CN107927353A - 一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂及其制备方法和应用，所述乳酸菌菌剂包括乳酸菌和绿狐尾藻汁液，乳酸菌菌剂中乳酸菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g，乳酸菌选自乳酸乳球菌、植物乳杆菌或乳酸乳球菌和植物乳杆菌混合而成的复合菌剂。本发明利用绿狐尾藻的汁液进行乳酸菌的培养驯化，再将此乳酸菌菌剂用于狐尾藻的青贮发酵，制备绿狐尾藻青贮饲料。本发明的乳酸菌菌剂能降低绿狐尾藻青贮饲料的pH值、丁酸含量以及中性洗涤纤维含量，而粗蛋白含量和生成乳酸的含量都有增多，可以改善绿狐尾藻青贮饲料的发酵品质和营养价值，对于绿狐尾藻实现资源化利用及其在养殖生产中推广应用提供数据参考。

Description

一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及青贮饲料加工技术领域，具体涉及一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
近些年我国养殖业发展迅猛，饲料资源存在“三缺一不足”的现状，尤其蛋白质饲料原料严重缺乏，到2025年，我国饲料消费量将达到2.5亿吨，占粮食总消费的42％以上。但目前，我国蛋白质饲料自给率不足50％，其中鱼粉和大豆的70-80％依赖进口，饲用玉米的进口也在逐年增加【王守伟.我国肉类产业发展现状与趋势[J].北方牧业,2017(10):10-10；吴诗樵,章世元,戚如鑫.我国青绿饲料生产与应用的研究进展[J].饲料广角,2016(12):48-51.】。
绿狐尾藻(Myriophyllum quaticum)在畜禽养殖废水尾水净化以及富营养化湖泊的生态修复中应用较为广泛【Zhang S,Liu F,Xiao R,et al.Nitrogen removal inMyriophyllum aquaticum wetland microcosms for swine wastewater treatment:15N‐labelled nitrogen mass balance analysis[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2017,97(2):1511-20.】，具有适应性强、生物量积累较快和耐污染能力较强等特点【Zhang H,Xu G,Zeng Z,et al.Nitrogen removal of a Myriophyllumelatinoides purification system for treating piggery wastewater in karstregion[C]//International Conference on Sustainable Energy and EnvironmentEngineering.2016；张树楠.绿狐尾藻湿地对养殖废水氮去除效应及其机理研究[D].中国科学院大学,2016；Liu F,Zhang S,Wang Y,et al.Nitrogen removal and mass balancein newly-formed Myriophyllum aquaticum mesocosm during a single 28-dayincubation with swine wastewater treatment[J].Journal of EnvironmentalManagement,2016,166:596-604.】。绿狐尾藻对水环境中氮的吸收能力强，在富含氮磷的水体中生长迅速【何洋.绿狐尾藻对养猪废水氮磷的吸收及收割管理模式研究[D].中国科学院大学,2016.】，因此绿狐尾藻的蛋白质含量较高且氨基酸组成比较均衡，矿物质种类多且含量高，并含有丰富的维生素和必需脂肪酸【孙婉婧,杨颖姿,罗晶晶,等.绿狐尾藻生物学特性及其在养殖业中的应用[J].饲料研究,2017(15).】。
青贮饲料是家畜家禽在冬、春两季蛋白质、维生素、矿物质的重要来源，它可以提高家畜的繁殖率和泌乳力，并促进幼畜的生长发育，是饲养家畜不可缺少的基础饲料。在冬季漫长的我国北方，天气寒冷，季节性强，生长期短，青割饲料生产受到限制，青贮饲料是提供冬季多汁饲料的最理想方式，也是灾年饲料短缺时的理想储备饲料。
目前以农作物秸秆为青贮原料的青贮饲料，其规模化的生产主要是添加酵母菌来进行青贮原料的发酵，这种发酵方法时间长，通常需要2-3个月，得到的青贮饲料蛋白含量低，其质量百分含量仅为4％左右，纤维素基本无降解，香味较淡，家畜食用后消化率低，且青贮原料的利用率低。而绿狐尾藻蛋白含量丰富，粗蛋白为22.4％，远高于目前常用的玉米(9.4％)、小麦(13.4％)、米糠(12.8％)等饲料原料。
将绿狐尾藻加工为优质的青贮饲料，既能解决绿狐尾藻净化畜禽养殖废水后资源化利用的难题，又能补充畜禽养殖中蛋白质及纤维素源饲料的不足，产生畜禽养殖废水净化修复与畜禽养殖成本降低的生态与经济双重效益。本发明采用不同种的乳酸菌添加剂，将绿狐尾藻加工调制成青贮饲料，以解决绿狐尾藻饲料化利用过程中的含水量高、适口性较差的问题，最终为绿狐尾藻净化养殖废水、青贮饲料加工、畜禽养殖的水牧循环的生产生态模式的建立提供基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂及其制备方法和应用，该乳酸菌菌剂包括乳酸菌和绿狐尾藻汁液，将其应用在绿狐尾藻青贮饲料的制备中，能够改善绿狐尾藻的青贮品质，提高绿狐尾藻青贮饲料的性能，并且该乳酸菌菌剂的制备方法简单易行，在绿狐尾藻的资源化利用领域具有广泛的应用前景。
基于上述目的，本发明提供的一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂，包括乳酸菌和绿狐尾藻汁液，所述乳酸菌菌剂中乳酸菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g，所述乳酸菌选自乳酸乳球菌、植物乳杆菌或乳酸乳球菌和植物乳杆菌混合而成的复合菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述绿狐尾藻汁液采用以下方法制备得到：将绿狐尾藻压榨得到液体，液体离心取上清液，即得。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂由乳酸乳球菌和植物乳杆菌菌体数以(0.5～2):1比例混合而成。
进一步的，本发明还提供了所述的乳酸菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将乳酸乳球菌和植物乳杆菌分别接种在液体培养基中进行培养，得到乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液，然后将乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液分别接种到新的液体培养基中进行扩大培养，获得乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液；
(2)乳酸菌菌剂的制备
将乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液分别接种到绿狐尾藻汁液培养基中进行培养，获得乳酸乳球菌的液体菌剂和植物乳杆菌的液体菌剂；或者，
将乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液进行混合后获得混合培养液，再将混合培养液接种到绿狐尾藻汁液培养基中进行培养，获得复合液体菌剂。
在微生物菌种资源中，每个菌种都有上百甚至上千个性能不同的亚种。根据微生物对生境的特异性和适应性原理，利用绿狐尾藻的汁液进行乳酸菌的培养驯化，再将此乳酸菌菌剂用于狐尾藻的青贮发酵，乳酸菌能更迅速地在狐尾藻青贮中定植，形成优势菌群。因此选用可以适应狐尾藻培养基的乳酸菌，制备狐尾藻专属的乳酸菌菌剂，是狐尾藻青贮成功并提高青贮饲料品质的重要保证。
本发明从众多的乳酸菌菌株中筛选出了对绿狐尾藻有较好的专属特异性和较高适应性的乳酸乳球菌和植物乳杆菌，本发明选用的乳酸乳球菌和植物乳杆菌属于同型发酵型乳酸菌，这类乳酸菌可以产生挥发性脂肪酸以抑制霉菌和酵母菌的活动。本发明的乳酸菌菌剂作为青贮饲料的添加剂可以改善青贮原料的青贮品质，提高动物对饲料的消化利用率，同时可以减少青贮所需的时间。
在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，所述培养为在36～38℃下培养24～36h，将乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液分别以0.5％～1.5％的比例接种到新的液体培养基中进行扩大培养，所述扩大培养为在36～38℃下培养18～24h。
在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，所述液体培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基的成分为：9.0～11.0g蛋白胨，9.0～11.0g牛肉浸膏，4.0～6.0g酵母粉，19.0～21.0g葡萄糖，4.0～6.0g乙酸钠，0.5～1.5g吐温-80，0.05～0.15g硫酸镁，0.01～0.08g硫酸锰，1.0～3.0g柠檬酸氢二铵，1.0～3.0g磷酸氢二钾，蒸馏水1000mL。
在本发明的一些实施例中，在步骤(2)中，将乳酸乳球菌培养液、植物乳杆菌培养液和混合培养液分别以0.5％～1.5％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中进行培养，所述培养为在36～38℃下培养18～24h；绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，19.0～21.0g/L葡萄糖；绿狐尾藻汁液采用以下方法制备得到：将绿狐尾藻压榨得到液体，在转速为3000～5000r/min的条件下离心4～6min，取上清液即得。
本发明以绿狐尾藻作为研究材料，探讨添加乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(LL)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(LP)和Lactococcus lactis和Lactobacillus plantarum复合菌剂(FH)三种乳酸菌菌剂对绿狐尾藻青贮发酵品质和绿狐尾藻青贮饲料的化学成分的影响。试验设4个处理组：即对照组(ck)，Lactococcus lactis菌剂组(LL)，Lactobacillus plantarum菌剂组(LP)，Lactococcus lactis和Lactobacillus plantarum复合菌剂组(FH)；在青贮第1，3，7，15，30天取样分析发酵品质和绿狐尾藻青贮饲料的化学成分。研究结果表明：与对照相比，添加菌剂可以显著降低绿狐尾藻青贮的pH值和丁酸含量(P<0.05)，显著提高乳酸含量及乳酸占总酸的比值(P<0.05)，降低乙酸和丙酸含量，提高粗蛋白含量(P<0.05)，降低中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量(P<0.05)；综上所述，乳酸菌菌剂可以改善绿狐尾藻的青贮品质、营养价值以及消化利用率。
因此，更进一步的，本发明还提供了所述的乳酸菌菌剂在制备绿狐尾藻青贮饲料中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述乳酸菌菌剂的应用方法为：将绿狐尾藻刈割后，晾干绿狐尾藻表面的水分，切短至2～3cm，获得青贮原料；将乳酸菌菌剂均匀的喷洒在青贮原料上，翻拌乳酸菌菌剂和绿狐尾藻以使乳酸菌菌剂与原料混合均匀；最后将青贮原料进行厌氧发酵，获得绿狐尾藻青贮饲料。
在本发明的一些实施例中，所述乳酸菌菌剂的用量为：每克青贮原料中含有1×106～4×106CFU的乳酸菌，所述青贮原料的含水量为75％～80％，所述厌氧发酵为在20～30℃下发酵15～30天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的乳酸菌菌剂可以提高蛋白含量，降低纤维素含量，提高了绿狐尾藻青贮饲料的营养价值和适口性；同时本发明的乳酸菌菌剂能够改善绿狐尾藻青贮饲料的发酵品质，并且可以抑制青贮饲料中霉菌等真菌的生长，提高了有氧稳定性，从而有利于延长绿狐尾藻青贮饲料的保存期限，为其大规模生产应用提供保障。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，下面实施例中所使用的乳酸乳球菌和植物乳杆菌均采用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种，其中乳酸乳球菌的编号是CGMCCNo.1.2470，植物乳杆菌的编号是CGMCC No.2869.X。
实施例1乳酸乳球菌菌剂的制备
在本实施例中，乳酸菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将乳酸乳球菌接种在MRS液体培养基中，37℃下培养30h，得到乳酸乳球菌菌液，然后将乳酸乳球菌菌液以1％的比例接种到新的MRS液体培养基中，37℃下扩大培养20h，获得乳酸乳球菌培养液；
所述的MRS液体培养基的成分为：10.0g蛋白胨，10.0g牛肉浸膏，5.0g酵母粉，20.0g葡萄糖，5.0g乙酸钠，1.0g吐温-80，0.1g硫酸镁，0.05g硫酸锰，2.0g柠檬酸氢二铵，2.0g磷酸氢二钾，1000mL，灭菌备用。
(2)乳酸乳球菌菌剂的制备
将获得的乳酸乳球菌培养液以1％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中，37℃下培养20h，获得乳酸乳球菌的液体菌剂，液体菌剂中乳酸乳球菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g；
所述的绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，20.0g/L葡萄糖，例如，500mL绿狐尾藻汁液与500mL灭菌蒸馏水混合后，加入20.0g葡萄糖制成绿狐尾藻汁液培养基；所述绿狐尾藻汁液为绿狐尾藻压榨得到的液体，液体在转速为4000r/min的条件下离心5min，取上清液所得。
实施例2乳酸乳球菌菌剂的制备
在本实施例中，乳酸菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将乳酸乳球菌接种在MRS液体培养基中，37℃下培养26h，得到乳酸乳球菌菌液，然后将乳酸乳球菌菌液以1.5％的比例接种到新的MRS液体培养基中，37℃下扩大培养24h，获得乳酸乳球菌培养液；
所述的MRS液体培养基的成分为：11.0g蛋白胨，11.0g牛肉浸膏，6.0g酵母粉，21.0g葡萄糖，6.0g乙酸钠，1.5g吐温-80，0.15g硫酸镁，0.08g硫酸锰，3.0g柠檬酸氢二铵，3.0g磷酸氢二钾，1000mL，灭菌备用。
(2)乳酸乳球菌菌剂的制备
将获得的乳酸乳球菌培养液以1.5％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中，37℃下培养24h，获得乳酸乳球菌的液体菌剂，液体菌剂中乳酸乳球菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g；
所述的绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，21.0g/L葡萄糖，例如，500mL绿狐尾藻汁液与500mL灭菌蒸馏水混合后，加入21.0g葡萄糖制成绿狐尾藻汁液培养基；所述绿狐尾藻汁液为绿狐尾藻压榨得到的液体，液体在转速为5000r/min的条件下离心4min，取上清液所得。
实施例3植物乳杆菌菌剂的制备
在本实施例中，植物乳杆菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将植物乳杆菌接种在MRS液体培养基中，37℃下培养30h，得到植物乳杆菌菌液，然后将植物乳杆菌菌液以1％的比例接种到新的MRS液体培养基中，37℃下扩大培养20h，获得植物乳杆菌培养液；
所述的MRS液体培养基的成分为：10.0g蛋白胨，10.0g牛肉浸膏，5.0g酵母粉，20.0g葡萄糖，5.0g乙酸钠，1.0g吐温-80，0.1g硫酸镁，0.05g硫酸锰，2.0g柠檬酸氢二铵，2.0g磷酸氢二钾，1000mL，灭菌备用。
(2)植物乳杆菌菌剂的制备
将获得的植物乳杆菌培养液以1％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中，37℃下培养20h，获得植物乳杆菌的液体菌剂，液体菌剂中植物乳杆菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g；
所述的绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，20.0g/L葡萄糖，例如，500mL绿狐尾藻汁液与500mL灭菌蒸馏水混合后，加入20.0g葡萄糖制成绿狐尾藻汁液培养基；所述绿狐尾藻汁液为绿狐尾藻压榨得到的液体，液体在转速为4000r/min的条件下离心5min，取上清液所得。
实施例4植物乳杆菌菌剂的制备
在本实施例中，植物乳杆菌菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将植物乳杆菌接种在MRS液体培养基中，38℃下培养24h，得到植物乳杆菌菌液，然后将植物乳杆菌菌液以0.5％的比例接种到新的MRS液体培养基中，38℃下扩大培养18h，获得植物乳杆菌培养液；
所述的MRS液体培养基的成分为：9.0g蛋白胨，9.0g牛肉浸膏，4.0g酵母粉，19.0g葡萄糖，4.0g乙酸钠，0.5g吐温-80，0.05g硫酸镁，0.01g硫酸锰，1.0g柠檬酸氢二铵，1.0g磷酸氢二钾，1000mL，灭菌备用。
(2)植物乳杆菌菌剂的制备
将获得的植物乳杆菌培养液以0.5％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中，38℃下培养18h，获得植物乳杆菌的液体菌剂，液体菌剂中植物乳杆菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g；
所述的绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，19.0g/L葡萄糖，例如，500mL绿狐尾藻汁液与500mL灭菌蒸馏水混合后，加入19.0g葡萄糖制成绿狐尾藻汁液培养基；所述绿狐尾藻汁液为绿狐尾藻压榨得到的液体，液体在转速为3000r/min的条件下离心6min，取上清液所得。
实施例5乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂的制备
在本实施例中，乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将乳酸乳球菌和植物乳杆菌分别接种在MRS液体培养基中，37℃下培养30h，分别得到乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液，然后将乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液分别以1％的比例接种到新的MRS液体培养基中，37℃下扩大培养20h，分别获得乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液；
所述的MRS液体培养基的成分为：10.0g蛋白胨，10.0g牛肉浸膏，5.0g酵母粉，20.0g葡萄糖，5.0g乙酸钠，1.0g吐温-80，0.1g硫酸镁，0.05g硫酸锰，2.0g柠檬酸氢二铵，2.0g磷酸氢二钾，1000mL，灭菌备用。
(2)复合菌剂的制备
将获得的乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液以体积比1:1的比例进行混合后获得混合培养液，将混合培养液以1％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中，37℃下培养20h，获得复合液体菌剂，复合液体菌剂中乳酸乳球菌和植物乳杆菌的含量均为1.7×107～8.4×107CFU/g；
所述的绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，20.0g/L葡萄糖，例如，500mL绿狐尾藻汁液与500mL灭菌蒸馏水混合后，加入20.0g葡萄糖制成绿狐尾藻汁液培养基；所述绿狐尾藻汁液为绿狐尾藻压榨得到的液体，液体在转速为4000r/min的条件下离心5min，取上清液所得。
实施例6乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂的制备
在本实施例中，乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将乳酸乳球菌和植物乳杆菌分别接种在MRS液体培养基中，36℃下培养36h，分别得到乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液，然后将乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液分别以0.8％的比例接种到新的MRS液体培养基中，36℃下扩大培养24h，分别获得乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液；
所述的MRS液体培养基的成分为：10.5g蛋白胨，10.3g牛肉浸膏，5.5g酵母粉，20.8g葡萄糖，5.3g乙酸钠，1.2g吐温-80，0.12g硫酸镁，0.04g硫酸锰，2.5g柠檬酸氢二铵，2.3g磷酸氢二钾，1000mL，灭菌备用。
(2)复合菌剂的制备
将获得的乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液以体积比1.5:1的比例进行混合后获得混合培养液，将混合培养液以0.8％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中，36℃下培养24h，获得复合液体菌剂，复合液体菌剂中乳酸乳球菌和植物乳杆菌的含量均为1.7×107～8.4×107CFU/g；
所述的绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，19.3g/L葡萄糖，例如，500mL绿狐尾藻汁液与500mL灭菌蒸馏水混合后，加入19.3g葡萄糖制成绿狐尾藻汁液培养基；所述绿狐尾藻汁液为绿狐尾藻压榨得到的液体，液体在转速为4500r/min的条件下离心5min，取上清液所得。
实施例7绿狐尾藻青贮饲料的制备
在本实施例中，将实施例1制备的乳酸乳球菌菌剂用于绿狐尾藻青贮饲料的制备，所述乳酸乳球菌菌剂的应用方法为：
将长沙市长沙县亚热带研究所试验站的绿狐尾藻生态沟渠及生态湿地中的绿狐尾藻刈割后，晾干绿狐尾藻表面的水分，控制含水量在75％～80％，切短至2～3cm，并保证原料清洁、无霉烂变质，获得青贮原料；将稀释后的乳酸乳球菌菌剂均匀的喷洒在青贮原料上，使乳酸乳球菌菌剂与青贮原料混合均匀，每克青贮原料中含有1×106～4×106CFU的乳酸乳球菌；最后将青贮原料装填在密封的玻璃罐中压实密封，压实过程注意青贮罐的边角以及四周，确保充分压实，且压实过程在刈割当日内完成；压实后将发酵罐的密封盖盖严，进行厌氧发酵，在室温条件20～30℃下发酵15～30天，获得绿狐尾藻青贮饲料；
其中，新鲜的绿狐尾藻含水量在85％～93％之间，不易长期保存且容易腐败变质，青贮原料水分含量过高会使青贮失败，难以发酵，而水分含量过低会使乳酸菌活动受到抑制，影响青贮饲料的发酵品质。因此，本实施例将绿狐尾藻的含水量控制在75％～80％间进行青贮；同时添加乳酸菌菌剂，增加绿狐尾藻表面的乳酸菌数量，使发酵得以快速进行，pH值快速下降，产生更多的乳酸，有利于抑制粗蛋白的降解，减少饲料中的蛋白质分解率，可以被动物直接消化吸收。
实施例8绿狐尾藻青贮饲料的制备
在本实施例中，将实施例3制备的植物乳杆菌菌剂用于绿狐尾藻青贮饲料的制备，所述植物乳杆菌菌剂的应用方法为：
将长沙市长沙县亚热带研究所试验站的绿狐尾藻生态沟渠及生态湿地中的绿狐尾藻刈割后，晾干绿狐尾藻表面的水分，控制含水量在75％～80％，切短至2～3cm，并保证原料清洁、无霉烂变质，获得青贮原料；将稀释后的植物乳杆菌菌剂均匀的喷洒在青贮原料上，使植物乳杆菌菌剂与青贮原料混合均匀，每克青贮原料中含有1×106～4×106CFU的植物乳杆菌；最后将青贮原料装填在密封的玻璃罐中压实密封，压实过程注意青贮罐的边角以及四周，确保充分压实，且压实过程在刈割当日内完成；压实后将发酵罐的密封盖盖严，进行厌氧发酵，在室温条件20～30℃下发酵15～30天，获得绿狐尾藻青贮饲料；
其中，新鲜的绿狐尾藻含水量在85％～93％之间，不易长期保存且容易腐败变质，青贮原料水分含量过高会使青贮失败，难以发酵，而水分含量过低会使乳酸菌活动受到抑制，影响青贮饲料的发酵品质。因此，本实施例将绿狐尾藻的含水量控制在75％～80％间进行青贮；同时添加乳酸菌菌剂，增加绿狐尾藻表面的乳酸菌数量，使发酵得以快速进行，pH值快速下降，产生更多的乳酸，有利于抑制粗蛋白的降解，减少饲料中的蛋白质分解率，可以被动物直接消化吸收。
实施例9绿狐尾藻青贮饲料的制备
在本实施例中，将实施例5制备的乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂用于绿狐尾藻青贮饲料的制备，所述乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂的应用方法为：
将长沙市长沙县亚热带研究所试验站的绿狐尾藻生态沟渠及生态湿地中的绿狐尾藻刈割后，晾干绿狐尾藻表面的水分，控制含水量在75％～80％，切短至2～3cm，并保证原料清洁、无霉烂变质，获得青贮原料；将稀释后的乳酸乳球菌与植物乳杆菌复合菌剂均匀的喷洒在青贮原料上，使复合菌剂与青贮原料混合均匀，每克青贮原料中含有1×106～4×106CFU的乳酸乳球菌与植物乳杆菌；最后将青贮原料装填在密封的玻璃罐中压实密封，压实过程注意青贮罐的边角以及四周，确保充分压实，且压实过程在刈割当日内完成；压实后将发酵罐的密封盖盖严，进行厌氧发酵，在室温条件20～30℃下发酵15～30天，获得绿狐尾藻青贮饲料；
其中，新鲜的绿狐尾藻含水量在85％～93％之间，不易长期保存且容易腐败变质，青贮原料水分含量过高会使青贮失败，难以发酵，而水分含量过低会使乳酸菌活动受到抑制，影响青贮饲料的发酵品质。因此，本实施例将绿狐尾藻的含水量控制在75％～80％间进行青贮；同时添加乳酸菌菌剂，增加绿狐尾藻表面的乳酸菌数量，使发酵得以快速进行，pH值快速下降，产生更多的乳酸，有利于抑制粗蛋白的降解，减少饲料中的蛋白质分解率，可以被动物直接消化吸收。
试验例1本发明的乳酸菌菌剂对青贮绿狐尾藻的发酵品质的影响
1.1试验设计
本试验在青贮原料绿狐尾藻中分别加入不同的乳酸菌菌剂进行青贮，试验共设为4个处理，即空白对照组(ck)，Lactococcus lactis菌剂组(LL，实施例1制备)，Lactobacillus plantarum菌剂组(LP，实施例3制备)，Lactococcus lactis与Lactobacillus plantarum复合菌剂组(FH，实施例5制备)。称取约500g青贮原料，对照组喷洒与菌剂等量的蒸馏水后直接青贮，其余菌剂添加组按照相应的比例添加Lactococcuslactis菌剂，Lactobacillus plantarum菌剂和复合菌剂(理论接种量均不低于106cfu/g鲜草)，充分混合均匀后，装填到2L的实验室青贮密封玻璃罐中，压实密封，放置于室温(20～30℃)下保存(即厌氧发酵)，分别在青贮后1，3，7，15，30天取样，每个时间点各个处理3个重复。
1.2分析方法
感官评价：依据农业部颁布的《青贮饲料质量评定标准》，从气味，色泽，霉变和质地等方面对青贮饲料进行感官鉴定。
实验室分析：绿狐尾藻青贮饲料四分法取样后，取20g鲜样置于250mL锥形瓶中，加入180mL蒸馏水，充分混合均匀后，4℃静置24h，通过4层纱布和滤纸过滤，滤液用于测定pH值和乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量；用pH测定计测定青贮料滤液的pH值；有机酸即乳酸、乙酸、丙酸和丁酸采用高效液相色谱法测定，使用日本岛津LC-20AD型，色谱柱为ThemoHypersil BDS C18柱(250mm×4.6mm，0.5μm)，流动相：0.02mol/L NaH2PO4与甲醇，流速分别为0.86mL/min和0.14mL/min，柱温30℃，检测波长190nm，进样量20μL。
1.3数据处理分析
使用SAS软件对试验数据进行方差分析，并用Duncan法多重比较，试验结果用平均值表示。
2结果与分析
2.1青贮饲料感官评定
青贮罐开封后，从感官上来看，各处理组的绿狐尾藻青贮料茎叶结构基本完好，均无霉变发生，颜色呈黄绿色，没有粘手现象，质地较好，有明显的酸香味。
2.2青贮绿狐尾藻的发酵品质
青贮过程中，青贮第1天时，FH组的pH值略高于对照组(见表1)，而LL组和LP组的pH值都显著(P<0.05)低于对照组。青贮第3天时，LP组与FH组的pH值逐渐降低，到青贮第7天时，LP组与FH组的pH值降到最低，且所有添加菌剂组的pH值均显著(P<0.05)低于对照组。到青贮第30天时，LL组的pH值降到最低，而LP组与FH组的pH值均有所升高，LL组和LP组的pH值显著(P<0.05)低于对照组，而FH组的pH值略低于对照组，但无显著差异(P>0.05)。
在整个青贮过程中，除了第30天第FH组的乳酸含量略低于对照组，其他添加菌剂组的乳酸含量基本均高于对照组(P<0.05)。其中LL组的乳酸含量在青贮第30天时达到最高，LP组与FH组的乳酸含量在青贮第7天时达到最高，分别较对照组提高了131.2％、47.47％和29.33％。
LL组的乙酸含量在整个青贮过程呈现先上升后下降的趋势，LP组与FH组的乙酸含量则在青贮过程中先降低后升高，在青贮结束后，添加菌剂组乙酸含量均高于对照组(P<0.05)。LL组、LP组与FH组的乙酸含量分别较对照组提高了41.62％、109.14％和116.75％。
青贮第30天，LL组的丙酸含量略低于对照组(P>0.05)，LP组和FH组的丙酸含量则显著低于对照组(P<0.05)，LL组、LP组与FH组的丙酸含量与对照组相比分别降低了11.49％、23.37％和27.97％。LP组的丁酸含量与对照组相比明显升高(P<0.05)，提高了54.69％，LL组和FH组的丁酸含量显著低于对照组(P<0.05)，LL组和FH组的丁酸含量分别比对照组降低了39.06％和64.06％。
表1狐尾藻青贮饲料发酵品质
注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
由表1可知，添加乳酸菌菌剂的绿狐尾藻青贮饲料相对于对照组，pH值显著降低，有机酸含量明显提高，且增加了乳酸在总有机酸中所占的比例，降低了乙酸，丙酸，丁酸所占比例。说明本发明的乳酸菌菌剂能够改善绿狐尾藻青贮饲料的发酵品质，并且可以抑制青贮饲料中霉菌等真菌的生长，提高了有氧稳定性，从而有利于延长绿狐尾藻青贮饲料的保存期限，为其大规模生产应用提供保障。
试验例2本发明的乳酸菌菌剂对青贮绿狐尾藻的化学成分的影响
1.1试验设计
本试验在青贮原料绿狐尾藻中分别加入不同的乳酸菌菌剂进行青贮，试验共设为4个处理，即空白对照组(ck)，Lactococcus lactis菌剂组(LL，实施例1制备)，Lactobacillus plantarum菌剂组(LP，实施例3制备)，Lactococcus lactis与Lactobacillus plantarum复合菌剂组(FH，实施例5制备)。称取约500g青贮原料，对照组喷洒与菌剂等量的蒸馏水后直接青贮，其余菌剂添加组按照相应的比例添加Lactococcuslactis菌剂，Lactobacillus plantarum菌剂和复合菌剂(理论接种量均不低于106cfu/g鲜草)，充分混合均匀后，装填到2L的实验室青贮密封玻璃罐中，压实密封，放置于室温(20～30℃)下保存(即厌氧发酵)，分别在青贮后1，3，7，15，30天取样，每个时间点各个处理3个重复。
1.2分析方法
实验室分析：绿狐尾藻青贮饲料采用烘干法测定干物质含量，粗蛋白含量以及中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量。
在65℃烘箱中烘至恒重，测定干物质(dry matter，DM)含量；采用凯式定氮法(GB6432-94)测定粗蛋白(crude protein，CP)含量，使用FOSS全自动蛋白测定仪测定；使用ANKOM A2000i型全自动纤维分析仪测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)及酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)含量。
1.3数据处理分析
使用SAS软件对试验数据进行方差分析，并用Duncan法多重比较，试验结果用平均值表示。
2结果与分析
2.1青贮绿狐尾藻的化学成分
在整个青贮过程中，所有处理组的干物质含量都随着发酵时间的增加呈下降趋势(见表2)，而各菌剂添加组与对照组均无显著差异(P>0.05)。
LL组的粗蛋白含量在青贮全过程中都略高于对照组，但无显著差异(P>0.05)，LP组的粗蛋白含量在青贮第15天比对照组略高(P>0.05)，其余均显著高于对照组(P<0.05)；FH组在整个青贮过程中的粗蛋白含量都显著高于对照组(P<0.05)。FH组的粗蛋白含量最高，较对照组高出12.6％，LP组和LL组的粗蛋白含量较对照组分别高出8.52％和2.18％。
LL组与FH组的中性洗涤纤维含量呈现先上升后下降的趋势，在青贮结束后，LL组的中性洗涤纤维含量显著低于对照组(P<0.05)，LP组和FH组的中性洗涤纤维含量略低于对照组(P>0.05)。LL组的中性洗涤纤维含量最低，比对照组降低了17.23％，LP组和FH组的中性洗涤纤维含量较对照组分别降低了10.65％和16％。
添加菌剂组的酸性洗涤纤维含量呈现先下降后上升的趋势，青贮的全过程中添加菌剂组的酸性洗涤纤维含量都低于对照组，在青贮第3天和第30天显著低于对照组(P<0.05)，在青贮结束后，LL组、LP组和FH组的酸性洗涤纤维含量分别较对照组降低了24.56％、18.15％和18.37％。
表2狐尾藻青贮饲料的化学成分
从表1可知，添加乳酸菌菌剂的绿狐尾藻青贮饲料相对于对照组，粗蛋白含量提高，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著降低，说明乳酸菌菌剂可以提高蛋白含量，降低纤维素含量，提高了绿狐尾藻青贮饲料的营养价值和适口性。中性洗涤纤维(NDF)主要成分包括纤维素、木质素和半纤维素等，饲料中的NDF的含量过高会影响动物的干物质采食量以及对饲料的消化利用率，本试验例中乳酸菌添加剂组的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维含量(ADF)都较对照组显著降低(P<0.05)，粗蛋白含量显著增加(P<0.05)，使得饲料中的营养物质被保留下来，添加菌剂组的粗蛋白含量都在25％以上，远高于常规的青绿饲料及粮食作物的粗蛋白含量，可以成为动物饲料中蛋白质来源的重要补充。
由试验例1和试验例2可知，添加LL菌剂对绿狐尾藻进行青贮后，青贮饲料的品质较为良好，乳酸含量较对照组显著提高(P<0.05)，中性洗涤纤维含量显著低于对照组(P<0.05)，比对照组降低了17.23％；酸性洗涤纤维的含量相比对照组显著降低(P<0.05)，比对照组降低了24.56％。添加LP菌剂对绿狐尾藻进行青贮后，酸性洗涤纤维的含量比对照组显著降低(P<0.05)，比对照组降低了18.15％。添加FH菌剂对绿狐尾藻青贮后，粗蛋白含量显著高于对照组(P<0.05)，较对照组高出12.6％。
综上所述，乳酸菌菌剂能降低绿狐尾藻青贮饲料的pH值、丁酸含量以及中性洗涤纤维含量，而粗蛋白含量和生成乳酸的含量都有增多，可以改善绿狐尾藻青贮饲料的发酵品质和营养价值，对于绿狐尾藻实现资源化利用及其在养殖生产中推广应用提供数据参考。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适用于绿狐尾藻青贮的乳酸菌菌剂，其特征在于，包括乳酸菌和绿狐尾藻汁液，所述乳酸菌菌剂中乳酸菌的含量为1.7×107～8.4×107CFU/g，所述乳酸菌选自乳酸乳球菌、植物乳杆菌或乳酸乳球菌和植物乳杆菌混合而成的复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌菌剂，其特征在于，所述绿狐尾藻汁液采用以下方法制备得到：将绿狐尾藻压榨得到液体，液体离心取上清液，即得。
3.根据权利要求1所述的乳酸菌菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由乳酸乳球菌和植物乳杆菌菌体数以(0.5～2):1比例混合而成。
4.根据权利要求1所述的乳酸菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌体的扩大培养
将乳酸乳球菌和植物乳杆菌分别接种在液体培养基中进行培养，得到乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液，然后将乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液分别接种到新的液体培养基中进行扩大培养，获得乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液；
(2)乳酸菌菌剂的制备
将乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液分别接种到绿狐尾藻汁液培养基中进行培养，获得乳酸乳球菌的液体菌剂和植物乳杆菌的液体菌剂；或者，
将乳酸乳球菌培养液和植物乳杆菌培养液进行混合后获得混合培养液，再将混合培养液接种到绿狐尾藻汁液培养基中进行培养，获得复合液体菌剂。
5.根据权利要求4所述的乳酸菌菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述培养为在36～38℃下培养24～36h，将乳酸乳球菌菌液和植物乳杆菌菌液分别以0.5％～1.5％的比例接种到新的液体培养基中进行扩大培养，所述扩大培养为在36～38℃下培养18～24h。
6.根据权利要求4所述的乳酸菌菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述液体培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基的成分为：9.0～11.0g蛋白胨，9.0～11.0g牛肉浸膏，4.0～6.0g酵母粉，19.0～21.0g葡萄糖，4.0～6.0g乙酸钠，0.5～1.5g吐温-80，0.05～0.15g硫酸镁，0.01～0.08g硫酸锰，1.0～3.0g柠檬酸氢二铵，1.0～3.0g磷酸氢二钾，蒸馏水1000mL。
7.根据权利要求4所述的乳酸菌菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将乳酸乳球菌培养液、植物乳杆菌培养液和混合培养液分别以0.5％～1.5％的比例接种到绿狐尾藻汁液培养基中进行培养，所述培养为在36～38℃下培养18～24h；绿狐尾藻汁液培养基的成分为：等体积的绿狐尾藻汁液与灭菌蒸馏水，19.0～21.0g/L葡萄糖；绿狐尾藻汁液采用以下方法制备得到：将绿狐尾藻压榨得到液体，在转速为3000～5000r/min的条件下离心4～6min，取上清液即得。
8.权利要求1所述的乳酸菌菌剂在制备绿狐尾藻青贮饲料中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌菌剂的应用方法为：将绿狐尾藻刈割后，晾干绿狐尾藻表面的水分，切短至2～3cm，获得青贮原料；将乳酸菌菌剂均匀的喷洒在青贮原料上，翻拌乳酸菌菌剂和绿狐尾藻以使乳酸菌菌剂与原料混合均匀；最后将青贮原料进行厌氧发酵，获得绿狐尾藻青贮饲料。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌菌剂的用量为：每克青贮原料中含有1×106～4×106CFU的乳酸菌，所述青贮原料的含水量为75％～80％，所述厌氧发酵为在20～30℃下发酵15～30天。
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