CN107976509B - 沙牛的薄层色谱鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种沙牛的薄层色谱鉴别方法，该方法先考察样品的适用性、测定沙牛总氮含量，再进行沙牛胆固醇和氨基酸的薄层色谱鉴别。本发明操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，规范了沙牛的鉴别方法。
Description
技术领域
本发明涉及中医药鉴别技术领域，具体是沙牛的薄层色谱鉴别方法。
背景技术
《中国药材标准名录》中沙牛的来源为蚁蛉科动物蚁狮MyrmeLeon formicarius L．、中华东蚁蛉EuroLon sinicus (Navas)．或黄足蚁蛉Hagenomyia micans (MacLaehLan)的幼虫干燥体。秋季捕捉，用沸水烫死，干燥即得。
蚁蛉科是脉翅目中种类最多、分布最广的一类药用昆虫，在全国各地均有分布。自古以来，民间常用沙牛治疗癫痫、疟疾、中耳炎、小儿高烧惊厥以及跌打损伤和毒蛇咬伤等症；近年来更发现用沙牛作主要成分，能有效治疗脉管炎和骨髓炎；在1983《中国药用动物志》中介绍其医疗作用为平肝熄风、解热镇痉、祛淤散结、拔毒消肿、通便泻下和截疟杀虫等。盛展能在1994《本草抗癌治验》记载其性辛、咸和凉，有毒，归脾和胃经，具败毒抗癌作用，用于胃癌和皮肤癌，有消肿解热之功效，也可治疠疮肿烂、无名肿毒、弹入伤肿和折伤跌肿。地牯牛有软坚化石利尿通淋有良好的溶石、化石、排石的作用，在粤北的仁化、乐昌和南雄等县、市的中医师以沙牛治疗秘尿系统结石有显著疗效。据不完全统计,近几年来治疗35例肾结石、27例膀胱结石、26例输尿管结石，有效率达100%，治愈率高达94.4%。沙牛有高效的“化石”功能， 对治疗结石疾病有极其显著的疗效。在广西民间及中成药也将沙牛用于通淋利湿，化石止痛，如五淋化石丸。沙牛具有较高的药用价值，也是五淋化石丸的主要成分，但是至今还未见有关于沙牛的鉴别方法报道。
发明内容
基于此，本发明公开了一种沙牛的薄层色谱鉴别方法，本发明操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，规范了沙牛的鉴别方法。
为实现上述技术目的，具体鉴别方法包括以下步骤：
（1）收集沙牛样品，同时确定沙牛的对照药材；
（2）考察样品的适用性，考察水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物四项指标，均根据《中国药典》2015年版四部通则里的检测方法进行检测，拟定样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的限值；
（3）含量测定：沙牛为动物药，富含氨基酸、蛋白质，参照《中国药典》2015年版四部通则0704氮测定法第二法测定沙牛总氮含量，拟定样品中总氮含量限值；
（4）沙牛胆固醇薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取沙牛对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取胆固醇对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液5～10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16∶2∶1∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
耐用性实验考察：采用点状点样对不同薄层板，不同展开温度：28℃、4℃，不同相对湿度：84%、32%进行考察；
（5）沙牛氨基酸薄层色谱鉴别：取鉴别（4）项下的供试品溶液作为本鉴别供试品溶液。另取沙牛对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取缬氨酸、精氨酸对照品，加50%甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1))为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰；
耐用性实验考察：采用点状点样对不同薄层板，不同展开温度：28℃、4℃，不同相对湿度：72%、32%进行考察。
本发明的有益效果是：
本发明采用薄层色谱鉴别方法，通过分别鉴别沙牛胆固醇和氨基酸的薄层色谱，控制沙牛的质量，本发明操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，规范了沙牛的鉴别方法。
本发明先考察样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物、测定沙牛总氮含量，拟定了样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物和总氮含量的限值，规范了鉴别标准，提高了鉴别的准确性。本发明还进行了耐用性实验考察，结果均表明本发明方法的耐用性良好，放宽了本发明方法的适用条件。
附图说明
图1为沙牛原动物；
图2为沙牛药材；
图3为沙牛粉末显微图；
图4为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度28℃、相对湿度84RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中 1表示SN-2（5μL），2表示SN-3（10μL），3表示SN-4（10μL），4表示胆固醇对照品（5μL），5表示沙牛对照药材（5μL），6表示甲醇（10μL）；
图5为采用烟台化学工业研究所生产的硅胶G薄层预制板（批号：20140616），在温度28℃、相对湿度84RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中 1表示SN-2（5μL），2表示SN-3（10μL），3表示SN-4（10μL），4表示胆固醇对照品（5μL），5表示沙牛对照药材（5μL）；
图6为采用MERCK生产的普通硅胶G薄层预制板（批号：HX67912426），在温度28℃、相对湿度84RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中 1表示SN-2（5μL），2表示SN-3（10μL），3表示SN-4（10μL），4表示胆固醇对照品（5μL），5表示沙牛对照药材（5μL）；
图7为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度4℃、相对湿度84RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中 1表示SN-2（5μL），2表示SN-3（10μL），3表示SN-4（10μL），4表示胆固醇对照品（5μL），5表示沙牛对照药材（5μL）；
图8为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度28℃、相对湿度32RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中 1表示SN-2（5μL），2表示SN-3（10μL），3表示SN-4（10μL），4表示胆固醇对照品（5μL），5表示沙牛对照药材（5μL）；
图9为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度28℃、相对湿度72RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-1（5μL），2表示SN-2（5μL），3表示SN-3（8μL），4表示SN-4（8μL），5表示SN-5（8μL），6表示SN-6（8μL），7表示胆固醇对照品（5μL），8表示SN-7（8μL），9表示SN-8（10μL），10表示SN-9（10μL），11表示SN-10（10μL），12表示SN-11（10μL），13表示沙牛对照药材（5μL）；
图10为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度28℃、相对湿度72RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-2（2μL），2表示缬氨酸对照品（2μL），3表示SN-3（2μL），4表示精氨酸对照品（2μL），5表示SN-4（2μL），6表示沙牛对照药材（2μL），7表示甲醇（2μL）；
图11为采用烟台化学工业研究所生产的硅胶G薄层预制板（批号：20140616），在温度28℃、相对湿度72RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-2（2μL），2表示缬氨酸对照品（2μL），3表示SN-3（2μL），4表示精氨酸对照品（2μL），5表示SN-4（2μL），6表示沙牛对照药材（2μL）；
图12为采用MERCK生产的普通硅胶G薄层预制板（批号：HX67912426），在温度28℃、相对湿度72RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-2（2μL），2表示缬氨酸对照品（2μL），3表示SN-3（2μL），4表示精氨酸对照品（2μL），5表示SN-4（2μL），6表示沙牛对照药材（2μL）；
图13为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度4℃、相对湿度72RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-2（2μL），2表示缬氨酸对照品（2μL），3表示SN-3（2μL），4表示精氨酸对照品（2μL），5表示SN-4（2μL），6表示沙牛对照药材（2μL）；
图14为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度28℃、相对湿度32RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-2（2μL），2表示缬氨酸对照品（2μL），3表示SN-3（2μL），4表示精氨酸对照品（2μL），5表示SN-4（2μL），6表示沙牛对照药材（2μL）；
图15为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在温度28℃、相对湿度72RH%、展距8.5 cm条件下点状点样的薄层色谱，图中1表示SN-1（2μL），2表示SN-2（2μL），3表示SN-3（2μL），4表示SN-4（2μL），5表示缬氨酸对照品（2μL），6表示SN-5（2μL），7表示SN-6（2μL），8表示SN-7（2μL），9表示SN-8（2μL），10表示精氨酸对照品（2μL）11表示SN-9（2μL），12表示SN-10（2μL），13表示SN-11（2μL），14表示沙牛对照药材（2μL）；
以上附图中标记的A、B、C、D、E表示点状点样后在薄层色谱中显示的清晰的斑点，用字母标记斑点以突出供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液所显示出来的斑点存在区别。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例，内容如下：
（1）收集沙牛样品共11批，详细信息见下表1及图1～3；
表1 沙牛样品信息一览表
沙牛样品SN-2，经中广州中医药大学昆虫学专家赵维波鉴定为昆虫纲蚁蛉科动物蚁蛉的幼虫干燥体，实验中以该样品作为沙牛的对照药材与其它样品进行对比研究。
（2）考察样品的适用性，考察水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物四项指标，分别根据《中国药典》2015年版四部通则里0832第二法、2302项下总灰分测定法、2302项下酸不溶性灰分测定法和2201项测定，测定结果见表2；
表2 沙牛水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物测定结果一览表
根据上表考察结果，考虑药材来源差异情况，拟定样品水分为不超过10.0％，总灰分为不超过38.0％，酸不溶性灰分为不超过30.0％，浸出物含量为不少于12.0%。
（3）含量测定：沙牛为动物药，富含氨基酸、蛋白质，参照《中国药典》2015年版四部通则0704氮测定法第二法测定沙牛总氮含量，11批沙牛总氮含量测定结果如表3；
表3 沙牛总氮含量测定结果一览表
由上表结果可知，沙牛11批样品总氮含量最高为85.3mg/g，最低为73.7mg/g，平均值为77.5mg/g，考虑药材来源差异情况，拟定限度为：样品每1g含总氮(N)不得少于60mg。
（4）沙牛胆固醇薄层色谱鉴别：
取样品粉末1g，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取沙牛对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取胆固醇对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液5～10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16∶2∶1∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图4。
耐用性实验考察：采用点状点样①对不同薄层板进行考察，见图4～6；②对不同展开温度：28℃、4℃进行考察，见图4、7；③对不同相对湿度：84%、32%进行考察，见图4、8；结果均表明本法的耐用性良好，11批沙牛薄层色谱图见图9。
（5）沙牛氨基酸薄层色谱鉴别：
取鉴别（4）项下的供试品溶液作为本鉴别供试品溶液，另取沙牛对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取缬氨酸、精氨酸对照品，加50%甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1))为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图10。
耐用性实验考察：采用点状点样①对不同薄层板进行考察，见图10～12；②对不同展开温度：28℃、4℃进行考察，见图10、13；③对不同相对湿度：72%、32%进行考察，见图10、14；结果均表明本法的耐用性良好，11批沙牛薄层色谱图见图15。
Claims (1)
1.沙牛的薄层色谱鉴别方法，其特征在于，所述方法包括沙牛胆固醇和氨基酸的薄层色谱鉴别，具体内容如下：
（1）收集沙牛样品，同时确定沙牛的对照药材；
（2）考察样品的适用性：考察水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物四项指标，均根据《中国药典》2015年版四部通则里的检测方法进行检测；
（3）含量测定：参照《中国药典》2015年版四部通则0704氮测定法第二法测定沙牛总氮含量；
（4）沙牛胆固醇薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取沙牛对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取胆固醇对照品，加甲醇制成每1mL含0 .5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液5～10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸16∶2∶1∶0.6为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
（5）沙牛氨基酸薄层色谱鉴别：取鉴别（4）项下的供试品溶液作为本鉴别供试品溶液；另取沙牛对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取缬氨酸、精氨酸对照品，加50%甲醇制成每1mL含0 .2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水4∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
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