CN107916233A - 一株酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents

一株酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用。所述酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为FS14，保藏编号:CGMCC No.14591。在北京地区本土葡萄醪当中，FS14表现出更好的发酵能力，以其酿造出的葡萄酒香气协调、口感平衡，品质很高。相较于进口商业酿酒酵母，FS14能更好地呈现北京地区葡萄酒的特色，从而帮助北京地区葡萄酒产业形成自己的本土特色，促进整个产区葡萄酒产业发展。

Description

一株酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域。本发明具体涉及一株酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用。
背景技术
葡萄酒的酿造离不开酿酒酵母，酿酒酵母不仅通过发酵作用将葡萄醪中的糖转化为酒精，还能通过一系列代谢作用对葡萄酒的风味、香气甚至结构产生影响。然而，目前我国几乎所有的葡萄酒生产企业在酿造时选用进口商业酿酒酵母，且各酒厂选择的商业酿酒酵母品牌类型比较集中，只通过区分红、白葡萄酒选择两种不同的商业酵母，对依据不同产地，不同酿酒葡萄品种、不同最终产品及目标产品香气、口感等特征选择不同酿酒酵母的意识薄弱，导致我国葡萄酒品质相对单一，缺乏特色，尤其是风土特色。我国地大物博，有着分布广泛而风格各异的葡萄酒产区，其中蕴藏着巨大葡萄酒酵母资源，及时开发我国多类别、有针对性、有产区及品种特色的本土酵母资源有助于我国各葡萄酒产区本土特色的形成，也有助于保护我国本土酿酒酵母资源的多样性。
北京的葡萄酒生产历史悠久，最早可以追溯到1910年(宣统二年)，法国圣母天主教会沈蕴璞修士在北京创建的上义洋酒厂。虽然生产历史较久，但北京市的葡萄酒产业发展十分缓慢，随着中国葡萄酒产业的迅速发展，近十几年，北京的房山、延庆、密云、通州等区上百个大小酒庄兴起。但针对北京地区的本土酿酒酵母的研究工作尚未开展。及时筛选出北京地区本土优质酿酒酵母，将有助于北京地区葡萄酒地域特色的形成，对推动北京地区葡萄酒产业又好又快地发展具有重要意义。目前尚无筛选自北京房山区莱恩堡的酿酒酵母相关专利。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一株发酵性能好的筛选自北京地区的本土酿酒酵母，弥补我国市场上缺少本土酿酒酵母选择的不足。
本发明的另一目的是提供一株发酵性能好的酿酒酵母在酿造葡萄酒中的应用。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，名称为FS14，属于酵母属(Saccharomyces sp.)，分离自北京市房山区莱恩堡酒庄葡萄园采摘成熟的红色酿酒葡萄品种——“赤霞珠”(Cabernet Sauvignon)葡萄果实。该菌株已于2017年9月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区大屯路3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.14591，建议分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
除非特别指明，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FS14CGMCC No.14591，在本文中简称酿酒酵母FS14。
本发明提供的酿酒酵母FS14可用于酿造葡萄酒。利用酿酒酵母FS14酿造葡萄酒的优点在于：在北京地区本土葡萄醪当中，FS14表现出更好的发酵能力，以其酿造出的葡萄酒香气协调、口感平衡，品质很高。因此，对于北京地区本土酿酒葡萄原料，接种酿酒酵母FS14，可以获得较快的发酵速度、较好的葡萄酒质量，稳定的发酵过程，相较于进口商业酿酒酵母，能更好地呈现北京地区葡萄酒的特色，从而帮助北京地区葡萄酒产业形成自己的本土特色，促进整个产区葡萄酒产业发展。
附图说明
图1菌株FS14在WL培养基上的菌落形态。
图2酿酒酵母RX60与FS14对比中试试验发酵记录。
具体实施方式
为了更好地理解与实施，下面结合实施例和附图详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的方法均为常规方法。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级别的试剂，且可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取统计平均值。
实施例中涉及的培养基配方如下：
YPD固体培养基(每1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g。
葡萄酒酵母WLN鉴别培养基(每1L)：酵母粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，KH2PO40.55g，KCl 0.425g，CaCl2 0.125g，MgSO4 0.125g，FeCl3 2.5mg，MnSO4 2.5mg，琼脂20g，溴甲酚绿22mg。
实施例1酿酒酵母FS14的分离、纯化及其鉴定
本发明一株酿造性能好的的酿酒酵母，是从北京地区莱恩堡酒庄葡萄园中赤霞珠葡萄品种中得到，筛选过程如下：
挑选摘取完整成熟、无霉果烂果的成串葡萄样品，样品设置三个平行，每份葡萄样品约1kg，保存于无菌袋中，当天采集的葡萄当天处理，无菌条件下将葡萄样品除梗，挑选完整、成熟、无病变霉变的果粒收集于500mL三角瓶中，以药匙在三角瓶内破碎葡萄，葡萄破碎后每瓶葡萄醪约400mL，添加亚硫酸1mL/L，搅拌均匀后以无菌封口膜封口，葡萄醪置于25℃条件下自然发酵。
从自然发酵第0天(葡萄破碎时)开始，前7天每24h无菌条件下取样一次，每次取1mL葡萄汁，以无菌水梯度稀释至10-7，选取合适的3个稀释浓度各0.1mL，涂布于WLN鉴别培养基平板，28℃条件下倒置培养72h。之后在葡萄醪菌群动态和化学成分变化平缓的发酵后期，第10天、第12天和第20天再次取样。挑选出菌落数为30-300个的平板，根据WLN鉴别培养基对酵母菌分类鉴别的方法，对不同特点的菌落进行分类、编号，记录各类菌落特点及数目，并拍照存档。菌落形态不同、出现时期不同的每类酵母中，挑选2-3株保存于YPD斜面培养基中，于4℃条件下保存。酵母初步筛选完成后，防止菌落不纯，对菌株进行纯化。挑取单菌落以平板划线法于WLN鉴别培养基平板上纯化菌株，28℃条件下倒置培养72h，记录每次纯化后的菌落特点并拍照存档，结合显微镜观察菌株纯度，每个菌株纯化2-3次。纯化后的酵母使用40％甘油冻存管于-80℃条件下保存，待分子鉴定。
提前活化待测酵母，将其接种于YPD液体培养基，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养12h，离心后取酵母细胞待用。使用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取待测酵母基因组DNA。选用引物对ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对酵母rDNA基因5.8S ITS区进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，循环35次；72℃补充延伸10min。PCR反应体系：10×PCR buffer(Taq buffer with KCl)5μL，25mmol/L MgCl2 6μL，10mmol/L dNTPs1μL，10μmol/L引物各2.5μL，Taq酶2.0U，模板DNA 1μL，加双蒸水定容至50μL。取6μL扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物测序由北京华大基因和北京擎科新业生物技术有限公司完成。
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的BLAST工具搜索待测菌株目的序列，进行相似序列搜索，根据同源序列的相似性初步确定FS14菌株的种属地位，同时校正测序图谱。比较FS14与已知酵母菌对应序列的相似程度，相似度超过99％，并通过FS14在WLN鉴别培养基上的菌落形态和细胞显微形态最终鉴定待测菌株的种属地位。
其中，酿酒酵母FS14(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.14591)的5.8S ITS rDNA的测序结果如SEQ ID No.1所示。
与相关模式菌株酿酒酵母YJM271相似性：99.25％，鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
实施例2酿酒酵母FS14和商业酿酒酵母小型酿酒比较试验
将成熟美乐品种酿酒葡萄除梗破碎，以1L玻璃广口瓶作为葡萄酒发酵容器，FS14及来源酒庄使用的商业酿酒酵母共两组分别设置3个平行。酵母经活化后，接种于YPD液体培养基中，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养10h。向每个广口瓶中加0.8L葡萄醪，0.8mL亚硫酸。酵母按3％接种量接入葡萄醪。用蘸有亚硫酸的纱布清理广口瓶口、瓶盖，瓶盖倒放，置于25℃下发酵。葡萄醪开始发酵后，每天进行温度、糖度和比重的检测并记录。根据发酵情况适时搅拌。当葡萄酒比重不再下降时，取上层清液灌装，密封置于4℃冰箱中保存。
通过高效液相色谱法(HPLC)对葡萄酒中还原糖、甘油、乙醇及部分有机酸含量进行测定，测定结果如表1所示。并根据GB/T 15038-2006对葡萄酒基本理化指标进行检测。
表1测试菌株小型酿酒试验后酒样基本糖酸含量
小型酿酒试验结果显示，FS14的发酵性能稳定，酒样乙醇含量高于11(V/V％)，总糖不高于4g/L，总糖与总酸的差值低于2，挥发酸低于1.2g/L，符合GB15038-2006对干型葡萄酒相关指标的要求。另外，与商业酵母相比，FS14对葡萄醪中果糖消耗程度更大，对能给葡萄酒带来醇厚、甘甜口感的甘油产量较高，因此发酵能力比常用的商业酵母优异。
参照GB10220-2012中描述性检验步骤及GB15038-2006中的葡萄酒评分细则，邀请10位专业葡萄酒品评师对试验酒样进行盲品打分。依据葡萄酒品质的四个部分进行评分：外观和颜色(10分)，香气(30分)，口感和风味(40分)，总体评价(20分)，共计100分。葡萄酒感官评分表参照葡萄酒评价比赛中的感官分析用表(sensorial analysis tasting sheetfor wine judging competitions)。感官品评分析结果见表2。
表2测试菌株小型酿酒试验感官品评试验结果
感官品评试验结果显示，以酿酒酵母FS14酿制的葡萄酒在外观、香气、口感、总体质量以及总分上均优于商业酿酒酵母，其酿造的干红葡萄酒香气丰富，回味也更有层次感。
实施例3酿酒酵母FS14和商业酿酒酵母的中试规模发酵试验
酿酒酵母FS14和法国LAFFORT公司生产的商业酵母RX60进行对照，用于酿造中试试验。中试试验在FS14对应的来源酒庄进行。
FS14经湖北安琪酵母公司实验室扩培制成冻干酵母粉后，采用赤霞珠葡萄进行酿造中试试验。发酵过程记录如图2所示。由发酵记录可知，酿酒酵母FS14表现出了较强的发酵性能，尤其在发酵中后期，FS14试验组发酵速度快于对照组RX60。
发酵完成后对莱恩堡试验组和对照组葡萄酒进行化学成分分析，结果见表3。
表3 2016年莱恩堡中试葡萄酒化学成分分析
由表3可知，与商业酵母RX60相比，FS14乙醇转化能力较强。
综上所述，优选野生酿酒酵母菌株FS14在酿造干红葡萄酒过程中，表现出优秀的发酵性能，其乙醇转化能力较强，产酸能力较高，以其酿造的葡萄酒风味突出，香气和谐，口感较好，是能够发挥出本土干红葡萄酒特色的优质酿酒酵母菌株，具备商业化应用的潜力。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一株酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 812
<212> DNA
<213> Saccharomyces sp.
<400> 1
ggcctagact catattttga aaatggattt tttttttttg ttttggcaag agcatgagag 60
cttttactgg gcaagaagac aagagatgga aagtccagcc gggcctgcgc ttaagtgcgc 120
ggtcttgcta ggcttgtaag tttctttctt gctattccaa acggtgagag atttctgtgc 180
ttttgttata ggacaattaa aaccgtttca atacaacaca ctggggagtt ttcatatctt 240
tgcaactttt tctttgggca ttcgagcaat cggggcccaa aggtaacaaa cacaaacaat 300
tttatctatt cattaaattt ttgtcaaaaa caagaatttt cgtaactgga aattttaaaa 360
tattaaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 420
tgcgatacgt aatgtgaatt gcaaaattcc gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 480
cgccccttgg tattccaggg ggcatgcctg tttgagcgtc atttccttct caaacattct 540
gtttggtagt gagtgatact ctttggagtt aacttgaaat tgctggcctt ttcattggat 600
gttttttttt ccaaagagag gtttctctgc gtgcttgagg tataatgcaa gtacggtcgt 660
tttaggtttt accaactgcg gctaatcttt tttatactga gcgtattgga acgttatcga 720
taagaagaga gcgtctaggc gaacaatgtt cttaaagttt gacctcaaat caggtaggag 780
tacccgctga acttaagcat atcaaaaacc gg 812

Claims (4)

1.一株酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为FS14，保藏编号:CGMCC No.14591。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母在生产北京地区葡萄酒中的应用。
3.一种生产葡萄酒的方法，是利用如权利要求1所述的酿酒酵母发酵葡萄原料，得到葡萄酒。
4.如权利要求1所述的酿酒酵母的分离、纯化和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)挑选摘取完整成熟、无霉果烂果的成串葡萄样品，样品设置三个平行，每份葡萄样品约1kg，保存于无菌袋中，当天采集的葡萄当天处理，无菌条件下将葡萄样品除梗，挑选完整、成熟、无病变霉变的果粒收集于500mL三角瓶中，以药匙在三角瓶内破碎葡萄，葡萄破碎后每瓶葡萄醪约400mL，添加亚硫酸1mL/L，搅拌均匀后以无菌封口膜封口，葡萄醪置于25℃条件下自然发酵；
(2)从自然发酵第0天开始，前7天每24h无菌条件下取样一次，每次取1mL葡萄汁，以无菌水梯度稀释至10-7，选取合适的3个稀释浓度各0.1mL，涂布于WLN鉴别培养基平板，28℃条件下倒置培养72h；之后在葡萄醪菌群动态和化学成分变化平缓的发酵后期，第10天、第12天和第20天再次取样。挑选出菌落数为30-300个的平板，根据WLN鉴别培养基对酵母菌分类鉴别的方法，对不同特点的菌落进行分类、编号，记录各类菌落特点及数目，并拍照存档；
(3)菌落形态不同、出现时期不同的每类酵母中，挑选2-3株保存于YPD斜面培养基中，于4℃条件下保存。酵母初步筛选完成后，防止菌落不纯，对菌株进行纯化。挑取单菌落以平板划线法于WLN鉴别培养基平板上纯化菌株，28℃条件下倒置培养72h，记录每次纯化后的菌落特点并拍照存档，结合显微镜观察菌株纯度，每个菌株纯化2-3次；纯化后的酵母使用40％甘油冻存管于-80℃条件下保存，待分子鉴定；
(4)提前活化待测酵母，将其接种于YPD液体培养基，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养12h，离心后取酵母细胞待用；使用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取待测酵母基因组DNA；选用引物对对酵母rDNA基因5.8S ITS区进行PCR扩增，取扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(5)PCR产物测序；
(6)通过美国国家生物技术信息中心网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的BLAST工具搜索待测菌株目的序列，进行相似序列搜索，根据同源序列的相似性初步确定FS14菌株的种属地位，同时校正测序图谱；比较FS14与已知酵母菌对应序列的相似程度，相似度超过99％，并通过FS14在WLN鉴别培养基上的菌落形态和细胞显微形态最终鉴定待测菌株的种属地位。
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