CN107937479A - 一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法 - Google Patents

一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法，通过制备含有细菌抑制剂的病原真菌或生防真菌孢子悬浮液、制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液、共培养、抑菌圈测定等简易程序进行抗菌活性测定。本发明具有技术上的创新性，可替代目前常见的过滤法等测定拮抗活性的方法，既能真实反应生防细菌代谢产物的活性，又具有试验稳定性好、重复性好、操作简便、抗污染能力强、周期短和效率高等优点，可简便快速的实现多种生防细菌对多种病原真菌/生防真菌的拮抗活性的大量测定，有利于快速评价生防细菌对病原真菌/生防真菌的拮抗活性，对研制复合生防细菌和生防真菌制剂也具有重要意义。

Description

一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法
技术领域
本发明属于植物病理学和微生物学领域，更具体涉及一种微生物菌剂研制中所必须的生防细菌代谢产物对植物病原真菌或生防真菌拮抗活性的测定方法。
背景技术
由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora nicotianae)引起的作物枯萎病、瘟病等毁灭性土传病害，以及灰梨孢菌(Magnaporthe oryzae)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的作物炭疽病、稻瘟病等叶面病害给我国农业生产造成巨大损失。生物防治是近年来发展起来的前沿技术，具有安全，环保的优势，已成为研究热点。自然界中存在的芽孢杆菌等生防细菌对植物病原真菌具有抑菌活性，在对峙培养中表现为与病原菌竞争营养、分泌代谢产物引起病原菌菌丝消解、断裂，抑制孢子萌发，形成抑菌带；拟青霉、木霉等生防真菌具有营养竞争、分泌代谢产物抑制病原菌生长的特点，上述生防菌在田间应用中具有实用环保的优势，然而单一种类的生防细菌或真菌制剂由于功能单一常导致田间应用效果不稳定，因此选择具有兼容性的生防细菌和生防真菌研制复合制剂具有广阔应用前景。
测定生防细菌代谢产物对植物病原菌/病害生防真菌的拮抗活性是微生物菌制剂研制过程中的关键环节，但目前常见的用于生防细菌代谢产物活性测定方法如平板对峙培法、菌体直接作用法、三明治法、过滤法(过滤器过滤、双层培养基滤纸夹心法)等均需要在无菌条件下操作，同时还存在其他明显的局限性：
1)平板对峙培法、菌体直接作用法和三明治法存在稳定性、重复性差的局限：
(1)平板对峙法：通常在平板培养基上的病原菌周围点接生防细菌进行对峙培养，根据病原菌与生防菌之间形成的抑菌带宽度判断生防细菌的拮抗活性强弱。此法虽操作比较简便，但由于点接生防细菌的接种量、与病原菌的距离，导致分泌活性物质产量和形成抑菌带宽度也不一致，同时细菌菌体生长也会与病原菌形成营养竞争，影响病原菌生长，无法真实反应出细菌代谢产物的拮抗活性，此法仅适合于生防细菌的初筛。
(2)菌体直接作用测定法：通常是取生防细菌菌体或含菌体的发酵液，涂布至平板培养基表面或混合于培养基制成含菌的平板，然后在含菌的平板上接入病菌块，测定病菌菌落生长直径。采用此法，由于细菌菌体快速生长与病原菌形成营养竞争，对病菌生长影响也极大，仅适合判断细菌营养竞争力，无法真实反应出细菌代谢产物的拮抗活性。
(3)三明治法：在两层培养基中间为一层培养基与拮抗菌菌液(含活菌体)的混合体，然后在上层培养基中接入病原菌菌块，但中间层培养基的菌体容易从上层培养基表面长出与病原菌形成营养竞争，对病菌生长影响极大，同时中层培养基缺乏氧气也会影响生防细菌代谢产物的正常分泌，无法真实反应出细菌代谢产物的拮抗活性。
(2)过滤法(过滤器过滤、双层培养基滤纸夹心法)存在操作繁琐、成本高和效率低的局限：
此类方法虽然通过过滤提高了测定结果的准确性，但在操作过程中需要通过离心、细菌过滤器如微孔滤膜过滤去除细菌菌体等繁琐和费用高的环节，才能避免细菌生长对测定结果的干扰；专利(ZL200810071987.0)公开了一种双层培养基滤纸夹心法，取生防细菌涂布至上层培养基后，生长分泌的代谢产物通过滤纸扩散到下层培养基，移除滤纸和上层培养基后，接入病原菌菌块至下层培养基，培养后测定菌落直径。但测定需要4-7d，周期较长，单个平板培养基只能测定一种生防细菌对一种病原真菌的拮抗活性。
发明内容
本发明的针对生防细菌代谢产物对植物病原真菌/生防真菌拮抗活性测定过程中操作繁琐、成本高、周期长和效率低的实际问题，提供一种非无菌条件下生防细菌代谢产物对植物病原真菌或生防真菌拮抗活性测定的简易方法，该法操作简便、成本低、周期短和效率高。
本发明采取的技术方案如下：
一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法，包括以下步骤：1)制备含有细菌抑制剂的植物病原菌或生防菌孢子悬浮液；2)制备含有细菌抑制剂的生防菌发酵液；3)共培养；4)抑菌圈测定。
优选的，步骤1)所述植物病原菌为植物病原真菌，所述生防菌孢子悬浮液为生防真菌孢子悬浮液；步骤2)所述生防菌发酵液为生防细菌发酵液。
优选的，所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法包括以下步骤：
1)制备含有细菌抑制剂的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液：分别取植物病原真菌或生防真菌的孢子悬浮液，添加至少一种细菌抑制剂，即获得含有细菌抑制剂的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液；
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液：取生防细菌发酵液，添加至少一种细菌抑制剂，即获得含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液；
3)共培养：
(1)取含有细菌抑制剂的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液，加入熔化状态的培养基，混匀后倒入培养皿，培养基凝固后进行预培养，然后用打孔器在距离培养皿中心位置等距离打孔；
(2)取含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液加入步骤(1)中打出的孔内，继续进行培养；
4)抑菌圈测定：待病原菌生长2-3d后测量培养基上孔周围的抑菌圈直径，观察抑菌圈透明程度。
优选的，适合植物病原真菌或生防真菌生长的培养基包括常规的PDA或CA培养基。
优选的，适合生防细菌生长的培养基包括常规的NA或LB培养基。
优选的，所述的打孔器包括直径为6mm的打孔器。
优选的，所述步骤1)中的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液浓度不低于1.5×106个/mL。
优选的，步骤3)中每孔加入等体积的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液。
优选的，所述植物病原真菌包括尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌和辣椒疫霉；所述生防真菌包括淡紫拟青霉和绿色木霉；所述生防细菌包括芽孢杆菌。
本发明的有益效果：在非无菌条件下即可完成，而且操作过程简便、快速、抗污染能力强，周期短，仅通过添加细菌抑制剂即可抑制共培养环节中细菌菌体的生长，排除了因细菌菌体生长与病原真菌/生防真菌形成营养竞争对测定结果的干扰，同时排除了细菌菌体继续分泌代谢产物拮抗病原真菌/生防真菌对测定结果的干扰，又可以减少操作过程中的其他细菌的污染，替代无菌条件下过滤法中的离心和过滤等繁琐、成本高、周期长和效率低的去除细菌菌体等操作环节，适用简便、快速和准确地测定多种生防细菌对尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、辣椒疫霉等病原真菌和淡紫拟青霉、绿色木霉等生防真菌的拮抗活性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所述细菌抑制剂采用现有技术中常规的制剂即可。细菌抑制剂的添加量不低于10μg/mL。共培养步骤中每孔加入不低于10μL的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液。
本发明实施例所用NA培养液：牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1g/L，蛋白陈5g/L，葡萄糖10g/L，用蒸馏水定容，其pH为7.0。
本发明实施例所用NA培养基是在上述NA培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
本发明实施例所用LB培养液：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，用蒸馏水定容。
本发明实施例所用LB培养基是在上述LB培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
本发明实施例所用PDA培养液：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。
本发明实施例所用PDA培养基：是在上述PDA培养液中加入琼脂(15g/L)得到的固体培养基。
本发明实施例所用CA培养基：200g切碎的胡萝卜煮沸1小时后去除残渣,加入琼脂(25g/L)得到的固体培养基。
实施例中涉及到的尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌、胶孢炭疽菌、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06和生防细菌(如芽孢杆菌)均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，可由现有技术中的常规方法获得。
淡紫拟青霉E16的公开文献：黄俊生，汪军，梁昌聪，邓国平，任文彬，郭立佳.一株淡紫拟青霉及其应用(ZL201210358765.3)。
绿色木霉H06的公开文献：黄俊生,梁昌聪,杨腊英,吴琳,王亚.一株绿色木霉菌及其应用(ZL201210323738.2)；
实施例一、生防细菌代谢产物对尖孢镰刀菌的拮抗活性
采用本发明的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法(即细菌抑制法)，以过滤法作为本发明的对比方法，测定生防细菌对尖孢镰刀菌(即香蕉枯萎病菌)的拮抗活性。
1、细菌抑制法
1)制备含有细菌抑制剂的尖孢镰刀菌孢子悬浮液
挑取PDA平板上的尖孢镰刀菌菌丝，接种至PDA液体培养基，28℃，150r/min振荡培养48h，离心收集沉淀，无菌水清洗2次，3层灭菌擦镜纸过滤，去除菌丝，取孢子滤液，加入细菌抑制剂，调节孢子浓度至1.5×106个/mL。
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液
取NA斜面培养基上的待测芽孢杆菌菌株6株，分别接种至LB液体培养基，置于摇床37℃，150r/min，培养3h，取2mL发酵液离心(12000r/min,离心15min)，收集沉淀的菌体，再用无菌水清洗沉淀2次，定容后调节至细胞浓度为106个/mL作为种子液；按照1％比例接入LB培养基，置于摇床37℃，150r/min，培养14h，获得生防细菌发酵液，加入细菌抑制剂，即获得含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液。
3)共培养
取含有细菌抑制剂的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，按照约104个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后置于28℃的智能生化培养箱培养1d，取出后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
2、过滤法
1)制备尖孢镰刀菌孢子悬浮液
挑取PDA平板上的尖孢镰刀菌菌丝，接种至PDA液体培养基，28℃，150r/min振荡培养48h，离心收集沉淀，无菌水清洗2次，3层灭菌擦镜纸过滤，去除菌丝，取孢子滤液，调节孢子浓度至1.5×106个/mL。
2)制备生防细菌发酵液无菌滤液
取NA斜面培养基上的待测芽孢杆菌菌株6株，分别接种至LB液体培养基，置于摇床37℃，150r/min，培养3h，取2mL发酵液离心(12000r/min离心15min)，收集沉淀的菌体，再用无菌水清洗沉淀2次，定容后调节至细胞浓度为106个/mL作为种子液；按照1％比例接入LB培养基，置于摇床37℃，150r/min，培养14h，获得生防细菌发酵液，离心(12000r/min，离心10min)，取上清液用无菌0.22μm的微孔滤膜过滤后，即获得生防细菌发酵液无菌滤液。
3)共培养
取尖孢镰刀菌孢子悬浮液，按照约104个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后置于28℃的智能生化培养箱培养1d后，取出后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的生防细菌发酵液无菌滤液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
3、细菌抑制法和过滤法测定结果比较
比较两种方法的测定结果表明，本发明方法细菌抑制法的测定结果与对比方法过滤法测定的结果并无显著性差异，抑菌圈周围均无细菌菌体生长，6株生防芽孢杆菌代谢产物对尖孢镰刀菌的抑菌圈直径达16mm，说明本发明方法具有简便快速、成本低的特点，结果见表1。
表1生防细菌对尖孢镰刀菌的抑菌圈直径(mm)
同列不同字母表示不同处理间有显著差异(P＜0.05)
实施例二、生防细菌代谢产物对胶孢炭疽菌的拮抗活性
采用本发明的细菌抑制法，以过滤法作为本发明的对比方法，测定生防细菌对胶孢炭疽菌(即芒果炭疽病菌)的拮抗活性。
1、细菌生长抑制法
1)制备含有细菌抑制剂的胶孢炭疽菌孢子悬浮液：
取PDA平板上培养2d的胶孢炭疽菌，用无菌水将分生孢子器洗下，涡旋振荡，获得孢子悬浮液。加入细菌抑制剂，调节孢子浓度为2.2×107个/mL。
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取含有细菌抑制剂的胶孢炭疽菌孢子悬浮液，按照约105个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后置于28℃的智能生化培养箱培养1d，取出后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的含有细菌抑剂制的生防细菌发酵液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d，观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
2、过滤法
1)制备胶孢炭疽菌孢子悬浮液：
取PDA平板上培养2d的胶孢炭疽菌,用无菌水将分生孢子器洗下，涡旋振荡,获得孢子悬浮液,调节孢子浓度至2.2×107个/mL。
2)制备生防细菌发酵液无菌滤液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取胶孢炭疽菌孢子悬浮液，按照约105个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后置于28℃的智能生化培养箱培养1d，取出后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的生防细菌发酵液无菌滤液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
3、细菌抑制法和过滤法测定结果比较
结果表明，本发明方法细菌抑制法的测定结果与对比方法过滤法的测定结果并无显著性差异，抑菌圈周围均无细菌菌体生长，6株生防芽孢杆菌对胶孢炭疽菌均具有较好拮抗活性，拮抗强弱一致，说明本发明方法适合简便、快速地测定生防细菌对胶孢炭疽菌的拮抗活性，结果见表2。
表2生防细菌代谢产物对胶孢炭疽菌的抑菌圈直径(mm)
同列不同字母表示不同处理间有显著差异(P＜0.05)
实施例三、生防细菌代谢产物对辣椒疫霉的拮抗活性
采用本发明的细菌抑制法，以过滤法作为本发明的对比方法，测定生防细菌对辣椒疫霉的拮抗活性。
1、细菌抑制法
1)制备含有细菌抑制剂的辣椒疫霉孢子悬浮液
参照文献(张子君,刘晓舟,张宏志,张春萍.辣椒疫霉产孢方法初探[J].辽宁农业科学,1996,5.)方法略作修改，在CA培养基上培养获得辣椒疫霉孢子悬浮液，加入细菌抑制剂，调节孢子浓度至2.2×107个/mL。
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取含有细菌抑制剂的辣椒疫霉孢子悬浮液，按照约106个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后后置于28℃的智能生化培养箱培养1d，取出用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
2、过滤法
1)制备辣椒疫霉孢子悬浮液
参照文献(张子君,刘晓舟,张宏志,张春萍.辣椒疫霉产孢方法初探[J].辽宁农业科学,1996,(5)49-50.)方法略作修改，在CA培养基上培养获得辣椒疫霉孢子悬浮液，调节孢子浓度至2.2×107个/mL。
2)制备生防细菌发酵液无菌滤液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取辣椒疫霉孢子悬浮液，按照约106个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后置于28℃的智能生化培养箱培养1d，取出用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的生防细菌发酵液无菌滤液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
3、细菌抑制法和过滤法测定结果比较
结果表明，本发明方法细菌抑制法的测定结果与对比方法过滤法的测定结果并无显著性差异，抑菌圈周围均无细菌菌体生长，6株芽孢杆菌对辣椒疫霉均有较好拮抗活性，而且本发明方法具有更加简便快速的特点，结果见表3。
表3生防细菌对辣椒疫霉的抑菌圈直径(mm)
同列不同字母表示不同处理间有显著差异(P＜0.05)
实施例四、生防细菌代谢产物对淡紫拟青霉E16的拮抗活性
采用本发明的细菌抑制法，以过滤法作为本发明的对比方法，测定生防细菌对淡紫拟青霉E16的拮抗活性。
1、细菌抑制法
1)制备含有细菌抑制剂的淡紫拟青霉孢子悬浮液
取PDA平板上培养3d的淡紫拟青霉E16，用无菌水洗出孢子，3层灭菌擦镜纸过滤，去除菌丝，取孢子滤液，加入细菌抑制剂，调节孢子浓度至2.7×108个/mL。
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取含有细菌抑制剂的淡紫拟青霉孢子悬浮液，按照约105个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
2、过滤法
1)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液
取PDA平板上的培养3d的淡紫拟青霉E16，用无菌水洗出孢子，3层灭菌擦镜纸过滤，去除菌丝，取孢子滤液，调节孢子浓度至2.7×108个/mL。
2)制备生防细菌发酵液无菌滤液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取淡紫拟青霉孢子悬浮液，按照约105个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的生防细菌发酵液无菌滤液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
3、细菌抑制法和过滤法测定结果比较
测定结果表明，本发明方法细菌生长抑制法的测定结果与对比方法生防细菌无菌发酵滤液活性测定的结果并无显著性差异，抑菌圈周围均无细菌菌体生长，6株生防细菌中HB04、HB05和HB06对淡紫拟青霉拮抗活性较弱，具有较好的兼容性，说明本发明方法可简便快速的测定生防细菌对淡紫拟青霉拮抗活性。结果见表4。
表4生防细菌对淡紫拟青霉E16的抑菌圈直径(mm)
同列不同字母表示不同处理间有显著差异(P＜0.05)
实施例五、生防细菌对绿色木霉H06的拮抗活性
采用本发明的细菌抑制法，以过滤法作为本发明的对比方法，测定生防细菌对绿色木霉H06的拮抗活性。
1、细菌抑制法
1)制备含有细菌抑制剂的绿色木霉孢子悬浮液
取PDA平板上的培养3d的绿色木霉H06，用无菌水洗出孢子，3层灭菌擦镜纸过滤，去除菌丝，取孢子滤液，加入细菌抑制剂，调节孢子浓度至3.2×108个/mL。
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取含有细菌抑制剂的绿色木霉孢子悬浮液，按照约105个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
2、过滤法
1)制备绿色木霉孢子悬浮液
取PDA平板上培养3d的绿色木霉H06，用无菌水洗出孢子，3层灭菌擦镜纸过滤，去除菌丝，取孢子滤液，调节孢子浓度至3.2×108个/mL。
2)制备生防细菌发酵液无菌滤液
参照实施例一方法制备。
3)共培养
取绿色木霉孢子悬浮液，按照约105个/mL的浓度加入20mL熔化状态的PDA培养基，摇匀后，倒入6cm培养皿，冷却凝固后用6mm打孔器打孔，每孔加入等体积的生防细菌发酵液无菌滤液，对照为无菌水，各处理3次重复，置于28℃的智能生化培养箱培养2d。
4)测定结果
观察抑菌圈透明程度，测定抑菌圈直径、记录结果。
3、细菌抑制法和过滤法测定结果比较
结果表明，本发明方法细菌抑制法具有简便快速准确特点，其测定结果与对比方法过滤法的测定结果并无显著性差异，抑菌圈周围均无细菌菌体生长，6株生防细菌均对绿色木霉H06拮抗活性较弱，其中HB05菌株与绿色木霉H06兼容性最好，结果见表5。
表5生防细菌对绿色木霉H06的抑菌圈直径(mm)
同列不同字母表示不同处理间有显著差异(P＜0.05)
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (9)

1.一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备含有细菌抑制剂的植物病原菌或生防菌孢子悬浮液；2)制备含有细菌抑制剂的生防菌发酵液；3)共培养；4)抑菌圈测定。
2.根据权利要求1所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法，其特征在于，步骤1)所述植物病原菌为植物病原真菌，所述生防菌孢子悬浮液为生防真菌孢子悬浮液；步骤2)所述生防菌发酵液为生防细菌发酵液。
3.根据权利要求2所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，包括以下步骤：
1)制备含有细菌抑制剂的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液：分别取植物病原真菌或生防真菌的孢子悬浮液，添加至少一种细菌抑制剂，即获得含有细菌抑制剂的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液；
2)制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液：取生防细菌发酵液，添加至少一种细菌抑制剂，即获得含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液；
3)共培养：
(1)取含有细菌抑制剂的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液，加入熔化状态的培养基，混匀后倒入培养皿，培养基凝固后进行预培养，然后用打孔器在距离培养皿中心位置等距离打孔；
(2)取含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液加入步骤(1)中打出的孔内，继续进行培养；
4)抑菌圈测定：待病原菌生长2-3d后测量培养基上孔周围的抑菌圈直径，观察抑菌圈透明程度。
4.根据权利要求3所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，适合植物病原真菌或生防真菌生长的培养基包括常规的PDA或CA培养基。
5.根据权利要求3所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，适合生防细菌生长的培养基包括常规的NA或LB培养基。
6.根据权利要求3所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，所述的打孔器包括直径为6mm的打孔器。
7.根据权利要求3所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，所述步骤1)中的植物病原真菌或生防真菌孢子悬浮液浓度不低于1.5×106个/mL。
8.根据权利要求3所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，步骤3)中每孔加入等体积的含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液。
9.根据权利要求3所述的一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法,其特征在于，所述植物病原真菌包括尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌和辣椒疫霉；所述生防真菌包括淡紫拟青霉和绿色木霉；所述生防细菌包括芽孢杆菌。
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