CN107937554A - 犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents
犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒及检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于特异性扩增犬基因组17个基因座的17组引物对，17个基因座分别为FH2658、FH2004、FH2309、PEZ21、CHR.X、FH2361、ZUBECA4、FH2137、FH2508、FH3241、WILMS‑TF、ZUBCA6、SRY、REN214L11、PEZ01、PEZ16和PEZ17各引物对中至少有一个引物的5’端具有荧光染料标记,还公开了该试剂盒的检测方法和应用。本发明所述试剂盒的优点主要表现在：系统的灵敏度高、特异性强；系统适应于不同来源的检材；种属特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。
背景技术
微卫星DNA，又称为短串联重复序列(Short tandem repeat,STR),是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列。其核心序列一般为2～6bp的重复，重复次数通常在15～30次，这就是其高度多态性的遗传基础。由于STR标记的多态性能遵循孟德尔共显性遗传规律将其传递给后代，因此它已被广泛应用于肿瘤生化研究、法医学个体识别、亲子鉴定和群体遗传学分析等领域。
STR-PCR扩增是建立在PCR基础上的STR分型技术。由于不同基因组卫星DNA重复序列单位数目的可变性，因此可形成极其复杂的等位基因片段长度多态性。实践中，联合使用多个STR基因座进行PCR扩增，可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，因此在实践中具有很高的鉴别能力。而在犬类的个体识别、亲权鉴定和遗传育种等方面多采用美国ABI公司推荐的StokMarks Animal Genotyping System的10个犬基因座，还有一些国内开发的犬11基因座荧光复合扩增试剂盒、犬17基因座复合扩增试剂盒等。
但是美国ABI公司推荐的StokMarks Animal Genotyping System中仅有10个犬基因座，有部分基因座遗传多态性不高，不同犬群间的差异较大，而国内开发的复合扩增试剂盒中检测基因座数量不全，由此给DNA检验技术的应用及其效率带来一定的影响，不能更好地满足使用的要求，急需开发覆盖更多的检测基因座来作为补充。
发明内容
本发明旨在提供一种犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒,提高了检测系统的累计个体识别力和累积非父排出率,满足犬的个体识别、亲权鉴定和遗传育种等多方面应用的需要。
本发明所采取的技术方案是：一种犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，包括用于特异性扩增犬基因组17个基因座的17组引物对，17个基因座分别为FH2658、FH2004、FH2309、PEZ21、CHR.X、FH2361、ZUBECA4、FH2137、FH2508、FH3241、WILMS-TF、ZUBCA6、SRY、REN214L11、PEZ01、PEZ16和PEZ17，所述引物对如SEQ ID №1～34所示，各引物对中至少有一个引物的5’端具有荧光染料标记。
各基因座的引物浓度如下所示：
所述试剂盒中，对应17个基因座的引物对分为四组并分别以四种不同的荧光染料进行标记，其中：FH2658、FH2004和FH2309为第一组，PEZ21、CHR.X、FH2361和ZUBECA4为第二组，FH2137、FH2508、FH3241、WILMS-TF和ZUBCA6为第三组，SRY、REN214L11、PEZ01、PEZ16和PEZ17为第四组。四组引物对分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX荧光染料标记，第一组采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记。
进一步，试剂盒中还包括反应混合物、5U/μl的热启动C-Taq酶和sdH2O。
上述试剂盒的检测方法包括：将待检测样品进行聚合酶链式反应扩增，并将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，所述聚合酶链式反应程序为：
初始变性：95℃2min；
热循环：94℃1min，59℃1min，72℃1min，重复10个循环；94℃1min，58℃1min，72℃1min，重复18个循环；
终延伸：72℃10min。
本发明所述犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒的优点主要表现在下述几个方面：
1、系统的灵敏度高、特异性强
本发明所述犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒在DNA模板为1.0ng的条件下，可检出全部17个基因座，各基因座峰值均衡，且无非特异性峰产生；
2、系统适应于不同来源的检材
所述犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒对同一个体的血痕、口腔拭子、毛发及组织的DNA进行复合扩增和荧光检测，结果一致，表明该系统适应于不同来源的检材；
3、种属特异性强
所述犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒检验人、猪、马、牛、猫、鸡、鸭、鼠、鱼和大肠杆菌等，没有出现特异性扩增峰，表明该系统具有种属特异性。
附图说明
图1是实施例1中未知犬种的提取样品的分型结果；
图2是实施例2中德国牧羊犬的血卡分型结果；
图3是实施例3中罗威纳犬的血卡分型结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1，未知犬种的全血样品检测。
1、样本来源
由南昌警犬基地提供的1个无关个体的犬全血样。
2、DNA提取
采用Chelex-100法分别提取1个全血样本的基因组DNA：
取0.5～5μl全血置于灭菌的1.5ml离心管中，加入sdH2O 1mL于管中，振荡数秒；置于室温10分钟后，振荡数秒，12000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μL5％的Chelex-100，振荡数；于56℃保温30分钟，振荡数秒；沸水浴10分钟，振荡数秒；12000rpm离心5分钟，上清为提取得到的基因组DNA。
3、17个基因座的分组及其对应的引物荧光标记；
选用犬17个基因座的分组方式为：FH2658、FH2004和FH2308为一组,其对应的引物采用FAM标记；PEZ21、CHR.X、FH2361和ZUBEC4为一组,其对应的引物采用HEX标记；FH2508、FH2137、FH3241、WLMS-TF和ZUBC6为一组,其对应的引物采用TAMRA标记；SRY、REN214L11、PEZ01、PEZ16和PEZ17为一组,其对应的引物采用ROX标记。
4、PCR扩增体系
其中引物混合物：
5、扩增热循环
(1)将PCR扩增管置于热循环仪上：
(2)选择下面的程序进行扩增：
热循环仪的扩增程序及参数：
6、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)组成上样混合物[(0.5μL AGCU Marker SIZ-500)×(样品数)+(12μL去离子甲酰胺)×(样品数)]。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，用ABI3130或ABI3100遗传分析仪电泳检测分析。
7、分型分析
用片断分析软件GeneMapper分析步骤6中遗传分析仪检测收集的数据，得到实际样品各个基因座的分子量大小，结果见附图1。
实施例2，德国牧羊犬的血卡样品检测。
1、样品来源
由南昌警犬基地提供。
2、基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、扩增检测
将样品进行PCR直接扩增、遗传分析仪检测并获得如图2所示的分型结果。
4、结果和结论
与该纯种德国牧羊犬相同基因座检测分型一致。
实施例3，罗威纳犬的血卡样品检测。
1、样品来源
由南昌警犬基地提供。
2、基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、扩增检测
将样品进行PCR直接扩增、遗传分析仪检测并获得如图3所示的分型结果。
4、结果和结论
与该纯种罗威纳犬相同基因座检测分型一致。
由于不同品种犬的外表体征虽然差异较大，而在饲养和遗传育种中加以犬耳标以示区分，但是犬耳标模糊、丢失、缺损等现象时有发生，导致种犬个体难以识别，从而造成巨大的经济损失。
本实验中样品为在遗传育种过程中出现的耳标模糊，缺损的纯种犬血卡，加以本试剂盒进行鉴定，增加其17个STR基因座，大大增强犬种的身份鉴定及亲缘鉴定能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东华美众源生物科技有限公司
公安部南昌警犬基地
<120> 犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒及检测方法和应用
<130> 2017
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (7)
1.犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括用于特异性扩增犬基因组17个基因座的17组引物对，17个基因座分别为FH2658、FH2004、FH2309、PEZ21、CHR.X、FH2361、ZUBECA4、FH2137、FH2508、FH3241、WILMS-TF、ZUBCA6、SRY、REN214L11、PEZ01、PEZ16和PEZ17，所述引物对如SEQ ID№1～34所示，各引物对中至少有一个引物的5’端具有荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，其特征在于，各基因座的引物浓度如下所示：
3.根据权利要求1所述的犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，其特征在于，对应17个基因座的引物对分为四组并分别以四种不同的荧光染料进行标记，其中：FH2658、FH2004和FH2309为第一组，PEZ21、CHR.X、FH2361和ZUBECA4为第二组，FH2137、FH2508、FH3241、WILMS-TF和ZUBCA6为第三组，SRY、REN214L11、PEZ01、PEZ16和PEZ17为第四组。
4.根据权利要求3所述的犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，其特征在于，四组引物对分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX荧光染料标记，第一组采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记。
5.根据权利要求1～4任一项所述的犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括反应混合物、5U/μl的热启动C-Taq酶和sdH2O。
6.一种犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测方法，其特征在于，取如权利要求1～5任一项所述的犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，将待检测样品进行聚合酶链式反应扩增，并将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，所述聚合酶链式反应程序为：
初始变性：95℃ 2min；
热循环：94℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，重复10个循环；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，重复18个循环；
终延伸：72℃ 10min。
7.权利要求1～5所述犬基因组17个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒在犬的身份鉴定及亲权鉴定中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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