CN107936024B - 一种间变性淋巴瘤激酶抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式(I)化合物及其药物组合物和制备方法，其可用作ALK抑制剂来治疗由ALK介导的疾病。本发明还涉及式(I)化合物的制备方法，以及式(I)化合物及其药物组合物在制备治疗由ALK介导的疾病的药物中的应用。

Description

一种间变性淋巴瘤激酶抑制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及新的具有蛋白激酶抑制活性的吡咯并嘧啶衍生物、其制备方法、药物组合物，还涉及这类化合物及其药物组合物在治疗与蛋白激酶有关的疾病中的用途。

背景技术

ALK(渐变性淋巴激酶)是一种受体型蛋白酪氨酸磷酸激酶，属于胰岛素受体超家族。已有报导，ALK的基因异常(易位、点基因突变或基因扩增)的结果，会导致产生与其它基因融合的异常激酶并且参与癌变。

例如，在肺癌中，ALK通过染色体的易位与细胞内骨架蛋白质EML4相结合，产生具有激活型酪胺酸激酶活性的EML4-ALK，获得癌变能力(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2004，101，13306-13311)。

另外，对通过ALK的易位而形成异常的激酶而言，在全身性间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymophoma)和炎性肌纤维母细胞瘤(inflammatorymyofibroblastic tumors)(Cancer Res.，1999，59，2776-2780)、食道癌(WorldJ.Gastroenterol，2006，12，7104-7112)中均有报导，并已明确ALK的激活型点基因突变(约10％)或基因扩增是引起神经细胞瘤的原因(Nature，2008，455，930-935)。

另外，还有报导被作为ALK配体的多效生长因子(pleiotrophin)或中期因子(midkine)(J.Biol.Chem.，2001，276，16772-16779)所活化的肿瘤。

虽然人们已经研究了大量的对蛋白激酶有抑制活性的化合物，且一些蛋白激酶抑制剂已经上市用于抗肿瘤的治疗，但是会产生耐药性。因而，有必要继续开发新的、活性更高、具有耐药性的蛋白激酶抑制剂，例如ALK激酶抑制剂，用于治疗由蛋白激酶(例如ALK)介导的癌症，如ALK阳性的非小细胞肺癌(NSCLC)等。

发明概述

本发明涉及可用作ALK抑制剂的化合物或其药学上可接受的盐，其可用于治疗由ALK介导的疾病。本发明还涉及本发明化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，涉及包含所述本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及所述本发明化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗由ALK介导的疾病的药物中的应用。

本发明还公开了利用本发明化合物或其药学上可接受的盐来治疗由ALK介导的疾病的方法。

本发明提供了如下所述的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐：

其中，

A和B各自独立地选自含有1-3个选自N、O和S的杂原子的3-8元杂环基，并且A和B可任选地各自独立地被1-3个选自R³的基团取代；

R¹、R²和R³各自独立地选自H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基和C_3-8环烷基；

R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵各自独立地选自H和C_1-6烷基；

在一些实施方式中，A和B各自独立地选自含有1-3个N原子的3-8元杂环基；

在一些实施方式中，R⁴、R⁵和R⁶均为氢；

在一些实施方式中，R⁷、R⁸和R⁹均为氢；

在一些实施方式中，R¹⁰、R¹¹、R¹²和R¹³均为H；

在一些实施方式中，R¹⁴和R¹⁵均为H；

在一些实施方式中，R¹、R²和R³各自独立地选自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基和C_3-8环烷基；优选地，R¹、R²和R³各自独立地选自C_1-6烷基和C_3-8环烷基；更优选地，R¹、R²和R³各自独立地选自C_1-6烷基；

在一些实施方式中，本发明提供以下化合物或其药学上可接受的盐：

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有本发明化合物或其药学上可接受的盐作为活性成份，以及一种或多种药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供一种调节蛋白激酶活性的方法，其中包括将所述蛋白激酶与本发明化合物或其药学上可接受的盐或它们的药物组合物接触。优选地，所述蛋白激酶选自ALK。此外，所述蛋白激酶包括突变的激酶，其中突变激酶选自突变的ALK激酶。

再者，本发明同时提供本发明化合物或其药学上可接受的盐或它们的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病是与蛋白激酶(例如ALK)活性相关的疾病，例如异常细胞增殖，其中异常细胞增殖包括癌症。

本发明还提供本发明化合物或其药学上可接受的盐或它们的药物组合物在制备用于治疗由ALK介导的疾病的药物中的应用。所述由ALK介导的疾病包括ALK阳性的非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、全身组织细胞增生症和神经母细胞瘤等，优选地包括ALK阳性的非小细胞肺癌。

另外，本发明还提供一种治疗哺乳动物(例如人)疾病的方法，其中所述疾病是与蛋白激酶(例如ALK)活性相关的，包括向人给予有效剂量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或它们的药物组合物。

发明详述

除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。

应理解，上述简述和下文的详述都是示例性的、解释性的，而不是对任何本发明主题的限制。

某些化学术语

术语“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生也可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，“任选取代的烷基”表示“未取代的烷基”或“取代的烷基”。并且，任选取代的基团可以是未取代的(例如：-CH₂CH₃)、完全取代的(例如：-CF₂CF₃)、单取代的(例如：-CH₂CH₂F)或者介于单取代和完全取代之间的任意层级(例如：-CH₂CHF₂、-CF₂CH₃、-CFHCHF₂等)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

可在参考文献(包括Carey和Sundberg，《高等有机化学》第四版，A卷(2000)和B卷(2001)，普莱南出版社(Plenum Press)，纽约)中找到对标准化学术语的定义。除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、核磁、高效液相色谱、红外和紫外/可见光谱法和药理学方法。除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和医药化学的有关术语以及实验步骤和技术是本领域已知的。可在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送、以及对患者的治疗中使用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来实施反应和进行纯化。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物。

一些在此命名的化学基团可以用简略记号表示碳原子的总个数。例如，C_1-6烷基描述了一个烷基基团，如下定义的那样，具有总共1到6个碳原子。简略记号所示碳原子总个数不包括可能的取代基上的碳原子。

本文单独或组合使用的术语“稠”或“稠环”是指两个或更多个环共享一个或更多个键的环状结构。

本文单独或组合使用的术语“螺”或“螺环”是指两个或更多个环共享一个或更多个原子的环状结构。

本文单独或作为其它组分(比如卤代烷基)的一部分使用的术语“烷基”是指任选取代的直链或任选取代的支链的一价饱和烃，其具有1-12个碳原子，优选1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子，通过单键与分子的其它部分相连，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、2-甲基己基、3甲基己基、正辛基，正壬基、正癸基等。

本文单独或作为其它成分的一部分使用的术语“烯基”是指直链或支链一价碳氢基团，其只有碳原子和氢原子，包含至少一个双键，并具有2-14个碳原子，优选2-10个碳原子，更优选2-6个碳原子。其通过单键与分子的其它部分相连，例如，乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1，4-戊二烯基等。

本文单独或作为其它成分的一部分使用的术语“炔基”是指直链或支链一价碳氢基团，其只有碳原子和氢原子，包含至少一个三键，有选择性的具有更多三键或更多双键，并具有2-14个碳原子，优选2-10个碳原子，更优选2-6个碳原子。其通过单键与分子的其它部分相连，例如，乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、1-烯4-戊炔基等。

本文单独或作为其它成分的一部分使用的术语“环烷基”是指稳定的单价非芳香单环或多环碳氢基团，只包含碳原子和氢原子，可能包括稠环、螺环或桥环系统，包含3-15个成环碳原子，优选包含3-10个成环碳原子，更优选包含3-8个成环碳原子，可饱和也可不饱和，通过单键与分子的其它部分相连。“环烷基”的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己酮基、环庚基、环辛基、1H-茚基、2，3-二氢茚基、冰片基、十氢萘基等。

本文单独或作为其它成分的一部分使用的术语“杂环基”、“杂环”是指稳定的3-18元单价非芳香环，包括2-12个碳原子，1-6个选自氮、氧和硫的杂原子。除非另作说明，杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环系统，其可能包含稠环、螺环或桥环系统，杂环基上的氮、碳或硫可选择性的被氧化，氮原子可选择性的被季铵化，杂环基可以部分或完全饱和。杂环基可以通过环上的碳原子或杂原子与分子的其余部分通过一个单键连接。包含稠环的杂环基中可以包含一个或多个芳环或杂芳环，只要与分子的其余部分连接的是非芳香环上的原子。杂环基优选的是一个稳定的4-11元单价非芳香单环或二环，其包含1-3个选自氮、氧和硫的杂原子，更优选的是一个稳定的4-8元单价非芳香单环，其包含1-3个选自氮、氧和硫的杂原子。杂环基的的非限制性实例包括氮杂环庚烷基、氮杂环丁基、十氢异喹啉基、二氢呋喃基、二氢吲哚基、二氧戊烷基、吗啉基、2-氧哌啶基、四氢异喹啉基、三噻烷基等。

除非另有指定，本发明化合物所含有的烯烃双键包括E和Z异构体。

应理解，本发明化合物可能含有不对称中心。这些不对称中心可以独立的为R或S构型。一些本发明化合物也可显示出顺-反异构现象，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。应理解，本发明化合物包括它们的单独的几何异构体和立体异构体以及它们的混合物，包括外消旋混合物。通过实施或修改已知方法，例如层析技术和重结晶技术可以从它们的混合物中分离这些异构体，或者可以由它们的中间体的合适的异构体分别制备它们。

本文所用术语“药学上可接受的盐”既包括加酸盐，也包括加碱盐。

“药学上可接受的加酸盐”是指那些保留了化合物的游离碱的生物效力和特性、在生物学上或其它方面并非不合需要、跟无机酸，例如但是不限于，氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或有机酸，例如但不限于，乙酸、2，2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙基磺酸、2-羟基乙二酸、蚁酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸酯乙醇酸，马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲基磺酸、黏酸、萘-1，5-萘二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸酒石酸，硫氰酸，对甲苯磺酸、三氟乙酸，十一烯酸等形成的盐。“药学上可接受的加碱盐”是指那些保留了化合物的游离酸的生物效力和特性、在生物学上或其它方面并非不合需要的盐。这些盐通过游离酸跟无机碱或有机碱反应制备。通过跟无机碱反应生成的盐包括，但不限于，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐、和锰盐。

形成盐的有机碱包括，但不限于，伯胺、仲胺、叔胺、取代胺(包括自然界发生的取代的胺)、环胺和基本的离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲胺乙醇、2-二甲基乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明青霉素、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、氨基葡萄糖、葡甲胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶，N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本发明的化合物或其盐可以作为活性物质单独给药，优选以其药物组合物的形式给药。

本文所用术语“药物组合物”是指混合有本发明化合物和通常在本领域被接受的用来将具有生物活性的化合物传送给哺乳动物(比如人类)的介质的制剂。这种介质包含所有药学上可接受的载体。

本文所用的跟制剂、组合物或成分相关的术语“可接受的”是指对治疗主体的总体健康没有持续的有害影响。

本文所用术语“药学上可接受的”是指不影响本发明化合物的生物活性或性质的物质(如载体或稀释剂)，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中包含的任意组分相互作用。

“药学上可接受的载体”包括但不限于已经被相关政府行政部门批准的可以被用于人类和驯养动物的佐剂、载体、赋形剂、助剂、脱臭剂、稀释剂、保鲜剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂和润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、或乳化剂。

本发明的药物组合物可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等等。

给予本发明化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选的给药途径是口服给药。

本发明的药物组合物可以采用本领域周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。

在优选的实施方案中，药物组合物是口服形式。对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合，来配制该药物组合物。这些载体能使本发明的化合物被配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、浆剂、悬浮剂等，用于对患者的口服给药。

可以通过常规的混合、填充或压片方法来制备固体口服药物组合物。例如，可通过下述方法获得：将所述的活性化合物与固体赋形剂混合，任选地碾磨所得的混合物，如果需要则加入其它合适的辅剂，然后将该混合物加工成颗粒，得到了片剂或糖衣剂的核心。适合的辅料包括但不限于：粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、甜味剂或矫味剂等。如微晶纤维素、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊；滑石、淀粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸；乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇或磷酸二钙；二氧化硅；交联羧甲基纤维素钠、预交化淀粉、淀粉羟乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、甲基纤维素、琼脂、羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮等。可以根据通常药物实践中公知的方法任选地对糖衣剂的核心进行包衣，尤其使用肠溶包衣。

药物组合物还可适用于肠胃外给药，如合适的单位剂型的无菌溶液剂、混悬剂或冻干产品。能够使用适当的赋形剂，例如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。

具体实施方式

以下结合实施例示例性阐述本发明的化合物及其制备方法和用途。流程1.：

可按照流程1所述路线制备本发明所示化合物。流程1中反应所得的产物可以通过传统分离技术来得到，这种传统技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱分离等。起始原料可以通过自己合成或从商业机构(例如，但不限于，Adrich或Sigma)购买获得。这些原料可以使用常规手段进行表征，比如物理常数和光谱数据。本发明所描述的化合物可以使用合成方法得到单一的异构体或者是异构体的混合物。

在流程1中，原料1与PMBC1在碱性条件下反应得到被保护的中间体2，再与化合物3进行取代反应得到中间体4，再与化合物5进行钯催化耦合反应生成中间体6，最后脱保护得到产物7。化合物5和化合物3可根据已知文献(如：WO2012092880A1)中的方法来合成。

实施例

除非另有说明，温度是摄氏温度。试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司，阿法埃莎(Alfa Aesar)，或北京百灵威科技有限公司等商业供应商，并且这些试剂可直接使用无需进一步纯化，除非另有说明。

除非另有说明，下列反应在室温、无水溶剂中、氮气或氩气的正压下或使用干燥管进行；反应瓶上装有橡胶隔膜，以便通过注射器加入底物和试剂；玻璃器皿烘干和/或加热干燥。

除非另有说明，柱色谱纯化使用青岛海洋化工厂的200-300目硅胶；制备薄层色谱使用烟台市化学工业研究所生产的薄层色谱硅胶预制板(HSGF254)；MS的测定用ThermoLCQ Fleet型(ESI)液相色谱-质谱联用仪；旋光测定使用SGW-3自动旋光仪，上海申光仪器仪表有限公司。

核磁数据(¹H NMR)使用Varian设备于400MHz运行。核磁数据使用的溶剂有CDCl₃、CD₃OD、D₂O、DMSO-d6等，以四甲基硅烷(0.00ppm)为基准或以残留溶剂为基准(CDCl₃：7.26ppm；CD₃OD：3.31ppm； D₂O：4.79ppm；d6-DMSO：2.50ppm)。当标明峰形多样性时，以下简写表示不同峰形：s(单峰)、d(双重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)、dd(双双重峰)、dt(双三重峰)。如果给出了耦合常数，则以Hertz(Hz)为单位。

缩略语：

TFA：三氟乙酸

TFE：三氟乙醇

EM：乙二醇单甲醚

Pd₂(dba)₃：三(二亚苄基丙酮)二钯

BINAP：(±)-2，2′-双-(二苯膦基)-1，1′-联萘

Toluene：甲苯

Cs₂CO₃：碳酸铯

i-PrOH：异丙醇

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

PMB：4-甲氧基苄基

h：小时

DCM：二氯甲烷

MeOH：甲醇

实施例1.

步骤A：2，4-二氯-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶

室温(30℃)搅拌下向2，4-二氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(18.8g，0.1mol)、碳酸钾(20.7g，0.15mol)的DMF(188mL)溶液中滴加4-甲氧基苄氯(18.8g，0.12mol)，滴加完毕后，加热至50～55℃，并在该温度搅拌17h。冷却至室温，过滤，向滤液中加入水(564mL)和乙酸乙酯(188mL)。水相分离，用乙酸乙酯(100mL)萃取一次，萃取液与有机相合并，用饱和食盐水(400mL X 2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得深色油状物。该油状物用乙酸乙酯(30mL)打浆，过滤，滤饼用乙酸乙酯(20mL)及石油醚(100mL)淋洗，然后室温晾干得到浅黄色固体产品2，4-二氯-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(16.57g，53.8％)。

Massenspektrum(ESI⁺)：m/z＝308[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)：7.19(2H，d，J＝8.8Hz)，7.14(1H，d，J＝3.6Hz)，6.87(2H，d，J＝8.8Hz)，6.58(1H，d，J＝3.6Hz)，5.34(2H，s)，3.79(3H，s)。

步骤B：4-氯-N-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-胺

将2，4-二氯-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(10.0g，32.5mmol)、2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯胺四盐酸盐(12.2g，27.1mmol)、TFA(3.1g，27.1mmol)、TFE(83mL)及乙二醇单甲醚(167mL)加入到500mL的三口烧瓶中，升温至回流(110℃)搅拌72h。减压浓缩除去溶剂，残留物用甲醇(350mL)和水(650mL)溶解，得到的溶液用乙酸乙酯(400mL X 2)洗涤，加入固体碳酸钠至pH＝9。用DCM(300mL X 2)萃取，萃取液合并，用饱和食盐水(500mL X 3)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得黑色油状物，用乙醇(200mL)打浆(16h)，过滤，滤饼用乙醇(50mL)淋洗，室温自然晾干得灰白色固体产品4-氯-N-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-胺(8.54g，54.7％)。

Massenspektrum(ESI⁺)：m/z＝576[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)：7.85(1H，d，J＝7.6Hz)，7.16(2H，d，J＝8.8Hz)，7.09(1H，s)，6.84(2H，d，J＝8.8Hz)，6.72(1H，d，J＝3.6Hz)，6.54-6.58(2H，m)，5.94(1H，d，J＝3.6Hz)，5.25(2H，s)，3.83(3H，s)，3.78(3H，s)，3.70-3.74(2H，m)，2.74(2H，td，J＝12.0Hz，2.0Hz)，2.57-2.71(4H，m)，2.35-2.56(5H，m)，2.30(3H，s)，1.94-1.97(2H，m)，1.65-1.75(2H，m)。

步骤C：N-异丙基-2-((2-((2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯磺酰胺

将4-氯-N-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-胺(7.49g，13.0mmol)、2-氨基-N-异丙基苯磺酰胺(4.18g，19.5mmol)、BINAP(0.81g，1.3mmol)、碳酸铯(12.7g，39.0mmol)及甲苯(150mL)加入到500mL的三口烧瓶中，氮气置换体系空气三次，氮气保护下加入Pd2(dba)3(0.6g，0.65mmol)，回流29h。冷却至室温，过滤，减压浓缩除去甲苯，残留物用DCM(200mL)溶解，饱和食盐水(200mL X 3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得深棕色油状物，该油状物用乙酸乙酯(100mL)打浆(2h)，过滤，滤饼用乙酸乙酯(20mL)和石油醚(100mL)淋洗，室温晾干得浅黄色固体产品N-异丙基-2-((2-((2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯磺酰胺(5.6g，57.1％)。

Massenspektrum(ESI⁺)：m/z＝754[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d₃)：8.61(1H，d，J＝8.0Hz)，8.38(1H，s)，8.12(1H，d，J＝8.8Hz)，7.92(1H，d，J＝8.0Hz)，7.49(1H，td，J＝8.8Hz，1.6Hz)，7.19(2H，d，J＝8.4Hz)，7.08(1H，s)，7.06(1H，t，J＝8.8Hz)，6.83(2H，d，J＝8.8Hz)，6.72(1H，d，J＝3.6Hz)，6.56(1H，d，J＝2.8Hz)，6.51(1H，dd，J＝8.8Hz，2.8Hz)，6.16(1H，d，J＝3.6Hz)，5.21(2H，s)，4.89(1H，d，J＝7.6Hz)，3.88(3H，S)，3.78(3H，s)，3.68-3.71(1H，m)，3.33-3.41(1H，m)，2.61-2.80(6H，m)，2.36-2.55(5H，m)，2.32(3H，s)，1.95-1.99(2H，m)，1.67-1.77(2H，m)，0.94(6H，d，J＝6.8Hz)。

步骤D：N-异丙基-2-((2-((2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯磺酰胺

将N-异丙基-2-((2-((2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-7-(4-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯磺酰胺(5.0g，6.63mmol)和4N盐酸(150mL)加入到500mL的三口烧瓶中，加热至95℃搅拌24h。冷却至室温，加入2N氢氧化钠至pH＝10，用DCM(200mL X 3)萃取，萃取液合并，饱和食盐水(200mL X 3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得黄色泡沫状固体，柱层析纯化(DCM∶MeOH＝10∶1)得浅黄色固体产品N-异丙基-2-((2-((2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)苯磺酰胺(1.0g，23.9％)。

Massenspektrum(ESI⁺)：m/z＝634[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：11.33(1H，s)，9.22(1H，s)，8.80(1H，d，J＝8.4Hz)，7.98(1H，d，J＝7.2Hz)，7.86(1H，d，J＝8.8Hz)，7.82(1H，dd，J＝8.0Hz，2.0Hz)，7.54(1H，t，J＝8.4Hz)，7.44(1H，s)，7.15(1H，t，J＝8.4Hz)，6.96-6.98(1H，m)，6.62(1H，d，J＝2.4Hz)，6.47(1H，dd，J＝8.8Hz，2.4Hz)，6.22-6.24(1H，m)，3.80(3H，s)，3.65-3.68(2H，m)，3.25-3.33(1H，m)，2.60-2.66(2H，m)，2.41-2.50(4H，m)，2.23-2.38(5H，m)，2.15(3H，s)，1.84-1.87(2H，m)，1.48-1.58(2H，m)，0.94(6H，d，J＝6.4Hz)。

生物活性实验

1.化合物的体外酶学活性测定：

采取Cisbio公司的匀相时间分辨荧光(HTRF)方法建立了ALK kinase domain(ALK(KD))及其突变体的激酶活性检测平台，进行化合物活性的测定。

HTRF是基于Eu螯和物的供体与受体(第二荧光标记物)之间的荧光共振能量转移的一项技术。供体被外来光源激发，如果它与受体比较接近，可以将能量共振转移到受体上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。本实验中，Biotin标记的TK Substrate被激酶磷酸化以后，将会被Eu标记的抗体所识别，此时Streptavidin-XL665通过与Biotin的相互作用使得Eu与XL665相互靠近，当Eu被激发后(320nM)，其能量会共振转移到XL665上并使后者激发产生特定波长)的激发光(665nM)。当小分子抑制剂对酶活产生抑制作用时，磷酸化产物减少，最终导致665nM处荧光信号的减弱。

具体实验操作如下：将化合物分别从100μM或10μM开始用DMSO进行3倍的梯度稀释，每个浓度取4μL加入到96μL的反应缓冲液中(50mM HEPES(pH7.5)，0.01％BSA，0.1mMNaVO3，0.001％TWEEN-20，5mM MnC12，50nM SEB，1mM DTT)，取2.5μL加入到384孔板(OptiPlate-384，PerkinElmer)，然后加入5μL的激酶(浓度为4nM)，离心混匀，再加入5μL的ATP(0.8μM(WT，L1196M，R1275Q)；0.2μM(F1174L，G1269S))和TK Substrate-biotin(4μM)启动反应。将384孔板放于孵育箱中23℃反应1小时后，加入5μL的50倍稀释的Eu3+-Cryptate标记的TK-Antibody，5μL的streptavidin-XL665(500nM)进行检测。在23℃反应1小时后，在Envision(PerkinElmer)上读取荧光值。化合物的IC₅₀值使用GraphPad Prism 5.0软件计算得到。

2.化合物的细胞增殖活性测定：

(1)采用Promega公司的

检测试剂建立了悬浮细胞增殖抑制筛选方法。

人血癌细胞Karpas299用补充有10％胎牛血清

的RPMI-1640

培养基进行培养，培养条件是37℃，95％空气和5％的CO₂，培养于25cm²或75cm²塑料组织培养瓶

中，一周传代培养2～3次。

将细胞以4×10³细胞/孔的密度接种在96-孔细胞培养板

中，195μl/孔，并在37℃，95％空气和5％的CO₂中进行培养。24小时后加入待测化合物：将化合物从10mM(溶于DMSO中)开始用DMSO进行3倍梯度稀释，每个浓度取4μl加入到96μl的无血清培养基中，最后取5μl培养基稀释后的化合物加入到接种有细胞的培养板中。细胞培养液中DMSO的终浓度为0.1％，所试化合物的终浓度是0.3nM～10μM。将上述细胞37℃温育3天。

3天后，通过CellTiter-Blue试剂盒进行细胞活力测定，最后通过Prism程序计算化合物对细胞增殖的半抑制浓度，即IC₅₀值。

(2)采用Promega公司的

检测试剂建立了贴壁细胞增殖抑制筛选方法。

人非小细胞肺癌细胞NCI-H2228用补充有10％胎牛血清

的RPMI-1640

培养基进行培养，培养条件是37℃，95％空气和5％的CO₂，培养于25cm²或75cm²塑料组织培养瓶

中，一周传代培养2～3次。

将细胞以3×10³细胞/孔的密度接种在96-孔白色细胞培养板

中，195μl/孔，并在37℃，95％空气和5％的CO₂中进行培养。24小时后加入待测化合物：将化合物从10mM(溶于DMSO中)开始用DMSO进行3倍梯度稀释，每个浓度取4μl加入到96μl的无血清培养基中，最后取5μl培养基稀释后的化合物加入到接种有细胞的培养板中。细胞培养液中DMSO的终浓度为0.1％，所试化合物的终浓度是0.3nM～10μM。将上述细胞37℃温育3天。

3天后，通过CellTiter-Glo试剂盒进行细胞活力测定，最后通过Prism程序计算化合物对细胞增殖的半抑制浓度，即IC₅₀值。

表一.化合物对ALK及其突变体的活性抑制作用

实施例1化合物能够显著抑制ALK的激酶活性，显著强于参照化合物Crizotinib.同时。与Crizotinib不同的是，实施例1化合物对四种ALK激酶区突变体的激酶活性都具有非常强的抑制作用，这意味着实施例1化合物不仅可以作为ALK融合肿瘤病人的一线用药，还有可能作为第二代ALK抑制剂，用于治疗Crizotinib耐药的病人的治疗。

表二.细胞增殖实验数据

实施例1化合物能够显著抑制ALK融合细胞的增殖，其有效半抑制剂浓度(IC₅₀)显著低于参照化合物Crizotinib。

Claims (5)

1.以下化合物或其药学上可接受的盐：

2.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成份，以及一种或多种药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗与蛋白激酶相关疾病的药物中的用途。

4.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗由ALK介导的疾病的药物中的用途。

5.权利要求4所述的用途，其中所述的ALK介导的疾病包括ALK阳性的非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、全身组织细胞增生症和神经母细胞瘤。