CN108012925A - 一种红心猕猴桃组织培养方法 - Google Patents

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杜永魏
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Abstract

本发明公开了一种红心猕猴桃组织培养方法，包括依次使用由母液组合物及不同的基础培养基组成的初代培养基、继代培养基和生根培养基进行培养，其中，母液组合物含有适用于红心猕猴桃组织营养需求、微量元素需求、铁盐需求以及维生素B和氨基酸需求的成分，不同阶段的基础培养基采用根据植物所需添加不同浓度激素，从而可在较短的周期内、以较大的成活率获得红心猕猴桃组织。

Description

一种红心猕猴桃组织培养方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种红心猕猴桃继组织培养方法。
背景技术
红心猕猴桃(Actinidia Chinensis)，别名红心果或者藤梨子。分布区域凉都六盘水，河南西峡县，陕西眉县，浙江遂昌县，四川苍溪县。是一种可食用与药用为一体的水果，每百克鲜果肉含维生素C100-420毫克，比柑橘高5-10倍，比柠檬高11-13倍，比苹果高20-80倍。红心猕猴桃果肉细嫩、香气浓郁、口感香甜清爽、酸度极低，营养丰富，看之饱眼福、食之饱口福。富含维生素C及P、K、Ca、Mg、Fe、Cu等多种矿物质和18种氨基酸，特别是微量元素中的含钙量为果中之首，被誉为“人间仙果”、被称为“果中之王”、“维C之王”，特别是微量元素中的含钙量较高。果实中的钙可直接被人体吸收，是中老年人良好的补钙剂，营养价值丰富。红心猕猴桃是新品种，属中华猕猴桃中的红肉猕猴桃变种，是特早熟红心品种，其子代遗传性状稳定，抗逆性强，果实较大，风味浓甜可口，较耐贮藏。红心猕猴桃在高、低海拔地区均能正常生长与结果，生态适应性良好，且丰产、稳产，果实品质优良，抗高温干旱能力强，具有较强的抗病虫能力，但在低海拔地区栽培，果肉红色变淡，以海拔1000米以上的地区栽培最能体现其果实红心的特性。因此，龙藏红更适宜于在海拔较高(1000-1500m)的地区种植，以充分表现其品种特色。
传统的育苗方式主要采用种子繁育的方法进行，但其需要的周期性过长，且所需的外界因素较为严格，控制不好就难于培育出种苗。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是为了提供一种生长周期短、植株存活率高的组织培养方法。
本发明的目的采用以下技术方案实现：
一种红心猕猴桃组织培养方法，包括：
初代培养步骤：取新鲜、无虫害的红心猕猴桃新绿色叶、茎和成熟叶组织，洗净、晾干后，置于初代培养基进行初代培养至长出愈伤组织；
继代培养步骤：将初代培养得到愈伤组织转移至继代培养基上进行继代培养，分化得到株芽；
生根培养步骤：将继代培养步骤后分化出株芽的组织进行生根培养；
所述初代培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.3mL/L的6-BA和余量的水组成；
所述继代培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.2mL/L的α-NAA和余量的水组成；
所述生根培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.2-0.4mL/L的α-NAA和余量的水组成；
其中母液组合物包括按重量份计的以下组分：20-30份稀释10倍的大量元素母液、5-10份稀释100倍的微量元素母液、5-10份铁盐母液和5-10份稀释50倍的有机物母液。
进一步地，所述大量元素母液包括以下浓度的以下组分：180-200g/L的KNO3、150-170g/L的NH4NO3、110-130g/L的CaCl2、196-228g/L的MgSO4、150-200g/L的KH2PO4；
所述微量元素母液，包括以下浓度的以下组分：80-90mg/L的KI、650-750mg/L的H3BO3、2.2-2.3g/L的MnSO4、382-405mg/L的ZnSO4、25-30mg/L的Na2MoO4、1.3-2.0mg/L的CuSO4和2-3mg/L的CoCl2；
所述铁盐母液包括按重量浓度计的以下组分：27.0-27.5g/L FeSO4和27-28g/LEDTA二钠；
所述有机物母液包括以下浓度的以下组分：30g/L的蔗糖、90-140mg/L的维生素B和200-210g/L的甘氨酸；所述维生素B包括维生素B1、维生素B3和维生素B6。
进一步地，所述维生素B1、维生素B3和维生素B6的重量比为6:(5-7):(1-3)。
进一步地，初代培养步骤中，培养的温度为15-20℃，培养光照为1500-2500lx，光照时长为12-14h/天。
进一步地，继代培养步骤中，培养温度为12-16℃，培养光照为2500-3500lx，光照时长为12-14h/天。
进一步地，继代培养步骤中，施加2-4％的二氧化碳氛围。
进一步地，生根培养步骤中，培养温度为15-20℃，培养光照为1000-2000lx，光照时长为6-8h/天。
进一步地，所述初代培养基由24-26mL/L的稀释10倍的大量元素母液、7-8mL/L的稀释100倍的微量元素母液、7-8mL/L的铁盐母液、7-8mL/L的稀释50倍的有机物母液、0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.3mL/L的6-BA和余量的水组成。
进一步地，所述继代培养基由24-26mL/L的稀释10倍的大量元素母液、7-8mL/L的稀释100倍的微量元素母液、7-8mL/L的铁盐母液、7-8mL/L的稀释50倍的有机物母液、0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.2mL/L的α-NAA和余量的水组成。
进一步地，所述生根培养基由24-26mL/L的稀释10倍的大量元素母液、7-8mL/L的稀释100倍的微量元素母液、7-8mL/L的铁盐母液、7-8mL/L的稀释50倍的有机物母液、0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.2-0.4mL/L的α-NAA和余量的水组成。相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的红心猕猴桃继代培养方法是根据红心猕猴桃组织初代、继代和生根生长的营养元素需求和生长特点，研制了分别适用于该三个阶段的培养基，可在较短的周期内获得较多的生根植株，具有重要的意义；
本发明提供的红心猕猴桃继代培养方法使用的母液组合物含有适用于红心猕猴桃组织营养需求、微量元素需求、铁盐需求以及维生素B和氨基酸需求的成分，而不同阶段的基础培养基是采用根据植物所需添加不同浓度激素，从而可在较短的周期内、以较大的成活率获得红心猕猴桃组织。
附图说明
图1为愈伤组织长势图；
图2为株芽分化图；
图3为生根长势图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
如未特殊说明，以下具体实施方式中，所采用的试剂或仪器，均可通过市售或常规试验手段获得。
本发明提供一种红心猕猴桃组织培养方法，包括：
初代培养步骤：取新鲜、无虫害的红心猕猴桃新绿色叶、茎和成熟叶组织，洗净、晾干后，置于初代培养基进行初代培养至长出愈伤组织；该步骤中，培养的温度为15-20℃，培养光照为1500-2500lx，光照时长为12-14h/天，可以有效地减少组织褐化腐烂等问题的发生；
继代培养步骤：将初代培养得到愈伤组织转移至继代培养基上进行继代培养，分化得到株芽；该步骤中，培养温度为12-16℃，培养光照为2500-3500lx，光照时长为12-14h/天；采用这种方式能有效地促进愈伤组织快速地分化为株芽；
生根培养步骤：将继代培养步骤后分化出株芽的组织进行生根培养；
该步骤中，培养温度为15-20℃，培养光照为1000-2000lx，光照时长为6-8h/天，该条件下可以有效地促进分化出株芽的组织生成致密、牢固的根系；
所述初代培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.3mL/L的6-BA和余量的水组成；
所述继代培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.2mL/L的α-NAA和余量的水组成；
所述生根培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.2-0.4mL/L的α-NAA和余量的水组成；
其中母液组合物包括按重量份计的以下组分：20-30份稀释10倍的大量元素母液、5-10份稀释100倍的微量元素母液、5-10份铁盐母液和5-10份稀释50倍的有机物母液。
本发明提供的组织培养方法，是根据红心猕猴桃组织生长过程中，初代、继代以及生根不同的阶段对营养元素、生长激素不同的可要求而配制的，可以在较短的周期内，由较少的植物组织培养得到较大量的、生长活力强的红心猕猴桃株芽。
实施例1：
一种红心猕猴桃初代培养基，其制备方法包括以下步骤：
大量元素母液的配制：分别称取CaCl2·2H2O 43g加水溶解，称取KNO3 190g、NH4NO3160g、MgSO4·7H2O 38g和KH2PO4 18g，加水溶解，混合定容至1000mL，得到大量元素母液；
微量元素母液：称取KI 85mg，H3BO3 700mg，MnSO4 2250mg，ZnSO4·7H2O 25mg，Na2MoO40.28g，CuSO4·5H2O 2.5mg，CoCl2 2.5mg，加水溶解，定容至1000mL，得到微量元素母液；
铁盐母液的配制：分别称取硫酸亚铁27.3g加水溶解、称取乙二胺四乙酸二钠27.5g加水溶解，加水定容至1000mL，得铁盐母液；
有机物母液的配制：分别称取25g维生素B3、25g维生素B6、8g维生素B1和103g的甘氨酸加水溶解、称取15g蔗糖加水溶解，混合，定容至500mL，得到有机物母液；
初代培养基的配制：取肌醇0.15g、琼脂粉4.2g、蔗糖30g、6-BA0.2mL、稀释10倍的大量元素母液25mL、稀释100倍的微量元素母液8mL、铁盐母液8mL、稀释50倍的有机物母液7mL，加热至琼脂粉融化，混合，冷却后定容至1000mL，调节pH至5.8-6.0，分装至培养瓶，盖上瓶盖；
杀菌：将培养瓶置于123℃、压力0.22MPa灭菌，冷却得到固化的红心猕猴桃初代培养基。
实施例2：
一种红心猕猴桃继代培养基，其制备方法包括以下步骤：
大量元素母液的配制：分别称取CaCl2·2H2O 43g加水溶解，称取KNO3 190g、NH4NO3160g、MgSO4·7H2O 38g和KH2PO4 18g，加水溶解，混合定容至1000mL，得到大量元素母液；
微量元素母液：称取KI 85mg，H3BO3 700mg，MnSO4 2250mg，ZnSO4·7H2O 25mg，Na2MoO40.28g，CuSO4·5H2O 2.5mg，CoCl2 2.5mg，加水溶解，定容至1000mL，得到微量元素母液；
铁盐母液的配制：分别称取硫酸亚铁27.3g加水溶解、称取乙二胺四乙酸二钠27.5g加水溶解，加水定容至1000mL，得铁盐母液；
有机物母液的配制：分别称取25g维生素B3、25g维生素B6、8g维生素B1和103g的甘氨酸加水溶解、称取15g蔗糖加水溶解，混合，定容至500mL，得到有机物母液；
继代培养基的配制：取肌醇0.15g、琼脂粉4.2g、蔗糖30g、6-BA0.2mL、α-NAA0.15mL、稀释10倍的大量元素母液25mL、稀释100倍的微量元素母液8mL、铁盐母液8mL、稀释50倍的有机物母液7mL，加热至琼脂粉融化，冷却后定容至1000mL，分装至培养瓶，盖上瓶盖；
杀菌：将培养瓶置于123℃、压力0.22MPa灭菌，冷却得到固化的红心猕猴桃继代培养基。
实施例3
一种红心猕猴桃生根培养基，其制备方法包括以下步骤：
大量元素母液的配制：分别称取CaCl2·2H2O 43g加水溶解，称取KNO3 190g、NH4NO3160g、MgSO4·7H2O 38g和KH2PO4 18g，加水溶解，混合定容至1000mL，得到大量元素母液；
微量元素母液：称取KI 85mg，H3BO3 700mg，MnSO4 2250mg，ZnSO4·7H2O 25mg，Na2MoO40.35g，CuSO4·5H2O 2.5mg，CoCl2 2.5mg，加水溶解，定容至1000mL，得到微量元素母液；
铁盐母液的配制：分别称取硫酸亚铁27.3g加水溶解、称取乙二胺四乙酸二钠27.5g加水溶解，加水定容至1000mL，得铁盐母液；
有机物母液的配制：分别称取25g维生素B3、25g维生素B6、8g维生素B1和103g的甘氨酸加水溶解、称取15g蔗糖加水溶解，混合，定容至500mL，得到有机物母液；
生根培养基的配制：取肌醇0.15g、琼脂粉4.2g、蔗糖30g、α-NAA0.3mL、稀释10倍的大量元素母液25mL、稀释100倍的微量元素母液8mL、铁盐母液8mL、稀释50倍的有机物母液7mL，加热至琼脂粉融化，冷却后定容至1000mL，分装至培养瓶，盖上瓶盖；
杀菌：将培养瓶置于123℃、压力0.22MPa灭菌，得到红心猕猴桃生根培养基。
实施例4：
一种红心猕猴桃的培养方法，包括：
初代培养步骤：取新鲜、无虫害的红心猕猴桃新绿色叶、茎和成熟叶组织，洗净、晾干后，置于实施例1得到的初代培养基进行初代培养至长出愈伤组织；培养的温度为18℃，培养光照为2000lx，光照时长为12-14h/天；初代培养15天后，愈伤组织长势图如图1所示；
继代培养步骤：将初代培养得到愈伤组织转移至置于实施例2得到的继代培养基上进行继代培养，分化得到株芽；培养温度为15℃，培养光照为3000lx，光照时长为12-14h/天；向培养瓶内施加3％的CO2氛围；继代培养15天后，株芽长势图如图2所示；
生根培养步骤：将继代培养步骤后分化出株芽的组织转移至实施例3得到的生根培养基进行生根培养；培养温度为15-20℃，培养光照为1000-2000lx，光照时长为6-8h/天；生根培养15天后，生根长势图如图3所示。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红心猕猴桃组织培养方法，包括：
初代培养步骤：取新鲜、无虫害的红心猕猴桃新绿色叶、茎和成熟叶组织，洗净、晾干后，置于初代培养基进行初代培养至长出愈伤组织；
继代培养步骤：将初代培养得到愈伤组织转移至继代培养基上进行继代培养，分化得到株芽；
生根培养步骤：将继代培养步骤后分化出株芽的组织进行生根培养；
所述初代培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.3mL/L的6-BA和余量的水组成；
所述继代培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.2mL/L的α-NAA和余量的水组成；
所述生根培养基由母液组合物和0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.2-0.4mL/L的α-NAA和余量的水组成；
其中母液组合物包括按重量份计的以下组分：20-30份稀释10倍的大量元素母液、5-10份稀释100倍的微量元素母液、5-10份铁盐母液和5-10份稀释50倍的有机物母液。
2.如权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述大量元素母液包括以下浓度的以下组分：180-200g/L的KNO3、110-130g/L的CaCl2、150-170g/L的NH4NO3、196-228g/L的MgSO4、150-200g/L的KH2PO4；
所述微量元素母液，包括以下浓度的以下组分：80-90mg/L的KI、650-750mg/L的H3BO3、2.2-2.3g/L的MnSO4、382-405mg/L的ZnSO4、25-30mg/L的Na2MoO4、1.3-2.0mg/L的CuSO4和2-3mg/L的CoCl2；
所述铁盐母液包括按重量浓度计的以下组分：27.0-27.5g/L FeSO4和27-28g/L EDTA二钠；
所述有机物母液包括以下浓度的以下组分：30g/L的蔗糖、90-140mg/L的维生素B和200-210g/L的甘氨酸；所述维生素B包括维生素B1、维生素B3和维生素B6。
3.根据权利要求2所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述维生素B1、维生素B3和维生素B6的重量比为6:(5-7):(1-3)。
4.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，初代培养步骤中，培养的温度为15-20℃，培养光照为1500-2500lx，光照时长为12-14h/天。
5.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，继代培养步骤中，培养温度为12-16℃，培养光照为2500-3500lx，光照时长为12-14h/天。
6.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，继代培养步骤中，施加2-4％的二氧化碳氛围。
7.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，生根培养步骤中，培养温度为15-20℃，培养光照为1000-2000lx，光照时长为6-8h/天。
8.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述初代培养基由24-26mL/L的稀释10倍的大量元素母液、7-8mL/L的稀释100倍的微量元素母液、7-8mL/L的铁盐母液、7-8mL/L的稀释50倍的有机物母液、0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.3mL/L的6-BA和余量的水组成。
9.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述继代培养基由24-26mL/L的稀释10倍的大量元素母液、7-8mL/L的稀释100倍的微量元素母液、7-8mL/L的铁盐母液、7-8mL/L的稀释50倍的有机物母液、0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.1-0.2mL/L的α-NAA和余量的水组成。
10.根据权利要求1所述的红心猕猴桃组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基由24-26mL/L的稀释10倍的大量元素母液、7-8mL/L的稀释100倍的微量元素母液、7-8mL/L的铁盐母液、7-8mL/L的稀释50倍的有机物母液、0.1-0.2g/L的肌醇、3.5-4.8g/L的琼脂粉、20-40g/L的蔗糖、0.2-0.4mL/L的α-NAA和余量的水组成。
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CN110122335A (zh) * 2019-06-27 2019-08-16 西南林业大学 徐香猕猴桃组培苗耐盐突变体的诱导方法

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