CN108018320B - 一种使用固定化脂肪酶富集藻油中的gla的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂肪酶富集藻油中的GLA的方法，包括以下步骤：S1：将脂肪酶固定化，得到固定化脂肪酶；S2：配制脂肪酶‑藻油反应体系，所述脂肪酶‑藻油反应体系中包含藻油、水、固定化脂肪酶和0.5‑2mM的抗坏血酸，使所述脂肪酶‑藻油反应体系反应8‑12h；S3：使用有机溶剂从反应后的所述脂肪酶‑藻油反应体系中萃取有机相，即得到GLA富集化的藻油。使用本发明的方法使用固定化脂肪酶即可大大提高藻油中的GLA浓度，达到富集的效果。

Description

一种使用固定化脂肪酶富集藻油中的GLA的方法
技术领域
本发明涉及微藻组分提取领域，更特别地，涉及一种使用固定化脂肪酶富集藻油中的GLA的方法。
背景技术
γ-亚麻酸(gamma linolenic acid，GLA)，属于n-6系列多不饱和脂肪酸中的一种，它的化学名称为全顺-Δ6、Δ9、Δ12－十八碳三烯酸，分子式为C18H28O2，为无色油状液体，在空气中极易被氧化。GLA是人体必需脂肪酸之一，它在生物体内经过复杂的代谢过程，产生多种次生代谢产物。主要形成二高-γ-亚麻酸或花生四烯酸，进而转化为前列腺素、白三烯和凝血恶烷等。GLA和其系列代谢物在免疫系统、心血管系统、生殖系统、内分泌系统中都具有重要而广泛的生理作用。在临床上，GLA可用于某些老年性疾病如糖尿病、高血脂病、动脉粥样硬化、血栓性心脑血管疾病、癌症以及胃溃疡、肥胖症、精神分裂症、特应性湿疹、风湿性关节炎、脉管炎等，还可用于合成前列腺素的前体，有调节血压和胆固醇合成的作用，并可起到控制炎症和促进细胞增殖的功效。
一般植物中亚麻酸的含量比较少，而且往往还含有比较高浓度的α-亚麻酸，该物质是GLA的同分异构体，在GLA的提纯过程中不易分离。研究发现，一些藻类例如栅藻、螺旋藻等中，GLA占总脂肪酸的含量可达15-25％，经过藻种选择和培养条件优化，GLA的含量甚至可高达30-40％，远高于高等植物中的GLA含量。因此，可从这些藻类中提取GLA用于科学研究或临床用途。
在生物体内，长链脂肪酸一般以脂肪酸酯的形式存在，脂肪酶可催化长链脂肪酸酯的水解。但是在水解难度上，C链上的多个不饱和键使C链高度弯曲，阻碍了脂肪酶与脂肪酸基团的结合，多不饱和脂肪酸酯比饱和脂肪酸酯或单不饱和脂肪酸酯更难被水解。正是具备了这种选择能力，使脂肪酶可用于多不饱和脂肪酸的富集。
然而，GLA的提取和纯化仍然存在许多问题。尤其是，当总脂中含有其他多不饱和脂肪酸，脂肪酶在催化水解过程中无法区分GLA和其他多不饱和脂肪酸，例如EPA(二十碳五烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)、ALA(α-亚麻酸)等，需要额外的步骤将其分开。
发明内容
由于GLA容易被氧化，为了保持GLA的品质，我们在提取和富集过程中尝试添加抗坏血酸作为抗氧化保护剂，结果出乎意料地，富集后的藻油中GLA的含量大大提高，其他不饱和脂肪酸的含量大大降低。
基于以上发现，本发明提供了一种使用固定化脂肪酶富集藻油中的GLA的方法，包括以下步骤：
S1：将脂肪酶固定化，得到固定化脂肪酶；
S2：配制脂肪酶-藻油反应体系，所述脂肪酶-藻油反应体系中包含藻油、水、固定化脂肪酶和0.5-2mM的抗坏血酸，使所述脂肪酶-藻油反应体系反应8-12h；
S3：使用有机溶剂从反应后的所述脂肪酶-藻油反应体系中萃取有机相，即得到GLA富集化的藻油。
在一个优选实施方案中，S2中，所述脂肪酶为CCL脂肪酶，所述反应在40-43℃振荡下进行。
在一个优选实施方案中，S2中，所述脂肪酶-藻油反应体系中的水与藻油的重量比为1:1.5-1:2。
在一个优选实施方案中，S2中，所述脂肪酶-藻油反应体系中固定化脂肪酶的含量为0.06-0.08g/20ml。
在一个优选实施方案中，S1中通过戊二醛交联的方法将所述脂肪酶固定于硅胶G上，得到固定化脂肪酶。
在一个优选实施方案中，S3中，所述有机溶剂为正己烷。
在一个优选实施方案中，S3包括以下步骤：
S31：向反应后的所述脂肪酶-藻油反应体系中添加等体积的正己烷，振荡分层后，收集有机相；
S32：用水洗涤所述有机相3次，即得到所述GLA富集化的藻油。
使用本发明的方法使用固定化脂肪酶即可大大提高藻油中的GLA浓度，达到富集的效果。
附图说明
图1为添加抗坏血酸和不添加抗坏血酸的反应体系在反应过程中不同时间点的GLA含量的统计图；
图2为添加不同浓度抗坏血酸的反应体系在反应8小时后GLA的含量统计图；
图3为在不同温度下反应8小时后GLA的含量统计图；
图4为水油比不同的反应体系在反应8小时后GLA的含量统计图
图5为添加不同的固定化脂肪酶的量的反应体系在反应8小时后GLA的含量统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.藻油和脂肪酶
以下具体实施方式中使用的藻油为提取自栅藻的藻油，除了含有饱和脂肪酸外，还含有15％左右的GLA，并且还含有DHA、EPA和ALA。所使用的脂肪酶为圆柱状假丝酵母脂肪酶(CCL脂肪酶)。
2.脂肪酶的固定化
称取15g脂肪酶溶于于300mL磷酸缓冲液(50mmol/L KH2P04-K2HP04，pH 7.2)，于室温、200r/min下孵育2h，用离心机在2680g下离心10min，取上清。用磷酸缓冲液稀释上述上清液，至脂肪酶浓度为0.05mg/mL。
将1g硅胶G和2mL戊二醛加入30mL上述酶液中，于30℃、150r/min振荡吸附2h后，过滤出固定化脂肪酶，干燥后于4℃储存待用。
3.固定化脂肪酶处理藻油
3.1反应时间的优化
配制脂肪酶-藻油反应体系，向50mL三角瓶中加入藻油、双蒸水、固定化脂肪酶和抗坏血酸，配制成20mL反应体系。其中，藻油和双蒸水的重量比为1：1.5，固定化脂肪酶的含量为0.06g，抗坏血酸的含量为0.5mM。将反应体系放置在40℃下孵育，每隔一定时间取样，用于萃取有机相。以不加抗坏血酸的反应体系为对照。
萃取方法如下：向反应后的体系中添加等体积的正己烷，振荡分层后，收集有机相；用水洗涤有机相3次，然后蒸发掉正己烷，即得到GLA富集化的藻油。将富集后的藻油进行液相色谱，检测其中GLA的含量。
结果如图1所示，添加了抗坏血酸的反应体系中，随着时间的推移，GLA含量迅速升高，在8-12小时内，GLA的含量高达80％以上，然后GLA的含量开始降低。而没有添加抗坏血酸的反应体系中，GLA含量随时间的增加没有前者中那么多，最高出现在8小时，最高GLA含量为45％左右。在添加了抗坏血酸后，GLA的含量明显比没有添加时高出了很多，可见抗坏血酸在该反应中不仅仅起了保护多不饱和脂肪酸不被氧化的作用，而且很有可能起了其他作用。
不受理论的限制，我们猜测，由于藻油中除了含有GLA，还含有其DHA、EPA和ALA等Ω-3型多不饱和脂肪酸。当不含抗坏血酸时，脂肪酶主要水解饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而多不饱和脂肪酸在初期都没有水解下来，所以，反应后的藻油中GLA的含量提高有限。抗坏血酸的加入促使脂肪酶更快地催化饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸的水解，同时还催化Ω-3型多不饱和脂肪酸的水解，而Ω-6型的多不饱和脂肪酸GLA并没有受到影响，由此导致GLA进行了更高程度的富集。我们检测了其中DHA、EPA和ALA的含量，发现加了抗坏血酸的反应体系中，这几种Ω-3型多不饱和脂肪酸的含量均出现大幅下降。
随着反应时间的延长，当许多其他脂肪酸水解下来之后，脂肪酶才开始催化水解GLA，所以，当时间到一定程度后，GLA的含量也开始降低，因此反应时间优选设定为8-12小时。
3.2抗坏血酸浓度的优化
反应体系和条件如3.1中设置，加入不同浓度的抗坏血酸，反应8小时后，检测GLA的含量。结果如图2所示，当抗坏血酸浓度为0.5-2mM时，反应8小时后，GLA的含量在80％左右，而当抗坏血酸的浓度低于或高于这个区间时，GLA的含量降低。
3.3温度的优化
反应体系和条件如3.1中设置，使反应体系在不同温度下反应，反应8小时后，检测GLA的含量。结果如图3所示，当温度为40和43℃时，反应8小时后，GLA的含量在80％左右，而当温度过高或过低时，GLA的含量降低。
3.4水:藻油的重量比的优化
反应体系和条件如3.1中设置，使反应体系中的藻油与水的比例不同，反应8小时后，检测GLA的含量。结果如图4所示，当水油比为1：1.5和1:2时，反应8小时后，GLA的含量在80％左右，而当水油比过高或过低时，GLA的含量降低。
3.5所加固定化脂肪酶量的优化
反应体系和条件如3.1中设置，添加不同量的固定化脂肪酶，反应8小时后，检测GLA的含量。结果如图5所示，当添加的固定化脂肪酶为0.6g和0.8g时，反应8小时后，GLA的含量在80％左右，而当添加的固定化脂肪酶的量过高或过低时，GLA的含量降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种使用固定化脂肪酶富集藻油中的γ-亚麻酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将脂肪酶固定化，得到固定化脂肪酶，所述脂肪酶为圆柱状假丝酵母脂肪酶；
S2：配制脂肪酶-藻油反应体系，所述脂肪酶-藻油反应体系中包含藻油、水、固定化脂肪酶和0.5-2mM的抗坏血酸，使所述脂肪酶-藻油反应体系反应8-12h，所述反应在40-43℃振荡下进行，所述脂肪酶-藻油反应体系中，水与藻油的重量比为1:1.5-1:2；
S3：使用有机溶剂从反应后的所述脂肪酶-藻油反应体系中萃取有机相，即得到γ-亚麻酸富集化的藻油。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中，所述脂肪酶-藻油反应体系中固定化脂肪酶的含量为0.06-0.08g/20ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中通过戊二醛交联的方法将所述脂肪酶固定于硅胶G上，得到固定化脂肪酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，S3中，所述有机溶剂为正己烷。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S3包括以下步骤：
S31：向反应后的所述脂肪酶-藻油反应体系中添加等体积的正己烷，振荡分层后，收集有机相；
S32：用水洗涤所述有机相3次，即得到所述γ-亚麻酸富集化的藻油。
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