CN108025026A - 抗第三方中央型记忆t细胞的用途 - Google Patents

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Abstract

公开一种移植方法。所述方法包括给予需要移植处于悬浮状态的细胞的受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。还提供了治疗方法和试剂盒。

Description

抗第三方中央型记忆T细胞的用途
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及包含中央型记忆T淋巴细胞表型的耐受性诱导抗第三方细胞在过继细胞疗法中的用途。
过继免疫疗法已用于其中给予患者治疗性淋巴细胞(例如T细胞)以治疗病毒感染或癌症。这种免疫疗法的实例包括由供体淋巴细胞输注(DLI)介导的移植物抗白血病(GVL)效应，用于治疗同种异体干细胞移植后的造血系统癌症。另外的实例包括治疗性输注离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与淋巴细胞耗尽(lymphodepletion)组合用于治疗黑素瘤[Fujiwara H., Pharmaceuticals (2014) 7: 1049-1068]。
尽管取得了这些成功，但DLI和TIL疗法两者都存在较大的缺点，DLI通常与移植物抗宿主病(GVHD)相关，而用于疗法的TIL的制备耗时耗力且并非总是成功。主要挑战仍然是将GVL效应与GVHD分开。因此，目前大多数疗法采用自体或HLA-相同的细胞。
先前的研究已经证实，造血干细胞即CD34+级分内的细胞具有否决活性(vetoactivity) (例如在与宿主细胞接触时导致其细胞凋亡的供体细胞)，从而使其能够在大量给予宿主即“大剂量(megadose)”移植时诱导耐受性[Gur等人, Blood (2005) 105:2585-2593; Gur等人, Blood (2002) 99:4174-4181; Rachamim等人, Transplantation(1998) 65:1386-1393]。然而，可在人收获的CD34+细胞的数量通常不足以在减低强度预处理(RIC)方案下实现耐受性。
其他细胞类型也已显示介导否决活性，包括T淋巴细胞(例如CD8+ CTL)、自然杀伤细胞和树突状细胞。直接比较各种细胞类型的否决活性揭示细胞毒性T淋巴细胞(CTL)包含最强的否决效应[Reich-Zeliger等人, J Immunol. (2004) 173:6654-6659]。
Reisner与同事描述了一种被开发产生没有移植物抗宿主(GVH)活性的否决CTL(veto CTL)的方法，其中在不存在外源性IL-2的情况下刺激CTL免受第3方刺激物的刺激。这种方法基于观察到在原代培养物中仅有激活的细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)能够经受住IL-2丧失(IL-2饥饿导致未诱导的T细胞的细胞凋亡)。这种方法在体外和体内都显示出耗尽来自抗第3方否决CTL的GVH反应性[PCT公开号WO 2001/049243, Bachar-Lustig等人,Blood. 2003; 102:1943-1950; Aviner等人, Hum Immunol. (2005) 66:644-652]。将这些抗第3方否决CTL引入到接受者(与移植物一起)防止了移植物排斥反应而不诱导移植物抗宿主病(GVHD) (PCT公开号WO 2001/049243)。
已考虑用于产生没有GVH反应性的耐受性诱导细胞的各种方法，并将其用作移植物移植的辅助治疗，其中一些概述在下文中。
PCT公开号WO 2007/023491公开了致耐受性细胞用于在受试者中减少或预防非同源移植物的移植物排斥反应的用途。所公开的致耐受性T调节细胞(例如CD4+CD25+细胞)可源自与受试者和移植物两者均非同源的任何供体(“第三方”致耐受性细胞)。移植物(例如骨髓)可源自与受试者同种异体或异种异体的任何移植供体。
PCT公开号WO 2002/102971公开了包含增强的否决活性的经培养的造血祖细胞(HPC)用于诱导对自供体移植至接受者的移植物的耐受性的用途。所公开的致耐受性细胞优选地表达CD33，并在移植物(例如细胞或器官移植物)的移植之前、同时或之后给予。
PCT公开号WO 2010/049935公开了一种包含非GVHD的分离细胞群，所述细胞群诱导具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。具体地讲，WO 2010/049935教导了未成熟造血干细胞与抗第三方Tcm细胞一起的共移植。使用抗第三方Tcm细胞使得未成熟造血细胞能够植入而没有移植物抗宿主病(GVHD)。
PCT公开号WO 2013/035099公开了产生分离细胞群的方法，所述细胞群包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞为耐受性诱导细胞和/或具有抗病活性，并能够在移植后归巢至淋巴结。
发明概述
本发明一些实施方案的一个方面提供一种移植方法，所述方法包括给予需要移植处于悬浮状态的细胞的受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
本发明一些实施方案的一个方面提供用于治疗需要移植处于悬浮状态的细胞的受试者的治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
本发明一些实施方案的一个方面提供一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括：(a) 给予所述受试者治疗有效量的处于悬浮状态的细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞；和(b) 给予所述受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，从而治疗疾病。
根据本发明的一些实施方案，步骤(a)和步骤(b)同时实施。
根据本发明的一些实施方案，步骤(b)在步骤(a)之前实施。
本发明一些实施方案的一个方面提供治疗有效量的处于悬浮状态的细胞(其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞(所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结)，用于在有需要的受试者中治疗疾病。
本发明一些实施方案的一个方面提供一种用于移植的试剂盒，所述试剂盒包含：(i) 处于悬浮状态的细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞；和(ii) 具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
根据本发明的一些实施方案，所述细胞配制成用于静脉内给予。
根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括给予受试者处于悬浮状态的细胞。
根据本发明的一些实施方案，使用的治疗有效量的抗第三方细胞进一步包含治疗有效量的处于悬浮状态的细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
根据本发明的一些实施方案，非造血细胞包含分化的细胞。
根据本发明的一些实施方案，分化的细胞选自肺细胞、胰腺细胞、肾细胞、肝细胞、心脏细胞、脑细胞、肠细胞、皮肤细胞、脾细胞和卵巢细胞。
根据本发明的一些实施方案，分化的细胞得自胎儿组织。
根据本发明的一些实施方案，分化的细胞得自成人组织。
根据本发明的一些实施方案，非造血细胞包含祖细胞或干细胞。
根据本发明的一些实施方案，祖细胞或干细胞选自间充质干细胞、内皮祖细胞和上皮祖细胞。
根据本发明的一些实施方案，不为干细胞的造血细胞包含淋巴细胞亚群。
根据本发明的一些实施方案，不为干细胞的造血细胞包含免疫细胞。
根据本发明的一些实施方案，免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞和树突状细胞(DC)。
根据本发明的一些实施方案，T细胞选自CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。
根据本发明的一些实施方案，非造血细胞或不为干细胞的造血细胞为基因修饰的。
根据本发明的一些实施方案，基因修饰的细胞包含基因修饰的免疫细胞。
根据本发明的一些实施方案，免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或修饰的T细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方案，免疫细胞为T细胞。
根据本发明的一些实施方案，给予受试者治疗有效量的具有Tcm表型的抗第三方细胞实现至少两次。
根据本发明的一些实施方案，需要移植的受试者患有恶性疾病。
根据本发明的一些实施方案，疾病为恶性疾病。
根据本发明的一些实施方案，恶性疾病为实体肿瘤或肿瘤转移。
根据本发明的一些实施方案，恶性疾病为血液恶性肿瘤。
根据本发明的一些实施方案，恶性疾病选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌和胰腺癌。
根据本发明的一些实施方案，需要移植的受试者患有非恶性疾病。
根据本发明的一些实施方案，疾病为非恶性疾病。
根据本发明的一些实施方案，非恶性疾病选自器官功能障碍或衰竭、感染性疾病、自身免疫性疾病和损伤。
根据本发明的一些实施方案，非恶性疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、视网膜疾病、糖尿病、脑缺血、肌源性疾病、肺部疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、心脏疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、生育疾病和脑部疾病。
根据本发明的一些实施方案，当祖细胞为间充质干细胞时，疾病为选自美容病症、组织或器官损伤、整形外科病症、神经病症、心脏疾病或病症、糖尿病、耳聋、克罗恩病、自身免疫性障碍、白血病、癌症、镰状细胞病、肌萎缩侧索硬化症和代谢障碍的医学病症。
根据本发明的一些实施方案，当祖细胞为内皮祖细胞时，疾病为选自骨疾病、骨损伤、心血管疾病、心血管损伤、缺血性疾病、缺血性损伤、血管疾病、镰状细胞病、动脉粥样硬化、糖尿病和自身免疫性障碍的医学病症。
根据本发明的一些实施方案，当祖细胞为上皮祖细胞时，疾病为选自溃疡、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、伤口愈合缺陷、癌症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、特发性肺纤维化、肺动脉高压、肺癌、结节病、急性肺损伤(成人呼吸窘迫综合征)、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性肺部疾病(支气管肺发育不良)、表面活性蛋白B缺乏、先天性膈疝、肺泡蛋白沉积症、肺发育不良、肺损伤和角膜变性的医学病症。
根据本发明的一些实施方案，当不为干细胞的造血细胞包含免疫细胞时，疾病为选自恶性肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的医学病症。
根据本发明的一些实施方案，非造血细胞或不为干细胞的造血细胞为与受试者非同源。
根据本发明的一些实施方案，非造血细胞或不为干细胞的造血细胞和具有Tcm表型的抗第三方细胞得自相同供体。
根据本发明的一些实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞为与受试者同源。
根据本发明的一些实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞为与受试者非同源。
根据本发明的一些实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+特征。
根据本发明的一些实施方案，分离细胞群的至少50%为CD3+CD8+细胞，其CD3+CD8+细胞的至少50%具有所述特征。
根据本发明的一些实施方案，方法进一步包括在给予之前，于亚致死、致死或超致死预处理方案下预处理受试者。
根据本发明的一些实施方案，使用的治疗有效量的细胞进一步包含亚致死、致死或超致死预处理方案。
根据本发明的一些实施方案，亚致死、致死或超致死预处理选自全身照射(TBI)、体分区照射、清髓性预处理、非清髓性预处理、共刺激性阻断、化疗药物和抗体免疫疗法。
根据本发明的一些实施方案，亚致死预处理方案选自全身照射(TBI)、共刺激性阻断、化疗药物和抗体免疫疗法。
根据本发明的一些实施方案，给予通过选自气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、脑室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠道的途径实现。
根据本发明的一些实施方案，细胞被配制成用于通过选自气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、脑室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠道的途径给予。
根据本发明的一些实施方案，受试者为人受试者。
根据本发明的一些实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞通过包括以下的方法产生：(a) 在存在IL-21的情况下使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以致使得富集抗原反应性细胞；和(b) 在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下培养由步骤(a)生成的细胞，以致包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)抗第三方表型的细胞能够增殖，从而产生具有Tcm表型的抗第三方细胞。
根据本发明的一些实施方案，方法进一步包括在与一种或多种第三方抗原接触之前自PBMC耗尽贴壁细胞。
根据本发明的一些实施方案，方法进一步包括在与一种或多种第三方抗原接触之前自PBMC耗尽CD4+和/或CD56+细胞。
根据本发明的一些实施方案，方法包括在步骤(a)之后和在步骤(b)之前选择激活的细胞。
根据本发明的一些实施方案，选择激活的细胞通过选择CD137+和/或CD25+细胞来实现。
根据本发明的一些实施方案，一种或多种第三方抗原包含树突状细胞。
根据本发明的一些实施方案，一种或多种第三方抗原选自第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质以及由自体呈递细胞、非自体呈递细胞或在人工载体或在人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
根据本发明的一些实施方案，第三方细胞为选自由外周血淋巴细胞、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞和人工抗原呈递细胞纯化的细胞的刺激性细胞。
根据本发明的一些实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞通过包括以下的方法产生：(a) 用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的物质处理非贴壁外周血单核细胞(PBMC)，以致获得CD8+ T细胞；(b) 使CD8+ T细胞与第三方树突状细胞在存在IL-21的情况下接触12小时-5天，以致使得能够富集抗原反应性细胞；(c) 在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下培养自步骤(b)生成的细胞5-20天，以致使得包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞能够增殖，从而产生分离细胞群。
根据本发明的一些实施方案，方法进一步包括于步骤(c)之前，在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下用第三方树突状细胞培养自步骤(b)生成的细胞12小时-3天。
除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明实施方案的实践或测试，但是以下描述示例性的方法和/或材料。如果发生冲突，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并且不打算成为一定的限制。
附图说明
本文仅通过实例并参照附图描述本发明的一些实施方案。现具体详细地参照附图，需要强调的是，所显示的细节仅作为实例并且为了本发明实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，结合附图的描述对本领域技术人员可如何实践本发明的实施方案是显而易见的。
附图中：
图1A-C为用于研究Tcm细胞在不存在同种异体BM的诱导特性的情况下诱导耐受性的能力的模型示意图。经FACS分析Tcm细胞存活和增殖，同时使用51Cr测定法测试宿主CTL活性通过Tcm细胞的下调。
图2A-B为说明在同源骨髓移植物(BMT)环境下过继转移的F1-Tcm细胞的持续存在的图表。如在图1A中概述的那样移植C57BL/6 (H-2b)小鼠。使用αH2Dd (供体)和αH2Kb，通过FACS分析移植后60天每组中1只小鼠的代表性散点图(显示小鼠外周全血中Tcm细胞的百分数)，以鉴定F1 (H2DdXH2Kb)-Tcm细胞。
图3为说明Tcm细胞特异性地耗尽来自多克隆宿主T细胞(HTC)群的抗供体T细胞，同时保留其他HTC以呈现细胞毒活性的图表。如在图1A中概述的那样移植小鼠。移植后60天处死小鼠，收获脾脏和淋巴结(LN)，并选择CD8+细胞(并且负向选择H-2Dd以排除Tcm)。以铬释放测定法测试了这些首次实验的HTC的C3H (H-2k)或BALB/c (H-2d)靶标的杀伤能力。条呈现如下的杀伤效果：来自仅接受BM的小鼠的HTC (黑色条，“仅BM→C3H”)或来自也接受Tcm的小鼠的细胞(深灰色条，“仅BM + Tcm→C3H”)杀伤C3H靶标，或者来自仅接受BM的小鼠的HTC (白色条，“仅BM→BALB”)或来自也接受Tcm的小鼠的T细胞(亮灰色条，“BM + Tcm→BALB”)杀伤BALB/c靶标。结果以每组12个孔的杀伤百分比的平均值±SD呈现。呈现所实施的2个独立实验中的代表性实验。(**)代表p值小于0.01，(***)代表p值小于0.001。
图4为说明CB6 F1来源的Tcm细胞持续存在于接受了亚致死5.5 Gy TBI与同源T细胞耗尽的骨髓(TDBMT)的小鼠中的图表。将Balb/c (H2Dd)小鼠亚致死性地(5.5 Gy)照射并如在图1B中描述的那样移植。使用αH2Dd (宿主)和αH2Kb，通过FACS分析移植后40、80和132天的外周血，以鉴定H2db F1-Tcm细胞。散点图显示每只小鼠中CB6 Tcm细胞的百分数，每个点代表属于适当组的1只小鼠中的Tcm细胞群，显示每组的平均值和SD。
图5为说明在没有TDBMT的情况下使得Tcm细胞能够存活的照射剂量校准的图表。Balb/c (H2Dd)小鼠在第-1天用2/4/5.5/6.5 Gy亚致死性地照射。在第0天，小鼠接受过继转移至小鼠尾静脉的5 x 106或9 x 106 F1 CB6 (H-2db) Tcm细胞。使用αH2Dd (宿主)和αH2Kb，移植后42天通过FACS分析描绘Balb/c宿主小鼠的外周全血中CB6 Tcm细胞的百分数的散点图，以鉴定H2db F1-Tcm细胞。显示每组的平均值和SD。
图6A-B为说明完全同种异体Tcm细胞长时间持续存在于5.5 Gy Balb/c小鼠中的图表。如在图1C中概述的那样移植Balb/c (H-2d)小鼠。Tcm细胞属于CB6-F1 (H-2db)或C57BL/6 (H-2b)来源。小鼠在指示的日子放血，并使用αH2Dd (宿主)和αH2Kb (供体)通过FACS分析Tcm细胞群以鉴定H2db F1-Tcm和H2b Allo-Tcm细胞。图6A为描绘Balb/c宿主中Tcm细胞百分数的散点图。每个点代表属于适当组的1只小鼠中的Tcm细胞群，显示每组的平均值和SD。图6B为说明外周血中Tcm细胞群经长时间减少的时间曲线图。
图7为说明完全同种异体Tcm细胞持续存在于5.5 Gy Balb/c小鼠中并促进另外的供体T细胞植入的图表。Balb/c (H-2b)小鼠在第-1天接受5.5 Gy TBI，和在第0天接受5 x106 CB6 (H-2db)或C57BL/6 (H-2b)来源的Tcm细胞。Tcm细胞注射后89天，小鼠用2 Gy TBI照射，第二天它们接受2 x 106 CD45.1+、OT1+、RAG+CD8+细胞。散点图显示Tcm细胞移植后120天和OT-1细胞移植后30天出血。
图8为说明亚致死性地照射的Balb/c小鼠的外周血中OT-1细胞的分析的图表。Balb/c (H-2d)小鼠在第-1天接受5.25 Gy TBI，并在第0天转而接受首次实验的CD8+ OT-1+CD45.1+ RAG-细胞，伴有或没有指示数目的CB6 (H-2db)或C57BL/6 (H-2b)来源的Tcm细胞。Tcm细胞注射后60天，使用FACS分析测试小鼠的外周血，以检测OT-1细胞的存在。散点图显示总CD8+H-2b+细胞中不同组的OT-1细胞的百分数。
图9为说明B16-黑素瘤残留疾病预防模型的图表。在该模型中，将表达B16-OVA的黑素瘤细胞(在第-2天)注射到C57BL/6小鼠中。第二天(在第-1天)，用TBI经RIC治疗这些小鼠。在第二天(第0天)，OT1-F1 (H-2db)新鲜细胞单独或与F1 Tcm细胞(即来自相同细胞供体)或与表达OT1-F1细胞的非共有MHC (H-2d)的同种异体Balb/c Tcm细胞一起给予荷瘤C57BL/6小鼠。
图10为说明抗第三方Tcm细胞凭借否决活性支持错配抗Ova转基因供体来源的CD8+细胞(OT1-F1)的植入并使得能够有效根除携带Ova的黑素瘤肿瘤细胞的图表。
具体实施方式
本发明在其一些实施方案中涉及包含中央型记忆T淋巴细胞表型的耐受性诱导抗第三方细胞在过继细胞疗法中的用途。
本发明的原理和操作可参照附图和随附描述更好地理解。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是，本发明的应用不一定限于以下描述中阐述或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有以各种方式实践或实施的其他实施方案。而且，应该理解的是，本文使用的用语和术语是为了描述的目的，而不应认为是限制性的。
用各种淋巴细胞和抗原呈递细胞的基于细胞的疗法为用于免疫疗法的有前途的方法。过继细胞转移(ACT)，包括自自体或非自体来源转移免疫源性细胞，提供将免疫功能和特征转移至新宿主中的目标。为了使移植物排斥反应和GVHD减至最小，通常使用自体细胞。或者，将耗尽了T细胞的骨髓与否决细胞一起移植，以避免移植物排斥反应和GVHD。先前用于ACT的另一种方法包括基因修饰的T细胞，其中细胞的特异性被重定向于靶抗原。然而，移植物排斥反应仍然是过继细胞转移疗法中的主要问题。
在实施本发明时，本发明人已经令人惊讶地发现，抗第三方Tcm细胞配备有其自身的否决能力，并可对于移植各种类型处于悬浮状态的细胞自行诱导耐受性，甚至在不存在造血CD34+干细胞的情况下。因此，本发明的Tcm细胞可在不存在移植物排斥反应和/或移植物抗宿主病的情况下帮助移植各种类型非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
如本文以下和随后的实施例部分中显示的那样，本发明人已显示同种异体供体型抗第三方Tcm细胞可在伴有或没有骨髓移植的情况下在宿主中长时间(例如超过120 天，分别参见图2A-B和图6A-B)存活。此外，抗第三方Tcm细胞发挥否决活性(图3)。因此，甚至在不存在BM前体的情况下单独应用抗第三方Tcm细胞可提供一种有用的工具，用于利用对肿瘤抗原、病原体和自身抗原特异性的供体型细胞创建给予细胞疗法的机会的时间窗口(即其中抗第三方细胞存活并发挥其否决活性，使得过继细胞能够发挥其功能的一段时间)。
综合考虑，这些结果证实抗第三方Tcm细胞作为耐受性诱导细胞在需要包括在癌症疗法和在病毒性疾病疗法中的过继细胞疗法的情况下用于过继细胞转移和用于疾病治疗中的用途。
本文使用的短语“处于悬浮状态的细胞”指的是已自其天然环境(例如人体)分离和自血液或组织/器官提取，同时保持存活力但不保持组织结构(即没有血管化的组织结构)，使得其可注射比如通过静脉内给予的细胞。根据一个具体的实施方案，处于悬浮状态的细胞不贴附于固体支持物上。
本文使用的术语“非造血细胞”指的是不属于造血谱系的体细胞。这种细胞包括分化的细胞以及祖细胞和干细胞。
本文使用的短语“分化的细胞”指的是终末分化的细胞。可根据本教导移植的示例性细胞包括但不限于肝、胰腺、脾、肾、心脏、肺、皮肤、肠、输卵管、卵巢或脑细胞。
根据一个实施方案，分化的细胞得自成人组织(即出生后任何时间的生物体组织)。
根据一个实施方案，分化的细胞得自胎儿组织(如下文详细描述的那样)。
根据本发明的一个实施方案，非造血细胞包含祖细胞或干细胞。
本文使用的短语“干细胞”指的是可分化成具有特定的特化功能的其他细胞类型(例如完全分化的细胞)的细胞。实例包括但不限于全能、多能或多能性细胞。
全能干细胞产生比全能细胞更分化的“祖细胞”。这些细胞能够分化成特定的细胞谱系，例如内皮谱系、上皮谱系或间充质谱系。
本文使用的术语“内皮祖细胞”或“EPC”指的是定向于内皮谱系的未分化的细胞。EPC具有增殖、迁移和分化成内皮细胞的能力，但是尚未获得成熟内皮细胞的特征。EPC包括但不限于集落形成单元-内皮细胞(CFU-EC)、循环成血管细胞(CAC)、循环血管内皮前体细胞(CEP)和内皮集落形成细胞(ECFC)，包括低增殖潜能ECFC (LPP-ECFC)和/或高增殖性ECFC (HPP-ECFC)。
EPC可分离自血液、骨髓或脐带血，并可在成人外周单核细胞的CD34+细胞级分中鉴定。EPC可也响应某些生理刺激比如组织损伤自骨髓迁移至外周血(循环EPC)。循环EPC可得自成人血液。在某些方面，可使用单独的CD34+细胞或CD133+细胞或者与KDR+组合作为外周血中富含EPC的细胞级分，经直接FACS分选或其他可用的离体选择方法比如磁珠、微流控、芯片实验室、亲和柱或相关装置，自这些或其他来源分离EPC。
本文使用的术语“上皮祖细胞”指的是定向于上皮谱系的未分化的细胞。上皮祖细胞具有增殖、迁移和分化成上皮细胞的能力，但是尚未获得成熟上皮细胞的特征。上皮细胞组成其在整个哺乳动物身体结构的任何腔或表面形成轮廓的组织。上皮祖细胞包括但不限于肺、胃肠道、生殖器官、泌尿道、肾、皮肤、缺血、心脏、内皮、循环和脑上皮祖细胞。在某些方面，上皮祖细胞可通过细胞标志物例如CD34、CD105、HES1、FRZB1、DCT、SOD2、ABCG2、CDH1和/或KRT19的表达来鉴定。
上皮祖细胞可通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过显微切割分离自组织(例如胰腺、肺、肾、心脏等)，比如分离自胎儿组织。显微切割的非限制性实例包括提供机械剪切力的装置(即匀浆器、研钵和研杵、搅拌器等)、提供切割或撕裂的装置(即解剖刀、注射器、镊子等)或超声波装置。或者，显微切割组织的另一种方法为使用酶处理。用于显微切割组织的各种酶处理为本领域技术人员已知的，比如但不限于使用胶原酶，如下文进一步详细描述的那样。
本文使用的“间充质干细胞”、“MSC”、“基质干细胞”或“基质细胞”(本文可互换使用)指的是具有基质干细胞表型的贴壁细胞。细胞一般地源自于骨髓、脂肪组织或胎盘，尽管身体的其他器官也包含这些细胞。
基质干细胞表型包括例如纺锤形。或者或另外，细胞可表达对间充质/基质干细胞典型的至少一种表面标志物或表面标志物(例如表面标志物)的集合。基质干细胞表面标志物(正和负)的实例包括但不限于CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、CD20-、CD11B-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-和FMC7-。其他间充质干细胞标志物包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和HNF-4α。
使用本领域已知的方法，比如通过使用基于杂交的技术例如RNA印迹、荧光原位杂交、逆转录PCR或至少一种细胞表面标志物的抗体(例如与可检测部分直接或间接偶联并通过熟知的方法比如FACS、ELISA或蛋白质印迹分析)，可以mRNA或蛋白质水平确定这些标志物中任何一种的表达。
基质干细胞典型的功能表型的实例包括但不限于免疫(T细胞)抑制活性、造血干细胞支持活性以及成脂、肝源性、成骨和神经源性分化。
这些结构或功能特征中的任何一种可用于限定本发明的细胞。
可根据本发明该方面给予的MSC包括培养的细胞(在二维或三维环境中)、收获的MSC及其间充质和部分或终末分化的衍生物。
细胞可为首次实验的或基因修饰的，比如以衍生目标谱系(参见美国专利申请第20030219423号或www.jeccr.com/content/34/1/33)。
本文使用的术语“不为干细胞的造血细胞”指的是在血液或淋巴系统中循环的所有骨髓来源的细胞。该术语指的是成熟细胞类型及其未成熟前体。造血细胞一般地通过形态学和/或通过细胞表面标志物的表达来鉴定。
不为干细胞的造血细胞一般地被细分为髓样细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)、淋巴样细胞(例如B细胞、T细胞、NK细胞)、红细胞和血小板。
因此，根据一个实施方案，细胞为淋巴细胞的亚群。这种细胞包括在淋巴系统(例如在骨髓和胸腺)循环的任何细胞，包括例如B细胞和T细胞。
根据一个实施方案，不为干细胞的造血细胞包含分化的细胞。可根据本教导移植的示例性细胞包括但不限于免疫细胞(例如T细胞、B细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)和/或NKT细胞)。本文使用的术语“T细胞”指的是具有CD3+、具有CD4+或CD8+表型的T细胞受体(TCR)+的分化的淋巴细胞。T细胞可为效应T细胞或调节性T细胞。
本文使用的术语“效应T细胞”指的是例如通过产生细胞因子或具有细胞毒活性，激活或引导其他免疫细胞的T细胞，例如CD4+、Th1/Th2、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
本文使用的术语“调节性T细胞”或“Treg”指的是负调节其他T细胞(包括效应T细胞)以及先天免疫系统细胞的激活的T细胞。Treg细胞特征为效应T细胞反应的持续抑制。根据一个具体的实施方案，Treg为CD4+CD25+Foxp3+ T细胞。
根据具体的实施方案，分化的细胞为T细胞。
根据另一个具体的实施方案，T细胞为CD8+ T细胞。
根据另一个具体的实施方案，T细胞为CD4+ T细胞。
根据另一个具体的实施方案，T细胞为首次实验的T细胞(例如未遇到其同源抗原的成熟T细胞)。
本方法的T细胞可被选择或修饰以靶向特定抗原(也称为过继细胞疗法)。
根据一个实施方案，T细胞为天然抗肿瘤或抗病毒T细胞。
根据另一个具体的实施方案，T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL可分离自肿瘤块(例如黑素瘤或肾癌)，例如在其自受试者除去之后，可使细胞离体扩增(例如使用细胞因子)并给予回受试者用于抗癌疗法。
根据另一个具体的实施方案，T细胞为肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。TAL可被选择用于T细胞受体(TCR)特异性(参见例如Cancer Immunol Immunother. 2009; 58: 553-66)。在这种情况下，通过用预先装载肿瘤抗原或用编码癌抗原的mRNA或DNA转染的肿瘤抗原温育(例如使用抗原呈递细胞比如成熟DC、B细胞或者通过可溶性肽、人工呈递细胞、抗原包被珠、新鲜细胞、肿瘤细胞或细胞系)，使T细胞激活并离体扩增。然后将选择的针对肿瘤抗原的TCR特异性T细胞(例如CD8+或CD4+ T细胞)给予受试者用于抗癌疗法。
根据一个实施方案，T细胞(即分化的T细胞)被基因修饰(如以下进一步详细描述的那样)。
本文使用的术语“B细胞”指的是具有B细胞受体(BCR)+、CD19+和/或B220+表型的分化的淋巴细胞。B细胞特征为其结合特异性抗原并引发体液反应的能力(例如抗体分泌细胞)。
本文使用的术语“自然杀伤细胞”或“NK细胞”指的是具有CD16+ CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化的淋巴细胞。NK细胞特征为其结合并通过激活特定细胞溶解酶杀伤不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力，杀伤肿瘤细胞或其他表达NK激活受体的配体的病变细胞的能力以及释放刺激或抑制免疫反应的细胞因子的能力。
本文使用的术语“NKT细胞”指的是表达半不变αβ T细胞受体，但是还表达多种一般地与NK细胞相关的分子标志物比如NK1.1的特化T细胞群。NKT细胞包括NK1.1+和NK1.1-，以及CD4+、CD4-、CD8+和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR为独特的，因为其识别由MHC I样分子CD1d呈递的糖脂抗原。NKT细胞由于其产生促进炎症或免疫耐受性的细胞因子的能力而可具有保护性或有害作用。
本文使用的术语“树突状细胞”或“DC”指的是能够敏化HLA-限制性T细胞的抗原呈递细胞。DC包括源自骨髓造血细胞的DC，比如浆细胞样树突状细胞、髓样树突状细胞、郎格罕细胞和交错突细胞以及滤泡DC。树突状细胞可通过功能或通过表型，特别是通过细胞表面表型来识别。这些细胞特征为其独特的形态学，在细胞表面具有面纱样凸起、中等至高水平的表面HLA-II类表达以及将抗原呈递给T细胞，特别是呈递给首次实验的T细胞的能力(参见Steinman R,等人, Ann. Rev. Immunol. 1991; 9:271-196)。一般地，DC的细胞表面表型包括CD1a+、CD4+、CD86+或HLA-DR。术语DC包括未成熟和成熟DC两者。根据一个具体的实施方案，DC包含未成熟DC。未成熟DC的特定细胞表面表型可为lin-/CD11c+/CD83-。
依需要的应用(例如依待治疗的疾病)而定，本发明的细胞可为首次实验的或基因修饰的。这种确定很好地处于本领域普通技术人员的能力范围内。
根据一个实施方案，提供基因修饰的免疫细胞。
根据另一个实施方案，免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或修饰的T细胞受体(TCR)。
因此，本发明的免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、树突状细胞)可被转导以表达TCR或CAR。
本文使用的“用TCR转导”指的是克隆两条链(即多肽链)，比如T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链或其组合(例如αβ链或γδ链)。根据一个实施方案，TCR包含TCR的可变区(例如α链和β链或γ链和δ链)。用TCR转导细胞(例如T细胞) (例如产生TCR-T细胞)的方法为本领域已知的，并且例如公开于Nicholson等人 Adv Hematol. 2012;2012:404081; Wang and Rivière Cancer Gene Ther. 2015 Mar; 22(2):85-94); 和Lamers等人, Cancer Gene Therapy (2002) 9, 613-623中。
本文使用的“用CAR转导”指的是克隆编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中CAR包含抗原识别部分和T细胞激活部分。嵌合抗原受体(CAR)为含有连接于T细胞信号传导或T细胞激活结构域的抗体(例如单链可变片段(scFv))的抗原结合结构域的人工构建杂合蛋白或多肽。用CAR转导细胞(例如T细胞) (例如产生CAR-T)的方法为本领域已知的，并且例如公开于Davila等人 Oncoimmunology. 2012 Dec 1; 1(9):1577-1583; Wang andRivière Cancer Gene Ther. 2015 Mar; 22(2):85-94); 和Maus等人 Blood. 2014 Apr24;123(17):2625-35中。
据一个实施方案，基因修饰的免疫细胞为T细胞。根据一个实施方案，基因修饰的T细胞表达转基因TCR (TCR-T)或CAR (CAR-T)。
因此，通过用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)转导，通过促进呈递靶向疾病抗原(例如肿瘤或病毒抗原)的受体，通过重定向细胞特异性(例如T细胞特异性)，可修饰本发明细胞(处于悬浮状态) (例如T细胞)以用于疗法(例如抗癌或抗病毒过继细胞疗法)。
根据本发明的一些实施方案，产生表达TCR或CAR的免疫细胞(例如T细胞)以靶向表达特定配体(例如抗原)的疾病细胞，比如肿瘤、病毒或自身免疫性疾病的细胞。例如，可产生TCR或CAR表达免疫细胞以靶向恶性疾病，例如滤泡性淋巴瘤(CD20或GD2)、成神经细胞瘤(CD171)、非霍奇金淋巴瘤(CD20)、淋巴瘤(CD19)、成胶质细胞瘤(IL13Rα2)、慢性淋巴细胞白血病或CLL和急性淋巴细胞白血病或ALL (均为CD19)；包括但不限于卵巢、前列腺、乳腺、肾、结肠、成神经细胞瘤等的实体肿瘤；和带有病毒比如但不限于 HIV的细胞。
依应用而定，方法可使用与受试者同源或非同源的细胞来实现。
本文使用的术语“同源”细胞指的是与受试者或受试者的基本上所有淋巴细胞基本上基因相同的细胞。同源细胞的实例包括源自受试者(本领域也称为“自体”)、源自受试者的克隆或源自受试者的同卵双胞胎的细胞。
本文使用的术语“非同源”细胞指的是与受试者或受试者的基本上所有淋巴细胞基本上基因不相同的细胞，比如同种异体细胞或异种异体细胞。
本文使用的术语“同种异体”指的是源自与受试者属于相同物种的供体但对受试者明显为非克隆的细胞。一般地，相同物种的远交、非合子孪生哺乳动物为彼此同种异体的。应该意识到，就受试者而言，同种异体细胞可为HLA相同、部分HLA相同的或HLA不相同的(即呈现一种或多种不同HLA决定簇)。
本文使用的术语“异种异体”指的是相对于受试者的相当大比例淋巴细胞的种类明显表达不同种类抗原的细胞。一般地，不同物种的远交哺乳动物为彼此异种异体的。
本发明设想异种异体细胞源自多种物种。因此，根据一个实施方案，细胞可源自任何哺乳动物。细胞的合适物种来源包括主要的驯养或家畜动物和灵长类动物。这种动物包括但不限于猪类(例如猪)、牛科动物(例如奶牛)、马科动物(例如马)、绵羊类(例如山羊、绵羊)、猫科动物(例如家猫(Felis domestica))、犬科动物(例如家犬(Canis domestica))、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)和灵长类动物(例如黑猩猩、恒河猴、猕猴、绒猴)。
异种异体来源(例如猪源)的细胞优选地得自已知没有人畜共患病比如猪内源性逆转录病毒的来源。类似地，人源细胞或组织优选地得自基本上无病原体的来源。
根据本发明的一个实施方案，受试者为人，并且细胞来自人源。
根据一个实施方案，受试者为人，并且细胞来自异种异体来源(例如猪源)。
根据一个实施方案，细胞为与受试者非同源。
根据一个实施方案，细胞为与受试者同种异体。
根据一个实施方案，细胞为与受试者异种异体。
根据一个实施方案，细胞为与受试者同源(例如自体)。
依应用和可用来源而定，本发明的细胞可得自产前生物体、产后生物体、成人或尸体供体。这种确定很好地处于本领域普通技术人员的能力范围内。
本领域已知的任何方法可用于获得用于移植的细胞。因此，例如免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞、DC)可通过自供体(例如自如下文详细描述的Tcm细胞供体)收集外周血获得。收集外周血的方法为本领域熟知的，并且包括但不限于自供体(例如如下文详细描述的Tcm细胞供体)取高达500-1000 ml的全血并收集在含有抗凝血剂(例如肝素或枸橼酸盐)的容器中，或者通过单采术，其为一种其中使个体的外周血通过装置，产生主要成分(例如单核细胞，比如淋巴细胞、单核细胞或树突状细胞)，并使其他成分返回到受试者的循环的程序。或者，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可通过细胞的体外或离体培养获得。应该意识到，本发明的处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可属于新鲜或冷冻(例如冷冻保存)制剂，如以下讨论的那样。
根据另一个实例，细胞可得自器官或组织。
根据一个实施方案，器官或组织来自胎儿生物体。胎儿生物体可属于人或异种异体来源(例如猪)中的任何一种，并且在妊娠的任何阶段。这种确定处于本领域普通技术人员的能力范围内。
根据一个实施方案，胎儿器官或组织包括胎儿肺组织、胎儿胰腺组织、胎儿肾脏组织、胎儿肝脏组织、胎儿心脏组织、胎儿脑组织、胎儿脾脏组织、胎儿肠道组织、胎儿皮肤组织、胎儿输卵管组织和胎儿卵巢组织。
各种方法可用于自胎儿生物体获得器官或组织。因此，例如获得组织(例如肝脏、胰腺或肺组织)可通过自发育中的胎儿收获组织来实现，例如通过在对应于人妊娠14-24周的妊娠阶段进行手术操作。本领域技术人员应该理解，生物体的妊娠阶段为在产生生物体的卵母细胞受精后经过的时间段。
同样地，各种方法可用于自成人生物体(例如活体或尸体)获得器官或组织。因此，例如获得组织(例如肝脏、胰腺或肺组织)可通过经手术操作例如剖腹手术或腹腔镜手术自器官供体收获组织来实现。
或者，组织可通过细胞、器官或组织的体外或离体培养来获得。细胞、组织或器官的这种受控的体外分化通常例如使用培养胚胎干细胞系以产生含有期望的谱系的细胞/组织/器官的培养物来实施。
根据一个实施方案，本发明的细胞自成人干细胞或多能干细胞比如胚胎干细胞(ES细胞)或iPS离体分化。
短语“胚胎干细胞”或“ES细胞”指的是能够分化成全部3个胚胎胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”可包括自胚胎植入之前(即植入囊胚前)，在妊娠之后形成的胚胎组织(例如囊胚)获得的细胞、得自植入后/原肠胚形成前阶段囊胚的扩展囊胚细胞(extended blastocyst cell) (EBC) (参见WO2006/040763)、得自妊娠期间的任何时间(优选地在妊娠10周之前)的胎儿生殖器组织的胚胎生殖(EG)细胞，和来源于受孤雌生殖刺激的未受精卵(孤雌生殖体)的细胞。
来源于受孤雌生殖刺激的未受精卵(孤雌生殖体)的胚胎干细胞(例如人ESC)为本领域已知的(例如 Zhenyu Lu等人, 2010. J. Assist Reprod. Genet. 27:285-291;“Derivation and long-term culture of human parthenogenetic embryonic stemcells using human foreskin feeders”, 其通过参照完全结合到本文中)。孤雌生殖指的是在不存在精子细胞的情况下通过激活卵子来启动细胞分裂，例如使用电或化学刺激。激活的卵子(孤雌生殖体)能够发育成原始胚胎结构(称为囊胚)，但不能发育成称为多能的细胞，这意味着其不能发育能存活的人胎需要的必要的胚外组织(比如羊水)。
用于制备ES细胞的另一种方法描述于Chung等人, Cell Stem Cell, Volume 2,Issue 2, 113-117, 7 February 2008中。该方法包括在体外受精过程期间自胚胎除去单细胞。胚胎在该过程中不被破坏。
诱导的多能干细胞(iPS；胚胎样干细胞)为通过使具有多能性的成人体细胞去分化而获得的细胞(即能够分化成3个胚胎生殖细胞层，即内胚层、外胚层和中胚层)。根据本发明的一些实施方案，这种细胞得自分化的组织(例如体细胞组织比如皮肤)并通过基因操作经历去分化，所述基因操作重新编程细胞以获得胚胎干细胞特征。根据本发明的一些实施方案，诱导的多能干细胞通过诱导体细胞中Oct-4、Sox2、Kfl4和/或c-Myc中的一种或多种的表达而形成。根据一个实施方案， Oct-4、Sox2、Kfl4和c-Myc全部在体细胞中被诱导。
根据一个实施方案，多能干细胞不是胚胎破坏的结果。
短语“成人干细胞”(也称为“组织干细胞”或源自体细胞组织的干细胞)指的是源自[出生后或出生前动物(尤其是人)]的体细胞组织的任何干细胞。成人干细胞通常认为是一种多能性的干细胞，能够分化成多种细胞类型。成人干细胞可源自任何成人、新生儿或胎儿组织，比如脂肪组织、皮肤、肾脏、肝脏、前列腺、胰腺、肠道、骨髓和胎盘。
例如，对于通过体外分化自胚胎干细胞产生肺细胞参见Otto WR., 1997. Int JExp Pathol. 78:291-310。
例如，对于通过体外分化自胚胎干细胞产生心肌细胞参见Paquin等人, Proc.Nat. Acad. Sci. (2002) 99:9550-9555。
例如，对于通过体外分化自胚胎干细胞产生胰腺细胞参见Shi等人 Stem Cells.2005 May; 23(5):656-62。
例如，对于自胚胎干细胞体外分化肾细胞参见Takasato等人 Nature CellBiology 16, 118-126 (2014)。
例如，对于自胚胎干细胞体外分化肝细胞参见Touboul等人, Hepatology. 2010May; 51(5):1754-65。
胚胎干细胞也被诱导分化成神经或神经胶质谱系[Reubinoff等人, NatureBiotechnology (2001) 19:1134-1140; 美国专利第5851832号]。
在获得器官/组织后，本发明进一步考虑从中产生分离细胞群。
分化的细胞可在悬浮液中包含单细胞或总计不超过5、10、50、100、200、300、400、500、1000、1500、2000个细胞的细胞聚集体。
本发明的细胞悬液可通过任何机械或化学(例如酶促)手段获得。存在几种方法用于解离细胞簇，以例如通过物理力(机械解离比如细胞刮棒、通过窄孔吸液管研磨、细针抽吸、涡旋解聚和通过细尼龙或不锈钢网强制过滤)、酶(酶促解离比如胰蛋白酶、胶原酶、Accutase等)或两者的组合，自原代组织、培养中贴壁的细胞和聚集体形成细胞悬液(例如单细胞悬液)。
因此，例如可通过使组织经受酶比如IV型胶原酶(Worthington biochemicalcorporation，Lakewood，NJ，USA)和/或分散酶(Dispase) (Invitrogen Corporationproducts, Grand Island NY, USA)实施将组织/器官酶促消化成分离细胞。例如，组织可通过于37℃下，在存在例如胶原酶、分散酶(dispase)和CaCl2的情况下用剃刀刀片精细切碎组织约1小时来进行酶消化。基本上如在随后的实施例部分的“一般材料和实验方法”描述的那样，方法可进一步包括通过例如经过滤器(例如70和40 μm过滤器)依序过滤，自生成的细胞悬液去除非特定碎片。
此外，可使用设计成将组织破碎至预定大小的装置实施将组织机械解离成分离细胞。这种装置可得自CellArtis Goteborg, Sweden。另外或者，机械解离可在于倒置显微镜下观察组织/细胞的同时使用针比如27 g针(BD Microlance, Drogheda, Ireland)手动实施。
在组织的酶促或机械解离之后，使用200 μl Gilson吸液管头(例如通过上下吸取细胞)将解离的细胞进一步破碎成小团块。
根据本发明，分化的细胞的细胞悬液包含活细胞。细胞存活力可使用本领域已知的任何方法监测，例如使用细胞活力测定(例如可得自Promega的MultiTox MultiplexAssay)、流式细胞术、台盼蓝等。
一般地，分化的细胞立即用于移植。然而，在细胞于移植之前保持处于悬浮的情况下，例如持续1-12小时，细胞可在能够支持其存活力的培养基中培养。这种培养基可为水基培养基，其包括物质比如盐、营养物、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质比如细胞因子、生长因子和激素的组合，所有这些是保持分化的分离细胞群处于存活状态需要的。例如，本发明该方面的培养基可为合成的组织培养基，比如RPMI-1640 (Life Technologies,Israel)、Ko-DMEM (Gibco-Invitrogen Corporation products, Grand Island, NY,USA)、DMEM/F12 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel)、Mab ADCB培养基(HyClone, Utah, USA)或DMEM/F12 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel)，补充有必要的添加剂。优选地，包含在本发明培养基中的所有成分为基本上纯的，具有组织培养级。
分化的细胞也可储存于适当的条件下(一般地通过冷冻)，以保持细胞(例如分化的细胞)存活和用于移植的功能。根据一个实施方案，分化的细胞作为冷冻保存的群体储存。其它保存方法描述于美国专利第5656498、5004681、5192553、5955257和6461645号中。用于库藏干细胞的方法描述于例如美国专利申请公开号2003/0215942中。
本发明的处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可包含异质或同质细胞群。因此，根据一个实施方案，细胞包含纯的CD8+ T细胞群或纯的基因修饰T细胞群(例如分别用CAR或用TCR转导的T细胞，即CAR-T或TCR-T，靶向特定抗原)。根据另一个实施方案，细胞包含细胞(至少两种细胞类型) (比如但不限于T细胞例如 CD8+ T细胞和CD4+ T细胞)的混合群，或者T细胞与B细胞的混合群。这种确定很好地处于本领域技术人员的能力范围内。或者，细胞可包含得自多于一个细胞供体的细胞。
如在随后的实施例部分说明的那样，抗第三方中央型记忆T细胞具有特异性否决活性，并可在其中需要非同源(例如同种异体)细胞移植的情况下用作移植促进细胞。
因此，根据一个实施方案，为了避免移植物排斥反应(即处于悬浮状态的细胞，即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞的排斥反应)，以提供抗病活性(至少在细胞为与受试者同源时的情况下)和/或避免移植物抗宿主病(即通过处于悬浮状态的细胞即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)，给予受试者具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
本文使用的短语“抗第三方细胞”指的是针对(通过T细胞识别)一种或多种第三方抗原的T淋巴细胞。
本文使用的短语“一种或多种第三方抗原”指的是不存在于供体或接受者中的一种或多种可溶性或不可溶性(比如膜缔合)抗原，如下文详细描绘的那样。
例如，第三方抗原可为第三方细胞、细胞抗原(例如细胞表面抗原)、与恶性疾病相关的抗原(例如肿瘤抗原)、病毒比如EB病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)的抗原(即病毒抗原)，或细菌的抗原(即细菌抗原)，比如鞭毛蛋白。病毒或细菌抗原可由被其感染或者以其他方式使得表达病毒/细菌蛋白质的细胞(例如细胞系)呈递。
自体或非自体抗原呈递细胞或人工载体或人工抗原呈递细胞可用于呈递融合或装载于其上的短合成肽或者呈递蛋白质提取物或纯化的蛋白质。这种短肽、蛋白质提取物或纯化的蛋白质可为病毒或细菌来源的肽或代表任何其他抗原的肽。
专用软件可用于分析病毒或其他序列以鉴定免疫原性短肽，即可在I类MHC或II类MHC的情况下呈递的肽。
第三方细胞就接受者而言可为同种异体或异种异体的(下文进一步详细解释)。在同种异体第三方细胞的情况下，这种细胞具有与供体不同的HLA抗原，但其不与接受者HLA抗原交叉反应，以致针对这种细胞产生的抗第三方细胞不会对移植物或接受者抗原发生反应。
根据本发明的一个实施方案，同种异体或异种异体第三方细胞为选自以下的刺激性细胞：由外周血淋巴细胞(PBL)、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞(DC)和人工抗原呈递细胞纯化的细胞。
本发明的人工APC可被工程改造为呈现具有第3方肽或第3方MHC的自体MHC，而不需用外源性肽脉冲。因此，根据一个实施方案，人工APC包含用第三方MHC决定簇和共刺激分子转染的K562肿瘤细胞[如先前描述的，例如Suhoski MM等人, Mol Ther. (2007) 15(5):981-8]或用相同物质转染的成纤维细胞。
第三方抗原可呈递在细胞、病毒或细菌表面上，或者由此来源和/或纯化。另外，病毒或细菌抗原可展示在感染细胞上，并且细胞抗原可展示在人工载体比如脂质体或人工抗原呈递细胞(例如用一种或多种第三方抗原转染的白血病或成纤维细胞系)上。
第三方抗原可进一步包含由自体呈递细胞、非自体呈递细胞或在人工载体上或在人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
另外，第三方抗原可例如为自多种来源提取或纯化的蛋白质。可用作本发明第三方抗原的纯化蛋白质的实例为卵清蛋白。可设想其他实例。
采用细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、病毒肽呈递细胞或细菌肽呈递细胞作为第三方抗原特别有利，因为这种第三方抗原包括各种各样的抗原决定簇，并且因此引导形成多样化群体的抗第三方细胞，其可在其中需要这种重建的情况下，例如在致死或亚致死照射或化疗程序之后进一步用于更快速地重建T细胞。
此外，当抗第三方细胞针对第三方抗原时，细胞具有抗病活性。术语“抗病活性”指的是Tcm细胞针对病变细胞(例如癌细胞，比如移植物抗白血病(GVL)活性)的活性(例如杀伤能力)。该活性一般地是由于通过LFA1-I/CAM1结合介导的TCR独立杀伤[Arditti等人,Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6]。
根据一个实施方案，第三方细胞包含树突状细胞。
根据一个实施方案，第三方细胞包含成熟的树突状细胞。
产生第三方树突状细胞(其可用作用于诱导Tcm细胞的刺激性细胞)的方法为本领域熟知的。因此，作为非限制性实例，外周血单核细胞(PBMC)可得自第三方非同源细胞供体[例如在Tcm细胞为同源例如自体的情况下，就受试者而言树突状细胞(DC)可为非同源例如同种异体的；而如果Tcm细胞为非同源例如同种异体的，则DC选自为非同源例如同种异体，和HLA与受试者和Tcm细胞两者错配的供体]。单核细胞然后可通过塑料贴壁分离，并使用补充有人血清(例如1%人血清)、青霉素/链霉素和GM-CSF (例如800 IU/ml)和IL-4 (例如20ng/ml)(可得自例如Peprotech，Hamburg，Germany)的DC细胞培养基(例如Cellgro DC培养基)培养(例如在细胞培养板中)。在培养约24-72小时(例如48小时)后，可加入包含GM-CSF(例如1600 IU/ml)和IL-4 (例如20 ng/ml)的DC培养基。约12-36小时(例如24小时)后，可收获非贴壁细胞，并可将大细胞(大多数为未成熟DC)重悬浮于含有GM-CSF (例如800 IU/ml)、IL-4 (例如20 ng/ml)、LPS (例如来自大肠杆菌O55:B5，以例如10 ng/ml)和IFNγ(例如100 IU/ml) (可得自例如Peprotech, Hamburg, Germany)的新鲜培养基中，铺板并温育过夜。第二天，可弃去非贴壁细胞，并可在冰上温育约15-30分钟(例如20分钟)后使用例如冷的PBS/1% HS轻轻去除贴壁DC，从而获得由成熟DC组成的大细胞。
根据一个实施方案，第三方细胞包含照射的树突状细胞。
因此，根据一个实施方案，DC用约5-10 Gy、约10-20 Gy、约20-30 Gy、约20-40 Gy、约20-50 Gy、约10-50 Gy照射。根据一个具体的实施方案，DC用约10-50 Gy (例如30 Gy)照射。
根据一些实施方案，本发明的抗第三方细胞包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型。
本文使用的短语“中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型”指的是归巢至淋巴结的T细胞毒性细胞的亚群。人的具有Tcm表型的细胞一般地包含CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA-特征。应该意识到，Tcm细胞可在单细胞上表达所有特征标志物，或者可在单细胞上仅表达部分特征标志物。
应该意识到，至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或者甚至100%的抗第三方细胞为CD3+CD8+细胞。根据一个具体的实施方案，抗第三方细胞包含约70-90%的CD3+CD8+细胞。
应该意识到，至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或者甚至100%的CD3+CD8+细胞具有Tcm细胞特征。根据一个具体的实施方案，约30-80%的CD3+CD8+细胞具有Tcm细胞特征(例如40-50%)。
根据一个实施方案，分离细胞群的至少50%为CD3+CD8+细胞，其CD3+CD8+细胞的至少50%具有所述特征。
如所提及的那样，Tcm细胞一般地在移植后归巢至淋巴结。根据一些实施方案，本发明的抗第三方Tcm细胞可在移植后归巢至淋巴结中的任何一种，例如外周淋巴结和肠系膜淋巴结。这些细胞的归巢性质使其能够以快速和有效的方式发挥其耐受性效应。
因此，本发明的抗第三方Tcm细胞为耐受性诱导细胞。
本文使用的短语“耐受性诱导细胞”指的是与不存在给予的耐受性诱导细胞的情况下接受者细胞的反应性相比较，当其与接受者细胞接触时引起接受者细胞(例如接受者T细胞)的反应性降低的细胞。如先前在PCT公开号WO 2001/049243和WO 2002/102971中描述的那样，耐受性诱导细胞包括否决细胞(即在与宿主T细胞接触时导致其细胞凋亡的T细胞)。
术语“否决活性”涉及免疫细胞(例如供体来源的细胞)，其在识别并结合于否决细胞时导致抗供体接受者T细胞的失活。根据一个实施方案，失活导致抗供体接受者T细胞的细胞凋亡。
本发明的Tcm细胞也为非GVHD诱导细胞。
本文使用的术语“非GVHD”指的是具有显著降低的或没有移植物抗宿主诱导反应性。因此，产生本发明的细胞以致不显著引起移植物抗宿主病(GVHD)，如由移植的受试者30-100天的存活、体重和总体外观证实的那样。
根据一个实施方案，相对于不为抗第三方Tcm细胞的T细胞的移植，本发明的细胞对宿主的反应性降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或者甚至100%。
因此，本发明的抗第三方Tcm细胞可用作辅助疗法用于移植处于悬浮状态的细胞即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞(如上文描述的那样)。另外，本发明的Tcm细胞还具有抗病活性(例如抗肿瘤细胞活性)，并因此可用于疾病治疗(或作为疾病治疗的部分)。
根据一些实施方案，本发明的Tcm细胞可为非基因修饰细胞或基因修饰细胞(例如已经基因工程改造为表达或不表达特定基因、标志物或肽或者分泌或不分泌特定细胞因子的细胞)。本领域已知的任何方法可以基因工程改造细胞来实施，比如通过相关基因的失活或通过插入干扰多肽表达的反义RNA (参见例如WO/2000/039294，其特此通过参照结合)。
可如先前在PCT公开号WO 2010/049935、WO 2012/032526和WO 2013/035099中描述的那样，按照本发明使用产生抗第三方Tcm细胞的任何方法，本文通过参照结合。
因此，例如具有Tcm表型的抗第三方细胞可通过包括以下的方法产生：(a) 在存在或不存在IL-21的情况下使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以致使得能够富集抗原反应性细胞；和(b) 在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下培养自步骤(a)生成的细胞，以致使得包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞能够增殖。
根据一个实施方案，步骤(a)中的PBMC在不存在IL-21的情况下与一种或多种第三方抗原接触。
根据一个实施方案，步骤(a)中的PBMC在存在IL-21的情况下与一种或多种第三方抗原接触。
根据一个实施方案，在仅存在IL-15 (IL-21和/或IL-7可任选地添加)的情况下，在无抗原环境中(例如不向细胞培养物添加抗原)培养自步骤(a)生成的细胞。
本发明的抗第三方Tcm细胞一般地通过首先使同源(例如自体)或非同源(例如非自体比如同种异体或异种异体)外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原(比如以上描述的)在补充有IL-21的培养物中(例如在本来无细胞因子的培养物中，即不添加任何另外的细胞因子)中接触来产生。该步骤一般地实施约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天、2-5天、2-6天、1-7天、5-7天、2-8天、8-10天或1-10天，并使得能够富集抗原反应性细胞。
根据一个具体的实施方案，在补充有IL-21的培养物(本来无细胞因子的培养物)中实现使同源或非同源PBMC与一种或多种第三方抗原(比如以上描述的)接触1-5天(例如3天)。
该步骤一般地在存在约0.001-3000 IU/ml、0.01-3000 IU/ml、0.1-3000 IU/ml、1-3000 IU/ml、10-3000 IU/ml、100-3000 IU/ml、1000-3000 IU/ml、0.001-1000 IU/ml、0.01-1000 IU/ml、0.1-1000 IU/ml、1-1000 IU/ml、10-1000 IU/ml、100-1000 IU/ml、250-1000 IU/ml、500-1000 IU/ml、750-1000 IU/ml、10-500 IU/ml、50-500 IU/ml、100-500IU/ml、250-500 IU/ml、100-250 IU/ml、0.1-100 IU/ml、1-100 IU/ml、10-100 IU/ml、30-100 IU/ml、50-100 IU/ml、1-50 IU/ml、10-50 IU/ml、20-50 IU/ml、30-50 IU/ml、1-30IU/ml、10-30 IU/ml、20-30 IU/ml、10-20 IU/ml、0.1-10 IU/ml或1-10 IU/ml IL-21的情况下实施。
根据一个具体的实施方案，IL-21的浓度为50-150 IU/ml (例如100 IU/ml)。
根据一个具体的实施方案，在无细胞因子的培养物(例如仅补充有IL-21)中实现使同源或非同源PBMC与一种或多种第三方抗原接触，这种培养条件仅使得经历用一种或多种第三方抗原(即抗原反应性细胞的抗原)刺激和激活的那些细胞能够存活和富集，因为这些细胞分泌使得其能够存活的细胞因子(例如IL-2) (所有其余的细胞在这些培养条件下死亡)。
一种或多种第三方抗原(例如树突状细胞)与PBMC的比率一般地为约1:2-约1:10，比如约1:4、约1:6、约1:8或约1:10。根据一个具体的实施方案，一种或多种第三方抗原(例如树突状细胞)与PBMC的比率为约1:2-约1:8 (例如1:5)。
接下来，抗第三方细胞在存在IL-21、IL-15和/或IL-7的情况下(例如在无抗原环境中)进行培养，以致使得包含Tcm表型的细胞能够增殖。该步骤一般地实施约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-20 天、1-15天、1-10天、1-5天、5-20天、5-15天、5-10天、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、2-5天、2-8天、2-10天、4-10天、4-8天、6-8天、8-10天、7-9天、7-11天、7-13天、7-15天、10-12天、10-14天、12-14天、14-16天、14-18天、16-18天或18-20天。根据一个具体的实施方案，抗第三方细胞在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下，于无抗原环境中(例如不添加抗原)培养约7-11天(例如8天)。
该步骤一般地在以约0.001-3000 IU/ml、0.01-3000 IU/ml、0.1-3000 IU/ml、1-3000 IU/ml、10-3000 IU/ml、100-3000 IU/ml、1000-3000 IU/ml、0.001-1000 IU/ml、0.01-1000 IU/ml、0.1-1000 IU/ml、1-1000 IU/ml、10-1000 IU/ml、100-1000 IU/ml、250-1000 IU/ml、500-1000 IU/ml、750-1000 IU/ml、10-500 IU/ml、50-500 IU/ml、100-500IU/ml、250-500 IU/ml、100-250 IU/ml、0.1-100 IU/ml、1-100 IU/ml、10-100 IU/ml、30-100 IU/ml、50-100 IU/ml、1-50 IU/ml、10-50 IU/ml、20-50 IU/ml、30-50 IU/ml、1-30IU/ml、10-30 IU/ml、20-30 IU/ml、10-20 IU/ml、0.1-10 IU/ml或1-10 IU/ml IL-21的浓度存在IL-21的情况下实施。根据一个具体的实施方案，IL-21的浓度为50-150 IU/ml (例如100 IU/ml)。
该步骤进一步地在以约浓度存在IL-15的情况下实施。该步骤进一步地在以约0.001-3000 IU/ml、0.01-3000 IU/ml、0.1-3000 IU/ml、1-3000 IU/ml、10-3000 IU/ml、100-3000 IU/ml、125-3000 IU/ml、1000-3000 IU/ml、0.001-1000 IU/ml、0.01-1000 IU/ml、0.1-1000 IU/ml、1-1000 IU/ml、10-1000 IU/ml、100-1000 IU/ml、125-1000 IU/ml、250-1000 IU/ml、500-1000 IU/ml、750-1000 IU/ml、10-500 IU/ml、50-500 IU/ml、100-500 IU/ml、125-500 IU/ml、250-500 IU/ml、250-500 IU/ml、125-250 IU/ml、100-250 IU/ml、0.1-100 IU/ml、1-100 IU/ml、10-100 IU/ml、30-100 IU/ml、50-100 IU/ml、1-50 IU/ml、10-50 IU/ml、20-50 IU/ml、30-50 IU/ml、1-30 IU/ml、10-30 IU/ml、20-30 IU/ml、10-20 IU/ml、0.1-10 IU/ml或1-10 IU/ml IL-15的浓度存在IL-15的情况下实施。根据一个具体的实施方案，IL-15的浓度为100-150 IU/ml (例如125 IU/ml)。
该步骤进一步地在以约0.001-3000 IU/ml、0.01-3000 IU/ml、0.1-3000 IU/ml、1-3000 IU/ml、10-3000 IU/ml、30-3000 IU/ml、100-3000 IU/ml、1000-3000 IU/ml、0.001-1000 IU/ml、0.01-1000 IU/ml、0.1-1000 IU/ml、1-1000 IU/ml、10-1000 IU/ml、30-1000 IU/ml、100-1000 IU/ml、250-1000 IU/ml、500-1000 IU/ml、750-1000 IU/ml、10-500 IU/ml、30-500 IU/ml、50-500 IU/ml、100-500 IU/ml、250-500 IU/ml、100-250 IU/ml、0.1-100 IU/ml、1-100 IU/ml、10-100 IU/ml、30-100 IU/ml、50-100 IU/ml、1-50 IU/ml、10-50 IU/ml、20-50 IU/ml、30-50 IU/ml、1-30 IU/ml、10-30 IU/ml、20-30 IU/ml、10-20 IU/ml、0.1-10 IU/ml或1-10 IU/ml IL-7的浓度存在IL-7的情况下实施。根据一个具体的实施方案，IL-7的浓度为10-50 IU/ml (例如30 IU/ml)。
本发明人已通过辛苦的实验和筛选收集了许多可用于改善包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞增殖的标准，所述抗第三方细胞没有移植物抗宿主(GVH)反应性细胞和/或增强抗病(例如GVL)反应性细胞。
根据一个实施方案，在存在IL-21的情况下与一种或多种第三方抗原接触之前，PBMC被耗尽贴壁细胞。
根据一个实施方案，在存在IL-21的情况下与一种或多种第三方抗原接触之前，PBMC被耗尽CD4+和/或CD56+细胞。
根据一个实施方案，在存在IL-21的情况下与一种或多种第三方抗原接触之前，选择PBMC的CD45RA+细胞。
耗尽CD4+和/或CD56+细胞可使用本领域已知的任何方法实施，比如通过基于亲和力的纯化(例如通过使用MACS珠、FACS分选仪和/或捕获ELISA标记)。为了增加培养物中CD8+细胞的纯度(即清除细胞培养物中的其它淋巴细胞，例如T CD4+细胞或NK细胞)或为了增加CD8+ T细胞的数目，这种步骤可为有益的。
根据一个实施方案，PBMC包含非贴壁细胞。
根据一个实施方案，PBMC包含CD8+ T细胞。
根据一个实施方案，PBMC包含首次实验的CD8+ T细胞。
首次实验的CD8+ T细胞的选择可通过选择表达CD45RA+的细胞和/或表达CD45RO-的细胞来实现，并可使用本领域已知的任何方法实施，比如通过基于亲和力的纯化(比如通过使用MACS珠、FACS分选仪和/或捕获ELISA标记)。
根据一个实施方案，PBMC包含CD45RA+细胞。
可按照本教导实施的另外步骤包括在自细胞培养物去除一种或多种第三方抗原之前(即在产生无抗原环境之前)，在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下用一种或多种第三方抗原培养PBMC细胞。该步骤一般地实施约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2 天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天或2-5天，并且以相同剂量的以上指明的IL-21、IL-15和IL-7实现。根据一个具体的实施方案，在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下用一种或多种第三方抗原培养PBMC细胞实施12小时-4天(例如1-2天)。
另外或者备选地，可实施使得能够选择和分离激活的细胞的另外两步骤过程。这种选择步骤助于在其中PBMC为与受试者非同源的情况下去除潜在的宿主反应性T细胞(例如同种异体反应性细胞)(如以下文进一步详细描述的那样)。
因此，分离激活的细胞可以两阶段方法实施。在第一阶段中，在存在IL-15和IL-7的情况下培养细胞之前选择激活的细胞。该第一阶段一般地在PBMC与一种或多种第三方抗原于存在IL-21的情况下初始接触之后实施。该选择过程仅挑选被第三方抗原激活(例如如以下描述的那样表达激活标志物)的那些细胞，并且一般地在PBMC与一种或多种第三方抗原初始接触后约12-24小时、约24-36小时、约12-36小时、约36-48小时、约12-48小时、约48-60小时、约12-60小时、约60-72小时、约12-72小时、约72-84小时、约12-84小时、约84-96小时、约12-96小时实现。根据一个具体的实施方案，选择过程在PBMC与一种或多种第三方抗原初始接触后约12-24小时(例如14小时)实现。
分离激活的细胞可通过基于亲和力的纯化(例如通过使用MACS珠、FACS分选仪和/或捕获ELISA标记)来实现，并可针对任何激活标志物实现，包括细胞表面标志物比如但不限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137或非细胞表面标志物比如但不限于IFN-γ和IL-2。分离激活的细胞还可使用本领域已知的任何方法(例如通过FACS)通过基于形态学的纯化(例如分离大细胞)实现。一般地，还选择激活的细胞用于表达CD8+细胞。此外，以上方法的任何组合可用于有效分离激活的细胞。
根据本发明的一个实施方案，对激活的细胞的选择通过选择CD137+和/或CD25+细胞来实现。
一般地在培养结束时(即在不添加抗原的情况下用IL-21、IL-15和IL-7培养之后)实施分离激活的细胞的第二阶段。该阶段通过耗尽在中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)与经照射的宿主抗原呈递细胞(APC，例如树突状细胞)接触之后激活的那些细胞而耗尽同种异体反应性细胞。如以上提及的那样，分离激活的细胞可通过基于亲和力的纯化(例如通过使用MACS珠、FACS分选仪和/或捕获ELISA标记)来实现，并可针对任何激活标志物实现，包括细胞表面标志物比如但不限于 CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137或非细胞表面标志物比如但不限于 IFN-γ和IL-2。
根据本发明的一个实施方案，耗尽同种异体反应性细胞通过耗尽 CD137+和/或CD25+细胞和/或IFN-γ捕获来实现。
以下为可根据本发明的一些实施方案使用的方案的许多非限制性实例。
本发明的一个实施方案提供一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的分离细胞群的方法，所述细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，所述方法包括：(a) 用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的物质处理非贴壁外周血单核细胞(PBMC)，以致获得CD8+ T细胞；(b) 在存在IL-21的情况下使CD8+ T细胞与第三方树突状细胞接触12小时-5天，以致使得能够富集抗原反应性细胞；(c) 在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下用第三方树突状细胞培养自步骤(b)生成的细胞12小时-3天；和(d) 在无抗原的环境中(例如不添加抗原)，在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下培养自步骤(c)生成的细胞5-20天，以致使得包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞能够增殖。
因此，本发明的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞不是天然存在的，也不是自然的产物。这些细胞一般地通过离体操作产生(即在存在特定细胞因子的情况下暴露于一种或多种第三方抗原)。
本发明的方法可用于治疗其中移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可为有利的任何疾病或病症。因此，本发明的抗第三方Tcm细胞可用于促进移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)，而没有移植物排斥反应和/或GVHD的有害作用。例如，基因修饰的免疫细胞，例如被工程改造为表达嵌合抗原受体(CAR)的同种异体T细胞或NK细胞，可用于根除肿瘤细胞、病毒感染细胞或呈递自体抗原的细胞(例如在自身免疫性疾病中)。另外，可移植同种异体细胞比如肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺、皮肤、肠、卵巢、输卵管或脑细胞以重建受伤或受损的器官。本发明的抗第三方Tcm细胞的耐受作用使得其可用于免疫受损的个体以及非恶性疾病例如血液疾病(例如贫血、地中海贫血和自身免疫性疾病)的情况中。
因此，根据本发明的一个方面提供一种移植方法，所述方法包括给予需要移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)的受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
根据本发明的一个方面提供用于治疗需要移植处于悬浮状态的细胞的受试者的治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
本文使用的术语“受试者”或“需要……的受试者”指的是需要细胞移植(即细胞的移植)或患有可用细胞移植(即细胞的移植)治疗的疾病的任何年龄的哺乳动物，优选地为人，男性或女性。一般地，受试者由于适合于经细胞移植进行治疗的障碍或者病理或不期望的病症、状态或综合征或者身体、形态或生理异常而需要移植(本文也称为接受者)。以下进一步提供这种障碍的实例。
本文使用的短语“移植”指的是给予受试者体细胞例如单细胞或一组细胞。
根据一个实施方案，方法进一步包括给予受试者处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)。
根据另一方面提供一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括：(a)给予受试者治疗有效量的处于悬浮状态的细胞，其中所述细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞；和(b) 给予受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
根据另一方面提供治疗有效量的处于悬浮状态的细胞(其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞(所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结)，用于在有需要的受试者中治疗疾病。
本文使用的术语“治疗”包括终止、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或者基本上预防出现病症的临床或美学症状。
本文使用的术语“治疗有效量”意指有效预防、缓解或改善障碍(例如恶性或非恶性疾病)的症状或延长正在治疗的受试者的存活的活性成分(即处于悬浮状态的细胞和/或抗第三方Tcm细胞)的量。
治疗有效量的确定很好地处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。
对于用于本发明方法的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可自体外和细胞培养测定估计。例如，剂量可以动物模型配制以获得期望的浓度或滴度。这种信息可用于更准确地确定用于人的有用剂量。
例如，在细胞移植的情况下，输注给接受者的抗第三方Tcm细胞的数目应多于1×104/Kg体重。输注给接受者的抗第三方Tcm细胞的数目应一般地在1 x 103/Kg体重-1 x104/Kg体重的范围内、1 x 104/Kg体重-1 x 105/Kg体重的范围内、1 x 104/Kg体重-1 x106/Kg体重的范围内、1 x 104/Kg体重-1 x 107/Kg体重的范围内、1 x 104/Kg体重-1 x108/Kg体重的范围内、1 x 103/Kg体重-1 x 105/Kg体重的范围内、1 x 104/Kg体重-1 x106/Kg体重的范围内、1 x 106/Kg体重-1 x 107/Kg体重的范围内、1 x 105 /Kg体重-1 x107/Kg体重的范围内、1 x 106/Kg体重-1 x 108/Kg体重的范围内或1 x 106/Kg体重-1 x109/Kg体重的范围内。根据一个具体的实施方案，输注给接受者的抗第三方Tcm细胞的数目应在1 x 106/Kg体重-1 x 108/Kg体重的范围内。
根据一个实施方案，疾病为恶性疾病、与移植物移植相关的疾病、感染性疾病(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或寄生虫感染)、变态反应、炎性疾病和/或自身免疫性疾病。
癌性疾病
可通过本发明一些实施方案的方法治疗的恶性疾病(也称为癌症)可为任何实体或非实体肿瘤和/或肿瘤转移。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地讲，这种癌症的实例包括鳞状细胞癌、软组织肉瘤、卡波齐肉瘤、黑素瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、类癌(carcinoid carcinoma)、唾液腺癌、肾癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、移植后淋巴增生性障碍(PTLD)及各种类型的头颈癌(例如脑瘤)。适合于本发明治疗的癌性病症包括转移性癌症。
根据一个实施方案，恶性疾病为血液恶性肿瘤。示例性的血液恶性肿瘤包括但不限于白血病[例如急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞性前体B细胞白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、急性-巨核细胞白血病、单核细胞白血病、急性髓性白血病、急性髓样白血病、伴随嗜酸性粒细胞增多的急性髓样白血病、B细胞型白血病、嗜碱性粒细胞白血病、慢性髓样白血病、慢性白血病、B细胞型白血病、嗜酸性粒细胞白血病、Friend白血病、粒细胞白血病或髓细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴细胞白血病、巨核细胞白血病、单核细胞白血病、单核细胞-巨噬细胞白血病、成髓细胞白血病、髓样白血病、髓单核细胞白血病、浆细胞白血病、前体B细胞白血病、早幼粒细胞白血病、亚急性白血病、T细胞白血病、淋巴样肿瘤、易患髓样恶性肿瘤、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)]和淋巴瘤[例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胸腺淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性淋巴瘤)、小淋巴细胞(SL) NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥漫性NHL、高级别成免疫细胞NHL、高级别成淋巴细胞NHL、高级小无裂细胞NHL、巨块病变NHL (bulky disease NHL)、套细胞淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症]。
根据一个具体的实施方案，恶性疾病为白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌或胰腺癌。
炎性疾病-包括但不限于慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
与超敏反应相关的炎性疾病
超敏反应的实例包括但不限于I型超敏反应、II型超敏反应、III型超敏反应、IV型超敏反应、速发型超敏反应、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。
I型或速发型超敏反应，比如哮喘。
II型超敏反应包括但不限于类风湿性疾病、类风湿性自身免疫性疾病、类风湿性关节炎(Krenn V.等人, Histol Histopathol 2000 Jul; 15 (3):791)；脊柱炎、强直性脊柱炎(Jan Voswinkel等人, Arthritis Res 2001; 3 (3):189)；系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(Erikson J.等人, Immunol Res 1998; 17 (1-2):49)；硬化症、系统性硬化症(Renaudineau Y.等人, Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6 (2):156); Chan OT.等人, Immunol Rev 1999 Jun; 169:107)；腺性疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺自身免疫性疾病、糖尿病、I型糖尿病(Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996Oct; 34 Suppl:S125)；甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Orgiazzi J.Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2):339)；甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12):7262)；桥本氏甲状腺炎(Toyoda N.等人, Nippon Rinsho 1999 Aug; 57 (8):1810)；粘液性水肿、特发性粘液性水肿(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57 (8):1759)；自身免疫性生殖疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫(Garza KM.等人, J Reprod Immunol 1998 Feb; 37(2):87)；自身免疫性抗精子不育症(Diekman AB.等人, Am J Reprod Immunol. 2000Mar; 43 (3):134)；反复胎儿丧失(Tincani A.等人, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9)；神经退行性疾病、神经疾病、神经系统自身免疫性疾病、多发性硬化症(Cross AH.等人,JNeuroimmunol 2001 Jan 1; 112 (1-2):1)；阿尔茨海默病(Oron L.等人, J NeuralTransm Suppl. 1997; 49:77)；重症肌无力(Infante AJ. And Kraig E, Int RevImmunol 1999; 18 (1-2):83)；运动神经病(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191)；吉兰-巴雷综合征、神经病和自身免疫性神经病(Kusunoki S. Am J Med Sci.2000 Apr; 319 (4):234)；肌无力疾病、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Takamori M. Am JMed Sci. 2000 Apr; 319 (4):204)；副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩、非副肿瘤性僵人综合征、小脑萎缩、进行性小脑萎缩、脑炎、拉斯穆森脑炎、肌萎缩侧索硬化症、西登哈姆舞蹈病、日勒德拉图雷特综合征、多内分泌腺疾病、自身免疫性多内分泌腺疾病(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23)；神经病、免疫不全神经病(dysimmune neuropathies) (Nobile-Orazio E.等人,Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50:419)；神经性肌强直、获得性神经性肌强直、先天性多发性关节挛缩症(Vincent A.等人, Ann N Y Acad Sci. 1998May 13; 841:482)；心血管疾病、心血管自身免疫性疾病、动脉粥样硬化(Matsuura E.等人, Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S135)；心肌梗死(Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S132)；血栓形成(Tincani A.等人, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9)；肉芽肿、韦格纳肉芽肿、动脉炎、高安动脉炎和川崎综合征(Praprotnik S.等人, Wien Klin Wochenschr2000 Aug 25; 112 (15-16):660)；抗因子VIII的自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S.等人, Semin Thromb Hemost. 2000; 26 (2):157)；血管炎、坏死性小血管血管炎、显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征、肾小球肾炎、寡免疫局灶性坏死性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎(Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178)；抗磷脂综合征(Flamholz R.等人, J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171)；心力衰竭、心力衰竭中的激动剂样β-肾上腺素受体抗体(Wallukat G.等人, Am J Cardiol. 1999 Jun 17; 83(12A):75H)；血小板减少性紫癜(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14 (2):114)；溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG.等人, Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4):285)；胃肠疾病、胃肠道的自身免疫性疾病、肠道疾病、慢性炎性肠道疾病(Garcia Herola A.等人, Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 23 (1):16)；乳糜泻(Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2):122)；肌肉组织的自身免疫性疾病、肌炎、自身免疫性肌炎、斯耶格伦综合征(Feist E.等人, Int ArchAllergy Immunol 2000 Sep; 123 (1):92)；平滑肌的自身免疫性疾病(Zauli D.等人,Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6):234)；肝脏疾病、肝脏自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎(Manns MP. J Hepatol 2000 Aug; 33 (2):326)及原发性胆汁性肝硬化(Strassburg CP.等人, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6):595)。
IV型或T细胞介导的超敏反应包括但不限于类风湿性疾病、类风湿性关节炎(Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Jan 18; 91 (2):437)；系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(Datta SK., Lupus 1998; 7 (9):591)；腺性疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺疾病、胰腺自身免疫性疾病、I型糖尿病(Castano L.and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647)；甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Sakata S.等人, Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92 (1):77)；卵巢疾病(Garza KM.等人, J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2):87)；前列腺炎、自身免疫性前列腺炎(Alexander RB.等人, Urology 1997 Dec; 50 (6):893)；多腺体综合征、自身免疫性多腺体综合征、I型自身免疫性多腺体综合征(Hara T.等人, Blood. 1991 Mar 1; 77(5):1127)；神经疾病、自身免疫性神经疾病、多发性硬化症、神经炎、视神经炎(SoderstromM.等人, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May; 57 (5):544)；重症肌无力(OshimaM.等人, Eur J Immunol 1990 Dec; 20 (12):2563)；僵人综合征(Hiemstra HS.等人,Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Mar 27; 98 (7):3988)；心血管疾病、南美洲锥虫病的心脏自身免疫(Cunha-Neto E.等人, J Clin Invest 1996 Oct 15; 98 (8):1709)；自身免疫性血小板减少性紫癜(Semple JW.等人, Blood 1996 May 15; 87 (10):4245)；抗辅助T淋巴细胞自身免疫(Caporossi AP.等人,Viral Immunol 1998; 11 (1):9)；溶血性贫血(Sallah S.等人, Ann Hematol 1997 Mar; 74 (3):139)；肝脏疾病、肝脏自身免疫性疾病、肝炎、慢性活动性肝炎(Franco A.等人, Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54(3):382)；胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551)；肾病、肾脏自身免疫性疾病、肾炎、间质性肾炎(Kelly CJ. J Am SocNephrol 1990 Aug; 1 (2):140)；结缔组织疾病、耳疾病、自身免疫性结缔组织疾病、自身免疫性耳疾病(Yoo TJ.等人, Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249)；内耳疾病(Gloddek B.等人, Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830:266)；皮肤疾病、皮肤病、皮肤疾病、大疱性皮肤病、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮。
迟发型超敏反应的实例包括但不限于接触性皮炎和药疹。
介导超敏反应的T淋巴细胞类型的实例包括但不限于辅助T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞。
辅助T淋巴细胞介导的超敏反应的实例包括但不限于Th1淋巴细胞介导的超敏反应和Th2淋巴细胞介导的超敏反应。
变态反应性疾病
变态反应性疾病的实例包括但不限于哮喘、荨麻疹、风疹、花粉变态反应、尘螨变态反应、毒液变态反应、化妆品变态反应、乳胶变态反应、化学品变态反应、药物变态反应、昆虫叮咬变态反应、动物皮毛变态反应、刺痛植物变态反应、毒葛变态反应和食物变态反应。
自身免疫性疾病
包括但不限于心血管疾病、类风湿性疾病、腺性疾病、胃肠疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经疾病、肌肉疾病、肾病、与生殖相关的疾病、结缔组织疾病和系统性疾病。
自身免疫性心血管疾病的实例包括但不限于动脉粥样硬化(Matsuura E.等人,Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S135)；心肌梗死(Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S132)；血栓形成(Tincani A.等人, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9)；韦格纳肉芽肿、高安动脉炎、川崎综合征(Praprotnik S.等人, Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112(15-16):660)；抗因子VIII的自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S.等人, Semin ThrombHemost. 2000; 26 (2):157)；坏死性小血管血管炎、显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征、寡免疫局灶性坏死性和新月体性肾小球肾炎(Noel LH. Ann Med Interne (Paris).2000 May; 151 (3):178)；抗磷脂综合征(Flamholz R.等人, J Clin Apheresis 1999;14 (4):171)；抗体诱导的心力衰竭(Wallukat G.等人, Am J Cardiol. 1999 Jun 17; 83(12A):75H)；血小板减少性紫癜(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14 (2):114; Semple JW.等人, Blood 1996 May 15; 87 (10):4245)；自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG.等人, Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28 (3-4):285; Sallah S.等人, AnnHematol 1997 Mar; 74 (3):139)；南美洲锥虫病的心脏自身免疫(Cunha-Neto E.等人, JClin Invest 1996 Oct 15; 98 (8):1709)和抗辅助T淋巴细胞自身免疫(Caporossi AP.等人,Viral Immunol 1998; 11 (1):9)。
自身免疫性类风湿性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎(Krenn V.等人,Histol Histopathol 2000 Jul; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl AcadSci units S A 1994 Jan 18; 91 (2):437)和强直性脊柱炎(Jan Voswinkel等人,Arthritis Res 2001; 3 (3): 189)。
自身免疫性腺性疾病的实例包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液性水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不育症、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺体综合征。疾病包括但不限于胰腺自身免疫性疾病、1型糖尿病(Castano L. and Eisenbarth GS.Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34Suppl:S125)；自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Orgiazzi J. Endocrinol Metab ClinNorth Am 2000 Jun; 29 (2):339; Sakata S.等人, Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77)；自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000Dec 15; 165 (12):7262)；桥本氏甲状腺炎(Toyoda N.等人, Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8):1810)；特发性粘液性水肿(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57 (8):1759)；卵巢自身免疫(Garza KM.等人, J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2):87)；自身免疫性抗精子不育症(Diekman AB.等人, Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3):134)；自身免疫性前列腺炎(Alexander RB.等人, Urology 1997 Dec; 50 (6):893)和I型自身免疫性多腺体综合征(Hara T.等人, Blood. 1991 Mar 1; 77 (5):1127)。
自身免疫性胃肠疾病的实例包括但不限于慢性炎性肠道疾病(Garcia Herola A.等人, Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 23 (1):16)；乳糜泻(Landau YE. andShoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2):122)；结肠炎、回肠炎和克罗恩病。
自身免疫性皮肤疾病的实例包括但不限于自身免疫性大疱性皮肤病，比如但不限于寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮。
自身免疫性肝脏疾病的实例包括但不限于肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎(Franco A.等人, Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3):382)；原发性胆汁性肝硬化(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov; 91 (5):551; Strassburg CP.等人,Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6):595)和自身免疫性肝炎(Manns MP.J Hepatol 2000 Aug; 33 (2):326)。
自身免疫性神经疾病的实例包括但不限于多发性硬化症(Cross AH.等人,JNeuroimmunol 2001 Jan 1; 112 (1-2):1)；阿尔茨海默病(Oron L.等人, J NeuralTransm Suppl. 1997; 49:77)；重症肌无力(Infante AJ. And Kraig E, Int RevImmunol 1999; 18 (1-2):83; Oshima M.等人, Eur J Immunol 1990 Dec; 20 (12):2563)；神经病、运动神经病(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May; 7 (3):191)；吉兰-巴雷综合征和自身免疫性神经病(Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):234)；肌无力、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319(4):204)；副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合征(HiemstraHS.等人, Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27; 98 (7):3988)；非副肿瘤性僵人综合征、进行性小脑萎缩、脑炎、拉斯穆森脑炎、肌萎缩侧索硬化症、西登哈姆舞蹈病、日勒德拉图雷特综合征和自身免疫性多内分泌腺疾病(Antoine JC. and Honnorat J. RevNeurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23)；免疫不全神经病(Nobile-Orazio E.等人,Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50:419)；获得性神经性肌强直、先天性多发性关节挛缩症(Vincent A.等人, Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13; 841:482)；神经炎、视神经炎(Soderstrom M.等人, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994May; 57 (5):544)和神经退行性疾病。
自身免疫性肌肉疾病的实例包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原发性斯耶格伦综合征(Feist E.等人, Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123 (1):92)和平滑肌的自身免疫性疾病(Zauli D.等人,Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6):234)。
自身免疫性肾病的实例包括但不限于肾炎和自身免疫性间质性肾炎(Kelly CJ.J Am Soc Nephrol 1990 Aug; 1 (2):140)。
与生殖相关的自身免疫性疾病的实例包括但不限于反复胎儿丧失(Tincani A.等人, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9)。
自身免疫性结缔组织疾病的实例包括但不限于耳疾病、自身免疫性耳疾病(YooTJ.等人, Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249)和自身免疫性内耳疾病(Gloddek B.等人, Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830:266)。
自身免疫性系统性疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮(Erikson J.等人,Immunol Res 1998; 17 (1-2):49)和系统性硬化症(Renaudineau Y.等人, Clin DiagnLab Immunol. 1999 Mar; 6 (2):156); Chan OT.等人, Immunol Rev 1999 Jun; 169:107)。
感染性疾病
感染性疾病的实例包括但不限于慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、原生动物性疾病、寄生虫病、真菌性疾病、支原体病和朊病毒病。
引起可按照本发明的教导治疗的感染性疾病的病毒病原体的具体类型包括但不限于逆转录病毒、圆环病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、痘病毒、嗜肝病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、正粘病毒、副粘病毒，棒状病毒、本雅病毒、冠状病毒、沙粒病毒和丝状病毒。
可按照本发明的教导治疗的病毒感染的具体实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、流感、鼻病毒感染、病毒性脑膜炎、EB病毒(EBV)感染、甲型、乙型或丙型肝炎病毒感染、麻疹、乳头状瘤病毒感染/疣、巨细胞病毒(CMV)感染、单纯疱疹病毒感染、黄热病、埃博拉病毒感染和狂犬病。
移植物排斥反应疾病
根据其他实施方案，疾病与移植物的移植相关。与移植物的移植相关的疾病的实例包括但不限于移植物排斥反应、慢性移植物排斥反应、亚急性移植物排斥反应、超急性移植物排斥反应、急性移植物排斥反应、同种异体移植物排斥反应、异种移植物排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)。
变态反应性疾病
变态反应性疾病的实例包括但不限于哮喘、荨麻疹、风疹、花粉变态反应、尘螨变态反应、毒液变态反应、化妆品变态反应、乳胶变态反应、化学品变态反应、药物变态反应、昆虫叮咬变态反应、动物皮毛变态反应、刺痛植物变态反应、毒葛变态反应和食物变态反应。
根据一个具体的实施方案，疾病为非恶性疾病。
根据另一个具体的实施方案，非恶性疾病为器官功能障碍或衰竭、脑缺血、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、视网膜疾病、糖尿病(例如I型糖尿病或II型糖尿病)或肌源性疾病。
MSC、上皮祖细胞和EPC的多能性使这些细胞成为具有吸引力的治疗工具和移植候选物，能够在广泛范围的临床或美容应用中发挥作用。
因此，本发明的方法可用于治疗患有可得益于间充质干细胞、上皮祖细胞和/或内皮祖细胞移植的任何医学病症的受试者。
根据一个实施方案，医学病症可包括非恶性疾病、自身免疫性疾病(也称为自身免疫)、美容治疗、置换组织或器官或者诱导或加速受试者的组织修复或再生。
只要它们是基质细胞可分化成的组织，组织就不受限制。实例包括活体内所有类型的组织，比如皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经组织、肺组织、胃肠组织、肝脏/胆道/胰腺组织及泌尿生殖器官。
需要再生的组织的实例包括但不限于由于缺血/灌注不足/低氧条件、创伤、烧伤、炎症、自身免疫、基因异常等而由各种病理状况损伤的组织。
除了需要再生的组织以外的组织的实例包括血液组织、肌肉组织、皮下组织、皮内组织、腹腔、神经组织等。
因此，间充质干细胞或内皮祖细胞可用于帮助组织再生、促进伤口愈合并纠正许多其他遗传性和获得性障碍。MSC或EPC由于其分化、提供营养支持和调节先天性免疫反应的能力也可用于治疗炎性病症。MSC或EPC的治疗潜力正在用于适应症比如骨和软骨修复、心脏再生、严重肢体缺血、急性缺血性病症、糖尿病、克罗恩病、癌症和GVHD的多项临床试验中进行测试。
其中可使用MSC或EPC的示例性非恶性疾病包括但不限于器官功能障碍或衰竭、脑缺血、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、视网膜疾病、糖尿病和肌源性疾病。
根据一个实施方案，MSC或EPC可用于治疗骨疾病、骨损伤、心血管疾病、心血管损伤、缺血性疾病和缺血性损伤。
因此，本发明的细胞可用于治疗由缺血损伤或处于缺血性损伤风险下的任何组织，比如但不限于骨骼肌、心肌、肾脏、肝脏、肠、脑、肺、血管、皮肤组织、头皮或眼睛。
根据一个实施方案，MSC或EPC可用于在受试者中治疗病变或受损的骨(例如断骨)。待治疗的病变骨可包括但不限于骨质减少性骨、骨质疏松性骨、坏死性骨或缺血性骨。
因此，本教导的MSC或EPC可用于治疗神经退行性障碍，包括但不限于家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症(分别为FALS和ALS)、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、橄榄体脑桥小脑萎缩、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、弥漫性路易体病、皮质齿状核黑质变性(corticodentatnigral degeneration)、进行性家族性肌阵挛性癫痫、纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)、扭转性肌张力障碍、家族性震颤、唐氏综合征、日勒德拉图雷特综合征、哈勒沃登-施帕茨病、糖尿病性周围神经病变、拳击员痴呆、艾滋病痴呆、年龄相关的痴呆、年龄相关的记忆障碍以及淀粉样变性相关的神经退行性疾病比如与传染性海绵状脑病相关的由朊病毒蛋白(PrP)引起的那些神经退行性疾病(克罗伊茨费尔特-雅各布病、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、羊瘙痒症和苦鲁病)和由过量的胱抑素C积累引起的那些神经退行性疾病(遗传性胱抑素C血管病)、创伤性脑损伤(例如手术相关的脑损伤)、脑水肿、周围神经损伤、脊髓损伤、利氏病、吉兰-巴雷综合征、溶酶体贮积障碍比如脂褐质沉积症、阿耳珀病、由CNS变性引起的眩晕；慢性酗酒或药物滥用产生的病理学，包括例如蓝斑和小脑的神经元的变性；由老化产生的病理学，包括导致认知和运动障碍的小脑神经元和皮层神经元的变性；和慢性安非他明滥用产生的病理学，包括导致运动障碍的基底神经节神经元变性；由局灶性损伤比如中风、局灶性缺血、血管功能不全、低氧缺血性脑病、高血糖症、低血糖症或直接创伤引起的病理变化；作为治疗性药物和治疗的负面副作用产生的病理学(例如响应抗惊厥剂量的NMDA类谷氨酸受体拮抗剂的扣带回和内嗅皮层神经元的变性)及Wernicke-Korsakoff相关的痴呆；影响感觉神经元的神经退行性疾病包括弗里德赖希共济失调、糖尿病、周围神经病和视网膜神经元变性。
上文详细讨论了其中MSC或EPC可用于疗法的示例性自身免疫性疾病。例如，MSC或EPC可用于治疗多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病牛皮癣、重症肌无力、格雷夫斯病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
根据一个实施方案，当祖细胞为间充质干细胞时，疾病为包括美容病症、组织或器官损伤、整形外科病症、神经病症、心脏疾病或病症、糖尿病、耳聋、克罗恩病、自身免疫性障碍、白血病、癌症、镰状细胞病、肌萎缩侧索硬化症或代谢障碍的医学病症。
根据一个实施方案，当祖细胞为内皮祖细胞时，疾病为包括骨疾病、骨损伤、心血管疾病、心血管损伤、缺血性疾病、缺血性损伤、血管疾病、镰状细胞病、动脉粥样硬化、糖尿病或自身免疫性障碍的医学病症。
根据一个实施方案，当祖细胞为上皮祖细胞时，疾病为包括溃疡、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、伤口愈合缺陷、癌症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、特发性肺纤维化、肺动脉高压、肺癌、结节病、急性肺损伤(成人呼吸窘迫综合征)、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性肺部疾病(支气管肺发育不良)、表面活性蛋白B缺乏、先天性膈疝、肺泡蛋白沉积症、肺发育不良、肺损伤和角膜变性的医学病症。
根据一个实施方案，当不为干细胞的造血细胞包含免疫细胞时，疾病为包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的医学病症。
依应用而定，方法可使用处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和/或与受试者同源或非同源的抗第三方Tcm细胞实现。
根据一个实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞为与受试者同源(例如自体)。
根据一个实施方案，当具有Tcm表型的抗第三方细胞为与受试者同源(例如自体)时，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)为与受试者同源或非同源。
根据一个实施方案，具有Tcm表型的抗第三方细胞为与受试者非同源。
根据一个实施方案，当具有Tcm表型的抗第三方细胞为与受试者非同源(例如同种异体)时，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)为与受试者同源(例如自体)或非同源(例如同种异体)。
根据一个实施方案，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和具有Tcm表型的抗第三方细胞得自相同供体(例如人)。
根据一个实施方案，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和具有Tcm表型的抗第三方细胞得自不同供体(例如人)。
根据本发明的方法，抗第三方Tcm细胞和处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可同时给予(例如同时或在同一天，例如12-24小时内)。或者，抗第三方Tcm细胞可在移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)之前给予。因此，抗第三方细胞可在给予细胞之前1天、1周、1个月或者甚至几周或数月给予。在这种情况下，建议在给予处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)之前监测Tcm细胞在受试者中的存活(例如通过自受试者抽取的血液的FACS或ELISA测试)。根据另一个实施方案，抗第三方Tcm细胞可在移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)之后给予。因此，抗第三方细胞可在给予处于悬浮状态的细胞之后1天、1周、1个月或者甚至几周或数月给予(例如在其中可促进细胞植入或帮助消除移植物排斥反应或GVHD的情况下)。
根据一个实施方案，抗第三方Tcm细胞可给予受试者至少两次。根据一个实施方案，Tcm细胞可给予受试者两次、三次、四次、五次或更多次。抗第三方细胞可在细胞移植前(如以上讨论的那样)、同时(如以上讨论的那样)或在给予分化的细胞之后(例如在给予处于悬浮状态的细胞之后1天、1周、1个月或者甚至几周或数月)给予受试者。同样地，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可以多于一次给予(例如2、3、4、5或更多次)给予。这种确定很好地处于本领域技术人员的能力范围内。
本发明一些实施方案的抗第三方Tcm细胞和/或处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可本身或以其与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物给予生物体。
本文使用的“药物组合物”指的是本文描述的一种或多种活性成分与其他化学组分比如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的为促进把化合物给予生物体。
本文中术语“活性成分”指的是可引起生物效应的抗第三方Tcm细胞和/或处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)。
在下文中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指的是不对生物体造成显著刺激并且不消除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。
本文中术语“赋形剂”指的是加入到药物组合物中以进一步促进给予活性成分的惰性物质。赋形剂的实例(非限制性地)包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油类和聚乙二醇类。
用于配制和给予药物的技术可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition (最新版本)中找到，其通过参照结合到本文中。
给予受试者抗第三方Tcm细胞和/或处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可以多种方式实现，这取决于各种参数，比如细胞类型、接受者疾病的类型、阶段或严重程度(例如器官衰竭)、受试者特有的身体或生理参数和/或期望的治疗结果。
例如，依应用和目的而定，给予抗第三方Tcm细胞和细胞(处于悬浮状态)可通过选自以下的途径来实现：气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、脑室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠道。
根据一个实施方案，给予通过静脉内途径实现。
或者，给予受试者抗第三方Tcm细胞和/或处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可通过将其给予到各种合适的解剖位置以致具有治疗效果来实现。因此，依应用和目的而定，可将细胞给予到同位解剖位置(细胞的器官或组织类型的正常解剖位置)或给予到异位解剖位置(细胞的器官或组织类型的异常解剖位置)。
因此，依应用和目的而定，可将细胞有利地植入(例如移植)在肾小囊下，或植入到肾脏、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、门静脉、肝脏、脾脏、心腔、心脏、胸腔、肺、胰腺、皮肤和/或腹腔内。
例如，对于肝脏疾病或病症(例如肝功能障碍或衰竭)的治疗，可将处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)移植到肝脏、门静脉、肾小囊、皮下组织、网膜、脾脏和腹腔内。类似地，对于胰腺疾病或病症(例如糖尿病)的治疗，本发明的移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)可有利地通过将细胞移植到门静脉、肝脏、胰腺、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、肠袢(小肠U环的浆膜下)和/或腹腔内来实现。对于肺部疾病或病症的治疗，可将处于悬浮状态的细胞给予肺、肾小囊下、肝脏、门静脉、皮下组织、网膜、脾脏、腹腔内、胰腺和/或睾丸脂肪。同样地，为了治疗患有例如肾衰竭、心力衰竭或脑损伤的接受者的目的，可实施移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)。
任选地，当将本发明的细胞移植到具有缺陷器官的受试者时，首先至少部分地自受试者移除衰竭的器官以致使得移植物发育及其结构/功能整合对于受试者的解剖学/生理学处于最佳状态可能是有利的。
本发明一些实施方案的药物组合物可通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸剂、磨细(levitating)、乳化、包封、捕获或冻干方法。
因此，用于本发明一些实施方案的用途的药物组合物可以常规方式使用一种或多种生理学上可接受的载体配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其促进将活性成分加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给予途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以水溶液，优选地以生理学上相容的缓冲液比如汉克氏液、林格氏液或生理盐缓冲液配制。对于经粘膜给予，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常为本领域已知的。
对于口服给予，药物组合物可通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合而易于配制。这样的载体使得药物组合物能够配制成用于由患者口服摄入的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。可使用固体赋形剂制备用于口服使用的药物制剂，任选地研磨生成的混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂之后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂具体讲为填充剂比如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂比如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，比如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐比如海藻酸钠。
糖衣丸芯被提供合适的包衣。为此目的，可使用可任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物的浓缩糖液。向片剂或糖衣丸包衣中加入染料或颜料用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fitcapsule)以及由明胶和增塑剂比如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂比如乳糖、粘合剂比如淀粉、润滑剂比如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可溶解或悬浮于合适的液体比如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。所有用于口服给予的制剂应以适合于所选择的给予途径的剂量存在。
对于颊给予，组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予，用于本发明一些实施方案的用途的活性成分便利地以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾剂形式递送，其中使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，可通过提供递送计量的量的阀门来确定剂量单位。用于分配器的例如明胶胶囊和药筒可配制成含有化合物与合适的粉末基质比如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文描述的药物组合物可配制成用于肠胃外给予，例如通过大剂量注射或连续输注。用于注射的制剂可以单位剂型，例如以安瓿或多剂量容器呈现，任选地添加防腐剂。组合物可为在油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有配制剂比如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的混悬剂可制备成合适的油性或水基注射用混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油类比如芝麻油或合成的脂肪酸酯类比如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射用混悬剂可含有提高混悬剂粘度的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可含有合适的稳定剂或提高活性成分的溶解度以使得能够制备高度浓缩的溶液剂的物质。
或者，活性成分可以用于在使用前用合适的载体例如无菌无热原的水基溶液构建的粉末形式存在。
本发明一些实施方案的药物组合物还可使用例如常规栓剂基质比如可可脂或其他甘油酯类以直肠组合物比如栓剂或保留灌肠剂配制。
适合于在本发明一些实施方案的情况下使用的药物组合物包括其中活性成分以有效达到预期目的的量包含的组合物。更具体地讲，治疗有效量意指有效预防、减轻或改善障碍(例如癌症、感染性疾病)的症状或延长正在治疗的受试者的存活的活性成分(抗第三方Tcm细胞和/或处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞))的量。
治疗有效量的确定很好地处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。
对于用于本发明方法的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可自体外和细胞培养测定估计。例如，剂量可以动物模型配制以获得期望的浓度或滴度。这样的信息可用于更准确地确定用于人的有用剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效力可通过体外标准药学程序，以细胞培养物或实验动物来确定。自这些体外和细胞培养测定以及动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量可依使用的剂型和采用的给予途径而定变化。确切的剂型、给予途径和剂量可由个体医生鉴于患者的状况来选择(参见例如Fingl,等人, 1975, in“ThePharmacological Basis of Therapeutics”Ch. 1 p.1)。
剂量和间隔可单个调整以提供足以诱导或抑制生物效应的活性成分水平(最小有效浓度，MEC)。每种制剂的MEC有所不同，但可自体外数据估算。获得MEC必要的剂量取决于个体特征和给予途径。检测分析可用于确定血浆浓度。
依待治疗病症的严重程度和反应性而定，给予可为单次或多次给予，治疗过程持续几天-几周或者直至实现治愈或实现疾病状态的减轻(如上文详细讨论的那样)。
当然，待给予的组合物的量将取决于正在治疗的受试者、痛苦的严重程度、给予方式、处方医生的判断等。
因为非同源(例如同种异体)细胞在给予受试者时可能诱导免疫反应，已经开发了几种方法来降低非同源细胞排斥反应的可能性。这些方法包括抑制接受者免疫系统或在移植前将非自体细胞包封在免疫隔离的半透膜中。或者，细胞可为不表达异种异体表面抗原的用途，比如在转基因动物(例如猪)中发育的那些。
在根据本教导将处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)移植到受试者体内后，建议根据标准医学实践，根据各种标准技术中的任何一种监测细胞的存活和功能性。例如，胰腺细胞的功能性可在移植后通过标准胰腺功能测试(例如分析血清胰岛素水平) 来监测。同样地，肝细胞移植可在移植后通过标准肝功能测试(例如分析白蛋白、总蛋白质、ALT、AST和胆红素的血清水平，和分析凝血时间)来监测。细胞的结构发育可经计算机断层扫描或超声波成像来监测。
依移植背景而定，为了促进植入处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)，方法可进一步有利地包括在移植之前，于亚致死、致死或超致死条件下预处理受试者。
当涉及预处理本发明的受试者时，本文使用的术语“亚致死”、“致死”和“超致死”指的是骨髓毒性和/或淋巴细胞毒性治疗，其在应用于受试者的代表性群体时，一般地分别为：对群体的基本上所有成员为非致死的；对群体的一些而不是所有成员为致死的；或者在正常的不育条件下对群体的基本上所有成员为致死的。
根据本发明的一些实施方案，亚致死、致死或超致死预处理包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI，即所有淋巴结、胸腺和脾脏的暴露)、体分区照射(例如肺、肾、脑等的特定暴露)、清髓性预处理和/或非清髓性预处理，例如用包括但不限于共刺激性阻断、化疗药物和/或抗体免疫疗法的不同组合。根据本发明的一些实施方案，预处理包括任何以上描述的预处理方案的组合(例如化疗药物与TBI、共刺激性阻断与化疗药物、抗体免疫疗法与化疗药物等)。
根据一个实施方案，TBI包含在以下范围内的单次或分次照射剂量：0.5-1 Gy、0.5-1.5 Gy、0.5-2.5 Gy、0.5-5 Gy、0.5-7.5 Gy、0.5-10 Gy、0.5-15 Gy、1-1.5 Gy、1-2Gy、1-2.5 Gy、1-3 Gy、1-3.5 Gy、1-4 Gy、1-4.5 Gy、1-1.5 Gy、1-7.5 Gy、1-10 Gy、2-3 Gy、2-4 Gy、2-5 Gy、2-6 Gy、2-7 Gy、2-8 Gy、2-9 Gy、2-10 Gy、3-4 Gy、3-5 Gy、3-6 Gy、3-7Gy、3-8 Gy、3-9 Gy、3-10 Gy、4-5 Gy、4-6 Gy、4-7 Gy、4-8 Gy、4-9 Gy、4-10 Gy、5-6 Gy、5-7 Gy、5-8 Gy、5-9 Gy、5-10 Gy、6-7 Gy、6-8 Gy、6-9 Gy、6-10 Gy、7-8 Gy、7-9 Gy、7-10Gy、8-9 Gy、8-10 Gy、10-12 Gy或10-15 Gy。
根据一个具体的实施方案，TBI包含在1-7.5 Gy范围内的单次或分次照射剂量。
根据一个实施方案，预处理步骤通过在超致死条件下，比如在清髓性条件下预处理受试者实现。
或者，预处理步骤可通过在致死或亚致死条件下预处理受试者来实现，比如通过在myeloreductive条件或非清髓性条件下预处理受试者。
根据一个实施方案，预处理步骤通过用清髓性药物(例如白消安或美法仑)或非清髓性药物(例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)预处理受试者来实现。
可用于预处理受试者的预处理物质的实例包括(非限制性地)照射、药物和耐受性诱导细胞(如本文描述的那样)。
药物的实例包括骨髓毒性药物、淋巴细胞毒性药物和免疫抑制药物(以下详细讨论)。
骨髓毒性药物的实例包括(非限制性地)白消安、二甲基马利兰(dimethylmileran)、美法仑和噻替派。
另外或者备选地，方法可进一步包括在移植处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)之前、同时或之后用免疫抑制方案预处理受试者。
合适类型的免疫抑制方案的实例包括给予免疫抑制药物、耐受性诱导细胞群(例如，如上文详细描述的抗第三方Tcm细胞)和/或免疫抑制性照射。
用于选择和给予合适的用于移植的免疫抑制方案的充分指导提供在本领域的文献中(例如参照: Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952;Higgins RM.等人, 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. and Strom TB., 1996.New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE.等人, 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175;Morrison VA.等人, 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46,381; Senderowicz AM.等人, 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F.等人,1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J.等人 1998. Lancet 351, 623)。
优选地，免疫抑制方案由给予受试者至少一种免疫抑制药物组成。
免疫抑制药物的实例包括但不限于他克莫司(也称为FK-506或藤霉素，商品名:Prograf, Advagraf, Protopic)、霉酚酸酯、霉酚酸钠、泼尼松、甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、环孢菌素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺吡啶(sulfasalazine或sulphasalazopyrine))、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNF-α阻断剂(靶向炎性细胞因子的生物药物)和非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、水杨酰水杨酸、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯灭酸盐、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、曲马多、雷帕霉素(西罗莫司)和雷帕霉素类似物(比如CCI-779、RAD001、AP23573)。这些药物可单个或组合给予。
如果需要，本发明的治疗组合物可以包装或分配器装置呈现，比如FDA批准的试剂盒，其可含有一个或多个单位剂型，所述单位剂型含有活性成分。
因此根据本发明的一个方面提供一种用于移植的试剂盒，所述试剂盒包含：(i)处于悬浮状态的细胞，其中所述细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞；和(ii) 具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
试剂盒中的细胞可配制成用于静脉内给予。
根据一个实施方案，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和具有Tcm表型的抗第三方细胞包含在单个容器中。根据另一个实施方案，处于悬浮状态的细胞(即非造血细胞或不为干细胞的造血细胞)和具有Tcm表型的抗第三方细胞包含在单独容器中。
试剂盒可例如包含金属或塑料箔，比如泡罩包装。包装或分配器装置可附有给药说明书。包装或分配器也可以政府机构规定的规范药品生产、使用或销售的形式附有与容器相关的注意事项，该注意事项反映机构对组合物或人或兽医给予的批准形式。例如，这种注意事项可为由美国食品和药品管理局批准的用于处方药或经批准的产品说明书的标签。包含以相容性药用载体配制的本发明制剂的组合物也可被制备，置于适当的容器中，并被标记用于治疗指示的病症，如以上进一步详述的那样。
根据一个实施方案，试剂盒进一步包含化疗药物(例如抗肿瘤药物)。根据一个具体的实施方案，化疗药物包含烷化剂。示例性的烷化剂包括但不限于环磷酰胺、白消安、氮芥或莫司汀(HN2)、乌拉莫司汀(Uramustine)或尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、亚硝脲类、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、噻替派、铂、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂、四硝酸三铂、丙卡巴肼、六甲蜜胺、三氮烯类(达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺)、达卡巴嗪、替莫唑胺、马利兰、白舒非、氟达拉滨和二甲基马利兰。
根据一个实施方案，试剂盒进一步包含抗排斥药物(例如免疫抑制剂)。示例性的免疫抑制剂在上文得到详细描述。
根据一个实施方案，试剂盒进一步包含抗病毒药物。根据一个具体的实施方案，抗病毒药物包含更昔洛韦、伐昔洛韦、阿昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸、西多福韦、马立巴韦或来氟米特。
本文使用的术语“约”指的是±10%。
术语“包含”、“包涵”、“包括”、“涵盖”、“具有”及其词形变化形式意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但只是在另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征时才可行。
本文使用的单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指涉，除非上下文另外明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在整个该申请中，本发明的各种实施方案可以范围样式呈现。应该理解的是，以范围样式呈现的描述仅是为了方便和简洁，并且不应解释为对本发明范围的刻板限制。因此，范围的描述应认为已具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的描述比如1-6应认为已具体公开子范围比如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及处于该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
每当本文指示数值范围时，其意指包括处于指示范围内的任何引用的数值(分数或整数)。短语“在第一个指示数字与第二个指示数字之间的范围”和“第一个指示数字至第二个指示数字的范围”本文可互换使用，并且意指包括第一和第二个指示数字及其间的所有分数和整数数字。
本文使用的术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于已经为化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或者可易于自已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
应该意识到，为了清楚起见而在单独实施方案的情况下描述的本发明的某些特征，也可以单个实施方案的组合提供。相反地，为了简便起见而在单个实施方案的情况下描述的本发明的各种特征，也可单独地或以任何适合的子组合或者合适时以任何其他描述的本发明实施方案提供。在各种实施方案的情况下描述的某些特征不认为是那些实施方案的必要特征，除非实施方案在没有那些元素的情况下不起作用。
如上文描绘的和如在以下权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现参照以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明。
通常，本文使用的命名以及本发明中采用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有充分解释。参见例如“Molecular Cloning: Alaboratory Manual”Sambrook等人, (1989);“Current Protocols in MolecularBiology”Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel等人,“CurrentProtocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons,New York (1988); Watson等人,“Recombinant DNA”, Scientific American Books, NewYork; Birren等人 (eds)“Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 如在美国专利第4666828、4683202、4801531、5192659和5272057号中阐述的方法学;“Cell Biology: ALaboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994);“CurrentProtocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites等人(eds),“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition), Appleton & Lange,Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds),“Selected Methods in CellularImmunology”, W.H. Freeman and Co., New York (1980); 可用的免疫测定在专利和科学文献中得到广泛描述，参见例如美国专利第3791932、3839153、3850752、3850578、3853987、3867517、3879262、3901654、3935074、3984533、3996345、4034074、4098876、4879219、5011771和5281521号;“Oligonucleotide Synthesis”Gait, M.J., ed. (1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985);“Transcription and Translation”Hames, B.D., and Higgins S.J., Eds. (1984);“Animal Cell Culture”Freshney, R.I., ed. (1986);“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press, (1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B.,(1984) and“Methods in Enzymology”Vol. 1-317, Academic Press;“PCR Protocols: AGuide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990);Marshak等人,“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL Press (1996); 所有这些参考文献通过参照结合，好像本文充分阐述那样。在整个该文件中提供其他一般参考文献。确信其中的程序为本领域熟知的，并且为读者提供便利。其中含有的所有信息本文通过参照结合。
一般材料和实验程序
动物
雌性6-12周龄的BALB/c、CB6 (F1)和C57BL/6小鼠得自Harlan Laboratories或生长于Weizmann Institute of Science的动物设施。将所有小鼠保持在小笼中(每笼5只动物)并喂食无菌食物和酸水。所有研究得到了Weizmann Institute of Science InstitutionalAnimal Care and Use Committee的批准
宿主非反应性小鼠抗第3方Tcm的制备
如先前描述的那样制备抗第三方Tcm [Ophir E等人, Blood (2010) 115: 2095-2104]。简而言之，在细胞因子丧失下将供体小鼠的脾细胞针对经照射的第三方脾细胞培养60小时。随后，使用磁性粒子(BD Pharmingen)正向选择CD8+细胞并在无Ag环境中培养。每隔一天加入rhIL-15 (20 ng/mL; R＆D Systems)。为了在培养结束时获得纯化的群体(第16天)，通过磁激活细胞分选正向选择Tcm细胞的CD62L表达[MACS, Miltenyi, BergischGladbach, Germany]。
骨髓移植
1. 自Balb/c或C57BL/6小鼠收获长骨[裸鼠(Nude)或野生型(WT)]。通过冲洗或研磨骨头来提取骨髓以获得单细胞悬液。通过磁激活细胞分选使自WT小鼠收获的一些制剂经受T细胞耗尽。计数骨髓并使其达到正确的浓度，并然后静脉内注射到小鼠尾静脉或眶内。
2. 在移植之前，使小鼠经受预处理方案。减低强度预处理(RIC)包括使小鼠经受亚致死照射剂量(即接受者小鼠可自发恢复的照射剂量)或使小鼠经受低剂量的清髓性(例如白消安)或非清髓性(例如环磷酰胺)药物。使用γ射线机或x射线(例如XRAD-320)给予全身照射(TBI)。药物通过i.v.、s.c.、i.p.或口服给予。
OT1+细胞移植
自OT-1转基因小鼠收获淋巴结和/或脾脏。小鼠为携带CD45.1基因的OT-1小鼠和/或在RAG-/-突变背景下。或者，OT-1小鼠为F1-OT1小鼠，宿主XOT-1小鼠的后代，可用于消除同种异体现象。创建单细胞悬液，并然后通过磁激活细胞分选经受T细胞纯化[MACS, Miltenyi,Bergisch Gladbach, Germany]。经FACS测试生成的OT-1 T细胞群的纯度。然后将细胞作为“新鲜”细胞注射或者以其他方式离体培养以产生如以上描述的Tcm细胞，即通过第三方激活来自卵清蛋白表达小鼠的经照射的脾细胞。然后如本文描述的那样注射OT-1 Tcm细胞。
流式细胞分析
使用改进的Becton Dickinson FACScan实施荧光激活细胞分选(FACS)分析。细胞用对Vα2、Vβ5、H2Dd、H2Kb、CD45.1、CD45.2、CD8a、CD4、CD25、CD69、CD19特异性的标记抗体染色(Biolegend; BD; Miltenyi)。
CTL活性测定(51Cr测定)
处死小鼠，收获脾脏和LN并选择CD8+细胞(并且负向选择 H-2Dd以排除‘Tcm’)。以铬释放测定法测试了这些首次实验HTC的C3H (H-2k)或BALB/c (H-2d)靶标的杀伤能力。将用作靶细胞的BALB/c和C3H脾细胞用2 μg/ ml伴刀豆球蛋白A (Sigma, St. Louis, MO)预处理48小时，并暴露于70 μCi 51Cr (Perkin Elmer, Wellesley, MA) 1小时。自C57BL/6小鼠的CD8+选择的细胞制备效应细胞，并在含有IL-2 (20 U/ml)的96孔板以每种稀释度重复12次对BALB/c或C3H脾细胞以不同稀释度温育6天。第6天，将滴定数目的效应细胞和5×103个51Cr标记的靶标在V形底板以各种效应物/靶标(E:T)比率混合。以4小时51Cr释放测定测量细胞毒活性。特异性溶解的百分数计算为(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。培养基中单独培养的或用1% SDS溶解的靶细胞的51Cr释放分别定义为自发释放或总释放。
外周血单核细胞(PBMC)
通过Ficoll密度梯度离心自患者和健康志愿者的全血分离PBMC。当指明时，细胞通过如先前描述的血清学方法按类型分为I类HLA [Manual of Tissue Typing Techniques.Washington DC, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIHDHEW Publication 76-545, 1976, p22]。
树突状细胞产生
通过塑料贴壁分离单核细胞并使用3 ml补充有1%人血清和青霉素/链霉素+GM-CSF(800 IU/ml)和IL-4 (20 ng/ml)的Cellgro DC培养基(Peprotech, Hamburg, Germany)在6孔板中进行培养。培养48小时后，加入1.5 ml培养基(+1600 IU/ml的GM-CSF和20 ng/ml的IL4)。24小时后，收获非贴壁细胞，并将大细胞进行计数(大多数为未成熟DC)，重悬浮于含有GM-CSF 800 IU/ml、IL-4 20 ng/ml、10 ng/ml来自大肠杆菌O55:B5的LPS (Sigma,Deisenhofen, Germany)和IFNγ (Peprotech, 100 IU/ml)的新鲜培养基中，并以约106DC/孔以2 ml铺板且温育过夜。第二天，弃去非贴壁细胞，并在于冰上温育20分钟后使用冷的PBS/1% HS轻轻地去除贴壁DC。对由成熟DC组成的大细胞进行计数。用30 Gy照射细胞以避免生长少数潜在污染的NK或记忆T细胞，并然后用于T细胞刺激。
自PBMC分离首次实验的CD8 T细胞
按照制造商的说明书，使用CD8负选择试剂盒(Miltenyi, Bergisch Gladbach,Germany)，通过初始负选择分离首次实验的CD8 T细胞。然后使用CD45RO-珠和在LD柱上耗尽经历抗原的CD8+ T细胞。
抗第3方中央型记忆人CD8 T细胞的产生
分离首次实验的CD8 T细胞并将其重悬浮于补充有IL-21 (Peprotech, 30 ng/ml)的T细胞培养基中。将经照射的DC以1:4 DC:T细胞比率用4 x 105个T细胞/孔加入到48孔板中。每孔的总容量为500 μl。
在培养开始后72小时，加入500 μl含有IL-7和IL-15 (Peprotech, 5 ng/ml最终浓度)的T细胞培养基，并如在结果部分中概述的那样随后每2-3天喂养细胞。
统计分析
存活数据的分析使用Kaplan-Meier曲线(对数秩检验)实施。使用Student t检验实施平均值的比较。
实施例1
MHC错配Tcm在同源骨髓环境下于宿主小鼠中存活并发挥特异性否决活性
考虑到同源骨髓移植(BMT)即使在致死全身照射(TBI)的情况下给予时在人中远比同种异体BMT更安全，本发明人首先试图确定过继转移的F1-Tcm细胞在连同同源TDBMT一起输注时是否在宿主抗供体HTC的攻击下存活(图1A-B)。如在图2A-B可见的那样，在移植后60天时，F1-Tcm持续存在于外周血中。Tcm细胞占总CD8+部分的约13%±10 (数据未显示)。接下来，为了评估Tcm诱导野生型多克隆HTC群内抗原特异性克隆缺失的能力并验证其余的HTC保留其功能性，使用铬释放杀伤测定法。结果显示来自Tcm治疗小鼠的H2bCD8+HTC呈现H-2d靶标的杀伤显著减少并且保留H-2k靶标的杀伤能力，而未用Tcm治疗的小鼠(即单独BM组)对两种细胞类型呈现类似的杀伤水平(图3)。这些结果表明，Tcm对多克隆HTC群发挥特异性否决活性并证实未因Tcm缺失的克隆保留其功能性。随后，在用减低强度预处理(RIC)预处理的小鼠中重复这些实验，RIC更适合于临床实施。因此，在经5.5 Gy TBI亚致死照射的Balb/c小鼠中的研究得出类似结果(图4)，该小鼠注射同源T细胞耗尽的骨髓(TDBMT)和同种异体(Balb×Black) F1 Tcm (在图1C中说明)。Tcm细胞在这些小鼠的外周血中存在超过15个月(此时实验终止，数据未显示)。因此，MHC错配Tcm的存活可以一种非常安全的程序诱导，包括用亚致死5.5 Gy TBI和自体BMT预处理。
实施例2
MHC错配Tcm在不存在骨髓移植物的情况下于宿主小鼠中存活
鉴于以上数据，评价了Tcm细胞在不存在BM的情况下单独诱导耐受性的能力。这种方案的范围会大得多。具体地讲，通过在安全预处理下单独给予抗第3方Tcm细胞来诱导免疫耐受性不仅对于免疫受损个体而言具有价值，而且可能允许治疗非恶性血液疾病(例如贫血和地中海贫血)、自身免疫性疾病，并可为给予细胞疗法提供平台。首先，本发明人试图定义F1来源的Tcm细胞植入的最小照射剂量，以建立可以测试宿主耐受性诱导的模型。为此目的，使Balb/c小鼠在有和没有过继转移CB6 F1-Tcm细胞的情况下暴露于一系列亚致死预处理剂量。分析整个外周血的H2db阳性Tcm细胞，显示Tcm可被检测到的最小照射剂量(即其中Tcm细胞不被排斥)为5.5 Gy TBI (图5)。因此，测试了完全同种异体C57BL/6来源的Tcm在亚致死TBI剂量(5.5 Gy)下存活的可持续性(如在图1C中描绘的那样)。该实验旨在验证同种异体来源的细胞不诱导GVHD，并且抗供体T细胞的缺失不是通过同种异体反应性而是通过否决活性介导。此外，一旦转变成人并且为了产生“现成的(off-the-shelf)”耐受性诱导Tcm，细胞将最可能源自同种异体的非匹配来源。结果显示C57BL/6来源的同种异体Tcm能够在经5.5 Gy照射的Balb/c宿主体内存活(如在图1C中描绘的那样)，在外周血中比在接受CB6 F1 Tcm的小鼠中呈现略低的Tcm百分数(图6A-B)。该结果可能归因于Tcm细胞的非常缓慢的排斥过程。尽管Tcm细胞在血液中持续存在超过1年，但在注射后头几个月其数目的减少与在铬释放测定中检测到的抗宿主克隆的消除一起，强烈提示Tcm诱导外周耐受性。
因此，Tcm的单独应用可用于创建用于给予治疗比如细胞疗法的机会窗口，至少几个月。
实施例3
MHC错配Tcm支持来自相同供体的细胞的过继转移
为了检验Tcm细胞可用于过继细胞疗法的假设，本发明人采用携带针对卵清蛋白肽的TCR的转基因OT1小鼠。在该情况下使用OT1转基因细胞的动机源自这样的想法，即这些细胞可用作称为供体淋巴细胞输注(DLI)的细胞疗法的模型，其中所述供体淋巴细胞输注(DLI)具有整个供体T细胞群或者具有针对病毒或肿瘤抗原的抗原特异性T细胞。
首先，在Tcm的初始过继转移后90天，将首次实验的CD8+OT1+CD45.1+ T细胞输注到Tcm嵌合小鼠体内。主要目的为确定存活的Tcm群是否可促进新输注的同种异体细胞的植入。在注射首次实验的Tg细胞之前，通过FACS分析嵌合小鼠中的Tcm群。因此，分别接受了C57BL/6 Tcm或CB6-Tcm的2/5和9/11小鼠保持了其Tcm群(图6A-B)。
这些小鼠在移植后第90天用2 Gy TBI进一步预处理(为了耗尽一些T细胞以允许引入新的T细胞)，并然后对小鼠输注2×106个OT1细胞(H-2b)。有趣的是，当在第120天(OT1细胞移植后30天)评估时，OT1细胞仅能在于移植之前呈现出Tcm群的那些小鼠中检测到(图7)。这些初步结果显示在呈现Tcm群的小鼠中可接受添加来自相同供体来源的细胞，使用转基因OT-1细胞如下进一步证实：CD8+OT-1细胞与Tcm在第0天一起移植，以预防需要进行二次预处理(先前在第90天使用2 Gy TBI)，并且在细胞输注后于不同时间点监测到外周血中存在OT1细胞。
如在图8中显示的那样，该实验的结果说明：
1. C57BL/6 Tcm以及(BalbxC57BL) F1 Tcm可持续存在于同种异体接受者中。
2. 当共注射时，C57BL/6 Tcm可赋予基于C57BL/6背景(OT-1+CD45.1+RAG-)产生的CD8+OT-1首次实验的细胞以保护，而OT-1细胞自行退出循环。
3. 表达C57BL/6 (H-2b)小鼠的MHC单倍体型(Haplotype)的CB6 (F1) Tcm也可赋予OT-1幼稚细胞保护。
实施例4
MHC错配的Tcm支持来自相同供体的CAR T细胞的过继转移
在移植前一天(第-1天)，患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者用亚致死预处理方案(5.0 Gy TBI)预处理。第二天(第0天)，患者被移植(通过输注) 1 x 107/Kg Tcm细胞(如以上讨论的那样产生)与1 x 107/Kg针对CD19的CAR T细胞。
实施例5
抗第三方Tcm细胞可支持植入使得能够根除黑素瘤肿瘤细胞的抗肿瘤TCR转基因供体来源的CD8+细胞
如在图9中说明的那样，本发明人已采用B16-黑素瘤残留疾病预防模型，其中将表达B16-OVA的黑素瘤细胞(H2b)注入(在第-2天) C57BL/6小鼠(H2b)。第二天(第-1天)，这些小鼠经RIC用TBI进行处理。第二天，荷瘤C57BL/6小鼠被单独或者与F1 Tcm细胞(即来自相同细胞供体)或与携带非共有MHC (H2d)的同种异体Balb/c Tcm细胞一起同时给予抗Ova TCR转基因OT1-F1 (H2db)新鲜细胞。如在图10中说明的那样，来自(Black x Balb) F1来源的新鲜OT1细胞未能抑制表达OVA抗原的宿主型黑素瘤肿瘤的生长(参见图10，红色柱)。值得注意的是，荷瘤小鼠为C57BL/6，并且其能够排斥F1 OT1细胞，因为这些细胞表达Balb的MHC。然而，当给予表达Balb来源的MHC的Tcm否决细胞(即相同F1供体的Tcm细胞或同种异体Balb/c背景的Tcm细胞)时，它们凭借否决机制支持新鲜OT1细胞的植入和存活，并显著增强了OT1细胞的抗肿瘤活性。因此，在接受Tcm细胞的小鼠中，肿瘤大小减至小于1/3.5。
尽管本发明已连同其具体实施方案进行了描述，但显而易见的是，许多备选方案、修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在包括落入附加权利要求的精神和广泛范围内的所有这种备选方案、修改和变化。
该说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请本文以其全部结合到说明书中，至好像每一个单个出版物、专利或专利申请被具体和单个地表明通过参照结合到本文中的相同程度。另外，该申请中任何参考文献的引用或识别不应解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术得到。在一定程度上使用了章节标题，但其不应解释为一定的限制。

Claims (61)

1.一种移植方法，所述方法包括给予需要移植处于悬浮状态的细胞的受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
2.用于治疗需要移植处于悬浮状态的细胞的受试者的治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
3. 一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括：
(a) 给予所述受试者治疗有效量的处于悬浮状态的细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞；和
(b) 给予所述受试者治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结，从而治疗所述疾病。
4.用于在有需要的受试者中治疗疾病的治疗有效量的处于悬浮状态的细胞和治疗有效量的具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
5. 一种用于移植的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i) 处于悬浮状态的细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞；和
(ii) 具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述抗第三方细胞为耐受性诱导细胞并能够在移植后归巢至淋巴结。
6.权利要求5的试剂盒，其中所述细胞配制成用于静脉内给予。
7.权利要求3的方法，其中步骤(a)和步骤(b)同时实施。
8.权利要求3的方法，步骤(b)在步骤(a)之前实施。
9.权利要求1的方法，所述方法进一步包括给予所述受试者所述处于悬浮状态的细胞。
10.权利要求2的用于用途的治疗有效量的抗第三方细胞，其进一步包含治疗有效量的处于悬浮状态的细胞，其中所述处于悬浮状态的细胞包含非造血细胞或不为干细胞的造血细胞。
11.权利要求1、3、9中任何一项的方法，权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中所述非造血细胞包含分化的细胞。
12.权利要求11的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述分化的细胞选自肺细胞、胰腺细胞、肾细胞、肝细胞、心脏细胞、脑细胞、肠细胞、皮肤细胞、脾细胞和卵巢细胞。
13.权利要求11的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述分化的细胞得自胎儿组织。
14.权利要求11的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述分化的细胞得自成人组织。
15.权利要求1、3、9中任何一项的方法，权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中所述非造血细胞包含祖细胞或干细胞。
16.权利要求15的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述祖细胞或干细胞选自间充质干细胞、内皮祖细胞和上皮祖细胞。
17.权利要求1、3、9中任何一项的方法，权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中所述不为干细胞的造血细胞包含淋巴细胞亚群。
18.权利要求1、3、9中任何一项的方法，权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中所述不为干细胞的造血细胞包含免疫细胞。
19.权利要求18的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞和树突状细胞(DC)。
20. 权利要求19的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述T细胞选自CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。
21.权利要求1、3、9或11-20中任何一项的方法，权利要求2、4、10或11-20中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或者权利要求5或11-20中任何一项的试剂盒，其中所述非造血细胞或不为干细胞的造血细胞为基因修饰的。
22.权利要求21的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述基因修饰的细胞包含基因修饰的免疫细胞。
23.权利要求22的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或修饰的T细胞受体(TCR)。
24.权利要求23的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述免疫细胞为T细胞。
25.权利要求1或3的方法，其中所述给予所述受试者治疗有效量的具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞实现至少两次。
26.权利要求1或9的方法或权利要求2或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述需要移植的受试者患有恶性疾病。
27.权利要求3的方法或权利要求4的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述疾病为恶性疾病。
28.权利要求26或27的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述恶性疾病为实体肿瘤或肿瘤转移。
29.权利要求26或27的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述恶性疾病为血液恶性肿瘤。
30.权利要求26或27的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述恶性疾病选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌和胰腺癌。
31.权利要求1或9的方法或权利要求2或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述需要移植的受试者患有非恶性疾病。
32.权利要求3的方法或权利要求4的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述疾病为非恶性疾病。
33.权利要求31或32的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述非恶性疾病选自器官功能障碍或衰竭、感染性疾病、自身免疫性疾病和损伤。
34.权利要求31或32的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述非恶性疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、视网膜疾病、糖尿病、脑缺血、肌源性疾病、肺部疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、心脏疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、生育疾病和脑部疾病。
35.权利要求16的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中当所述祖细胞为间充质干细胞时，所述疾病为选自美容病症、组织或器官损伤、整形外科病症、神经病症、心脏疾病或病症、糖尿病、耳聋、克罗恩病、自身免疫性障碍、白血病、癌症、镰状细胞病、肌萎缩侧索硬化症和代谢障碍的医学病症。
36.权利要求16的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中当所述祖细胞为内皮祖细胞时，所述疾病为选自骨疾病、骨损伤、心血管疾病、心血管损伤、缺血性疾病、缺血性损伤、血管疾病、镰状细胞病、动脉粥样硬化、糖尿病和自身免疫性障碍的医学病症。
37.权利要求16的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中当所述祖细胞为上皮祖细胞时，所述疾病为选自溃疡、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、伤口愈合缺陷、癌症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、特发性肺纤维化、肺动脉高压、肺癌、结节病、急性肺损伤(成人呼吸窘迫综合征)、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性肺部疾病(支气管肺发育不良)、表面活性蛋白B缺乏、先天性膈疝、肺泡蛋白沉积症、肺发育不良、肺损伤和角膜变性的医学病症。
38.权利要求18的方法或用于用途的治疗有效量的细胞，其中当所述不为干细胞的造血细胞包含免疫细胞时，所述疾病为选自恶性肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的医学病症。
39.权利要求1、3或9中任何一项的方法或权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述非造血细胞或不为干细胞的造血细胞为与受试者非同源。
40.权利要求1、3或9中任何一项的方法或权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述非造血细胞或不为干细胞的造血细胞和具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞得自相同的供体。
41.权利要求1或3的方法或权利要求2或4的用于用途的治疗有效量的细胞，其中具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞为与受试者同源。
42.权利要求1或3的方法或权利要求2或4的用于用途的治疗有效量的细胞，其中具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞为与受试者非同源。
43.权利要求1、3、25或40-42中任何一项的方法，权利要求2、4或40-42中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+特征。
44.权利要求43的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述分离细胞群的至少50%为CD3+CD8+细胞，其CD3+CD8+细胞的至少50%具有所述特征。
45.权利要求1、3或9中任何一项的方法，所述方法进一步包括在所述给予之前，在亚致死、致死或超致死预处理方案下预处理所述受试者。
46.权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其进一步包括亚致死、致死或超致死预处理方案。
47.权利要求45的方法或权利要求46的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述亚致死、致死或超致死预处理选自全身照射(TBI)、体分区照射、清髓性预处理、非清髓性预处理、共刺激性阻断、化疗药物和抗体免疫疗法。
48.权利要求45的方法或权利要求46的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述亚致死预处理方案选自全身照射(TBI)、共刺激性阻断、化疗药物和抗体免疫疗法。
49.权利要求1、3或9中任何一项的方法，其中所述给予通过选自气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、脑室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠道的途径实现。
50.权利要求2、4或10中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述细胞被配制成用于通过选自气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、脑室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠道的途径给予。
51.权利要求1、3、25、26、31、39、41、42或45中任何一项的方法或权利要求2、4、26、31、39、41、42或45中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞，其中所述受试者为人受试者。
52. 权利要求1、3、25或40-42中任何一项的方法，权利要求2、4或40-42中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞通过包括以下的方法产生：
(a) 在存在IL-21的情况下使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以致使得能够富集抗原反应性细胞；和
(b) 在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下培养所述由步骤(a)生成的细胞，以致包含所述中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)抗第三方表型的细胞能够增殖，从而产生具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞。
53.权利要求52的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，进一步包括在所述与所述一种或多种第三方抗原接触之前自所述PBMC耗尽贴壁细胞。
54.权利要求52或53的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，进一步包括在所述与所述一种或多种第三方抗原接触之前自所述PBMC耗尽CD4+和/或CD56+细胞。
55.权利要求52的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，进一步包括在步骤(a)之后和在步骤(b)之前选择激活的细胞。
56.权利要求55的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述选择激活的细胞通过选择CD137+和/或CD25+细胞来实现。
57.权利要求52的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述一种或多种第三方抗原包含树突状细胞。
58.权利要求52的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述一种或多种第三方抗原选自第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质及由自体呈递细胞、非自体呈递细胞或在人工载体上或在人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
59.权利要求58的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，其中所述第三方细胞为选自由外周血淋巴细胞、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞和人工抗原呈递细胞纯化的细胞的刺激性细胞。
60.权利要求1、3、25或40-42中任何一项的方法，权利要求2、4或40-42中任何一项的用于用途的治疗有效量的细胞或权利要求5的试剂盒，其中具有所述Tcm表型的所述抗第三方细胞通过包括以下的方法产生：
(a) 用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的物质处理非贴壁外周血单核细胞(PBMC)，以致获得CD8+ T细胞；
(b) 使所述CD8+ T细胞在存在IL-21的情况下与第三方树突状细胞接触12小时-5天，以致使得能够富集抗原反应性细胞；
(c) 在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下培养所述自步骤(b)生成的细胞5-20天，以致使得所述包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞能够增殖，从而产生分离细胞群。
61.权利要求60的方法、用于用途的治疗有效量的细胞或试剂盒，进一步包括于步骤(c)之前，在存在IL-21、IL-15和IL-7的情况下用所述第三方树突状细胞培养所述自步骤(b)生成的细胞12小时-3天。
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