CN107988248A

CN107988248A - 一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法

Info

Publication number: CN107988248A
Application number: CN201711124080.1A
Authority: CN
Inventors: 吕群丹; 钟永嘉; 徐金标; 程文亮; 方洁; 潘俊杰
Original assignee: LISHUI INSTITUTE OF AGRICULTURE SCIENCE; Zhejiang University ZJU
Current assignee: LISHUI INSTITUTE OF AGRICULTURE SCIENCE; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN107988248B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及融合His标签植物蛋白的原核表达、变性纯化及复性方法。本发明方法包括1)目的蛋白原核表达载体的构建；2)目的蛋白表达条件的优化；3)大肠杆菌总蛋白的提取；4)目的蛋白与Ni beads(镍珠)的结合；5)杂蛋白的去除；8)目的蛋白复性；7)目的蛋白洗脱。本发明方法适合于易形成包涵体或可溶性差的所有植物SPX蛋白，适用性广，操作便捷，耗时短，所得的蛋白纯度高，复性效果较好，能够成功实现对低可溶性植物SPX蛋白的快速、高效纯化。

Description

一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及融合His标签植物蛋白的原核表达、变性纯化及复性方法。

背景技术

SPX结构域根据Syg1，Pho81以及Xpr1三个蛋白命名而来，存在于多种真核生物蛋白的N端，近期研究表明含SPX结构域的蛋白家族的大部分成员在植物(或者酵母)体内磷信号和磷平衡过程中具有重要生理功能。在大多数植物中，根据是否含有额外结构域的区别，含SPX结构域的蛋白可以分成四个家族。第一个家族即SPX家族指只具有SPX结构域的蛋白；第二家族为SPX-MFS家族，该家族成员除了N端含有SPX结构域，C端同时含有MFS结构域；第三家族为SPX-EXS家族，其所有成员均含有N端的SPX结构域和C端的EXS结构域；第四家族为SPX-RING家族，该家族蛋白除了N端SPX结构域还具有C的RING结构域。本发明的OsSPX1属于第一家族SPX家族。拟南芥和水稻中分别有4个和6个属于第一家族的蛋白即SPX家族蛋白，命名为AtSPX1-4和OsSPX1-6。在这些SPX家族的蛋白成员中，大部分蛋白均得到了不同程度的研究，如拟南芥的AtSPX1和水稻的OsSPX1-5，上述蛋白均得到证实参与了磷信号通路。最近研究表明，SPX蛋白可通过与磷信号通路中心因子PHR2的互作抑制后者的转录功能来负调控磷信号通路。

随着植物分子生物学研究的不断深入和研究水平的不断提高，目前的基因分子功能研究已从DNA水平、转录组水平延伸到了蛋白水平，多种体外生化实验如pull-down、EMSA等已成为必不可少的基因功能验证手段。体外生化实验的开展主要依赖于目的蛋白是否可以在大肠杆菌中得到成功表达并完成后续的纯化。总体而言，SPX结构域在原核表达时，可溶性不高，纯化较为困难。相比较而言，拟南芥SPX蛋白可溶性高于水稻。目前，利用GST标签，已有一些拟南芥及水稻体内的SPX蛋白如AtSPX1，OsSPX1/2/4在大肠杆菌中已经得到表达和纯化。其中，水稻SPX4蛋白(OsSPX4)在为水稻SPX蛋白家族中最易纯化的成员，有研究者利用SUMO标签纯化得到了大量位于OsSPX4蛋白N端的SPX结构域，并成功解析出了该SPX结构域。相比于其它SPX同源蛋白，SPX1蛋白可溶性较差，较难纯化。为提高SPX1蛋白的可溶性，目前的方法一般借助于融合GST或SUMO等可溶性强的标签增加SPX1的可溶性，一定程度上提高了纯化效率。上述方法纯化得到的蛋白量和纯度基本可以满足Pull-down、EMSA等体外生化实验的需要。但上述SPX蛋白纯化方法中使用的均为大分子量的GST或SUMO标签，显著提高了SPX蛋白的错误折叠的风险，加大了体外蛋白实验的操作难度，同时也降低了体外生化实验的可信度。虽然GST或SUMO等大标签可以利用蛋白酶酶切去除，但进行下一步实验前还需借助层析等方法去除残留的蛋白酶，较为繁琐，并且在酶切过程中蛋白稳定性较低造成蛋白降解。同时目的蛋白在和蛋白酶长时间孵育过程中，会发生蛋白发生降解或某些特定氨基酸序列(如信号肽等)一并切除的情况，从而影响后续实验的开展。因此，为满足更多生化实验需求，如制备抗体等需要更大量的蛋白和更高的纯度，有必要对目前的植物SPX蛋白纯化方法进行改进，提高SPX蛋白的得率和生物活性。

相比于GST、SUMO等大分子标签，His标签只有6-8个氨基酸，分子量较小，对目的蛋白构象影响小，无需切除标签即可进行后续实验，非常适用于SPX蛋白的纯化。但是His-OsSPX蛋白可溶性极差，非变性纯化方法效率极低，且纯度较低。而使用传统的变性纯化方法在复性过程中需要通过透析逐渐降低尿素的浓度，时间久，蛋白易降解、析出，费时费力且纯化效果较差。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种简便、高效的利用His小标签进行SPX蛋白原核表达、变性纯化及复性的方法。本发明方法适合于易形成包涵体或可溶性差的所有植物SPX蛋白，适用性广，操作便捷，耗时短，所得的蛋白纯度高，复性效果较好，能够顺利进行后续生化实验。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法，该方法包括以下的步骤：

1)目的蛋白His-SPX融合蛋白原核表达载体的构建：

使用的原核表达载体构建方法为限制性酶切酶切目的基因片段和所用原核表达载体多克隆位点，用连接酶连接酶切产物；具体操作过程为：PCR扩增目的基因片段，并在PCR扩增过程中引入pET系列原核表达载体多克隆位点中有而目的基因序列中没有的限制性内切酶酶切位点，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，使用与PCR过程中导入位点一致的限制性内切酶酶切回收后的目的基因片段和原核表达载体质粒，凝胶回收试剂盒回收酶切产物，再用DNA Ligation Kit 16℃连接3h至过夜；连接产物使用热激法转化进入大肠杆菌BL21菌株感受态细胞中，并挑选阳性克隆；

2)目的蛋白原核表达条件的优化：

目的蛋白原核表达优化条件为：按1:50比例稀释新鲜的阳性克隆过饱和菌液于LB培养基中，摇床37℃、220rpm震荡培养至OD600至0.5-0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度100μM，摇床30℃、150rpm震荡培养8h；

3)大肠杆菌总蛋白的变性提取：

大肠杆菌总蛋白提取方法为：离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2-3遍，用漩涡搅拌器重悬菌体于抽提缓冲液Extraction Buffer中，1g湿重菌体/10ml抽提缓冲液，用超声仪于冰水混合浴低温条件破碎至菌液澄清，离心，吸取上清；沉淀部分再次重悬于5ml抽提缓冲液中，用超声仪于冰水混合浴低温条件破碎，离心，吸取上清，合并两次上清；

4)目的蛋白与Ni beads的结合：

His-SPX融合蛋白与Ni beads结合方法为：将步骤3)中得到的蛋白上清加至已预平衡的镍珠柱中，上下轻柔颠倒镍珠柱，使蛋白上清与镍珠充分混匀，置于360°旋转摇床中，4℃，最低速，旋转孵育1-2小时；

5)杂蛋白的去除：

杂蛋白去除方法为：取出孵育后的镍珠柱，将柱子竖直静置，待镍珠沉淀于柱子底部后打开柱子上下盖，让液体自由滴下，待液体流出约一半时，盖下盖，从柱子上方加入漂洗缓冲液，盖上盖，上下轻柔颠倒柱子至镍珠与溶液混匀，竖直静置柱子，待镍珠沉到柱子底部，打开上下盖，让液体自由滴尽，重复漂洗操作3次；

6)目的蛋白融合蛋白复性：

所用蛋白复性方法为：待漂洗缓冲液流尽后，往柱子里加入20ml蛋白复性缓冲液，上下轻柔颠倒柱子，直至镍珠与蛋白复性缓冲液充分混匀，置于360°旋转摇床，4℃，最低速，旋转孵育30min；孵育结束后，将柱子竖直静置5min，待镍珠沉降到柱子底部之后打开上下盖，流尽液体；

7)目的蛋白融合蛋白洗脱：

所用蛋白洗脱方法为：步骤6)流尽液体后，盖下盖，加入5ml平衡缓冲液，上下轻柔颠倒柱子，直至镍珠与蛋白复性缓冲液充分混匀，打开下盖，流尽液体；盖下盖，沿镍珠柱内壁加入2ml洗脱缓冲液，轻柔晃动柱子，使镍珠与洗脱缓冲液充分混合，静置2min，打开下盖，收集流出的液体，重复收集4-5次。

作为优选，所述蛋白为SPX家族蛋白包括拟南芥和水稻体内的SPX蛋白AtSPX1-4和OsSPX1-6及其它植物中可溶性低的SPX蛋白。

作为优选，所述步骤1)中所使用的原核表达载体为含His标签并能够使融合His标签后的SPX蛋白高水平表达的pET系列原核表达载体。

作为优选，所述的步骤3)、5)、6)和7)中所用缓冲液配方为：

抽提缓冲液：

50mM Na₂HPO₄，pH＝8.0

8M尿素

5％甘油

300mM NaCl

5mM咪唑；

漂洗缓冲液：

50mM Na₂HPO₄，pH＝8.0

300mM NaCl

0.1％Triton X-100

20mM咪唑

1mM DTT；

蛋白复性缓冲液：

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

150mM NaCl

0.1％Triton X-100

10mM DTT

5％甘油

1mM PMSF；

平衡缓冲液

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

10mM咪唑

5％甘油；

洗脱缓冲液

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

500mM咪唑

5％甘油。

本发明提供的利用His标签对植物SPX蛋白进行原核表达、变性纯化和复性的方法可以有效解决低可溶性或易形成包涵体的植物SPX蛋白纯化过程中得率不高、纯度低、耗时长、蛋白降解析出等问题。

本发明方法适用性广，操作便捷，耗时短，所得的蛋白纯度高，复性效果较好，能够顺利进行后续生化实验。

附图说明

图1为本专利方法(左)和非变性法(右)相同超声条件下使用不同抽提缓冲液的超声结果图。

图2为使用本方法(左)和非变性(右)的蛋白纯化SDS-PAGE检测结果图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1利用本专利方法和非变性法纯化水稻SPX1(OsSPX1)蛋白比较

1、OsSPX1蛋白(His-OsSPX融合蛋白)原核表达载体的构建(本专利方法和非变性方法相同)

PCR扩增OsSPX1序列，并在PCR过程中导入NdeI和BamHI。PCR产物经凝胶试剂盒(MN，德国)回收后与pET-15b载体质粒分别用NdeI和BamHI限制性内切酶(TAKARA，日本)酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒(MN，德使用DNA Ligation Kit 16℃(TAKARA，日本)连接3h。连接产物使用热激法转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞中，并挑选阳性克隆。

2、目的蛋白原核表达(本专利方法和非变性方法相同)

按1:50比例稀释新鲜的阳性克隆过饱和菌液于LB培养基中(6ml稀释于300ml LB培养基中)，摇床37℃、220rpm震荡培养至OD₆₀₀达0.5-0.6，加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导剂至终浓度100μM，置于摇床中30℃、150rpm震荡培养8h。

3、大肠杆菌总蛋白的提取

离心收集菌体，PBS缓冲液(上海生工，中国)洗涤2-3遍，本专利用漩涡搅拌器重悬菌体于抽提缓冲液(Extraction Buffer)中(1g湿重菌体/10ml抽提缓冲液)，非变性方法使用PBS作为抽提缓冲液，即用相同比例重悬于PBS溶液(上海生工，中国)中。超声条件相同：用超声仪(Scientz-II D，新芝，中国宁波)于低温条件(冰水混合浴)破碎至菌液澄清(100W，开10s/关10s，10min)，离心，吸取上清。沉淀部分再次重悬于5ml抽提缓冲液中，用超声仪(Scientz-II D，新芝，中国宁波)于低温条件(冰水混合浴)破碎(100W，开10s/关10s，10min)，离心，吸取上清，合并两次上清。本专利和非变性方法使用不同重悬液超声后的结果见图1，该图显示使用本专利方法超声后变为澄清的液体，而非变性方法仍为不透明乳白色液体。说明本方法使用的蛋白抽提缓冲液极显著增加了目的蛋白的可溶性。

抽提缓冲液(Extraction Buffer)具体配方为：

50mM Na₂HPO₄，pH＝8.0

8M尿素

5％甘油

300mM NaCl

5mM咪唑。

4、目的蛋白与Ni beads(镍珠)的结合(本专利方法和非变性方法相同)

将上一步骤中得到的蛋白上清加至已预平衡的镍珠柱(QIAGEN，德国)中，上下轻柔颠倒镍珠柱，使蛋白上清与镍珠充分混匀，置于360°旋转摇床中，4℃，最低速，旋转孵育1-2小时。由于非变性方法使用PBS作为抽提缓冲液，抽提液中目的蛋白含量较低，因此需要延长与镍珠的孵育时间至4-6小时。漂洗缓冲液(Wash Buffer)具体配方如下：

50mM Na₂HPO₄，pH＝8.0

300mM NaCl

0.1％Triton X-100

20mM咪唑

1mM DTT。

5、杂蛋白的去除(本专利方法和非变性方法相同)

取出孵育后的镍珠柱，将柱子竖直静置，待镍珠沉淀于柱子底部后打开柱子上下盖，让液体自由滴下，待液体流出约一半时，盖下盖，从柱子上方加入漂洗缓冲液(WashBuffer)，盖上盖，上下轻柔颠倒柱子至镍珠与溶液混匀，竖直静置柱子，待镍珠沉到柱子底部，打开上、下盖，让液体自由滴尽，重复漂洗操作3次。漂洗缓冲液(Wash Buffer)配方同步骤4。

6、目的蛋白融合蛋白复性(非变性法无需操作此步骤)

待漂洗缓冲液流尽后，往柱子里加入20ml蛋白复性缓冲液(Protein RefoldingBuffer)，上下轻柔颠倒柱子，直至镍珠与蛋白复性缓冲液充分混匀，置于360°旋转摇床，4℃，最低速，旋转孵育30min。孵育结束后，将柱子竖直静置5min，待镍珠沉降到柱子底部之后打开上、下盖，流尽液体。蛋白复性缓冲液(Protein Refolding Buffer)液具体配方为：

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

150mM NaCl

0.1％Triton X-100

10mM DTT

5％甘油

1mM PMSF。

7、目的蛋白融合蛋白洗脱(两种方法相同)

待步骤6流尽液体后，盖下盖，加入5ml平衡缓冲液(Balance Buffer)，上下轻柔颠倒柱子，直至镍珠与蛋白复性缓冲液充分混匀，打开下盖，流尽液体。盖下盖，沿镍珠柱内壁加入2ml洗脱缓冲液(Elution Buffer)，轻柔晃动柱子，使镍珠与洗脱缓冲液充分混合，静置2min，打开下盖，收集流出的液体，重复收集4-5次。平衡缓冲液(Balance Buffer)和洗脱缓冲液(Elution Buffer)具体配方为：

①平衡缓冲液(Balance Buffer)

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

10mM咪唑

5％甘油。

②洗脱缓冲液(Elution Buffer)

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

500mM咪唑

5％甘油。

8、纯化蛋白产物SDS-PAGE检测(本专利方法和非变性方法相同)

使用10％SDS-PAGE凝胶电泳方法检测两种方法的纯化产物，结果如图2。该图显示使用本专利方法纯化的目的蛋白含量和浓度均高于非变性方法。说明本方法使用的纯化方法显著提高了OsSPX1蛋白纯化的纯度和浓度。

使用本专利方法、非变性法和常规变性发纯化方法比较

	本专利方法	非变性法	常规变性
				耗时	2-4小时	4-8小时	8-10小时
蛋白得率	高	低	高
				实验操作	简易	简易	繁琐
蛋白稳定性	高	低	低

Claims

1.一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)目的蛋白His-SPX融合蛋白原核表达载体的构建：

2)目的蛋白原核表达条件的优化：

3)大肠杆菌总蛋白的变性提取：

4)目的蛋白与Ni beads的结合：

5)杂蛋白的去除：

6)目的蛋白融合蛋白复性：

7)目的蛋白融合蛋白洗脱：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白为SPX家族蛋白包括拟南芥和水稻体内的SPX蛋白AtSPX1-4和OsSPX1-6。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中所使用的原核表达载体为含His标签并能够使融合His标签后的SPX蛋白高水平表达的pET系列原核表达载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)、5)、6)和7)中所用缓冲液配方为：

抽提缓冲液：

50mM Na₂HPO₄，pH＝8.0

8M尿素

5％甘油

300mM NaCl

5mM咪唑；

漂洗缓冲液：

50mM Na₂HPO₄，pH＝8.0

300mM NaCl

0.1％Triton X-100

20mM咪唑

1mM DTT；

蛋白复性缓冲液：

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

150mM NaCl

0.1％Triton X-100

10mM DTT

5％甘油

1mM PMSF；

平衡缓冲液

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

10mM咪唑

5％甘油；

洗脱缓冲液

50mM Tris-HCl，pH＝8.0

500mM咪唑

5％甘油。