CN108830041B - 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于公开一种α‑葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，以及该虚拟筛选方法及其筛选出的化合物在预防和/或治疗2型糖尿病的药物制剂中的应用。包括1.大分子蛋白三维结构的获取、分析和处理；2.中药天然产物库的构建及小分子化合物的准备；3.虚拟筛选模型预测能力的校准及筛选模型的建立；4.天然产物库的虚拟筛选与相互作用机制分析；5.筛选结果的体内外生物活性验证。该方法除用于筛选目的，还可用于该类型化合物的构效关系探讨，并指导进一步的基于活性化合物的结构修饰。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，以及该虚拟筛选方法筛选出的化合物作为活性成分的药物，该药物能够预防和/或治疗2型糖尿病。本发明特别涉及从中药或天然产物(以丹参为例)中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。
背景技术
糖尿病是一种严重威胁人类健康的代谢性疾病，以高血糖为其主要生理特征。1型糖尿病是由于胰岛素缺乏所导致，约占糖尿病人群的5～10％，而2型糖尿病主要是由胰岛素抵抗引起，是最常见的类型。糖尿病在所有年龄段人群中的世界患病率正呈逐年上升的趋势，据估计，其患病率由2000年的2.8％(17.1亿)上升到2030年的4.4％(33.6亿)。糖尿病常常伴随着多种严重的并发症，如尿毒症、中风、神经性疾病、肾衰竭和心血管疾病等[1]。近些年来，许多研究者关注并致力于研究开发各种有效途径用于临床糖尿病的预防和治疗，并取得了丰富的研究成果。陆续有多种治疗途径和药物被应用于不同类型糖尿病的临床防治。其中，当前对于2型糖尿病重要的治疗途径之一就是通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性来降低餐后的血糖水平[2]。α-葡萄糖苷酶是一种膜结合蛋白，主要的生理功能是将寡聚糖和双糖转化为葡萄糖。而得到的葡萄糖被吸收进入血液，从而导致血糖水平显著性升高。随着α-葡萄糖苷酶的重要生理功能被不断认识与挖掘，α-葡萄糖苷酶已被认为是2型糖尿病治疗的潜在靶标蛋白之一。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂在餐后控制和延缓碳水化合物的消化水解以及单糖吸收等方面发挥着非常重要的生理作用[3]。具有新颖结构类型的高效低毒的α-葡萄糖苷酶抑制剂的发现也引起众多药物化学家们的兴趣，许多研究工作都致力于开发具有潜在成药性的新型α-葡萄糖苷酶抑制剂。在临床上，一些已知的α-葡萄糖苷酶抑制剂，如Miglitol、Voglibose、Acarbose和1-Deoxynojirimycin(DNJ)(化学结构如图1所示)，被用于临床2型糖尿病的用药治疗，主要均通过降低血浆中较高的葡萄糖水平来发挥药理作用。但是，在治疗过程中，相伴出现了许多较为严重的不良反应，如腹泻、腹痛、肠胃胀气、过敏及皮肤问题等[4]。因此，寻找和发现结构新颖且安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂对于糖尿病及其相关并发症的治疗和人体代谢学等方面的研究具有重要意义。
天然产物一直以来都是寻找发现治疗各类型疾病药物先导化合物的重要源泉，并取得了丰硕的研究成果，如川芎嗪、长春西汀等心血管药物，鬼臼毒素、紫杉醇等抗肿瘤药物均直接或间接来源于天然产物[5]。因此，基于中药或天然产物中寻找发现针对特定蛋白靶标的活性药物先导物，具有极其重要的研究意义和开发价值。丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)，一种传统中药材，为唇形科鼠尾草属植物，主要以其根用药，具有活血祛瘀、消肿止痛、镇静安神等多种药用功效[6]。在临床上，丹参已被用于心脑血管类疾病的治疗已有数百年，尤其在动脉粥样硬化、高血脂症、冠心病以及脑血管疾病等治疗中发挥着非常重要的作用[7]。根据丹参中化学成分的结构特点，主要可以分为两种类型，即脂溶性成分和水溶性成分。其中的脂溶性成分是以丹参酮为主要代表的二萜醌类化合物，而水溶性成分主要为酚酸类化合物，二者均是丹参发挥良好药效的主要物质基础[8]。近年来，在化学成分、药代动力学及药理学等方面研究较多的水溶性成分主要包括丹参素、丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)和丹酚酸C(Salvianolic acidC)，其它丹酚酸类化合物还包括丹酚酸D、E、F、G、H、I、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸等化合物。许多药理学实验研究表明，丹酚酸类成分通过多种生物学机制来发挥药理作用，如抗血栓形成、抑制血小板聚集、抑制细胞内源性胆固醇合成、防止动脉粥样硬化斑块形成且具有很强的抗氧化作用，它可以清除自由基、减少自由基对机体的损伤、抑制脂质过氧化反应，并且影响细胞内钙离子浓度及ATP酶活性等作用[9]。许多在丹参化学成分方面的研究被不断开展，并取得了系列的研究成果。然而，几乎没有相关文献报道丹参中的化学成分与α-葡萄糖苷酶之间的相互关系，这方面的研究仍然相对不足。因此，对于丹参中的大多数化学成分，包括其中的丹酚酸类化合物以及丹参酮类成分，均需要进一步深入探讨并阐明其与α-葡萄糖苷酶相互作用时的结合规律，以进一步从传统中药丹参中发现具有潜在生物活性的新型α-葡萄糖苷酶抑制剂。
计算机辅助药物设计(Computer-aided drug design，CADD)，是一种基于理论计算的研究方法，被广泛应用于药物发现过程。它已极大的促进了药物先导物的开发进程，主要归因于它具有多种优势，如节约时间与成本、具有高通量筛选的特性、可以为药物设计提供有参考价值的信息等[10]。分子对接是其中一种重要的研究蛋白—药物相互作用系统的计算模拟方法。它结合体内外的生物活性实验研究，已被广泛用于配体与受体蛋白的相互作用机制的分析[11]。中国专利(申请号201610990888.7)提供了一种JAK2激酶抑制剂的虚拟筛选方法，步骤如下：1)利用分子对接软件，对化合物进行对接打分；2)构建药效团模型，对尚未进行对接或已经对接后的小分子化合物进行匹配。该发明还提供虚拟筛选命中化合物作为活性成分，在预防和/或治疗JAK2激酶介导的疾病上的应用。
综上所述，丹参是传统的中药，被广泛应用于临床。其中的丹酚酸类和丹参酮类成分具有多种药理活性，α-糖苷酶是2型糖尿病治疗过程中的关键性靶标酶之一；但是传统中药丹参与α-糖苷酶之间存在怎样的相互关系仍不清楚，丹参的中药或天然产物库中是否存在潜在的可用于2型糖尿病治疗的α-糖苷酶抑制剂以及其中的构效关系还不明确。
目前，应用计算机辅助虚拟筛选的方法从中药丹参中寻找发现具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的抑制剂，尚未见相关文献报道。
参考文献：[1][M.Kalousova,T.Zima,V.Tesar,S.Stipek and S.Sulkova,KidneyBlood Press Res.,2004,27,18-28.]；[2][H.Rasouli,S.M.B.Hosseini-Ghazvini,H.Adibi and R.Khodarahmi,Food Funct.,2017,8,1942-1954.]；[3][S.R.Park,J.H.Kim,H.D.Jang,S.Y.Yang and Y.H.Kim,Food Chem.,2018,257,128-134.]；[4][Z.Liu andS.Ma,ChemMedChem.,2017,12,819-829.]；[5][L.Ouyang,Y.Luo,M.Tian,S.Y.Zhang,R.Lu,J.H.Wang,R.Kasimu and X.Li,Cell Proliferat.,2014,47,506-515.]；[6][T.Hu andC.H.Cho,Biomol.Res.Ther.,2013,2,1000110/1-1000110/6.]；[7][L.M.Zhou,Z.Zuo andM.S.S.Chow,J.Clin.Pharmacol.,2005,45,1345-1359.]；[8][Y.R.Lu and L.Y.Foo,Phytochemistry,2002,59,117-140]；[9][Y.Q.Ge,B.Yang,Z.Chen and R.B.Cheng,Mol.Med.Rep.,2015,12,7782-7788.]；[10][C.L.Hung and C.C.Chen,Drug DevelopRes.,2014,75,412-418.]；[11][E.Yuriev,J.Holien and P.A.Ramsland,J.Mol.Recognit.,2015,28,581-604.]。
发明内容
本发明的目的在于公开一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，以及该虚拟筛选方法及其筛选出的化合物在预防和/或治疗2型糖尿病的药物制剂中的应用。
本发明的设计构思：1.大分子蛋白三维结构的获取、分析和处理；2.中药中药或天然产物库的构建及小分子化合物的准备；3.虚拟筛选模型预测能力的校准及筛选模型的建立；4.中药或天然产物库的虚拟筛选与相互作用机制分析；5.筛选结果的体内外生物活性验证。
基于上述设计构思，本发明采用如下技术方案：
一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括如下步骤：
1)大分子蛋白三维结构的获取、分析和处理：选择从RCSB蛋白晶体数据库(https://www.rcsb.org/)中下载α-葡萄糖苷酶的晶体结构，或通过同源模建获得α-葡萄糖苷酶的三维结构。选择利用计算软件AutoDock、Surflex、Glide、Gold、MVD和DiscoveryStudio的一种或几种相应模块进行计算机辅助虚拟筛选。选择应用相关软件对大分子靶标蛋白进行三维结构分析、修补缺失的氨基酸残基和肽链末端、去除蛋白结构中的水分子并为整个蛋白分子添加氢原子，并选择应用Amber、Kollman、MMFF94、MMFF94s的一种或几种力场对蛋白分子进行能量最优化处理。
2)中药或天然产物库的构建及小分子化合物的准备：选择从相关文献或通过各类型中药或天然产物库收集已分离或提取已知的化合物。以丹参为例，从丹参中分离获得的天然产物，主要包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类化合物。选择通过Chem3D Pro14.0(PerkinElmer,Inc.)画出所有小分子化合物的三维结构，或通过Concord(SYBYL X-2.0)等其他绘图软件进行三维结构转换。选择使用标准的Tripos、MMFF94、MMFF94s的一种或几种力场对小分子化合物进行能量最优化，并为小分子化合物添加GASTEIGER-HUCKEL电荷。
3)虚拟筛选模型预测能力的校准及筛选模型的建立：为了建立可靠的分子对接预测模型，首先，选择利用计算软件AutoDock、Surflex、Glide、Gold、MVD和Discovery Studio中的一种或几种相应模块，对蛋白晶体结构中的原始配体分子α-D-glucose与α-葡萄糖苷酶进行重新对接。同时，为了确保所建立的对接模型具有真实可靠的预测能力，选择具有良好α-葡萄糖苷酶抑制剂和阳性药物组成模型的校准集，对上述建立的筛选模型做进一步分子对接和模型预测能力的校准和确证。
4)中药或天然产物库的虚拟筛选与相互作用机制分析：为了从中药或天然产物中高效、快速地筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，应用已构建的虚拟筛选模型，对建立的天然产物(中药丹参)库中的所有化合物进行与α-葡萄糖苷酶的分子对接分析。为了阐明筛选得到的抑制剂与α-葡萄糖苷酶之间可能存在的相互结合模式及作用位点，这里，采用分子对接的方法来探讨抑制剂与α-葡萄糖苷酶之间的作用规律。根据其对接打分(Total score)、结合自由能的指标确定化合物与α-葡萄糖苷酶对接打分最高的构象，结合自由能最低，即为最优势构象，并对其作进一步分析。以形成的氢键、疏水性相互作用、pi-pi stacking、范德华力、盐键以及RMSD值等基础性考察指标，来探讨配体—受体结合时的相互作用规律。
5)筛选结果的体内外生物活性验证：选择应用体外酶分子水平、细胞水平以及体内动物水平的相关实验对筛选得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性评价。通过体外酶学实验测定待测化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性根据如下公式计算：抑制率(％)＝[(C30–C0)–(S30–S0)]/(C30–C0)×100，数据处理：使用MS Excel 2013分析处理数据，并用GraphPad Prism 6.0.2计算得到半数抑制浓度(IC50)。同时，采用体外酶动力学实验对筛选得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性类型的评价，以进一步阐明活性化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用方式，筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
以丹参为例，通过上述计算机辅助的虚拟筛选和体内外生物活性验证，共发现2个具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制剂，该化合物具有以下特征：
化合物1：Salvianolic acid C
英文名称：
(R,E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-((3-(2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxybenzofuran-4-yl)acryloyl)oxy)propanoic acid
化合物化学结构：
化合物2：Salvianolic acid A
英文名称：
(R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(((E)-3-(2-((E)-3,4-dihydroxystyryl)-3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl)oxy)propanoic acid
化合物化学结构：
以丹参为例，通过研究传统中药丹参与α-葡萄糖苷酶之间的相互关系，并明了确丹参的中药或天然产物库中存在潜在的可用于2型糖尿病治疗的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其构效关系；以丹参为载体，通过其中的化学成分构建中药或天然产物库，并以此为基础，借助计算机辅助虚拟筛选，实现了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，以及该虚拟筛选的化合物(Salvianolic acid C、Salvianolic acid A)作为活性成分的药物，该药物能够预防和/或治疗2型糖尿病。
本发明公开的α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法具有如下优点：
(1)应用计算机辅助药物设计对中药的中药或天然产物库进行虚拟筛选，通过多种已知抑制剂和阳性药组成校准集，以建立可靠且具有预测能力的筛选模型，用于快速、高效地从复杂的中药资源中获得潜在的抑制剂，可大大降低进行生物活性实验测定的化合物数量，避免了实验的盲目性，并节约实验成本和时间；(2)通过后续体内外药理活性实验，对虚拟筛选结果进行进一步的生物活性验证，提高了筛选结果的准确性，降低了假阳性率；(3)该方法除用于筛选目的，还可用于该类型化合物的构效关系探讨，并指导进一步的基于活性化合物的结构修饰。
可以预见，本发明筛选的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及其药物上可接受的成盐化产物可与药用常见辅料和载体结合，制备2型糖尿病药物的组合物，从而达到预防或治疗的效果。同时，上述药物可根据实际的需要选择合适的剂型，如片剂、注射剂、栓剂、气雾剂、缓释制剂、微囊、控释制剂、脂质体、纳米制剂等。
附图说明
图1已知的α-葡萄糖苷酶抑制剂的化学结构。
图2原始配体α-D-glucose与α-葡萄糖苷酶的重新对接分析(原始配体为蓝色结构，重新对接配体为绿色结构表示)。
图3化合物Salvianolic acid C(A)、Salvianolic acid A(B)与α-葡萄糖苷酶的分子对接分析。
图4化合物Salvianolic acid C、Salvianolic acid A和Quercetin的α-葡萄糖苷酶抑制活性—浓度曲线分析。
图5化合物Salvianolic acid C(A,C)和Salvianolic acid A(B,D)的α-葡萄糖苷酶抑制动力学Lineweaver-Burk plots分析。
具体实施方式
下面以丹参为例作为具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
分子对接被广泛用于预测与分析生物活性小分子与蛋白靶标之间的相互作用规律。本发明通过分子计算软件SYBYL X-2.0(Tripos,L.P.)中的Surflex-dock模块进行小分子化合物与α-葡萄糖苷酶之间的分子对接模拟。基于准备好的小分子化合物和蛋白分子，通过分子对接，以形成的氢键、疏水性相互作用、pi-pi堆积、范德华力、盐键、以及RMSD值等基础性考察指标，来探讨配体—受体结合时的相互作用规律。
实施例1以丹参为例的一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法及其验证
1)大分子蛋白三维结构的获取、分析和处理：从RCSB蛋白晶体数据库中(https:// www.rcsb.org/)下载α-葡萄糖苷酶的晶体结构(PDB code:3A4A)，其中复合物蛋白晶体结构的原始配体分子为α-D-glucose。选择利用计算软件AutoDock、Surflex、Glide、Gold、MVD和Discovery Studio的一种或几种相应模块进行计算机辅助虚拟筛选。选择应用相关软件对大分子蛋白质进行结构分析，修补缺失的氨基酸残基和肽链末端，去除水分子并为整个蛋白分子添加氢原子。应用MMFF94s力场对蛋白分子进行能量最优化。其他参数按默认值设置。处理后的靶标蛋白另存为.pdb文件。
2)中药或天然产物库的构建及小分子化合物的准备：从相关文献收集从丹参中分离获得的天然产物，主要包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类化合物，共约100个单体小分子。通过Chem3D Pro 14.0(PerkinElmer,Inc.)画出所有小分子化合物的三维结构，并使用标准的Tripos力场对其进行能量最优化。能量梯度收敛性判据为0.005kcal/mol，最大迭代次数为10,000，并为小分子添加GASTEIGER-HUCKEL电荷。优化后的小分子化合物重新命名并另存为.mol2文件。
3)虚拟筛选模型预测能力的校准及筛选模型的建立：为了建立可靠的分子对接预测模型，首先，选择利用计算软件AutoDock、Surflex、Glide、Gold、MVD和Discovery Studio中的一种或几种相应模块，对蛋白晶体结构中的原始配体分子α-D-glucose与α-葡萄糖苷酶进行重新对接，其对接结果如图2所示。由图2可以观察到，晶体结构中的原始配体与重新对接的配体几乎完全重叠，且二者在酶活性口袋内所处的构象及取向保持相对一致。配体分子与氨基酸残基Gln182、Asp215、Gln279、His351、Asp352和Arg442之间共生成7根氢键的相互作用，同时还观察到其他疏水性相互作用力的存在。对接结果表明，此处建立的分子对接模型相对可靠，具有一定的分子相互作用预测能力。同时，为了确保所建立的对接模型具有真实可靠的预测能力，我们通过选择文献已报道的具有良好α-葡萄糖苷酶抑制剂和阳性药物组成模型的校准集，对上述建立的筛选模型做进一步对接确证，其对接结果如表1所示。所得结果表明，所有校准集抑制剂都能较好的与由氨基酸残基Asp69、Tyr72、His112、Phe159、Gln182、Val216、Glu277、Gln279、His351、Asp352、Glu411和Arg442组成的α-葡萄糖苷酶活性结合口袋相互作用，且均可观察到多根氢键以及其他疏水性相互作用产生，以共同维持复合物构象的稳定性。由此表明，所构建的分子对接模型具有相对可靠的预测能力。同时，我们选取对接打分(Total score)6.50作为一个以α-葡萄糖苷酶为作用靶标的活性与非活性化合物的相对区分标准，以用于后续α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。
表1已知抑制剂的虚拟筛选分析校准
4)中药或天然产物库的虚拟筛选与相互作用机制分析：为了从中药或天然产物中高效、快速地筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，我们应用已构建的虚拟筛选模型，对建立的中药或天然产物库中的所有化合物进行与α-葡萄糖苷酶的分子对接分析。分析结果表明，多个化合物具有相对较高的对接打分。由于多数丹参类药材提取物或其复方均由其水提物制备获得，因此多数水溶性的丹酚酸类化合物被优先考虑。结合单体化合物的可获得性和化合物的结构特点，我们选取了13个可获得样品的化合物包括9个丹酚酸类成分：Salvianolicacid A(SAA)、Salvianolic acid B(SAB)、Salvianolic acid C(SAC)、Lithospermic acid(LA)、Rosmarinic acid(RA)、Caffeic acid(CA)、Isoferulic acid(IA)、Protocatechuicaldehyde(PAH)、Ursolic acid(UA)；和4个脂溶性成分：Tanshinone IIA(TS-IIA)、Cryptotanshinone(CTS)、Tanshinone IIB(TS-IIB)、Miltirone(MT)，进行了深入的对接分析和后续的体外酶学活性实验验证，其对接结果分析如表2所示。其中的化合物Salvianolic acid A、Salvianolic acid C和Lithospermic acid表现出相对较高的对接打分，分别为8.0625、7.781和7.4909，而其他化合物的对接打分均低于前述的相对区分标准。
表2部分化合物与α-葡萄糖苷酶的分子对接分析
采用分子对接(Molecular docking)的方法分析活性化合物Salvianolic acidC、Salvianolic acid A与α-葡萄糖苷酶的相互作用规律。为了阐明筛选得到的抑制剂Salvianolic acid C、Salvianolic acid A与α-葡萄糖苷酶可能存在的相互结合模式及作用位点，这里，我们采用分子对接的方法来探讨二者与α-葡萄糖苷酶的作用规律。
α-葡萄糖苷酶(PDB code:3A4A)由一个亚基构成，蛋白晶体结构分辨率为
在对接实验中，分析分子对接结果，我们根据其对接打分(Total score)确定，化合物与α-葡萄糖苷酶对接打分最高的构象，结合自由能最低，即为最优势构象，并对其作进一步分析。分子对接分析结果如图3，化合物Salvianolic acid C及Salvianolic acid A的对接打分分别为7.781和8.0625。由图3可以看出，化合物Salvianolic acid C分别与氨基酸残基Asp215、Glu277、Gln279、Asp307和Asn350之间共形成了七根氢键。化合物Salvianolicacid A与氨基酸残基Asp215、Glu277、Gln279、Thr306、Gln353和Glu411之间共生成了九根氢键。此外，我们还可以观察到pi-stacking(如face-to-face和Phe303，face-to-edge和Phe159、Phe178、Phe301)以及其他疏水性相互作用的存在。由此，可以看出，小分子抑制剂与α-葡萄糖苷酶之间所形成的氢键、疏水性相互作用、范德华力等作用力的存在对于维系蛋白受体—配体复合物构象的稳定发挥着非常重要作用。
5)筛选结果的体内外生物活性验证：筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂
采用体外酶学实验对筛选得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性验证。
1.1试剂与标准溶液的配制
(1)75mM磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)：称取KH2PO4 0.0956g，K2HPO4 0.6946g，EDTA1.862mg，用超纯水溶解并稀释至50mL。每次实验前新鲜配制，用于溶解稀释样品和其它试剂；
(2)α-葡萄糖苷酶溶液：精密称取适量的α-葡萄糖苷酶，用75mM的PB溶液溶解并配制为10U/mL的α-葡萄糖苷酶工作液，用移液器吹匀酶溶液，置于冰上保存，待用；
(3)底物配制：精密称取适量4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(4-NPGP)，加入75mM PB溶液溶解，配制成浓度为25mM的底物工作液，涡旋混匀1min，每次实验前新鲜配制；
(4)供试药物配制：精密称取待测药物适量，用DMSO溶解配制为10mM的储备液，于-20℃避光保存。实验前用PB稀释至不同所需浓度(0～200μM)，DMSO含量小于0.1％。
1.2实验步骤
(1)在96孔板上加入不同浓度的待测样品溶液100μL，再加入0.1U/mLα-葡萄糖苷酶溶液50μL，并以相同体积的PB作为空白对照组，用已知的α-葡萄糖苷酶抑制剂槲皮素(Quercetin)和阿卡波糖(Acarbose)作为阳性对照组，每组平行设置3个复孔。将酶体系置于酶标仪上37℃孵育10min，于波长405nm处读数一次，并记录吸光度值。
(2)随后，向酶体系中加入50μL的底物4-NPGP(1mM)以启动酶反应，将微孔板置于酶标仪上37℃继续孵育30min，于波长405nm处读数一次，并记录吸光度值。
(3)待测化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性根据如下公式计算：
抑制率(％)＝[(C30–C0)–(S30–S0)]/(C30–C0)×100，
其中，C0和S0分别表示空白对照组和待测样品组在0min的吸光度值，C30和S30分别表示空白对照组和待测样品组在30min的吸光度值。数据处理：使用MS Excel 2013分析处理数据，并用GraphPad Prism 6.0.2计算得到半数抑制浓度(IC50)，IC50代表在所述实验条件下，α-葡萄糖苷酶的活性被抑制50％时所需待测化合物的浓度。
(4)我们应用体外酶学实验对筛选得到的部分化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性评价，其测定结果如表3所示。其中，化合物Salvianolic acid C和Salvianolic acid A表现出较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值分别为4.31和19.29μM。二者的IC50值与虚拟筛选结果的对接打分相对一致，也证明所建立的分子对接模型对于分子筛选的相对可靠性。此外，其他化合物表现出相对较弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，即使在最高测定浓度下(100μM)，仍然表现相对较弱的酶抑制活性。这些化合物的体外活性评价结果与虚拟筛选结果也保持着相对的一致性，其相对较低的对接打分主要归因于小分子化合物与α-葡萄糖苷酶之间较弱的结合亲和力。
表3筛选得到的化合物与α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性评价
aIC50值为三次独立实验结果的均值；
b文献报道IC50＝6.6μM；
其中，通过体外酶学活性实验验证，筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂Salvianolicacid C、Salvianolic acid A以及阳性对照药Quercetin在不同给药浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性—浓度曲线如图4所示。
另一种验证：采用体外酶动力学实验对筛选得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性类型的评价，筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
1.1试剂与标准溶液的配制
(1)75mM磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)：称取KH2PO4 0.0956g，K2HPO40.6946g，EDTA1.862mg，用超纯水溶解并稀释至50mL。每次实验前新鲜配制，用于溶解稀释样品和其它试剂；
(2)α-葡萄糖苷酶溶液：精密称取适量的α-葡萄糖苷酶，用75mM的PB溶液溶解并配制为10U/mL的α-葡萄糖苷酶工作液，用移液器吹匀酶溶液，置于冰上保存，待用；
(3)底物配制：精密称取适量4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(4-NPGP)，加入75mM PB溶液溶解，配制成浓度为25mM的底物工作液，涡旋混匀1min，每次实验前新鲜配制；
(4)供试药物配制：精密称取待测药物适量，用DMSO溶解配制为10mM的储备液，于-20℃避光保存。实验前用PB稀释至不同所需浓度(0～200μM)，DMSO含量小于0.1％。
1.2实验步骤
(1)在96孔板上加入不同浓度的待测样品溶液100μL，再加入0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50μL，并以相同体积的PB作为空白对照组，每组平行设置3个复孔。将酶体系置于酶标仪上37℃孵育10min，于波长405nm处读数一次，并记录吸光度值。
(2)随后，向酶体系中加入50μL不同浓度的底物4-NPGP(0.05、0.1、0.15、0.2mM)以启动酶反应，将96孔板置于酶标仪上37℃继续孵育10min，于波长405nm处每隔30s读数一次，并记录吸光度值。
(3)数据处理：使用MS Excel 2013分析处理测定的实验数据，酶反应体系的反应速率为ΔA/min。
(4)酶动力学抑制类型评价实验测定结果如图5所示。由图5A可以看出，筛选得到的抑制剂Salvianolic acid C表现为混合竞争性抑制剂。表明它不仅可以和α-葡萄糖苷酶结合，而且还可以和α-葡萄糖苷酶—底物复合物结合。同时，根据图5C可以得知，Salvianolic acid C和α-葡萄糖苷酶相互作用时的竞争性抑制常数Ki为1.5μM，非竞争性抑制常数Ki'为8.8μM。由此可知，化合物Salvianolic acid C和α-葡萄糖苷酶之间的结合亲和力要强于其与α-葡萄糖苷酶—底物复合物之间的亲和力。由图5B可以看出，筛选得到的抑制剂Salvianolic acid A表现为竞争性抑制剂，它仅与α-葡萄糖苷酶结合，且根据图5D可以得知，Salvianolic acid A和α-葡萄糖苷酶相互作用时的竞争性抑制常数Ki为21.2μM。
筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂Salvianolic acid C、Salvianolic acid A。
实施例2活性化合物Salvianolic acid A(SAA)制剂的制备
(1)本发明的活性化合物SAA的片剂
化合物SAA 2mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g
制备工艺：取本发明的化合物SAA过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。
(2)本发明的活性化合物SAA的胶囊
化合物SAA 2mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g
制备工艺：取本发明的化合物SAA过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。
(3)本发明的活性化合物SAA的软胶囊
化合物SAA 10mg，大豆卵磷脂100g
制备工艺：取本发明的化合物SAA，加大豆软磷脂，胶体磨混匀，抽真空，压制，即得软胶囊。
(4)本发明的活性化合物SAA的冻干粉
化合物SAA 2g，亚硫酸钠4g，乙醇50mL，加水定容至1000mL；
制备工艺：取本发明的化合物SAA分散在乙醇中，亚硫酸钠溶于水中，在超声或搅拌条件下将拿硫酸钠溶液逐渐加入，使成澄清透明溶液；补加水定容至足量；经0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥得到。
实施例3活性化合物Salvianolic acid C(SAC)制剂的制备
(1)本发明的活性化合物SAC的片剂
化合物SAC 2mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g
制备工艺：取本发明的化合物SAC过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。
(2)本发明的活性化合物SAC的胶囊
化合物SAC 2mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g
制备工艺：取本发明的化合物SAC过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。
(3)本发明的活性化合物SAC的软胶囊
化合物SAC 10mg，大豆卵磷脂100g
制备工艺：取本发明的化合物SAC，加大豆软磷脂，胶体磨混匀，抽真空，压制，即得软胶囊。
(4)本发明的活性化合物SAC的冻干粉
化合物SAC 2g，亚硫酸钠4g，乙醇50mL，加水定容至1000mL；
制备工艺：取本发明的化合物SAC分散在乙醇中，亚硫酸钠溶于水中，在超声或搅拌条件下将拿硫酸钠溶液逐渐加入，使成澄清透明溶液；补加水定容至足量；经0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥得到。
上述实施例为本发明具有代表性的实施方案的举例说明，仅仅是示例性的说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，以及该虚拟筛选方法及其筛选出的化合物在预防和/或治疗2型糖尿病的药物制剂中的应用；
所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括如下步骤：
1)大分子蛋白三维结构的获取、分析和处理：从RCSB蛋白晶体数据库中下载α-葡萄糖苷酶的晶体结构，其中复合物蛋白晶体结构的原始配体分子为α-D-glucose；选择利用计算软件AutoDock、Surflex、Glide、Gold、MVD和Discovery Studio的一种或几种相应模块进行计算机辅助虚拟筛选；选择应用相关软件对大分子蛋白质进行结构分析，修补缺失的氨基酸残基和肽链末端，去除水分子并为整个蛋白分子添加氢原子；应用MMFF94s力场对蛋白分子进行能量最优化；
2)中药或天然产物库的构建及小分子化合物的准备：从相关文献收集从丹参中分离获得的天然产物，包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类化合物；通过Chem3D Pro 14.0(PerkinElmer,Inc.)画出所有小分子化合物的三维结构，并使用标准的Tripos力场对其进行能量最优化；能量梯度收敛性判据为0.005kcal/mol；最大迭代次数为10,000，并为小分子添加GASTEIGER-HUCKEL电荷；
3)虚拟筛选模型预测能力的校准及筛选模型的建立：选择利用计算软件AutoDock、Surflex、Glide、Gold、MVD和Discovery Studio中的一种或几种相应模块，对蛋白晶体结构中的原始配体分子α-D-glucose与α-葡萄糖苷酶进行重新对接，要求晶体结构中的原始配体与重新对接的配体几乎完全重叠，且二者在酶活性口袋内所处的构象及取向保持相对一致；配体分子与氨基酸残基Gln182、Asp215、Gln279、His351、Asp352和Arg442之间共生成7根氢键的相互作用，同时观察到有其他疏水性相互作用力的存在；选择具有良好α-葡萄糖苷酶抑制剂和阳性药物组成模型的校准集，对上述建立的筛选模型做进一步对接确证，所有校准集抑制剂都能较好的与由氨基酸残基Asp69、Tyr72、His112、Phe159、Gln182、Val216、Glu277、Gln279、His351、Asp352、Glu411和Arg442组成的α-葡萄糖苷酶活性结合口袋相互作用，且观察到多根氢键以及其他疏水性相互作用产生；选取对接打分6.50作为一个以α-葡萄糖苷酶为作用靶标的活性与非活性化合物的相对区分标准；
4)中药或天然产物库的虚拟筛选与相互作用机制分析：应用已构建的虚拟筛选模型，对建立的中药或天然产物库中的所有化合物进行与α-葡萄糖苷酶的分子对接分析；结合单体化合物的可获得性和化合物的结构特点，选择化合物Salvianolic acid A、Salvianolicacid C进行深入的对接分析和后续的体外酶学活性实验验证；
5)筛选结果的体内外生物活性验证：采用体外酶学实验对筛选得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性验证；筛选得到α-葡萄糖苷酶抑制剂Salvianolic acid C、Salvianolic acid A。
2.如权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于：所述步骤5)中，采用体外酶动力学实验对筛选得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性类型的评价；筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂Salvianolic acid C、Salvianolic acid A。
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