾燥させて粉末を形成し、次いで、これを適切なサイズのカプセルに充填することができる。

上記態様の別の実施形態では、シサムペロス・パレイラの抽出物がデングウイルス感染症の予防に使用される。

シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）はツヅラフジ科（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ）に属し、アジア、東アフリカ、並びに北米及び南米の温暖地域の至る所に分布する登山用の低木で、インド及びスリランカでは一般的である。これはベルベットリーフ又はパサ（Ｐａｔｈａ）あるいはアンバササキ（Ａｍｂａｓｔｈａｋｉ）とも呼ばれている。これは、約１５００メートルの高度までのインドの熱帯及び亜熱帯地域の温暖で乾燥した地域で一般的である。これは、ヒマーチャル・プラデーシュ、チョーター・ナーグプル、ビハール、西ベンガル、パンジャブ、ラジャスタン、特にアラバリの東、マハラシュトラの丘陵性の森林、コンカン、デカン、マイソールのババブダンヒルズ、及びタミル・ナードゥに見られる（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｉｎｄｉａ、第１版、第１部、第１巻、９２〜９３頁；Ｇｏｖｔ．ｏｆ Ｉｎｄｉａ、Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｆａｍｉｌｙ Ｗｅｌｆａｒｅ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｉｎｄｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ、ニューデリー；Ｔｈｅ Ｗｅａｌｔｈ ｏｆ Ｉｎｄｉａ、Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｉａｎ Ｒａｗ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒａｗ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、第ＩＩ巻、Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、デリー；Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔｓ Ｕｓｅｄ Ｉｎ Ａｙｕｒｖｅｄａ、第２巻、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ａｙｕｒｖｅｄａ ａｎｄ Ｓｉｄｄｈａ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｉｎｄｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｏｍｏｅｏｐａｔｈｙ、ニューデリー）。

パラセタモールは化学的にＮ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミドである。これは一般的にアセトアミノフェンとしても知られている。これは、長年にわたって使用されている周知の解熱剤である。本発明は、パラセタモールとシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物の相乗的解熱効果を提供する。本発明は、デングウイルス感染症を治療又は予防するための、シサムペロス・パレイラの抽出物と組み合わせたパラセタモールの安全か且つ有効な使用を組み込んでいる。パラセタモールとシサムペロス・パレイラの抽出物は単一の医薬組成物として一緒に投与することができる、又は同時に若しくは連続的に併用することができる。

本明細書で使用される「アルコール抽出物」という用語は、シサムペロス・パレイラの任意のアルコール系抽出物、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、又はｔ−ブタノール抽出物を含む。特に、アルコール抽出物はメタノール抽出物である。

本明細書で使用される「水アルコール抽出物」という用語は、アルコールと精製水の混合物を用いて調製された抽出物を含む。アルコールの例は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、及びｔ−ブタノールである。特に、アルコールと精製水の１：１混合物が使用される。

本明細書で使用される「水性抽出物」という用語は、シサムペロス・パレイラの精製水抽出物を含む。

シサムペロス・パレイラの抽出物は、シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の植物塊を、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、ｔ−ブタノール、精製水、及びこれらの混合物から選択される１又は複数の溶媒で抽出し、抽出物を濃縮し、抽出物を乾燥させることによって調製される。

本明細書で使用される「シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の植物塊」という用語は、地上部、例えば果実、花、葉、枝、茎皮、茎、種子、又は心材、及び根を含む全植物を指す。

本明細書で使用される「最小致死量（ＭＬＤ）」という用語は、臨床症状及び曝露３〜４週間後に９０％〜１００％の死を引き起こし得る用量を指す。

本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物を所望の作用部位に有効に送達してデングウイルス感染症を治療又は予防することができる任意の組成物を含む。組成物は、経口、経鼻、肺、経皮、又は直腸等の任意の適切な投与経路によって送達することができる。医薬組成物は、１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。経口医薬組成物は、粉末、ペレット、顆粒、スフェロイド、ミニ錠剤、カプレット剤、錠剤、又はカプセル剤の形態であり得る。粉末は、薬学的に許容される賦形剤と共に適切なサイズのカプセルに充填された凍結乾燥粉末の形態であり得る。

本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、滑剤、ポリマー、香味剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤、緩衝液、及び張力調整剤を含む。

希釈剤の例としては、微結晶セルロース、粉末セルロース、デンプン、α化デンプン、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）、ラクチトール、フルクトース、圧縮糖（ｓｕｇａｒ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）、砂糖菓子（ｓｕｇａｒ ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒ）、デキストロース、ラクトース、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及びこれらの混合物が挙げられる。

結合剤の例としては、水溶性デンプン、例えばα化デンプン；多糖、例えば寒天、アラビアゴム、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、トラガカントガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ペクチン、又はコンドロイチン硫酸ナトリウム；合成ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリ乳酸、又はポリエチレングリコール；セルロースエーテル、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース；及びこれらの混合物が挙げられる。

崩壊剤の例としては、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース又はその塩、例えばクロスカルメロースナトリウム、架橋ポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、及びデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられる。

潤滑剤／滑剤の例としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、硬化植物脂、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、「Ａｅｒｏｓｉｌ」（登録商標）、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、硬化ヒマシ油、脂肪酸のスクロースエステル、微晶質ワックス、黄蜜蝋、白蜜蝋、及びこれらの混合物が挙げられる。

香味剤の例としては、合成香味油及び香味芳香剤；植物、葉、花、及び果実からの天然油又は抽出物；並びにこれらの組み合わせが挙げられる。これには、ケイヒ油、ウインターグリーン油、ペパーミント油、ベイ油、アニス油、ユーカリ、タイム油、バニラ、シトラス油（レモン、オレンジ、ライム、及びグレープフルーツを含む）、並びに果実エッセンス（リンゴ、バナナ、ブドウ、ナシ、モモ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、及びアプリコットを含む）が含まれ得る。

界面活性剤の例としては、アニオン性界面活性剤、例えば、スルホン酸又はその塩（ベンゼンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸若しくはドデカンスルホン酸など）；アルキル硫酸塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム；カチオン性界面活性剤、例えばテトラアルキルアンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウムハライド、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム若しくは塩化セチルピリジニウム等）；非イオン性界面活性剤、例えば（ポリ）オキシエチレンソルビタン長鎖脂肪酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、例えばポリソルベート等）；両性界面活性剤、例えばグリシン化合物（ドデシル−ジ−（アミノエチル）グリシン等）、ベタイン化合物（ベタイン又はジメチルドデシルカルボキシベタイン等）、並びにホスファチジン酸誘導体（レシチンなど）；ポリマー界面活性剤、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」（登録商標）又はポロキサマーなど）；並びにこれらの混合物が挙げられる。

緩衝剤の例としては、リン酸緩衝液（リン酸二水素ナトリウム等）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム等）、メグルミン、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。

張力調整剤の例としては、塩化ナトリウム、マンニトール、デキストロース、グルコース、ラクトース、スクロース、及びこれらの混合物が挙げられる。

医薬組成物を調製するための溶媒の例としては、水；水混和性有機溶媒、例えばイソプロピルアルコール又はエタノール；双極性非プロトン性溶媒；塩化メチレン；アセトン；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールエーテル；モノ−又はジ−グリセリドのポリエチレングリコール誘導体；緩衝液；有機溶剤；及びこれらの組み合わせが挙げられる。

以下の実施例は本発明の一定の実施態様に提供されるが、これらは本発明の範囲を限定することを意図していない。

実施例１：シサムペロス・パレイラのメタノール抽出物の調製
微粉砕されたシサムペロス・パレイラ地上部（１００ｋｇ）を抽出器に装入した。メタノール（５００リットル）を添加し、室温〜溶媒の沸点に及ぶ温度で抽出を約１６時間行った。抽出物を濾過し、次いで、容器に保存した。抽出及び濾過工程を、メタノール３００リットルを用いて２回繰り返した。濾過抽出物を容器に保存した。３つのメタノール抽出物を合わせ、減圧下低温で最大限に濃縮した。抽出物をステンレス鋼トレイにデカントし、次いで、高真空オーブン中室温で約１６時間〜１８時間乾燥させた。

収率＝６％〜１５％ｗ／ｗ

乾燥抽出物を凍結乾燥して粉末を形成した。次いで、この粉末を適切なサイズのカプセルに充填した。

実施例２：シサムペロス・パレイラの水アルコール（１：１メタノール：精製水）抽出物の調製
微粉砕されたシサムペロス・パレイラ地上部（１００ｋｇ）を抽出器に装入した。メタノールと精製水の混合物（２５０Ｌ：２５０Ｌ）を添加し、室温〜溶媒の沸点に及ぶ温度で抽出を約１６時間行った。抽出物を濾過し、次いで、容器に保存した。抽出及び濾過工程を、メタノール：精製水（１５０Ｌ：１５０Ｌ）を用いて２回繰り返した。濾過抽出物を容器に保存した。３つの水アルコール抽出物を合わせ、減圧下低温で最大限に濃縮した。抽出物をステンレス鋼トレイにデカントし、次いで、高真空オーブン中室温で約１６時間〜１８時間乾燥させた。

収率＝１０％〜２５％ｗ／ｗ

実施例３：シサムペロス・パレイラの水性抽出物の調製
微粉砕されたシサムペロス・パレイラ地上部（１００ｋｇ）を抽出器に装入した。精製水（５００Ｌ）を添加し、室温〜溶媒の沸点に及ぶ温度で抽出を約１６時間行った。抽出物を濾過し、次いで、容器に保存した。抽出及び濾過工程を、精製水３００Ｌを用いて２回繰り返した。濾過抽出物を容器に保存した。３つの水性抽出物を合わせ、減圧下低温で最大まで濃縮した。抽出物をステンレス鋼トレイにデカントし、次いで、高真空オーブン中室温で約１６時間〜１８時間乾燥させた。

収率＝１５％〜３０％ｗ／ｗ。

実施例４：生物学的活性
（ａ）プラークアッセイ
６ウェルプレート中のＬＬＣＭＫ２単層を、ウイルス含有試料（２５０μｌ／ウェル）の連続１０倍希釈物（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２％熱不活性化ウシ胎児血清（ΔＦＣＳ）中で調製）に２連で感染させた。擬感染を、等量のウイルス希釈剤のみを用いて並行して実施した。２時間後、感染単層（ウイルス接種材料を吸引した後）に１％メチルセルロースを含有するＤＭＥＭ＋６％ΔＦＣＳ（２ｍＬ／ウェル）を重層し、次いで６日間（３７℃、５％ＣＯ_２）インキュベートした。感染後６日目に、重層を除去し、細胞を４％ホルムアルデヒド溶液（１ｍＬ／ウェル）で固定した。固定した細胞を洗浄し、次いで、２０％エタノール中０．０５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット溶液で染色した。明らかになったプラークを計数して、プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌとして表されるウイルス力価を決定した。

（ｂ）抗ウイルススクリーニングのための細胞に基づくバイオアッセイ
（ｉ）１型アッセイ：１型アッセイとして指定された最初の抗ウイルススクリーニングアッセイにおいて、ＬＬＣＭＫ２細胞を１日前に２４ウェルプレートに播種した（５×１０^５個細胞／ウェル）。ＤＥＮＶ−１、−２、−３、及び−４（それぞれ１００ＰＦＵ）を、別々に、４℃で一晩、３００μｌ体積の本発明の抽出物の連続希釈物（最終濃度０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬに相当）とプレインキュベートした。プレインキュベーション混合物を等体積の培地（ＤＭＥＭ＋２％ΔＦＣＳ）で希釈し、これを使用して２４ウェルプレートでＬＬＣＭＫ２細胞（２００μｌ／ウェルで各濃度について３ウェル）に感染させた。インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）中で２時間吸着させた後、感染細胞にメチルセルロース含有増殖培地を重層し、その後、プラークアッセイ（ａ）について記載されるように処理した。潜在的な細胞傷害性を評価するために、細胞をＤＥＮＶ感染の非存在下で（同じ濃度範囲の）本発明の抽出物に曝露した。偽感染（陰性対照）又は本発明の抽出物の非存在下でＤＥＮＶに感染した（陽性対照）細胞を含む追加の対照実験を並行して行った。１００％感染（又は０％阻害）を示す陽性対照に関して、各ＤＥＮＶ血清型に対する各抽出物の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０値）を、プラーク数の５０％の阻害をもたらす抽出物の濃度（μｇ／ｍｌ）として定義した。

（ｉｉ）２型アッセイ：２４ウェルプレート中のＬＬＣＭＫ２細胞を、抽出物とプレインキュベートすることなくＤＥＮＶ（感染多重度（ＭＯＩ）＝０．００２）に感染させた。２時間の吸着後、ウイルス接種材料を吸引し、単層をすすぎ、次いで、本発明の抽出物を含有する完全培地（最終濃度０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬに相当）を供給した。本発明の抽出物への２４時間の曝露後、単層を吸引し、次いで、メチルセルロースを含有する増殖培地を重層すると、６日後にプラークが発達した。

（ｉｉｉ）３型アッセイ：Ｖｅｒｏ細胞を用いて、３型アッセイを行った。アッセイ設計は、ＤＥＮＶ及び本発明の抽出物への細胞の連続的曝露の後、細胞にメチルセルロース重層の代わりに液体増殖培地を供給したことを除いて、２型アッセイと同様であった。培養上清のアリコートをＮＳ１抗原レベル（市販ＥＬＩＳＡキットを使用）及びウイルス力価（（ａ）に記載されるプラークアッセイによる）の推定のために最大９日までの周期的間隔で採取した。

図１は抗ウイルススクリーニングアッセイの概略図を提供する。３つの型のスクリーニングアッセイ（数字１、２、及び３で示される）の概要を示す。多色の球はＤＥＮＶを表し、緑色液体を含むエッペンドルフ管は本発明の抽出物を表す。これらの２つを、単層に添加する前に予めインキュベート（１）、又は単層に順次添加した（２、３）。アッセイ１及び２では、処理した単層にメチルセルロース含有増殖培地を重層した。一番下に示すのは、１型アッセイ及び２型アッセイの考えられる結果である。「ｘ」マークは、細胞への侵入の失敗を示す。アッセイ３では、メチルセルロース重層の代わりに液体増殖培地を添加し、引き続いて培養上清中に放出されたＮＳ１及びウイルスの分析を行った。

（ｃ）細胞傷害性の測定
細胞傷害性を、２つの細胞株、ＬＬＣＭＫ２（抽出物の抗ウイルス活性をアッセイした）及びＨｅｐＧ２（インビトロ細胞傷害性試験のために一般的に使用される肝細胞代用物）で評価した。９６ウェルプレートに播種した細胞を、広い濃度範囲の本発明の抽出物（１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ）に３日間曝露した。本発明の抽出物に曝露していない対照細胞に関して、市販のＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイキットを用いて細胞生存率を評価した。１００％細胞生存率（又は０％細胞傷害性）を表す陽性対照（未処理細胞）に関連して、抽出物についての５０％細胞傷害性濃度（ＣＣ_５０値）を、５０％の細胞傷害性をもたらす抽出物の濃度（μｇ／ｍｌ）として定義した。抽出物の選択指数（ＳＩ）は、ＬＬＣＭＫ２細胞株を用いて得られるＣＣ_５０値とＩＣ_５０値の比として定義される。

（ｄ）ウイルス抗原及び感染性ウイルスの分泌の阻害
本発明の抽出物によるウイルス阻害の動力学を、３型アッセイで分析した。培養上清のアリコートを数日間にわたって一定間隔で採取し、図２に示すように、ウイルスＮＳ１抗原及び感染性ウイルスの存在について分析した。感染細胞を抽出物に曝露しなかった対照実験では、ＮＳ１抗原が２日目以降検出可能であり、その後、実験の過程中に上昇した。並行実験で、細胞の抽出物への曝露は、ＮＳ１抗原分泌に対する用量依存的阻害効果を有した。低用量の抽出物への曝露に起因する阻害が感染後４日目に現れたが、高用量での阻害は、より早く且つ比較的高い規模で明らかであった（図２Ａ）。実際、この実験で試験した抽出物の最高用量（１００μｇ／ｍｌ）では、ＮＳ１抗原の阻害は、実験の全期間にわたってほぼ完全であった。この実験から自明なウイルス抗原合成の阻害は、ウイルス産生も同様に影響を受けることを示している。この概念は、図２Ｂに示すように、上記実験の過程で培養上清中のウイルス力価の測定によって実証された。対照実験では、ウイルス力価が着実に増加し、感染後３日目にプラトーに達した。本発明の抽出物はＮＳ１分泌について見られるように用量依存的にウイルス力価を低下させた。従って、使用される抽出物の最低濃度では、４日目以降、ウイルス力価の減少が明らかになった。重要なことに、抽出物の投与量の僅かな増加は、感染後３日目の早い時点でウイルス力価の１対数超の減少をもたらした。試験した抽出物の最高用量（１００μｇ／ｍｌ）では、ウイルス力価の低下は約２対数であった。重要なことに、ウイルス力価の減少は数日間にわたって持続した。驚くべきことに、阻害の大きさは、ウイルス力価と比較してＮＳ１レベルに基づいて大きいように思われた。このデータは、抽出物がウイルス複製に対する効果とは異なるＮＳ１抗原の合成及び放出に対する効果を有し得ることを示している。

図２は、非存在下（空の黒色円）並びに２２μｇ／ｍｌ（塗りつぶされた青色円）、６６μｇ／ｍｌ（空の赤色正方形）、及び２００μｇ／ｍｌ（塗りつぶされた緑色円）濃度の存在下で培養上清中に放出されたＮＳ１抗原（Ａ）及び感染性ウイルス（Ｂ）の動力学を示している。

（ｅ）抗ＤＥＮＶ活性に対するプレインキュベーション時間及びウイルス用量の効果の測定
１型アッセイフォーマットでＤＥＮＶ抗ウイルス活性を有する本発明の抽出物のプレインキュベーションの持続時間の影響を評価するために、０〜２４時間に及ぶプレインキュベーション時間を、約５０ＰＦＵのＤＥＮＶ−３を用いて試験した。

プレインキュベーションステップ（４℃、一晩）における本発明の抽出物の抗ＤＥＮＶ有効性に対するＤＥＮＶ用量の大きさの効果を評価するために、５０〜５０００ＰＦＵに及ぶＤＥＮＶ−３を用いて１型アッセイを行った。各用量のＤＥＮＶ−３を、０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの濃度に及ぶ抽出物に対してアッセイした。

ＤＥＮＶ−３を、感染（１型アッセイ）及び重層の前の異なる期間、本発明の抽出物の濃度を高めながらプレインキュベートした。実験の最後に得られたプラーク数は、図３に示すように、ＤＥＮＶ−３に対する本発明の抽出物の用量及び時間依存性の殺ウイルス効果を明らかにした。力価が２対数にわたって変化するＤＥＮＶ−３ストックに対する抽出物の阻害有効性を決定するために、１型フォーマットで再度逆実験を行った。５０、５００及び５０００ ＰＦＵのＤＥＮＶ−３投与量に相当するメタノール抽出物のＩＣ_５０値はそれぞれ９．９２、１２．５、及び４４．４５μｇ／ｍｌであった。これは、メタノール抽出物の抗ウイルス効力が広範囲のウイルス負荷に及ぶという結論に至る。

図３は、本発明のメタノール抽出物の抗ウイルス活性に対するプレインキュベーション時間の効果を提供する。ＤＥＮＶ−３（５０ＰＦＵ）を１１μｇ／ｍｌ（塗りつぶされた赤色円）、３３μｇ／ｍｌ（空の青色正方形）及び１００μｇ／ｍｌ（塗りつぶされた黒色正方形）の抽出物と異なる期間（２〜２４時間）プレインキュベートし、引き続いて１型アッセイで抗ウイルス活性のアッセイを行った。

（ｆ）インビボ保護有効性の決定
インビボ有効性を決定するために、ＤＥＮＶ−２（ＮＧＣ）をＡＧ１２９（１０６ＰＦＵの頭蓋内接種）と組織培養におけるＣ６／３６細胞との間で交互に継代培養した。４〜５回のこのような継代サイクルの後、ウイルスをＡＧ１２９マウスで試験して、腹腔内注射によって最小致死量（ＭＬＤ）を決定した。このようにして得られた曝露ウイルスストックを滴定し、分割し、使用するまで液体窒素中に保存した。本発明の抽出物の保護有効性を試験するために、ＡＧ１２９マウス（９〜１２週齢、体重２０〜２４ｇ）を曝露ＤＥＮＶ−２ストック１０６ ＰＦＵ（マウス１匹あたり、０．４ｍＬ、腹腔内）に曝露した。

曝露マウスを群（ｎ＝６）に分割し、ビヒクル単独（０．２５％メチルセルロース）又は本発明の抽出物の２つの異なる用量のうちの１つ（１２５ｍｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ体重）で経口処理した。マウスに投与したメタノール抽出物中のメタノールを蒸発により完全に除去した。得られたメタノールを含まないペーストを０．２５％メチルセルロース水に完全に再懸濁し、感染マウスに経口投与した。経口用量の体積を各動物の体重に従って調整し（１０ｍＬ／Ｋｇ／用量）、目盛り付き１ｍＬ使い捨て注射器を装着した特別に設計されたマウスフィーダー針を用いて訓練された獣医師により投与した。感染の２時間後に治療を開始し、１日２回５連続日間続けた。動物を臨床症状及び死亡率について１日２回、３５日間監視した。ウイルス曝露されていないが、本発明の抽出物（２５０ｍｇ／ｋｇ）を受けた対照群も並行して試験した。実験終了時に、生存データを用いてＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いて統計学的有意性について対数順位検定（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）により分析した。

本発明者らは、曝露後５日間１日２回、抽出物（メタノールを含まない）で経口処理した曝露マウスの生存期間中央値（ＭＳＴ）が用量依存的に増加することを見出した。生存データは図４に存在する。曝露されたマウスのＭＳＴは、実験条件下で１９日間であった。１２５ｍｇ／ｋｇの用量で、５日間１日２回投与した場合、生存率は５０％であり、ＭＳＴは２８日間であった（ｐ＝０．１）。これは、投与量を２倍にすると約６７％に増加した。プラセボ処理（０．２５％メチルセルロース）群と比較して、２５０ｍｇ／Ｋｇ用量によって与えられた保護レベルは統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２１）。

図４は、インビボでのメタノール抽出物の保護有効性の評価を提供している。ＡＧ１２９マウス（９〜１２週齢）に１０^６ＰＦＵ脳継代ＤＥＮＶ−２を腹腔内注射した。

感染マウスを０．２５％メチルセルロース（中空でない赤色正方形）又は１２５ｍｇ（空の青色円）及び２５０ｍｇ／ｋｇ体重（中空でない青色円）のメタノール抽出物で経口処理した。処理は最初の５日間１日２回とした。ウイルスに感染していないが高用量のメタノール抽出物を経口で受けた対照群（中空でない緑色正方形）を並行して試験した。マウスの死亡率を毎日監視し、得られたデータをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線としてプロットした。メタノール抽出物処理群とプラセボ処理（０．２５％メチルセルロース）群との間の３５日目の生存率の統計学的有意性を評価するためのｐ値を、対数順位検定を用いて決定した。

（ｇ）パラセタモールの効果の測定
パラセタモールと本発明の抽出物との間の相互作用を、１型アッセイフォーマットを用いてインビトロで評価した。ＤＥＮＶ−３（約５０ＰＦＵ）及び本発明の抽出物（濃度０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬに及ぶ）を、１００μｌの体積で４℃で一晩プレインキュベートし、２４ウェルプレート中のＬＬＣＭＫ２細胞を感染させるために使用した。ＤＥＮＶ及び本発明の抽出物に加えて、パラセタモール（１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）を含有するプレインキュベーション混合物を使用して、並行感染を設定した。偽感染及びＤＥＮＶのみの感染（抽出物及びパラセタモールの非存在下）もまた並行して設定及び分析した。

パラセタモールの存在下及び非存在下における本発明の抽出物のインビボ効果を、ウィスターラット発熱モデルを用いて評価した。いずれかの性別のウィスターラット（体重１８０〜２２０ｇ）を使用した。デジタル直腸温度計を用いてラットの基礎温度を測定し、次いで、ラットに２０％ビール酵母（１０ｍＬ／Ｋｇ体重）を皮下（肩甲骨内領域に）注射し、水に自由に入手させて一晩絶食させた。注射１８時間後、直腸温度を再度記録して、試験に含めるために体温が０．７℃以上上昇した動物を同定した。発熱性ラットの群（ｎ＝７〜９）にパラセタモール（２００ｍｇ／ｋｇ）若しくは本発明の抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）、又はその両方を経口投与した。対照群のラットはビヒクル（０．５％メチルセルロース）のみを受けた。これに続いて、直腸温度を３０分間隔で３時間記録した。

メタノール抽出物及びパラセタモールに関する試験からのデータを図５に示す。ＤＥＮＶ−３をメタノール抽出物の連続希釈液とプレインキュベートした１型アッセイを実施した。メタノール抽出物濃度が増加するにつれてＤＥＮＶ−３感染性が次第に阻害され、ＩＣ_５０値は６．１μｇ／ｍＬとなることが観察された。ＤＥＮＶ−３／メタノール抽出物プレインキュベーション混合物への最大１００μｇ／ｍＬパラセタモールの添加は、抽出物の阻害プロファイルに有意に影響しなかった。１、１０、及び１００μｇ／ｍＬのパラセタモールの存在下での計算されたＩＣ_５０値は、それぞれ８．４、７．４、及び８．５μｇ／ｍＬであった（図５Ａ）。パラセタモール単独では試験した全ての濃度で、ＤＥＮＶ感染性に何の効果もなかった（ＤＥＮＶ−３単独及びＤＥＮＶ−３＋１００μｇ／ｍＬのパラセタモールで得られたプラーク数はそれぞれ４３±３及び４５±４であった；ｎ＝３）。次の実験は、ウィスターラット発熱モデルを用いて、パラセタモールの解熱活性に対するメタノール抽出物の効果を調べた。驚くべきことに、この実験は、メタノール抽出物が内因性解熱効果を有することを明らかにした（図５Ｂ）。ビール酵母の皮下注射によって熱が誘発されたラットをメタノール抽出物で処理すると、発熱はパラセタモールに匹敵する効率で抑制された。驚くべきことに、メタノール抽出物とパラセタモールとの同時投与は、相乗効果を有し、体温のより顕著な低下をもたらした。

図５はパラセタモールとメタノール抽出物との間の相互作用の分析を提供する。

（Ａ）ＤＥＮＶ−３（５０ＰＦＵ）を、パラセタモールの非存在下（中空でない黒色菱形）又は１μｇ／ｍＬ（中空でない青色菱形）、１０μｇ／ｍＬ（中空でない赤色円）若しくは１００μｇ／ｍＬ（中空でない緑色円）の存在下で、メタノール抽出物と４℃で一晩プレインキュベートし、引き続いて１型アッセイでウイルス阻害を分析した。

（Ｂ）ウィスターラットを擬処理（空の赤色円）した、又はパラセタモール（中空でない青色円）、メタノール抽出物（空の緑色正方形）若しくは両者の組み合わせ（中空でない黒色正方形）で処理し、引き続いて直腸温度を一定の間隔で処理後３時間監視した。

対照群と処理群との間の直腸温度を、一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較試験を用いて比較した（単独及び二重星は、対照群に対する処理群の有意な差を示し、それぞれ０．０５以下及び０．０１以下のｐ値に相当する）。

（ｈ）血小板及び赤血球に対する効果の測定
生体外試験のために、赤血球を、新たに収集したヘパリン処理したヒト血液から遠心分離機（１５００ｘｇ、５分）でペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で徹底的にすすぎ、これを使用してＰＢＳ中１％細胞懸濁液を作成した。濃度が１２．５ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌに及ぶ本発明の抽出物を赤血球懸濁液に添加し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。この後、試料を遠心沈殿し、上清の吸光度を５７６ｎｍで測定して、赤血球溶解の程度を決定した。赤血球を緩衝液単独（０％溶解）、ＤＭＳＯ単独及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１００％溶解）と共にインキュベートした対照を並行して処理した。新たに収集したヘパリン処理した血液及び様々な期間（１〜４時間）ＤＭＳＯ（ビヒクル）又は本発明の抽出物（２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）とプレインキュベートした血液中の基礎血小板数を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ血液学分析装置を用いて測定した。

インビボ試験のために、ウィスターラットの４つの群（ｎ＝５）を一晩絶食させ、次いで、ビヒクル（０．２５％メチルセルロース）又は３つの異なる投与量（１００、３００、及び１０００ｍｇ／ｋｇ体重）の本発明の抽出物を経口投与した。抽出物投与の直前（０時間）並びに投与の１時間後及び４時間後に血液を収集した。ＡＤＶＩＡ−１２０血液学分析装置を用いて血液学的パラメータを測定した。

図６は血小板に対するメタノール抽出物の効果を提供する。ヒトボランティアからの全血を収集し、メタノール抽出物との混合後１〜４時間前後に血小板数を得た。結果を図６Ａに示す。ビヒクル（生理食塩水）と混合した血液の対照試料では、血小板数は時間と共に徐々に減少した。メタノール抽出物で処理した血液試料は、最大２時間までそれらの同族対照に関して血小板数の統計学的に有意な変化を示さなかった（ｐ＞０．０５）。４時間で、メタノール抽出物で処理した試料は、対応する生理食塩水で処理した対照と比較して、有意に高い（ｐ＜０．０５）血小板数を示した。同様の結果が２μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのメタノール抽出物濃度で観察され、これはメタノール抽出物が血小板に悪影響を及ぼさなかったことを示している。血小板に対するメタノール抽出物の効果を、ウィスターラットを用いたインビボ実験でも評価した。この実験では、メタノール抽出物を経口投与したラットから採取した血液中の血小板数を測定した。図６Ｂに示される結果は、処理の４時間後まで、メタノール抽出物（最大１０００ｍｇ／ｋｇ体重）は、血小板数に有意に影響しなかった（４時間の最高用量のメタノール抽出物処理でｐ＞０．０５）ことを示している。

図６（Ａ）：新たに収集したヒト血液を生理食塩水（白色棒）又はメタノール抽出物（２μｇ／ｍＬ：青色棒；１０μｇ／ｍＬ：赤色棒）と最大４時間インキュベートした。血小板数を決定するために示された時間にアリコートをとった。

図６（Ｂ）：ウィスターラットに、０〜１０００ｍｇ／Ｋｇ体重に及ぶメタノール抽出物を含有する０．２５％メチルセルロースを経口投与した。

投与０時間後（白色棒）、１時間後（青色棒）、及び４時間後（赤色棒）にこれらのラットから収集した新鮮な血液を、血小板数について分析した。両方のパネルについて、示されるデータは平均値（ｎ＝５）である；縦棒は標準偏差（ＳＤ）を表す。

上記の血小板について行われたように、生体外アッセイとインビボアッセイの両方での赤血球に対するメタノール抽出物の効果も評価した。図７は、ＲＢＣに対するメタノール抽出物の効果を提供する。新たに収集したヒト赤血球と最大４００μｇ／Ｌの濃度のメタノール抽出物のインキュベーションによって、識別可能な溶血は起こらなかった（図７Ａ）。ウィスターラット（メタノール抽出物を与えた、上記）から抜き取った血液試料も、赤血球細胞数について分析した。この分析は、メタノール抽出物（１０００ｍｇ／Ｋｇ体重の高濃度）が投与４時間後までウィスターラットの血液中の赤血球数に影響しないことを再び明らかにした（図７Ｂ）。処理ラットと未処理ラットとの間の赤血球数の差は統計学的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。本発明者らはまた、メタノール抽出物で処理したウィスターラット（図６Ｂ及び図７Ｂに記載）の血液中の全白血球数及び白血球百分率を分析したが、有意な差は見出されなかった。

図７（Ａ）：新たに収集したヒト血液からの赤血球を、様々な濃度のメタノール抽出物（０μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬ）と３７℃で１時間インキュベートし、引き続いて５７６ｎｍで溶血を測定した。ＴＸ−１００は、赤血球の等量アリコートをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理して完全な溶解を達成した対照を表す。

図７（Ｂ）：投与０時間後（白色棒）、１時間後（青色棒）、及び４時間後（赤色棒）にメタノール抽出物で処理したラットから収集した新鮮な血液を、ＲＢＣ数について分析した。示されるデータは平均値（ｎ＝５）である；縦棒はＳＤを表す。

（ｉ）サイトカイン放出アッセイ
新たに収集したヘパリン処理した血液を等量のＲＰＭＩ １６４０培地で希釈し、次いで、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７上に層状化し、次いで、２５００ｒｐｍで室温で２５分間遠心分離した。上層を捨て、相間のふわふわの層を採取し、次いですすぎ、次いでＲＰＭＩ １６４０中に５×１０^５個細胞／ｍＬで再懸濁して、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。新たに収集したＰＢＭＣを９６ウェルプレートに播種し（１０５個細胞／ウェル）、様々な希釈度（ＲＰＭＩ１６４０中）の本発明の抽出物で処理し、引き続いて回転式振盪器（２００ｒｐｍ）上室温で３０分間インキュベートした。次に、ウェルを５０μｌ（４μｇ／ｍＬ）のリポ多糖で処理し、室温で更に３０分間インキュベートさせた。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳを用いて１ウェルあたりの体積を２００μｌとし、プレートをＣＯ_２インキュベータ内で３７℃で一晩インキュベートした。陰性対照（リポ多糖処理なし）を並行して行った。プレートを遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）して、市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦ−α及びＩＬ−１β測定のための清澄化された上清を得た。

メタノール抽出物はＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの分泌を効率的に抑制し、ＩＣ_５０値はそれぞれ６．１±１．３及び５．７±２．７μｇ／ｍＬであった。ＭＴＴアッセイは、これらの濃度で、メタノール抽出物が試験した両細胞株において識別可能な細胞傷害性を有さないことを示した（ＣＣ_５０＝ＨｅｐＧ２で７８．９μｇ／ｍｌ；ＬＬＣＭＫ２で＞２００μｇ／ｍｌ）。これらのデータは、メタノール抽出物の抗炎症活性を示している。

（ｊ）毒物学
５匹の成体ウィスターラットの群に、４ｍＬの０．２５％メチルセルロース（ビヒクル）／ｋｇ、又は４ｍＬの４００〜２０００ｍｇの本発明の抽出物／ｋｇを含有するビヒクルを１日１回、７日間（ＯＥＣＤガイドライン−４０７により）経口投与した。この期間中、食物摂取量、体重、及び臨床徴候を毎日監視した。実験終了時に、動物を安楽死させ、引き続いて血液学的（Ｈｂ、ＷＢＣ数、ＲＢＣ数、血小板数、及びヘマトクリット）、並びに生化学的（ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、総タンパク質、血清アルブミン、総コレステロール、尿素、クレアチニン、及びランダム糖）パラメータを測定した。剖検を行った。器官重量を記録し、病理組織学を行った。

結果は、最大２０００ｍｇ／ｋｇ体重で処理した動物が、ビヒクル処理対照と比較して、これらのパラメータのいずれにおいても有意な変化を示さないことを示した。

Claims (22)

1. （ａ）シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物と；
   （ｂ）パラセタモールと
   を含み、
   （ａ）及び（ｂ）が、単一医薬組成物として一緒に投与される、又は同時に若しくは連続的に併用される、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するための医薬組成物。
2. 請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む、デングウイルス感染症を治療する方法。
3. 哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるためのシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物。
4. シサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させる方法。
5. 血小板保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するためのシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物。
6. 血小板保護効果を示すシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症を治療する方法。
7. 赤血球保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療に使用するためのシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物。
8. 赤血球保護効果を示すシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデング感染症を治療する方法。
9. 前記抽出物がアルコール抽出物、水アルコール抽出物、又は水性抽出物から選択される、請求項１、３、５、又は７のいずれか１項に記載の抽出物。
10. 前記アルコール抽出物がメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、及びｔ−ブタノール抽出物からなる群から選択される、請求項９に記載の抽出物。
11. 前記抽出物がアルコール抽出物、水アルコール抽出物、又は水性抽出物から選択される、請求項２、４、６、又は８のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記アルコール抽出物がメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、及びｔ−ブタノール抽出物からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 血小板保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるためのシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物。
14. 血小板保護効果を示すシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物を投与することを含む、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させる方法。
15. 赤血球保護効果を示す、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させるためのシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物。
16. 赤血球保護効果を示すシサムペロス・パレイラ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ ｐａｒｅｉｒａ）の抽出物を投与することを含み、哺乳動物におけるデングウイルス感染症の治療の初期段階でウイルス負荷を減少させる方法。
17. 請求項１３、請求項１４、請求項１５、又は請求項１６に記載の抽出物と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
18. 前記薬学的に許容される賦形剤が、希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、滑剤、ポリマー、香味剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤、緩衝液、及び張性調整剤を含む群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記抽出物がアルコール抽出物、水アルコール抽出物、又は水性抽出物から選択される、請求項１３又は１５に記載の抽出物。
20. 前記抽出物がアルコール抽出物、水アルコール抽出物、又は水性抽出物から選択される、請求項１４又は１６に記載の方法。
21. 前記アルコール抽出物がメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノールおよびｔ−ブタノール抽出物からなる群から選択される、請求項１９に記載の抽出物。
22. 前記アルコール抽出物がメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、及びｔ−ブタノール抽出物からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。