CN107957462A - 一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法，本发明所述方法中，通过采用液相色谱的方法进行检测，并通过色谱柱的分离作用，能够将复方酮康唑软膏制备过程中的有关物质、杂质、其他辅料、以及其他药用成分的干扰及逆行有效分离和排出，因而能够更加真实、准确的反应所测定复方酮康唑软膏中甲硝唑成分含量。

Description

一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体而言，涉及一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法。

背景技术

复方酮康唑软膏是一种常用兽用外用药，属于抗微生物药，适用于治疗由犬猫真菌、厌氧菌等所引起的细菌性皮肤病，其主要功能成分为甲硝唑、酮康唑、薄荷脑。其中，甲硝唑对大多数厌氧菌、滴虫有效，而对需氧菌或兼性厌氧菌无效，能够用于治疗厌氧菌引起的全身或局部感染。

目前，国家标准中对于复方酮康唑软膏的甲硝唑成分的含量检测，是采用紫外分光光度法来进行，此方法对于仪器设备的要求简单，检测时间快捷，有其独特的优点。然而，考虑到复方酮康唑软膏中除甲硝唑成分外，还包括酮康唑、薄荷脑及相关辅料，而紫外分光光度法只能检测上机溶液的综合吸光度，如果上机溶液中残留有除甲硝唑外的其他成分，那么若仍以所测得的吸光度为基础来计算甲硝唑单成分含量，明显也是无法得到准确结果的。

相较于紫外分光光度法而言，高效液相色谱法能将上机溶液通过色谱柱将各组分分离，然后再进入紫外检测器，因而专属性更强。然而，现有技术中，并没有以高效液相色谱的方法对复方酮康唑软膏中甲硝唑含量检测的相关研究。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法，本发明所述方法中，通过采用高效液相色谱的检测方法，能够更加真实、准确的反映测定复方酮康唑软膏中甲硝唑成分含量。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法，所述方法包括如下步骤：

供试品溶液制备:向复方酮康唑软膏中加入流动相，振摇、超声，放冷后摇匀，滤过，取续滤液膜滤，得到供试样品溶液；

对照品溶液制备:将甲硝唑对照品以流动相溶解，得到对照品溶液；

甲硝唑含量检测方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法进行甲硝唑含量检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算甲硝唑含量，即得；

其中，所述高效液相色谱法的色谱条件与系统适用性试验：色谱柱型号Kromasil100-5C18，4.6×150mm，5μm；

磷酸盐缓冲液与甲醇的混合溶液为流动相；

检测波长为310nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按甲硝唑峰计算不低于2000。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述流动相的制备方法如下：

取磷酸二氢钾溶液适量，以磷酸调节pH后，与甲醇混合，即得到磷酸盐缓冲液。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.025～0.035mol/L；更优选的，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.030～0.032mol/L。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为3.0～5.0；更优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.0～4.5。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述磷酸盐缓冲溶液与甲醇的体积比为(50～80)：(20～50)；

更优选的，所述磷酸盐缓冲溶液与甲醇的体积比为(60～70)：(30～40)。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量毫克数与流动相的体积毫升数之比为(30～70)：(200～300)。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述超声的时间为15～60min；更优选的，所述超声的时间为30～45min。

优选的，本发明所述的检测方法中，所述膜滤为以孔径为0.1～1μm的滤膜进行过滤；更优选的，所述膜滤为以孔径为0.45～0.65μm的滤膜进行过滤。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用液相的方法对复方酮康唑中的甲硝唑成分进行检测，能够有效排除酮康唑、薄荷脑及其他辅料成分的干扰；

相较于紫外分光光度法而言，本发明方法能够更加真实、准确的测定复方酮康唑中甲硝唑成分的含量，而这也有利于对药品质量进行控制；

同时，本发明方法符合方法学验证要求，且专属性强，精密度、重复性好，准确度高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于目前用于复方酮康唑中甲硝唑检测的紫外分光光度法存在着由于其他组分残留所导致的检测结果不准确等技术问题，本发明特提供了一种采用高效液相色谱对复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量进行检测的方法，以解决现有方法所存在的检测结果无法准确反映甲硝唑含量的问题。

具体的，本发明所提供的方法步骤可参考如下：

(a)供试样品溶液制备

向复方酮康唑软膏中加入流动相；

优选的，所用流动相为磷酸盐缓冲溶液和甲醇的混合溶液，二者的体积比为(50～80)：(20～50)，更优选的，二者的体积比为(60～70)：(30～40)，进一步优选的，磷酸盐缓冲溶液和甲醇的体积比为70:30。

其中，所述磷酸溶液由磷酸二氢钾溶液与磷酸混合制得，优选的，所述磷酸溶液是向适量磷酸二氢钾溶液中加入磷酸调配得到的pH为3.0～5.0的磷酸盐缓冲溶液；更优选的，所得磷酸盐缓冲溶液的pH为4.0～4.5；更进一步优选的，所得磷酸缓冲溶液的pH为4.0；

而作为磷酸盐缓冲溶液的原料，所用磷酸二氢钾溶液的浓度为0.025～0.035mol/L；优选的，磷酸二氢钾溶液的浓度为0.030～0.032mol/L；更优选的，磷酸二氢钾溶液的浓度为0.032mol/L；

同时，复方酮康唑软膏与流动相的比例也要进行控制，优选的，复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量毫克数与流动相的体积毫升数之比要控制在(30～70)：(200～300)；更优选的，复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量毫克数与流动相的体积毫升数之比要控制在(45～55)：200；进一步优选的，复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量毫克数与流动相的体积毫升数之比要控制在50：200左右；

可以根据待检测复方酮康唑软膏上所标识的甲硝唑含量，计算并称取适量称取所需复方酮康唑软膏的质量。

在加入流动相后，对所得体系进行振摇，超声，超声的时间控制在15～60min；优选的，超声的时间控制在30～45min。

超声后，将体系优选的在室温条件下放冷，滤过，然后以优选的滤膜对续滤液进行再次过滤；

其中，所用滤膜的孔径优选的为0.1～1μm，更优选的，所用滤膜的孔径为0.45～0.65μm；更进一步优选的，所用滤膜的孔径为0.45μm；

所得滤液即为供试样品溶液。

(b)对照品溶液制备：

将甲硝唑对照品以流动相溶解，得到对照品溶液，优选的，作为对照所用的甲硝唑为甲硝唑标准品，并以如上相同的流动相对其进行溶解；

优选的，对照品溶液中，甲硝唑的含量为0.25mg/ml。

(c)液相色谱检测：

将制备的供试样品和对照品在相同条件下进行液相色谱检测；

优选的，所用色谱柱为Kromasil 100-5C18(4.6×150mm，5μm)；同时，所用流动相与步骤(a)、(b)中相同；

同时，优选的，检测的进样量为5～15μL(优选的为10μL)，波长为310nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按甲硝唑峰计不低于2000；

分别得到供试样品和对照品的液相质谱检测图谱，然后，根据对照品浓度，以及供试样品和对照品峰面积的比值，计算得出供试样品中甲硝唑的浓度，再计算得出供试样品中甲硝唑的质量以及复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量。

采用本发明如上高效液相的方法对于复方酮康软膏中甲硝唑的含量进行检测，就能够避免由于无法对待测样品进行完全纯化所导致的测定不准确等问题，进而更加准确、有效的反映复方酮康唑的质量水平。

实施例1

色谱条件：色谱柱型号Kromasil 100-5C18(4.6*150mm，5μm)；以PH4.0磷酸盐缓冲液(取0.032mol/L磷酸二氢钾溶液适量，用磷酸调PH至4.0)—甲醇(70:30)为流动相；检测波长为310nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按甲硝唑峰计算不低于2000。

测定方法：取复方酮康唑软膏适量(约相当于甲硝唑50mg)，精密称定，置500ml具塞锥形瓶中，精密加入流动相200ml，振摇，超声30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；

另取甲硝唑对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液，同法测定。

按外标法以峰面积，计算得出样品复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量。实验例1

1、检测波长

称取甲硝唑对照品25mg至50ml量瓶中，加流动相(流动相组成与实施例1中相同)溶解并定容，摇匀。精密移取5ml至200ml的容量瓶中，用流动相定容，作为波长测试溶液。利用紫外分光光度法，在190nm～600nm范围内扫描，在波长310nm处甲硝唑有最大吸收，即作为检测波长。

2、流动相

对多种流动相进行筛选，分别对不同配比的水-甲醇、水-甲醇-乙腈及不同配比、浓度、PH的磷酸二氢钾溶液-甲醇进行优化选择，部分结果如下表1所示：

表1复方酮康唑软膏(甲硝唑成分)在不同流动相下的检测结果

由表1检测结果可知，以pH4.0磷酸盐缓冲液(取0.032mol/L磷酸二氢钾溶液适量，用磷酸调pH至4.0得到)—甲醇(70:30)为流动相，能保证最佳的分离度，保留时间较合适，且峰形对称漂亮。

3、滤膜吸附影响

量取甲硝唑对照品溶液适量，用0.45μm滤膜滤过，将过滤前后的溶液于310nm波长处测定吸光度，考察滤膜对主成分的吸附量，结果如下表2所示：

表2溶液过滤前后吸光度：

样品名称	吸光度(A值)
		甲硝唑对照品溶液	0.5232
经0.45μm滤膜过滤后的甲硝唑对照品溶液	0.5188

由如上表2结果可知，在采用310nm波长时，0.45μm滤膜对甲硝唑的吸附干扰为0.84％，小于2％，可忽略不计。

4、专属性试验

按样品配制方法，称取1倍/2倍的辅料，配制成1倍/2倍的辅料溶液，取0.45μm滤膜过滤后滤液及样品溶液10μl，按本发明建立的含量测定测定方法检测分析，结果显示，在流动相、辅料溶液(1倍)、辅料溶液(2倍)色谱图中，流动相和辅料溶液在甲硝唑保留时间无干扰。

5、样品溶液的稳定性

取供试品溶液，分别于0、2、4、6、10小时，采用相同色谱条件，进样10μl，根据测得的色谱峰面积，结果如下表3所示：

表3溶液稳定性试验结果：

由如上表3的测试实验结果可知，供试品组RSD为1.0％＜2.0％，由此可见对照品及供试品溶液在10h内稳定性良好。

6、线性关系

精密称取甲硝唑对照品25mg置于50ml量瓶中，加入流动相使之完全溶解后定容，摇匀，作为储备液。分别再量取该储备液1、2、3、5、6、7ml于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，得到20％、40％、60％、100％、120％、140％系列测定浓度溶液。按本发明建立的色谱条件，进样10μl，测定样品色谱峰面积，实验结果如下表4所示：

表4线性试验结果：

浓度(mg/ml)	0.05	0.10	0.15	0.25	0.30	0.35
							峰面积	281.9	605.3	915.9	1528.6	1837.5	2138.8

根据如上表4的结果数据，以峰面积和浓度为坐标，建立标准曲线，得到方程为：Y＝6177X-17.4(R²＝0.9999)。由此可见，甲硝唑浓度在0.05mg/ml～0.35mg/ml范围内与峰面积存在良好的线性关系。

7、精密度试验

将“线性关系”项下的测试浓度为100％的溶液(即含甲硝唑浓度为0.25mg/ml的溶液)，在相同色谱条件下，重复进样6次，每次10μl，分别测定峰面积，考察仪器精密度，并计算6组数据所得的相对标准偏差RSD，结果如下表5所示：

表5精密度试验结果：

由如上表5的测试结果可知，6组数据的相对标准偏差为0.28％＜2.0％。由此可见，本发明建立的含量测定方法精密度良好。

8、重复性试验

选择同批号复方酮康唑软膏6份，精密称定后，根据供试品项操作制备溶液，采用相同色谱条件，进样10μl，采集6份样品的色谱图，计算溶液的相对标准偏差RSD，结果如下表6所示：

表6重复性试验结果：

由如上表6的实验结果可知，组数据的相对标准偏差为1.24％＜2.0％，由此可见，本发明建立的含量测定方法重复性良好。

9、重现性试验

选择同批号复方酮康唑软膏6份，由另一个分析员在不同的工作日，在不同实验室、使用不同的液相色谱仪，不同的色谱柱，同“重复性试验”操作，测定甲硝唑成分含量，结果如下表7所示：

表7重现性试验结果：

由如上表7的实验结果可知，两次试验的RSD为0.70％＜2.0％，差值为0.09％，由此可见，本发明建立的含量测定方法重现性良好。

10、准确度试验

精密称定甲硝唑对照品约40mg、50mg、60mg，各3份，分别置于9个200ml量瓶中，分别精密称取复方酮康唑软膏处方比例的全辅料混合物适量，根据供试品项操作制备溶液，即得80％、100％、120％测试浓度样品溶液各3份，按本发明建立的含量测定方法测定甲硝唑成分含量，计算回收率，结果如下表8所示：

表8准确度试验结果：

由如上表8的实验结果可知，多组平行实验的平均回收率均在92～105％以上，RSD都在2％以内。由此可见，本发明建立的含量测定方法准确度良好。

11、耐用性试验

取同一批复方酮康唑软膏适量，分别考察流速变化±0.2ml/min、柱温变化±5℃、流动相中甲醇比例变化±5％、流动相中磷酸盐缓冲液的pH变化±0.5，不同色谱柱时仪器色谱行为的变化，观察基线分离情况，计算各条件下所得数据的平均值及RSD值，结果如下表9所示：

表9耐用性试验结果

由如上表9的实验结果可知，复方酮康唑软膏甲硝唑成分含量测定方法耐用性试验中，流速、柱温、色谱柱、流动相组成、PH的微小变动，甲硝唑峰和相邻峰均达到基线分离，各条件下所测甲硝唑成分含量的RSD值均＜2％。由此可见，本发明建立的含量测定方法耐用性良好。

12、检测限

取甲硝唑对照品溶液，用流动相溶解，并逐级稀释，调节对照品溶液浓度使甲硝唑的响应值约为噪音水平的3倍，得出甲硝唑的检测限为10μg/ml，而对照品中甲硝唑的浓度约为0.25mg/ml，因此本发明建立的含量测定方法检测限可以满足检测需要。

13、样品中甲硝唑成分含量测定

按本发明建立的含量测定方法分别测定三批复方酮康唑软膏中甲硝唑成分含量，结果如下表10所示：

表10不同批次复方酮康唑软膏中甲硝唑成分含量

片号	20161001	20161002	20161003
				1	99.49％	100.11％	99.12％
2	98.86％	99.43％	98.97％
				3	98.37％	100.04％	99.40％
平均值(％)	98.91	99.86	99.16
				RSD(％)	0.57	0.37	0.22

由如上表10的结果可知，三批样品的甲硝唑成分含量RSD均小于2％，批内差异小。

对比例1(紫外分光光度法)

按《兽药国家标准汇编——兽药地方标准上升国家标准》(第三册)“复方酮康唑软膏”质量标准规定的【含量测定】项下的甲硝唑测定法，对复方酮康唑软膏甲硝唑成分含量进行检测及方法学考察。

精密度及重现性结果如下表11-14所示：

表11紫外分光光度法对复方酮康唑软膏中甲硝唑含量检测精度结果

表12紫外分光光度法对复方酮康唑软膏中甲硝唑含量检测准确度结果

表13供试液稳定性试验结果：

表14三批样品中甲硝唑成分含量测定结果：

片号	20161001	20161002	20161003
				1	100.22％	101.34％	99.46％
2	99.53％	103.75％	100.26％
				3	101.69％	100.87％	101.94％
平均值(％)	100.48％	101.99％	100.55％
				RSD(％)	1.10％	1.51％	1.26％

由如上表11-14的检测结果可知，采用国标紫外分光光度的方法对复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测数据的RSD均小于2％，由此可见，国家标准的紫外分光光度法符合药品分析方法相关要求。

然而，相较而言，本发明所建立的高效液相色谱法在专属性、准确度、精密度、重现性、稳定性更好。

综上可见，本发明建立的用于检测复方酮康唑软膏中甲硝唑成分含量的高效液相色谱法所测含量结果低于国家标准中的紫外光度测定法，相较而言，高效液相法更接近药物标识含量。考虑是因为高效液相法通过色谱柱的分离作用，将复方酮康唑软膏制备过程中的有关物质、杂质、其他辅料、另一药用成分的干扰有效分离，而紫外分光光度法采用直接测定方式，故高效液相法测定结果相对更准确。虽然高效液相法及紫外分光光度法均符合方法学考察相关要求，但高效液相法所测结果更接近真实含量，更能够准确测定复方酮康唑软膏中甲硝唑成分含量。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种复方酮康唑软膏中甲硝唑含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

供试品溶液制备:向复方酮康唑软膏中加入流动相，振摇、超声，放冷后摇匀，滤过，取续滤液膜滤，得到供试样品溶液；

对照品溶液制备:将甲硝唑对照品以流动相溶解，得到对照品溶液；

甲硝唑含量检测方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法进行甲硝唑含量检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算甲硝唑含量，即得；

其中，所述高效液相色谱法的色谱条件与系统适用性试验：色谱柱型号Kromasil 100-5C18，4.6×150mm，5μm；

磷酸盐缓冲液与甲醇的混合溶液为流动相；

检测波长为310nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按甲硝唑峰计算不低于2000。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的制备方法如下：

取磷酸二氢钾溶液适量，以磷酸调节pH后，与甲醇混合，即得到磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.025～0.035mol/L；

优选的，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.030～0.032mol/L。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为3.0～5.0；

优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.0～4.5。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液与甲醇的体积比为(50～80)：(20～50)；

优选的，所述磷酸盐缓冲溶液与甲醇的体积比为(60～70)：(30～40)。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述复方酮康唑软膏中甲硝唑的含量毫克数与流动相的体积毫升数之比为(30～70)：(200～300)。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声的时间为15～60min；

优选的，所述超声的时间为30～45min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述膜滤为以孔径为0.1～1μm的滤膜进行过滤；

优选的，所述膜滤为以孔径为0.45～0.65μm的滤膜进行过滤。