CN107916266A

CN107916266A - 镰刀菌毒素脱毒路径相关基因adh、akr6d1、akr13b2及其应用

Info

Publication number: CN107916266A
Application number: CN201711272601.8A
Authority: CN
Inventors: 廖玉才; 何伟杰; 李和平; 易沭远; 张静柏; 黄涛
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN107916266B

Abstract

本发明公开了镰刀菌毒素脱毒路径的相关基因ADH、AKR6D1、AKR13B2及其应用，通过原核表达基因ADH、AKR6D1、AKR13B2获得纯化的蛋白，体外实验证实纯化的三个蛋白一起可以催化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），形成3‑异构体‑脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3‑eip‑DON），其中ADH蛋白可氧化DON，形成3‑酮基‑脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3‑oxo‑DON）；而AKR6D1、AKR13B2蛋白可进一步还原3‑oxo‑DON，形成目前已知毒性最低的物质3‑epi‑DON。

Description

镰刀菌毒素脱毒路径相关基因ADH、AKR6D1、AKR13B2及其应用

技术领域

本发明属于食品安全中的真菌毒素脱毒领域，具体涉及镰刀菌毒素脱毒路径相关基因ADH、AKR6D1和AKR13B及其应用。ADH基因编码的蛋白质被证实能够作用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，将其氧化形成3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-oxo-DON)，同时AKR6D1、AKR13B2蛋白可以还原3-oxo-DON，形成毒性极弱的3-异构体-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-DON)。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种广泛分布的真菌毒素，主要由镰刀菌属真菌产生。这些产毒真菌在田间侵染小麦、大麦、玉米等禾谷类作物的小花组织，并定植在发育的籽粒上。因此，这些真菌产生的毒素会直接积累在成熟的谷物中，从而进入下游产品(Bai,G.,and Shaner,G.Management and resistance in wheat and barley to Fusariumhead blight.2004.Annu Rev Phytopathol 42:135-161.)。世界多地的谷物及其谷类早餐食品、烘焙产品、休闲食品、啤酒以及谷物制成的动物饲料中，均存在不同程度的真菌毒素污染(Desjardins 2006，Lancova et al.2008)。DON毒素耐高温，加热不易降解，可在食物链中长期存留，严重危害人畜健康。摄食DON污染的食物会导致人的免疫力低下、贫血、头痛、恶心及腹痛等，动物摄食后可导致拒食、呕吐、生长阻滞及生殖紊乱等(Pestka,J.J.Deoxynivalenol:mechanisms of action,human exposure,and toxicologicalrelevance.2010.Arch Toxicol 84:663-679.)。在植物中，极低剂量的毒素即可引起多种植物枯萎、蔫黄、坏死等症状；同时DON作为一种毒力因子，能够促进镰刀菌在小麦穗部的扩散从而加重赤霉病病症，严重降低作物产量(Bai等,Deoxynivalenol-nonproducingFusarium graminearum causes initial infection,but does not cause diseasespread in wheat spikes.2002.Mycopathologia.153:91-98)。由于我国农业生态环境及耕作制度引起的镰刀菌毒素污染面大，迄今国内外又缺乏控制或消除DON毒素的有效方法，所以时常发生人误食受镰刀菌毒素污染面粉而中毒的事件，尤其是DON毒素对猪、鸡等动物的影响巨大，既严重阻滞动物生长，DON毒素在动物产品中的残留又影响人类健康。因此，寻找消除DON毒性的材料和方法，是人类面临的一个重要任务。

利用微生物靶向改变DON毒性基团的生物脱毒方法，是目前毒素降解研究的热点及研究发展方向。这种方法相对于物理脱毒及化学脱毒方法，具有特异性强、环境安全、脱毒效率高等特点；同时，自然界微生物资源丰富，因此，开发利用微生物资源来进行镰刀菌毒素的生物脱毒，具有开发应用前景。目前已有几个具有生物脱毒活性的微生物菌株被分离，它们能够靶向改变DON的毒性基团从而大大降低DON的毒性(Karlovsky,P.Biologicaldetoxification of the mycotoxin deoxynivalenol and its use in geneticallyengineered crops and feed additives.2011.Appl Microbiol Biotechnol 91:491-504.)。Devosia sp.17-2-E-8等菌株能够将DON转化为3-异构-DON(3-epi-DON)，动物毒理实验及分子生物学研究表明，3-epi-DON的毒性相对于DON的毒性下降了1181倍，基本上已经没有毒性(He等,Toxicology of 3-epi-deoxynivalenol,a deoxynivalenol-transformation product by Devosia mutans 17-2-E-8.2015.Food Chem Toxicol 84:250-259.)。Sphingomonas sp.KSM1菌株能够降解DON产生16-羟基-DON(16-HDON)，后者的植物毒性是DON的1/10(Ito等，Bacterial cytochrome P450system catabolizing theFusarium toxin deoxynivalenol.2013.Appl Environ Microbiol 79:1619-1628.)。因此，将DON毒素转化为几乎没有毒性的3-异构-DON(3-epi-DON)，被认为是到目前为止最为有效的脱毒途径。然而，DON降解成为3-epi-DON的代谢路径以及涉及的相关基因仍然未知。

醛酮还原酶(Aldo-keto reductases,AKRs)是一个包括17个家族190多个成员的超家族，广泛分布于原核生物、原生动物、酵母、植物、动物以及人类。不同家族成员之间的氨基酸序列同源性低于40％，而同一家族内的不同成员之间氨基酸序列同源性高于60％。大多数AKR以单聚体形式存在，分子量在34-37kDa之间。这些酶具有多种多样的功能，多种研究表明它们参与了生物体内内源和外源有毒物质的代谢过程。来源于人和小鼠的AKR7A相关成员参与了体内的黄曲霉代谢过程，保护机体免受黄曲霉诱导的肝脏毒性(Penning,The aldo-keto reductases(AKRs):Overview.2005.Chem Biol Interact 234:236-246.)。

发明人从土壤中分离获得一株具有脱毒活性的德沃斯氏菌属(Devosia sp.)的细菌菌株D6-9，能将DON转化为3-异构-DON(3-epi-DON)，对其进行基因组测序，通过基因组比较分析发现这个转化过程涉及3个基因，分别是ADH、AKR6D1和AKR13B2基因。通过原核表达的融合蛋白体外转化实验表明，ADH基因编码的蛋白质被证实能够作用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，将其氧化形成3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-oxo-DON)，进一步由AKR6D1、AKR13B2蛋白还原3-oxo-DON，形成3-异构体-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-DON)。这些实验结果证明，ADH、AKR6D1和AKR13B2就是将DON毒素转化为无毒的3-epi-DON的一组基因，利用这3个基因，就可以有效清除DON毒素的毒性，从而保障粮食、食品安全，以及粮食高产稳产。

发明内容

本发明的目的在于提供从德沃斯氏菌(Devosia sp.)D6-9中分离克隆的与镰刀菌毒素脱毒路径相关的3个基因ADH、AKR6D1、AKR13B2，核苷酸序列如SEQ NO.1-3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。

本发明的另一个目的在于提供基因ADH、AKR6D1、AKR13B2的制备方法，利用所述的特异性引物进行PCR扩增，分别获得ADH、AKR6D1、AKR13B2的基因序列，操作简单，产物特异。

本发明的再一个目的在于提供基因ADH、AKR6D1、AKR13B2或其编码的蛋白质在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的应用，将DON毒素转化为3-异构-DON(3-epi-DON)，基因作用产物结构明确，转化后的3-异构-DON毒性相对于原型毒素显著性降低，为植物中镰刀菌防治和食品、饲料中毒素脱毒提供了材料。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

镰刀菌毒素脱毒路径的相关基因ADH、AKR6D1和AKR13B2，通过下述方式获得：

以降解菌株德沃斯氏菌(Devosia sp.)D6-9的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增ADH的正向引物为5′-CATGCTGACGGGGCCGCGG-3′，反向引物为5′-CTTGGCTTCG GGCAGGGCG-3′，获得基因ADH，其序列为SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质的序列为SEQ ID.3所示；扩增AKR6D1的正向引物为5′-ATGGAATATCGTCGTCTGGG-3′，反向引物为5′-CTAGAACCGCTGCGGGCCGG-3′，获得基因AKR6D1，其序列为SEQ ID NO.2所示，该基因编码的蛋白质的序列为SEQ ID.5所示；扩增AKR13B2的正向引物为5′-ATGTCAGAACCCAATGCAGC-3′，反向引物为5′-TCACGAAGCCCCTTCCAGCTC-3′，获得基因AKR13B2，其序列为SEQ ID NO.3所示，该基因编码的蛋白质的序列为SEQ ID.6所示。

基因ADH、AKR6D1、AKR13B2编码的蛋白质在氧化还原脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用：

通过原核表达基因ADH、AKR6D1、AKR13B2获得纯化的蛋白，将纯化的3种蛋白与DON在缓冲液中进行反应，体外实验证实纯化的3种蛋白联合使用可以催化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，形成3-异构体-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-eip-DON)，经分析表明，蛋白ADH能够将DON氧化形成3-oxo-DON，蛋白AKR6D1和蛋白AKR13B2能够将3-oxo-DON还原形成3-epi-DON。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1)此为首次完整克隆降解菌中参与DON脱毒的代谢路径相关基因，包括氧化DON形成3-oxo-DON功能的基因以及还原3-oxo-DON形成3-epi-DON功能的基因。这组基因克隆操作简单，产物特异，基因编码的蛋白质在原核细胞中易于表达，融合蛋白可溶性好，适用于大规模商业化生产，可制备成脱毒制剂或形成表达脱毒蛋白的生物材料。

2)ADH基因编码的蛋白质能够有效的作用于DON毒性基团，形成3-oxo-DON；AKR6D1和AKR13B2基因编码的蛋白质，进一步将3-oxo-DON还原形成3-epi-DON，3-epi-DON的毒性相对于DON和3-oxo-DON均大幅度性降低，在动物及植物中几乎没有毒性，这3个基因或者蛋白在DON毒素脱毒中具有巨大开发应用潜力。

附图说明

图1：采用MEGA 6.0(公开使用软件)分析ADH基因与其他细菌ADH基因之间的亲缘关系。

图2：采用MEGA 6.0(公开使用软件)分析AKR6D1基因与其他已分类的细菌AKR基因之间的亲缘关系。

图3：采用MEGA 6.0(公开使用软件)分析AKR13B2基因与其他已分类的细菌AKR基因之间的亲缘关系。

图4：原核表达载体pET22b-ADH的构建示意图，将ADH全长基因经酶切连接反应插入多克隆位点后的情况。

图5：原核表达载体pET22b-AKR6D1的构建示意图，将AKR6D1全长基因经酶切连接反应插入多克隆位点后的情况。

图6：原核表达载体pET22b-AKR13B2的构建示意图，将AKR13B2全长基因经酶切连接反应插入多克隆位点后的情况。

图7：原核表达和纯化的ADH、AKR6D1、AKR13B2蛋白SDS-PAGE检测结果。

图8：ADH蛋白对DON的催化作用。

图9：AKR6D1蛋白对3-oxo-DON的催化作用。

图10：AKR13B2蛋白对3-oxo-DON的催化作用。

图11：ADH、AKR6D1、AKR13B2三种蛋白对DON的催化作用。

具体实施方式

实施例1：目的基因ADH、AKR6D1、AKR13B2的克隆和原核表达载体的构建及转化

目的序列克隆：以德沃斯氏菌属(Devosia sp.)降解菌D6-9(由课题组实验室提供)基因组DNA为模板，高保真酶KOD plus(购自Toyobo公司，日本)扩增目的基因片段。基因ADH的扩增引物，正向引物：5′-CATGCTGACGGGGCCGCGG-3′，反向引物为5′-CTTGGCTTCGGGCAGGGCG-3′；基因AKR6D1的扩增引物，正向引物为5′-ATGGAATATCGTCGTCTGGG-3′，反向引物为5′-CTAGAACCGCTGCGGGCCGG-3′；基因AKR13B2的扩增引物，正向引物为5′-ATGTCAGAACCCAATGCAGC-3′，反向引物为5′-TCACGAAGCCCCTTCCAGCTC-3′。50μL反应体系：10×KOD buffer 5μL，25mmol/L MgSO₄2μL，2mmol/L dNTPs 5μL，10μmol/L primer各1.5μL，KOD plus(1U/μL)1μL，模板cDNA 1μL，甜菜碱：5μL，补ddH₂O至总体积50μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃30s，68℃2min，35个循环；68℃延伸10min。对目的片段测序后进行序列分析，基因ADH、AKR6D1、AKR13B2的核苷酸序列如SEQ NO.1-3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示，进化关系分析结果见图1-3。

载体构建的测序：用EcoR I和HindⅢ(购自Takara公司，中国)对原核表达载体PET-22b(购自Novagen公司，美国)进行双酶切。50μL反应体系：10×M buffer 5μL，质粒DNA或基因片段2-3μg，EcoR I 2μL，HindⅢ2μL，补ddH₂O至总体积50μL。37℃酶切6h。凝胶电泳检测酶切效果并回收所需的片段。用同源重组酶(购自诺唯赞公司，中国)连接回收的pET-22b载体和基因片段，构建后的原核表达载体如图4-6所示。测序表明载体pET-22b-ADH、pET-22b-AKR6D1、pET-22b-AKR13B2构建正确。

转化大肠杆菌：测序正确的原核表达载体pET-22b-ADH、pET-22b-AKR6D1、pET-22b-AKR13B2分别通过热击转化法转化大肠杆菌BL21感受态细胞(购自Invitrogen公司，中国)(Sambrook等，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)，用于ADH、AKR6D1、AKR13B2蛋白表达。

实施例2：表达和纯化ADH、AKR6D1、AKR13B2蛋白

蛋白的诱导表达：于LB液体培养基中培养含有表达载体的大肠杆菌BL21菌株，37℃摇床中(200r/min)至OD₆₀₀达到0.6左右；加入终浓度为0.4mM的IPTG(购自Sigma公司，美国)，置于16℃摇床中(140r/min)诱导培养12h。

蛋白的纯化：离心收集菌体，用适量的裂解缓冲液重悬菌体(按照1:20-1:40的比例)。剧烈涡旋振荡，充分溶解菌体。菌体破碎前按照1:100(v:v)加入100μM蛋白酶抑制剂PMSF，用高压细胞破碎仪将大肠杆菌细胞破碎。菌体破碎液16000r/min，离心30min，收集上清，全部通过Ni-NTA基质填充的蛋白纯化柱。加入20mL清洗缓冲液淋洗纯化柱，去除结合松弛的非目的蛋白。加入500μL洗脱缓冲液淋洗纯化柱3次，得到含有目的蛋白的组分。SDS-PAGE检测蛋白，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后分析蛋白条带。结果表明：ADH、AKR6D1、AKR13B2蛋白在大肠杆菌BL21细胞中被IPTG诱导表达了，过柱纯化后得到条带单一的目的蛋白(图7)。

实施例3：纯化ADH蛋白对DON的催化作用

将已纯化的ADH蛋白与DON在缓冲液中进行反应，在50μL反应体系中，包括6μg纯化蛋白，100μM DON，100μM PQQ，100μM Ca⁺，加Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)至总体积50μL，30℃反应，反应完成后加入等体积的甲醇结束反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的DON含量，HPLC分析系统组成：Agilent 1200半制备高效液相色谱主要组成：四元泵(1260QuatPump VL)，自动进样器(1260ALS)，柱温箱(1260FCC)，紫外检测器(1260VWD)，馏分自动收集器(1260FC-AS)，分析色谱柱(Eclipse XDB-C18，4.6×150mm,5μm)，半制备色谱柱(EclipseXDB-C18，9.4×250mm,5μm)，操作系统(Agilent ChemStation，B.04.03)。HPLC分析条件：进样量10μL，用甲醇-水(25:75，V/V)作为流动相，使用梯度洗脱的方法，运行时间30min，0-15min，甲醇25％-75％，15-20min，甲醇75％-80％，保持3min，23-26min，甲醇80％-25％，保持4min。流速1mL/min，柱温30℃，紫外检测波长218nm。HPLC检测结果显示，随着DON色谱峰高的降低，在保留时间更加晚的位置出现了一个新的色谱峰，该色谱峰已被鉴定为3-oxo-DON的峰。说明蛋白ADH能够在上述条件下将DON氧化形成3-oxo-DON(图8)。

实施例4：纯化AKR6D1蛋白对3-oxo-DON的催化作用

将已纯化的AKR6D1蛋白与3-oxo-DON在缓冲液中进行反应，在50μL反应体系中，包括6μg纯化蛋白，100μM 3-oxo-DON，0.2mM NADPH，加Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)至总体积50μL，30℃反应，反应完成后加入等体积的甲醇结束反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的3-oxo-DON含量，HPLC分析系统组成同实施实例3所述。HPLC检测结果显示，随着3-oxo-DON色谱峰高的降低，在保留时间更加早的位置出现了一个新的色谱峰，其保留时间为3.2min，该色谱峰已被鉴定为3-epi-DON的峰。说明蛋白AKR6D1能够在上述条件下将3-oxo-DON还原形成3-epi-DON(图9)。

实施例5：纯化AKR13B2蛋白对3-oxo-DON的催化作用

将已纯化的AKR13B2蛋白与3-oxo-DON在缓冲液中进行反应，在50μL反应体系中，包括6μg纯化蛋白，100μM 3-oxo-DON，0.2mM NADH，加Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)至总体积50μL，30℃反应，反应完成后加入等体积的甲醇结束反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的3-oxo-DON含量，HPLC分析系统组成同实施实例3所述。HPLC检测结果显示，随着3-oxo-DON色谱峰高的降低，在保留时间3.2min的位置出现一个新的色谱峰，该色谱峰已被鉴定为3-epi-DON的峰。说明蛋白AKR13B2能够在上述条件下将3-oxo-DON还原形成3-epi-DON(图10)。

实施例6：纯化的ADH、AKR6D1、AKR13B2三种蛋白对DON的催化作用

将已纯化的ADH、AKR6D1、AKR13B2三种蛋白与DON在缓冲液中进行反应，在100μL反应体系中，包括3μg纯化的ADH蛋白，3μg纯化的AKR6D1蛋白，3μg纯化的AKR13B2蛋白，100μMDON，100μM PQQ，0.2mM NADH，0.2mM NADPH，100μM Ca⁺，加Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)至总体积100μL，30℃反应，反应完成后加入等体积的甲醇结束反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的DON含量，HPLC分析系统组成同实施实例3所述。HPLC检测结果显示，三种蛋白复合物能够完全降解DON，在HPLC中已经检测不到该物质，在保留时间3.2min的位置出现一个新的色谱峰，该色谱峰已被鉴定为3-epi-DON的峰。说明蛋白3种蛋白的复合物能够在上述条件下将DON转化成3-epi-DON(图11)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 镰刀菌毒素脱毒路径相关基因ADH、AKR6D1、AKR13B2及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttggtctgg ctctgtctac cgctctgatc gcttctctgt ctgctccggc tttcgctcag 60

cacgctgacg gtgctgctgc tgaaaccgct gctccgggtc agtctgctat cgaaaacttc 120

cagccggtta ccgctgaaga cctggctggt ggtaacgctg ctaactggcc gatcctgcgt 180

ggtaactacc agggttgggg ttacacccag ctggaccaga tcaacaaaga caacgttggt 240

cagctgcagc tggcttgggc tcgtaccatg gaaccgggtt ctaacgaagg ttctgctatc 300

gcttacaacg gtgttgtttt cctgggtaac gctaacgacg ttgttcaggc tatcgacggt 360

aaaaccggta acctgatctg ggaataccgt cgtaaactgc cgccggcttc taaattcatc 420

aactctctgg gtgctgctaa acgttctatc gctctgttcg gtgacaaagt ttacttcgtt 480

tcttgggaca acttcgttgt tgctctggac gctaaaaccg gtaaactggc ttgggaaacc 540

aaccgtggtc agggtgttga agaaggtgtt tctaactctt ctggtccgat cgttgttgac 600

ggtgttgtta tcgctggttc tacctgccag tactctggtt tcggttgcta cgttaccggt 660

accgacgctg aatctggtga agaactgtgg cgtaacacct tcatcccgcg tccgggtgaa 720

gaaggtgacg acacctgggg tggtgctccg tacgaaaacc gttggatgac cggtgcttgg 780

ggtcagatca cctacgaccc ggaactggac ctggtttact acggttctac cggtgctggt 840

ccggcttctg aagttcagcg tggtaccgaa ggtggtaccc tggctggtac caacacccgt 900

ttcgctgtta aaccgaaaac cggtgaagtt gtttggaaac accagaccct gccgcgtgac 960

aactgggact ctgaatgcac cttcgaaatg atggttgttt ctaccaccgt taacccggac 1020

gctggtgctg acggtatgat gtctgttggt gctaacgttc cgcgtggtga aacccgtaaa 1080

gttctgaccg gtgttccgtg caaaaccggt gttgcttggc agttcgacgc tgaaaccggt 1140

gactacttct ggtctaaagc taccgttgaa cagaactcta tcgcttctat cgacgacaaa 1200

ggtctggtta ccgttaacga agacatgatc ctgaaagaac cgggtaaaga ctacaactac 1260

tgcccgacct tcctgggtgg tcgtgactgg ccgtctgctg gttacctgcc gaaatctaac 1320

ctgtacgtta tcccgctgtc taacgcttgc tacgacctga aagctcgtac caccgaagct 1380

accccggctg acgtttacaa caccgactct accgttaaac tggctccggg taaaaccaac 1440

atgggtcgtg ttgacgctat cgacgttgct accggtgcta ccaaatggtc tttcgaaacc 1500

gaagctgctc tgtacgaccc ggttatgacc accgctggtg acctggtttt cgttggttct 1560

accgaccgta tgttccgtgc tctggacgct gaaaccggta aagaagtttg gtctacccgt 1620

ctgccgggtg ctatctctgg ttacaccacc tcttactcta tcgacggtcg tcagtacgtt 1680

gctgttgttg ctggtggttc tctgggtacc ggtttcttca aagctgctgt tccgggtgtt 1740

gacgctgttc agggtggtaa cggtatctac gttttcgctc tgccggaagc taaataa 1797

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tgggtgcagg acgggcggcc cgaggtgctg cggcgcgggc tggaggcgag cctcaagcgg 360

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gccaatgcca tcggcttcat cccctgggcg ccgctggcga gcgggcgggt cggcggccgg 660

ccggtgctgg aggcggtggc gcagcggcat ggcgctagcc caggacagat cgcgctggcc 720

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ctggaagaga acgtcgccgc ggcggggatc acgctgagcg agggcgacat ggcggagctg 840

gaaggggctt cgtga 855

<210> 4

<211> 598

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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260 265 270

Ser Glu Gly Asp Met Ala Glu Leu Glu Gly Ala Ser

275 280

Claims

1.镰刀菌毒素脱毒路径相关基因，其特征在于，包括基因ADH、AKR6D1、AKR13B2，基因ADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，基因AKR6D1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，基因AKR13B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

2.权利要求1所述的镰刀菌毒素脱毒路径相关基因编码的蛋白质，其特征在于，基因ADH编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，基因AKR6D1编码蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.4所示，基因AKR13B2编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述镰刀菌毒素脱毒路径相关基因的扩增引物，其特征在于，基因ADH的扩增引物为正向引物5′-CATGCTGACGGGGCCGCGG-3′，反向引物5′-CTTGGCTTCGGGCAGGGCG-3′；基因AKR6D1的扩增引物为正向引物5′-ATGGAATATCGTCGTCTGGG-3′，反向引物5′-CTAGAACCGCTGCGGGCCGG-3′；基因AKR13B2的扩增引物为正向引物5′-ATGTCAGAACCCAATGCAGC-3′，反向引物5′-TCACGAAGCCCCTTCCAGCTC-3′。

4.权利要求1所述的基因ADH、AKR6D1、AKR13B2或权利要求2所述的蛋白质在氧化还原脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。