CN107970239A - 索拉非尼在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用 - Google Patents

索拉非尼在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了索拉非尼在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。属于索拉非尼的药物新用途。以索拉非尼为活性成分的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物具有以下优点：1、索拉非尼属于被U.S.FDA批准的药物，因此，可利用这种药物已有的众多毒性和剂量数据，从而节约了大量的时间和财力。2、疗效明显，索拉非尼显著抑制L02细胞中的脂质堆积，且在索拉非尼的预处理浓度为2μmol时便能看到明显的变化；当索非拉明为6μmol时，可在小鼠原代肝细胞中检测到索非拉明对脂质积累的显著地抑制作用；另外，索拉非尼对HFHC饮食诱导产生的脂质沉积具有抑制作用。索拉非尼在医学领域具有广阔的应用前景。

Description

索拉非尼在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药 物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种已知临床药物索拉非尼在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。
背景技术
随着社会经济的发展，居民饮食方式的改变，非酒精性脂肪肝(non alcoholicfatty liver disease,NAFLD)已经成为了影响全球的最常见的肝脏疾病，发病的原因多为肥胖。在发达国家，成人和儿童的肥胖率逐年升高[1,2]，NAFLD已经成为西方国家最常见的慢性肝病。在发展中国家，NAFLD的发病率也逐年上升，在局部地区，发病率飙升至65％[3,4]。由于脂肪和肌肉构成的差异，亚洲人表现为基因易感人群[5]，如今，NAFLD在我国是仅次于病毒性肝炎的常见肝病。据估计，NAFLD会使5年直接和间接的医疗成本增加26％。如今，NAFLD已成为我国突出的新型公共健康问题，威胁着国人的健康和生活质量。虽然近年来抗氧化剂、胰岛素增敏剂和细胞保护剂等药物均应用在针对NAFLD的治疗上[6]，但控制和治疗的效果仍差强人意。
索拉非尼(sorafenib)是目前唯一一个被U.S.FDA批准用于肝癌晚期治疗的药物，具有多靶向性抗肿瘤作用。索拉非尼一方面通过抑制Raf-1、B-Raf活性，阻断细胞增殖的Ras/Raf/Mek/Erk信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；另一方面通过抑制血管生长因子受体、血小板衍生生长因子受体等阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。多个临床研究表明该药物可以一定程度上延长晚期肝癌病人的生存时间，且药物的副作用不强烈或者温和，安全性是可以接受的[7]。但是关于本发明该药物对NAFLD的治疗效果目前还未见报道。
参考文献：
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[6]Nguyen TA,Sanyal AJ:Pathophysiology guided treatment ofnonalcoholic steatohepatitis.Journal of gastroenterology and hepatology(2012)27 Suppl 2(58-64).
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发明内容
本发明的目的是提供索拉非尼的药物新用途。
本发明所提供的索拉非尼的药物新用途是其在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。
发明人的研究表明索拉非尼在调控肝细胞的脂质代谢中有着重要的作用，通过用索拉非尼处理人肝细胞系L02以、小鼠的原代肝细胞及C57BL/6小鼠NASH模型，发现索拉非尼能够显著地抑制肝脏细胞的脂质堆积。
以索拉非尼为活性成分制备的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物也属于本发明的保护范围。
所述脂肪肝及其相关疾病包括但不限于：单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明所提供的以索拉非尼为活性成分的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物具有以下优点：
1、索拉非尼属于被U.S.FDA批准的药物，因此，发现了旧药的新用途是一件十分值得庆幸的事，可利用这种药物已有的众多毒性和剂量数据，从而节约了大量的时间和财力。
2、疗效明显，索拉非尼显著抑制L02细胞中的脂质堆积，且在索拉非尼的预处理浓度为2μmol时便能看到明显的变化；当索非拉明为6μmol时，可在小鼠原代肝细胞中检测到索非拉明对脂质积累的显著地抑制作用；另外，索拉非尼对HFHC饮食诱导产生的脂质沉积具有抑制作用。
鉴于索拉非尼能够显著地抑制肝脏细胞的脂质堆积，在我国医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是不同浓度的索拉非尼预处理L02细胞再加入棕榈酸/油酸处理12h后的油红O染色结果图；
上方结果图为×100，下方结果图为×200。
图2是不同浓度的索拉非尼预处理小鼠原代肝细胞再加入PA/OA处理12h后的油红O染色结果图；
上方结果图为×100，下方结果图为放大×200。
图3是C57BL/6小鼠体重和肝重变化的统计图；
(**，P<0.01；*，0.01<P<0.05)。
图4是C57BL/6小鼠NASH模型中对照组和索拉非尼给药组肝脏的H&E染色图(×200)。
图5是C57BL/6小鼠NASH模型中对照组和索拉非尼给药组肝脏的油红O染色图(×200)。
图6是C57BL/6小鼠NASH模型中对照组和索拉非尼给药组肝脏的PSR染色图，(×200)。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
1.实验动物及饲养
实验动物：选用8-10周龄，体重在23.5-27.5g，雄性C57BL/6小鼠为实验对象。
饲养环境：SPF级实验动物中心，SPF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22～24℃之间，湿度在40～70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
2.实验细胞及培养
实验细胞：选用L02人肝细胞系和小鼠原代肝细胞为实验对象。人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)。
2.1L02人肝细胞系的培养
该细胞培养于DMEM高糖培养基(含10％FBS)中，于37℃，5％CO2环境中培养。
2.2小鼠原代肝细胞的分离与培养
2.2.1原代肝细胞的分离
采用IV型胶原酶消化分离小鼠原代肝细胞。小鼠乙醚吸入麻醉，留置针穿刺门静脉，肝脏原位灌流(SC-1和SC-2轮流灌注)至肝脏消化完全，取下肝脏，反复吹打并过滤，收集肝细胞悬液。
2.2.2原代肝细胞的培养
①培养皿包被(以六孔板为例)
i)配适量的1×鼠尾胶(现用现配)：用灭菌的超纯水将无水乙醇稀释为30％乙醇后，0.22μM滤器过滤，然后将100×的鼠尾胶稀释为1×。
ii)六孔板中每孔加入稀释后鼠尾胶200μl，旋转六孔板，使胶铺满整个板底。
iii)开盖，在超净台吹风过夜。
②铺板
i)铺细胞之前要将吹干的板子打开，紫外照射30min。
ii)细胞计数：台盼蓝染色计数
iii)分别铺两个六孔板细胞，调整细胞密度，进行细胞铺板。铺满为1×106个。一个六孔板用于做Western Blot分析，需要细胞密度为80％，另外一个六孔板用于做油红O染色实验，需要细胞密度为50％。
iv)铺板后2h换液。
v)细胞大约6～8h贴壁。
3.实验用抑制剂：索拉非尼，购于Selleck公司，货号：S7397。
4.病理学检测
4.1油红O染色具体步骤：
细胞油红O染色主要操作程序包括：取出细胞观察细胞状态和细胞密度→吸出培养基，加PBS漂洗3次，洗净后尽量吸干PBS→4％多聚甲醛固定细胞，37℃，15min→固定结束后，吸弃甲醛溶液。加入PBS漂洗3次，每次3分钟，使用平动的摇床→准备60％异丙醇，异丙醇：PBS＝3:2→加入60％异丙醇作用30s→用PBS洗3次→超净台内吹干水分，水分完全干透后，皿底呈白色→准备油红O的工作液，Red Oil：PBS＝3:2配置。油红配置好后室温静置10min，然后用0.45μM滤器过滤，即可使用→吹干后加工作液，染色过程中及时观察，达到要求后吸弃染色液→用PBS洗3次→加PBS浸润拍照观察。
小鼠肝脏组织油红O染色主要操作程序包括：
4.2小鼠肝脏石蜡标本切片染色
4.2.1制备石蜡标本切片
主要操作程序包括：修剪肝脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。
4.2.2苏木精-伊红(H&E)染色
主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。
4.2.3天狼星红(PSR)染色
主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
【实施例1】索拉非尼预处理对L02细胞中脂肪堆积的影响
将L02细胞分为4组，分别为DMSO BSA组、DMSO PA/OA组、索拉非尼2μM PA/OA组和索拉非尼6μM PA/OA组。待细胞贴壁后，分别加入DMSO、2μM索拉非尼和6μM索拉非尼处理3h，然后再用0.2/0.4mM PA/OA处理12h后，以BSA处理作为对照，进行油红O染色。染色结果如图1：与对照组(DMSO组)相比，抑制剂预处理组细胞内红色脂肪滴明显减少。该结果说明，索拉非尼显著抑制L02细胞中的脂质堆积，且在索拉非尼的预处理浓度为2μmol时便能看到明显的变化。
【实施例2】索拉非尼预处理对小鼠原代肝细胞中脂肪堆积的影响
将小鼠原代肝细胞分为4组，分别为DMSO BSA组、DMSO PA/OA组、索拉非尼2μM PA/OA组和索拉非尼6μM PA/OA组。待细胞贴壁后，分别加入DMSO、2μM索拉非尼、6μM索拉非尼处理3h，然后用0.2/0.4mM PA/OA处理12h后，以BSA处理作为对照，进行油红O染色。染色结果如图2：与DMSO组相比，抑制剂预处理组红色脂肪滴的量明显降低。该结果说明，经索拉非尼抑制剂预处理后L02细胞中的脂肪堆积受到显著抑制。当索非拉明为6μmol时，可在小鼠原代肝细胞中检测到索非拉明对脂质积累的显著地抑制作用。
【实施例3】索拉非尼对小鼠肝脏中脂质堆积的影响
C57雄性小鼠(共20只)高脂高胆固醇(HFHC)喂养15周(建立NASH模型)时分为两组(每组10只，分别为给药组和对照组)，分别灌胃sorafenib(30mg/kg)和vehicle(DMSO:Solutol:PEG400:水＝5:10:20:65(v:v:v:v))(给药频率：隔天一次)，同时继续HFHC喂养4周后取材。测定两组小鼠的肝重，并对小鼠肝脏进行油红O染色、H&E染色以及PSR染色。
两组小鼠体重、肝重的变化结果如图3所示，索非拉尼给药组小鼠的体重、肝重与对照组小鼠相比显著下降。通过图4-6所示的油红O染色、H&E染色、PSR染色结果，可以观察到对照组小鼠的肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态已几乎完全被破坏，而索拉非尼给药组中小鼠肝细胞的这种情况被显著改善。以上结果说明索拉非尼对HFHC饮食诱导产生的脂质沉积具有抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.索拉非尼在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物为抑制肝脏细胞的脂质堆积的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，脂肪肝及其相关疾病包括但不限于：单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
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