CN107951879A - 聚醚类化合物在制备药物中的用途及筛选抗癌药物的方法 - Google Patents

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    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Abstract

本发明公开了聚醚类化合物在制备药物中的用途及筛选抗癌药物的方法。所述药物用于调控下列至少之一的信号通路：钙离子信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NF‑kappa B信号通路、Ras信号通路、mTOR信号通路、RNA降解信号通路、PPAR信号通路、cAMP信号通路、HIF‑1信号通路、Insulin信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、凋亡信号通路、细胞周期、cGMP‑PKG信号通路、DNA复制信号通路、MAPK信号通路、PI3K‑Akt信号通路以及自噬信号通路。本发明的聚醚类化合物能够通过调控多种信号通路，从而引起肿瘤细胞的死亡，起到较好的抗癌效果。

Description

聚醚类化合物在制备药物中的用途及筛选抗癌药物的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及聚醚类化合物在制备药物中的用途及筛选抗癌药物的方法。
背景技术
聚醚类抗生素是由链霉菌产生的一类重要的Ⅰ型聚酮类化合物，目前主要作为预防动物感染球虫病以及提高饲料利用率促进生长的兽药，例如：盐霉素、拉沙里菌素、尼日利亚霉素以及马杜拉霉素等。到现在已经有超过120种聚醚类化合物被发现报道，聚醚类化合物载体具有螯合金属阳离子(Na+、K+、Ca2+)的能力，形成脂溶性复合物，载体可以从细胞外扩散至细胞内，并返回到细胞外或留在细胞膜上作为金属离子运输载体来往于细胞内外，促进金属离子的跨膜转移。
然而，目前聚醚类抗生素在制备药物中的用途仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种聚醚类化合物在制备药物中的用途及筛选抗癌药物的方法。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人发现，聚醚类化合物具有特异性抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞增殖、分化的能力。进而，发明人通过深入研究发现，聚醚类化合物能够通过调控多种信号通路，从而引起肿瘤细胞的死亡，起到较好的抗癌效果。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了聚醚类化合物在制备药物中的用途。所述药物用于调控下列至少之一的信号通路：钙离子信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NF-kappa B信号通路、Ras信号通路、mTOR信号通路、RNA降解信号通路、PPAR信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、Insulin信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、凋亡信号通路、细胞周期信号通路、cGMP-PKG信号通路、DNA复制信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路以及自噬信号通路，所述聚醚类化合物具有下列之一的结构：
以及
发明人经过大量实验，聚醚类化合物能够调控蛋白的表达水平及蛋白磷酸化水平，从而调控上述多种信号通路，以抑制肿瘤细胞或肿瘤干细胞的增殖、分化，促发其凋亡，起到较好的抗癌效果。
根据本发明的实施例，上述聚醚类化合物在制备药物中的用途还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述药物通过下列至少之一的形式调控所述Wnt信号通路：抑制c-Myc蛋白表达；抑制cyclin D1蛋白表达；抑制Wnt5a蛋白表达；抑制Survivin蛋白表达；抑制Wnt3a蛋白表达；以及抑制CD44蛋白表达。发明人发现，聚醚类化合物通过下调上述蛋白表达，抑制了Wnt信号通路，从而抑制肿瘤细胞或肿瘤干细胞的增殖、分化，促发其凋亡，起到较好的抗癌效果。
根据本发明的实施例，所述药物通过下列至少之一的形式调控所述Hippo信号通路：促进MST1蛋白表达；促进MOB1蛋白表达；抑制YAP蛋白表达；以及抑制TAZ蛋白表达。发明人发现，聚醚类化合物通过下调YAP蛋白和/或TAZ蛋白表达、上调MST1蛋白和/或MOB1蛋白表达，抑制Hippo信号通路，从而抑制肿瘤细胞或肿瘤干细胞的增殖、分化，促发其凋亡，起到较好的抗癌效果。
根据本发明的实施例，所述药物通过促进LC3A/B蛋白表达，调控所述自噬信号通路。发明人发现，聚醚类化合物通过上调LC3A/B蛋白量，激活自噬信号通路(autophagy)，从而抑制肿瘤细胞或肿瘤干细胞的增殖、分化，促发其凋亡，起到较好的抗癌效果。
根据本发明的实施例，所述药物通过促进Caspase-3蛋白表达，调控所述凋亡信号通路。发明人发现，聚醚类化合物通过上调Caspase-3蛋白量，激活凋亡信号通路(apoptosis)，从而抑制肿瘤细胞或肿瘤干细胞的增殖、分化，促发其凋亡，起到较好的抗癌效果。
根据本发明的实施例，所述药物通过下列至少之一的形式调控蛋白质的磷酸化水平：抑制LRP6蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser1490；抑制β-catenin蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser552；促进MOB1蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr35；抑制AJUBA基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser230或Ser126或Ser119；抑制APBB1IP基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser525；抑制RB1基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr373；促进CSF1基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser533；促进ITGA3基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser1042；促进EPHA2基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser897；促进JUN基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser63；促进MCM6基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser762；促进MET基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr992；促进BAD基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser99；促进AKT1S1基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser212；促进FASN基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr2204。
发明人发现，聚醚类化合物能够抑制LRP6蛋白、β-catenin蛋白、AJUBA基因编码的蛋白、APBB1IP基因编码的蛋白及RB1基因编码的蛋白，能够促进MOB1蛋白、CSF1基因编码的蛋白、ITGA3基因编码的蛋白、EPHA2基因编码的蛋白、JUN基因编码的蛋白、MCM6基因编码的蛋白、MET基因编码的蛋白、BAD基因编码的蛋白、AKT1S1基因编码的蛋白以及FASN基因编码的蛋白，从而抑制肿瘤细胞或肿瘤干细胞的增殖、分化，促发其凋亡，起到较好的抗癌效果。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种筛选抗癌药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将候选药剂与癌细胞进行接触，并检测接触前后信号通路是否被调控，
所述信号通路包括下列的至少之一：
钙离子信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NF-kappa B信号通路、Ras信号通路、mTOR信号通路、RNA降解信号通路、PPAR信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、Insulin信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、凋亡信号通路、细胞周期信号通路、cGMP-PKG信号通路、DNA复制信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路以及自噬信号通路；
(2)在所述接触后，所述信号通路被调控是所述候选药剂作为所述抗癌药物的指示。
发明人发现，上述信号通路与癌细胞的增殖、分化密切相同，若癌细胞的上述信号通路被调控，能够抑制其增殖、分化，促发其凋亡。进而，若候选药剂与癌细胞接触后，能够使得上述信号通路被调控，从而能够确定该药剂具有抗癌的功效。
根据本发明的实施例，在步骤(1)中，检测接触前后下列至少之一蛋白的表达量：c-Myc蛋白、cyclin D1蛋白、Wnt5a蛋白、Survivin蛋白、Wnt3a蛋白、CD44蛋白、YAP蛋白、TAZ蛋白、MST1蛋白、MOB1蛋白、LC3A/B蛋白和Caspase-3蛋白；在步骤(2)中，在接触后，所述c-Myc蛋白、cyclin D1蛋白、Wnt5a蛋白、Survivin蛋白、Wnt3a蛋白、CD44蛋白、YAP蛋白以及TAZ蛋白至少之一的表达量降低，或者MST1蛋白、MOB1蛋白、LC3A/B蛋白和Caspase-3蛋白至少之一的表达量提高是所述候选药剂作为所述抗癌药物的指示。
发明人发现，c-Myc蛋白、cyclin D1蛋白、Wnt5a蛋白、Survivin蛋白、Wnt3a蛋白、CD44蛋白、YAP蛋白以及TAZ蛋白至少之一的表达量降低，或者MST1蛋白、MOB1蛋白、LC3A/B蛋白和Caspase-3蛋白至少之一的表达量提高，能够显著抑制癌细胞的增殖、分化，促发其凋亡。进而，若候选药剂具有上述作用效果，能够确定该药剂具有抗癌的功效。
根据本发明的实施例，在步骤(1)中，检测接触前后磷酸化的LRP6蛋白、磷酸化的β-catenin蛋白、磷酸化的AJUBA基因编码的蛋白、磷酸化的APBB1IP基因编码的蛋白、磷酸化的RB1基因编码的蛋白、磷酸化的MOB1蛋白、磷酸化的CSF1基因编码的蛋白、磷酸化的ITGA3基因编码的蛋白、磷酸化的EPHA2基因编码的蛋白、磷酸化的JUN基因编码的蛋白、磷酸化的MCM6基因编码的蛋白、磷酸化的MET基因编码的蛋白、磷酸化的BAD基因编码的蛋白、磷酸化的AKT1S1基因编码的蛋白以及磷酸化的FASN基因编码的蛋白至少之一的数量；
在步骤(2)中，在接触后，所述磷酸化的LRP6蛋白、磷酸化的β-catenin蛋白、磷酸化的AJUBA基因编码的蛋白、磷酸化的APBB1IP基因编码的蛋白、磷酸化的RB1基因编码的蛋白至少之一的数量降低，或者磷酸化的MOB1蛋白、磷酸化的CSF1基因编码的蛋白、磷酸化的ITGA3基因编码的蛋白、磷酸化的EPHA2基因编码的蛋白、磷酸化的JUN基因编码的蛋白、磷酸化的MCM6基因编码的蛋白、磷酸化的MET基因编码的蛋白、磷酸化的BAD基因编码的蛋白、磷酸化的AKT1S1基因编码的蛋白以及磷酸化的FASN基因编码的蛋白至少之一的数量增多是所述候选药剂作为所述抗癌药物的指示。
发明人发现，磷酸化的LRP6蛋白、磷酸化的β-catenin蛋白、磷酸化的AJUBA基因编码的蛋白、磷酸化的APBB1IP基因编码的蛋白及磷酸化的RB1基因编码的蛋白至少之一的数量降低，或者磷酸化的MOB1蛋白、磷酸化的CSF1基因编码的蛋白、磷酸化的ITGA3基因编码的蛋白、磷酸化的EPHA2基因编码的蛋白、磷酸化的JUN基因编码的蛋白、磷酸化的MCM6基因编码的蛋白、磷酸化的MET基因编码的蛋白、磷酸化的BAD基因编码的蛋白、磷酸化的AKT1S1基因编码的蛋白以及磷酸化的FASN基因编码的蛋白的数量增多，能够显著抑制癌细胞的增殖、分化，促发其凋亡。进而，若候选药剂具有上述作用效果，能够确定该药剂具有抗癌的功效。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的J1001-2化合物的色谱图；
图2显示了根据本发明一个实施例的J1001-3化合物的色谱图；
图3显示了根据本发明一个实施例的J1001-4化合物的色谱图；
图4显示了根据本发明一个实施例的J1-001化合物的色谱图；
图5显示了根据本发明一个实施例的蛋白质组学分析图；
图6显示了根据本发明一个实施例的标准曲线；
图7显示了根据本发明一个实施例的J1001-2钠盐的western blotting实验分析图；以及
图8显示了根据本发明一个实施例的J1-001钠盐的western blotting实验分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1聚醚类化合物的制备方法
将一株Streptomyces nanchangensis亚型，两株Streptomyces hygroscopicus亚型和一株Streptomyces endus亚型链霉菌分别接种于SFM平板，培养三天到四天左右。待SFM培养基中形成菌落时，挑单菌落至种子培养基中培养三天到四天左右，按照1％的量接菌至发酵培养基(发酵培养基的成份为可溶性淀粉30g/L，黄豆饼粉10g/L，酵母抽提物2.5g/L，CaCO3 3g/L，pH 7.2)中。培养条件：30度，220转速，培养7到8天时间。
待培养到第7或8天时，收取发酵液，高速离心使上清与菌丝体分离，菌丝体加入等量的丙酮破菌，超声20min，旋蒸丙酮，上清与菌丝体采用等量的乙酸乙酯萃取，重复一次。旋蒸浓缩至干，后用硅胶柱粗分离，得到粗品用HPLC检测产物，鉴于HPLC结果显示该三株菌的产量比较高。对浓缩完的样品进行了TLC点板，并在碘缸里显色，将很明显的点抠下，用甲醇溶解，高速离心取上清做质谱确定目标点的位置，分别得到了四种化合物，结构式分别如下：
(简称J1001-2)、
(简称J1001-3)、
(简称J1001-4)、
(简称J1-001)，
对应的图谱如图1～4所示。
下面以具有下列结构的J1001-2钠盐和J1-001钠盐作为研究对象：
J1001-2钠盐
J1-001钠盐
实施例2利用蛋白组学和磷酸蛋白组学对J1001-2钠盐的研究
(1)细胞培养
MDA-MB-231细胞(三阴乳腺癌细胞)用含10％胎牛血清、80μg/m L链霉素、80U/m L青霉素的DEME培养基于37℃、5％的CO2的培养箱常规培养。待细胞长满90％左右时，加入药物J1001-2钠盐。在蛋白组实验中，设置3个给药组(给药浓度为2μM)，分别为24h、48h、72h以及空白组(不加药)。在磷酸化蛋白组实验中，设置2个给药组(给药浓度为3μM)分别为6h、12h以及空白组(不加药)。
(2)蛋白组学的实验方法
1)蛋白组样品制备
收集空白组及给药组细胞，转移至1.5mL离心管中，2500rpm 4℃离心5min，弃上清，细胞沉淀加入10倍体积的细胞裂解液(8M尿素，100mM Tris，PH值为8)重悬并用超声以便提取蛋白，后12000rpm离心15min中，3倍体积的4℃预冷50％甲醇/丙酮50％/0.1％乙酸洗3次。重悬于4M的缓冲液中(CaCl2、8M尿素、0.2M Tris-HCl，pH值8)并吹打均匀后，2500rpm 4℃离心，上清液转移到一个新的EP管，加入10mM的DTT在50℃下孵育30min，用40mM的IAA试剂烷基化30min，在胰蛋白酶消化37℃过夜裂解蛋白，SepPak C18柱子脱盐并真空干燥。将来自不同组分的肽段混合用iTRAQ试剂标记通过强阳离子交换柱分离得到10个馏分，在通过脱盐柱(C18ZipTip)脱盐后进入MS分析。
2)蛋白质组质谱检测与数据库检索
质谱检测的仪器为TripleTOF 5600(AB SCIEX)。脱盐后的肽段溶解在含有0.1％的甲酸水溶液和乙腈(2％：98％)里，后加载到C18trap柱(5μm,5x 0.3mm,AgilentTechnologies,Inc.)以5μL/min流速，后在经过C18分析柱(75μm×150mm,3μm particlesize,pore size,Eksigent)以300nL/min流速分离100min。流动相分别是：A相为3％的DMSO和0.1％甲酸水溶液；B相为3％的DMSO和0.1％甲酸的乙腈溶液。用IDA模式检测MS/MS，搜索扫描要求在250ms完成，以及每100ms扫描要求收集到20个产物的离子。离子范围设置在350-1500。产物的离子设置范围设置在100-1500。
质谱检测到的原始数据使用ProteinPilot软件分析，使用Uniprot Homo sapiensreference database(version:2015.8)数据库进行生物信息学分析。设置参数为：样品模式：iTRAQ 4plex(Peptide Labeled)；丝氨酸烷基化：Iodoacetamide；消化：胰蛋白酶；搜索模式：快速。
3)生物信息学数据分析
发生调节的蛋白使用KEGG通路数据库(http://www.genome.jp/kegg/)挖掘评估信号通路(采用KEGG自动注释服务功能KAAS)，对于KAAS功能要求上传已发生调节的蛋白。
(3)磷酸蛋白组学的实验方法
1)磷酸化蛋白的提取和消化
收集空白组及给药组细胞，转移至1.5mL离心管中，2500rpm 4℃离心5min，弃上清，细胞沉淀加入10倍体积的细胞裂解液(8M尿素，100mM Tris，PH值为8)重悬，并用超声以便提取蛋白，12000rpm离心15min，取上清加入10mM的DTT在37℃，待冷却到室温，用40Mm的碘乙酰胺避光烷基化30min，用4倍体积的100mM Tris/HCl(PH＝8)冲洗后，加入胰蛋白酶消化蛋白(按照比例1:50)并在37℃过夜消化震荡，消化过后经过Sep-Pak C18柱子(Waters)脱盐，先用含1％的乙酸溶液清洗两次，后用80％的乙腈以及0.1％的乙酸溶液洗脱，过后真空干燥。
2)磷酸化蛋白肽段的双甲基标记
消化后的肽段用0.1M的醋酸钠溶液溶解(PH最好低于6)，每500μg肽段加入0.25mL醋酸钠溶液，加入4％的CH2O或CD2O或13CD2O(每500μg肽段加入40μL)混合，再加入0.6MNaBH3(CN)或者NaBD3(CN)(每500μg肽段加入40μL)，震荡混合0.5h，加入1％的NH4OH(每500μg肽段加入160μL)混合5min，加入5％的甲酸溶液(每500μg肽段加入160μL)混合后，在4℃下放置1h以上后，进行脱盐处理(Sep-Pak C18柱，Waters)。
3)磷酸化蛋白组肽段分离
混合后的肽段经过C18-ST柱((2.0mm×150mm,5μm particle size)初步分离在安捷伦HPLC 1260仪器上，流动相：A相为20mM的甲酸铵水溶液(用25％的NH3·H2O调节pH至10)；B相为含有20mM甲酸铵80％的乙腈溶液(用25％的NH3·H2O调节pH至10)。洗脱程序为在0min～20min由B相的5％增加到25％，20min～35min由B相的25％增加到45％，35min～36min由B相的45％增加到90％，36min～40min维持B相90％，40min～41min由B相90％降低到5％，维持B相5％15min，流动相流速为0.2mL/min。UV吸收波长设置为216nm。分10个馏分收集，馏分用StageTip C18柱子脱盐后真空干燥。
4)磷酸化蛋白组磷酸化肽段富集
磷酸化肽段富集根据实验的标准流程执行(多维色谱技术深度分析)。干燥过后的肽段用50μL的1％乙酸溶液溶解后，上样到含有10μL IMAC树脂的凝胶柱上，用50μL的洗涤缓冲液(25％乙腈，100mM NaCl和0.1％的乙酸溶液中)后，用50μL的去离子水冲洗凝胶柱，最后用120μL的6％NH3·H2O洗脱，洗脱液真空干燥。
5)磷酸化蛋白组质谱检测
样品检测使用RPLC-ESI-MS/MS方法检测，LC-MS/MS检测是采用混合的四级杆结合飞行时间质谱(Triple TOF 5600+，AB SCIEX)仪器。首先，肽段进过C18trap柱子(5μm,5x0.3mm,Agilent Technologies)，后再经过一个分析型柱子C18(75μm×150mm,3μmparticle size,pore size,Eksigent)。流动相：A相为含有3％DMSO和0.1％的甲酸铵水溶液；B相由3％DMSO，97％乙腈和0.1％的甲酸组成。洗脱程序为在0min～65min由B相的5％增加到23％，65min～85min由B相的23％增加到52％，85min～86min由B相的52％增加到80％，86.0min～86.1min将B相从80％降为5％，86.1min～100min维持B相5％，流动相流速为300nL/min。MS的扫描范围设置为350～1500,250ms扫描一次，对于MS/MS分析，每次扫描由一次全扫(从350～1500，电荷范围2-5)和40个MS/MS事件组成，阈值计数值设置为120以激活MS/MS的积累，前目标离子释放时间设置为18s。
6)数据分析
来至TripleTOF5600+的原始数据用ProteinPilot 5.0软件分析。数据搜索使用UniProt的人类蛋白组数据库，设置参数有以下几个：样品类型：双甲基定量((0,+4,+8)；丝氨酸烷基化：碘乙酰胺；消化：胰蛋白酶；特殊因子：强调磷酸化。搜索方式：快速。
(4)结果分析
结果如图5所示，其中(A)为J1001-2钠盐作用的蛋白质；(B)为J1001-2钠盐调控的代谢通路；(C)为J1001-2钠盐作用的磷酸化蛋白含量变化。可以看出，J1001-2钠盐作用于癌细胞，能够调控蛋白量表达，使得蛋白质磷酸化水平发生明显变化，包括AJUBA、APBB1IP以及RB1基因编码的蛋白发生下调；CSF1、EPHA2、ITGA3、JUN、MCM6、MET、BAD、AKT1S1以及FASN因编码的蛋白发生上调，从而调控多种代谢通路，使得癌细胞增殖分化受到抑制，导致凋亡。
实施例3聚醚类化合物的抑制肿瘤的靶点研究
1、实验方法—western blotting实验
蛋白胶浓度：8％预制胶、10％预制胶、12％预制胶、4-20％预制胶(来自金斯瑞)
设置如下图给药组，给药后16h收集细胞，用0.125％的胰酶消化，PBS清洗2次，离心，每10cm的皿细胞量加入400L的RIPA(其中往RIPA加入蛋白酶抑制剂以及磷酸化蛋白酶抑制剂)在冰上裂解细胞1～2个小时，4度高速离心(12000rmp×10min)。吸取上清即为蛋白。
蛋白上样量：(统一上样量25ng)(MDA-MB-231细胞)
BCA测定蛋白浓度标准曲线如图6所示。
通过标准曲线计算浓度(单位μg/mL)如下：
Control-1 Control-2 0.5M-1 0.5M-2-1 1M-1 1M-2-1
5097.5 4447.5 4822.5 4522.5 4872.5 3697.5
2M-1 2M-2-1 4M-1 4M-2-1 8M-1 8M-2-1
3797.5 4147.5 2697.5 2772.5 2722.5 3372.5
以统一上样量25ng为准计算得到的体积(单位mL)如下：
Control-1 Control-2 0.5M-1 0.5M-2-1 1M-1 1M-2-1
0.004904365 0.005621135 0.005184 0.005528 0.005131 0.006761
2M-1 2M-2-1 4M-1 4M-2-1 8M-1 8M-2-1
0.006583 0.006028 0.009268 0.009017 0.009183 0.007413
上样后过5min使之沉淀底部，浓缩胶条件恒压80V，20min。
分离胶条件：恒压120V，60-80min。
半干法转膜条件：恒压17V，20min。
封闭：5％脱脂奶粉(TBS配置)；室温1小时；0.1％PBST洗膜2次，每次5min。
孵育一抗：1：500(3％BSA的PBST配制)，4度过夜；0.1％PBST洗膜2次，每次5min。
孵育二抗：羊抗兔，荧光二抗(1：10000，5％奶粉PBST配制)；室温1小时，避光孵育；PBST洗膜3次，每次5min，最后超纯水洗膜1次，5min。
2、结果分析：
J1001-2钠盐作用结果如图7所示，通过western blotting实验看出，Wnt3a、Wnt5a和P-LPR6蛋白随着化合物浓度增加而降低，说明J1001-2钠盐抑制这三个蛋白表达，从而调控Wnt通路，导致下游的CD44、cyclin D1、c-Myc和Survivin等也发生相应的变化。因此在J1011-2钠盐的作用下有利于抑制肿瘤的发生。
J1001-2钠盐不仅作用Wnt通路，还可以作用Hippo通路、诱导细胞凋亡信号通路以及诱导细胞自噬。在Hippo通路中，关键蛋白YAP/TAZ蛋白出现明显下调，MST1以及MOB1以及P-MOB1蛋白出现上调；细胞凋亡信号的蛋白Caspase-3出现明显的上调；自噬信号通路中的关键蛋白LC3A/B出现明显的上调，这与蛋白质组学发现的YAP/TAZ蛋白下调、LC3A/B蛋白明显上调是一致的结果。此外，J1001-2钠盐抑制了LRP6蛋白的磷酸化，位点为Ser1490；抑制了β-catenin的蛋白磷酸化，位点为Ser552；促进了MOB1蛋白的磷酸化，位点为Thr35。最终，使得癌细胞增殖分化受到抑制，导致凋亡。进而，表明J1001-2钠盐具有较好的抗癌效果。
J1-001钠盐作用结果如图8所示，J1-001钠盐对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的自噬信号通路有影响，自噬信号通路中的关键蛋白LC3A/B随着时间延长而表达量增高；同时J1-001钠盐的给药浓度增加，LC3A/B的表达量也相应增加。表明该化合物可以作用自噬信号通路进而导致细胞死亡。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.聚醚类化合物在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于调控下列至少之一的信号通路：
钙离子信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NF-kappa B信号通路、Ras信号通路、mTOR信号通路、RNA降解信号通路、PPAR信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、Insulin信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、凋亡信号通路、细胞周期信号通路、cGMP-PKG信号通路、DNA复制信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路以及自噬信号通路，
所述聚醚类化合物具有下列之一的结构：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过下列至少之一的形式调控所述Wnt信号通路：
抑制c-Myc蛋白表达；
抑制cyclin D1蛋白表达；
抑制Wnt5a蛋白表达；
抑制Survivin蛋白表达；
抑制Wnt3a蛋白表达；以及
抑制CD44蛋白表达。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过下列至少之一的形式调控所述Hippo信号通路：
促进MST1蛋白表达；
促进MOB1蛋白表达；
抑制YAP蛋白表达；以及
抑制TAZ蛋白表达。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过促进LC3A/B蛋白表达，调控所述自噬信号通路。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过促进Caspase-3蛋白表达，调控所述凋亡信号通路。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过下列至少之一的形式调控蛋白质的磷酸化水平：
抑制LRP6蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser1490；
抑制β-catenin蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser552；
促进MOB1蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr35；
抑制AJUBA基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser230或Ser126或Ser119；
抑制APBB1IP基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser525；
抑制RB1基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr373；
促进CSF1基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser533；
促进ITGA3基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser1042；
促进EPHA2基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser897；
促进JUN基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser63；
促进MCM6基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser762；
促进MET基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr992；
促进BAD基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser99；
促进AKT1S1基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Ser212；
促进FASN基因编码的蛋白磷酸化，所述磷酸化的位点为Thr2204。
7.一种筛选抗癌药物的方法，其特征在于，包括：
(1)将候选药剂与癌细胞进行接触，并检测接触前后信号通路是否被调控，
所述信号通路包括下列的至少之一：
钙离子信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NF-kappa B信号通路、Ras信号通路、mTOR信号通路、RNA降解信号通路、PPAR信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、Insulin信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、凋亡信号通路、细胞周期信号通路、cGMP-PKG信号通路、DNA复制信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路以及自噬信号通路；
(2)在所述接触后，所述信号通路被调控是所述候选药剂作为所述抗癌药物的指示。
8.根据权利要求7所述的方法，在步骤(1)中，检测接触前后下列至少之一蛋白的表达量：
c-Myc蛋白、cyclin D1蛋白、Wnt5a蛋白、Survivin蛋白、Wnt3a蛋白、CD44蛋白、YAP蛋白、TAZ蛋白、MST1蛋白、MOB1蛋白、LC3A/B蛋白和Caspase-3蛋白；
在步骤(2)中，在接触后，所述c-Myc蛋白、cyclin D1蛋白、Wnt5a蛋白、Survivin蛋白、Wnt3a蛋白、CD44蛋白、YAP蛋白以及TAZ蛋白至少之一的表达量降低，或者MST1蛋白、MOB1蛋白、LC3A/B蛋白和Caspase-3蛋白至少之一的表达量提高是所述候选药剂作为所述抗癌药物的指示。
9.根据权利要求7所述的方法，在步骤(1)中，检测接触前后磷酸化的LRP6蛋白、磷酸化的β-catenin蛋白、磷酸化的AJUBA基因编码的蛋白、磷酸化的APBB1IP基因编码的蛋白、磷酸化的RB1基因编码的蛋白、磷酸化的MOB1蛋白、磷酸化的CSF1基因编码的蛋白、磷酸化的ITGA3基因编码的蛋白、磷酸化的EPHA2基因编码的蛋白、磷酸化的JUN基因编码的蛋白、磷酸化的MCM6基因编码的蛋白、磷酸化的MET基因编码的蛋白、磷酸化的BAD基因编码的蛋白、磷酸化的AKT1S1基因编码的蛋白以及磷酸化的FASN基因编码的蛋白至少之一的数量；
在步骤(2)中，在接触后，所述磷酸化的LRP6蛋白、磷酸化的β-catenin蛋白、磷酸化的AJUBA基因编码的蛋白、磷酸化的APBB1IP基因编码的蛋白、磷酸化的RB1基因编码的蛋白至少之一的数量降低，或者磷酸化的MOB1蛋白、磷酸化的CSF1基因编码的蛋白、磷酸化的ITGA3基因编码的蛋白、磷酸化的EPHA2基因编码的蛋白、磷酸化的JUN基因编码的蛋白、磷酸化的MCM6基因编码的蛋白、磷酸化的MET基因编码的蛋白、磷酸化的BAD基因编码的蛋白、磷酸化的AKT1S1基因编码的蛋白以及磷酸化的FASN基因编码的蛋白至少之一的数量增多是所述候选药剂作为所述抗癌药物的指示。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916834A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 武汉臻智生物科技有限公司 化合物的生物合成基因簇及其应用
CN108379251A (zh) * 2017-02-03 2018-08-10 武汉臻智生物科技有限公司 糖基聚醚类化合物作为抗癌药物的新机制研究发现
WO2019206203A1 (zh) * 2018-04-27 2019-10-31 厦门大学 调节Ras泛素化的方法
CN113456657A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 武汉大学 糖基聚醚化合物在制备抗rna病毒药物中的用途
CN113456591A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 武汉大学 糖基聚醚类化合物脂质体及其制备方法和药物
CN115043892A (zh) * 2022-06-10 2022-09-13 武汉合生科技有限公司 一类靶向肌动蛋白的糖基聚醚类化合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011213612A (ja) * 2010-03-31 2011-10-27 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 癌幹細胞及び／または癌前駆細胞の減少剤
CN104138369A (zh) * 2013-05-07 2014-11-12 武汉臻智生物科技有限公司 抗癌药物
CN106913564A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 武汉臻智生物科技有限公司 聚醚类化合物用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011213612A (ja) * 2010-03-31 2011-10-27 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 癌幹細胞及び／または癌前駆細胞の減少剤
CN104138369A (zh) * 2013-05-07 2014-11-12 武汉臻智生物科技有限公司 抗癌药物
CN106913564A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 武汉臻智生物科技有限公司 聚醚类化合物用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐威 主编: "《药学细胞生物学》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 *
贺大林 等主编: "《泌尿男生殖系统肿瘤学》", 30 August 1999, 陕西科学技术出版社 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916834A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 武汉臻智生物科技有限公司 化合物的生物合成基因簇及其应用
CN106916834B (zh) * 2015-12-24 2022-08-05 武汉合生科技有限公司 化合物的生物合成基因簇及其应用
CN108379251A (zh) * 2017-02-03 2018-08-10 武汉臻智生物科技有限公司 糖基聚醚类化合物作为抗癌药物的新机制研究发现
WO2019206203A1 (zh) * 2018-04-27 2019-10-31 厦门大学 调节Ras泛素化的方法
CN112055754A (zh) * 2018-04-27 2020-12-08 厦门大学 调节Ras泛素化的方法
JP2021518751A (ja) * 2018-04-27 2021-08-05 厦▲門▼大学 Ｒａｓのユビキチン化の調整方法
CN113456657A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 武汉大学 糖基聚醚化合物在制备抗rna病毒药物中的用途
CN113456591A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 武汉大学 糖基聚醚类化合物脂质体及其制备方法和药物
CN113456657B (zh) * 2020-03-31 2022-09-09 武汉大学 糖基聚醚化合物在制备抗rna病毒药物中的用途
CN115043892A (zh) * 2022-06-10 2022-09-13 武汉合生科技有限公司 一类靶向肌动蛋白的糖基聚醚类化合物
CN115043892B (zh) * 2022-06-10 2024-04-12 武汉合生科技有限公司 一类靶向肌动蛋白的糖基聚醚类化合物

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