CN107915776A

CN107915776A - 双特异性抗体fitc×cd3及其制备方法和应用

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Publication number: CN107915776A
Application number: CN201610888762.9A
Authority: CN
Inventors: 郭长缨; 康梦实
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-10-11
Also published as: CN107915776B

Abstract

本发明公开了双特异性抗体FITC×CD3及其制备方法和应用，属于生物制药和免疫学领域。本发明的双特异性抗体FITC×CD3靶向的免疫细胞抗原为CD3，靶向的靶抗原为荧光素FITC。双特异性抗体FITC×CD3与FITC修饰后的抗体结合后，可以将淋巴T细胞靶向到肿瘤细胞，对肿瘤细胞起到杀伤作用。与抗体单独使用相比，本发明的抗体可以增强药效，促进机体对肿瘤细胞的免疫反应。通过将双特异性抗体FITC×CD3与不同的FITC修饰的抗体组合，得到的双特异性抗体可以靶向多种肿瘤细胞。本发明的抗体是利用细胞工程技术和基因工程技术制备的生物大分子治疗药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。

Description

双特异性抗体FITC×CD3及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药和免疫学技术领域，更具体地说，涉及一种双特异性抗体FITC×CD3及其制备方法和应用。

背景技术

双特异性抗体是含有两种抗原结合位点的基因工程抗体，能在靶细胞和功能细胞之间架起桥梁，产生特异性的效应功能。在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有十分广阔的应用。通过双特异性抗体介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特征是双特异性抗体能同时结合肿瘤细胞表面特定的抗原和免疫效应细胞上的靶抗原，直接激发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。然而，在双特异性抗体药物研发过程中，普遍存在着原核表达困难、产量低、纯化步骤繁琐、稳定性差等障碍。

关于双特异性抗体的研究一直有报道，例如，中国专利申请号为201210564978.1，申请公布日为2013年5月8日的专利申请文件公开了一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体及其制备方法，该抗体分子量小，对肿瘤组织的穿透力较强，特别是针对前列腺组织具有较厚的前列腺包膜的解剖特点，小分子抗体更容易到达病变部位。中国专利申请号为201510029971.3，申请公布日为2015年5月6日的专利申请文件公开了一种双特异性抗体EpCAM×CD3的构建及应用，该发明的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单价单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单链单元针对肿瘤细胞表面抗原EpCAM具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。

在免疫学中，CD3蛋白是淋巴T细胞的共受体，是一种蛋白质复合物，此复合体具有活化T细胞，稳定淋巴T细胞表面受体(TCR)结构的功能。CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC能与各种抗体蛋白结合，主要用于荧光抗体技术中的荧光染料，结合后的抗体不丧失与抗原结合的特异性，并在碱性溶液中仍有强烈绿色荧光。肿瘤的治疗是目前双特异性抗体应用最为广泛的领域。大量的可以与肿瘤细胞特异性结合的抗体、多肽可以被FITC修饰。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有的双特异性抗体存在原核表达困难、产量低、纯化步骤繁琐、稳定性差等问题，本发明提供一种双特异性抗体FITC×CD3及其制备方法和应用。本发明的双特异性抗体FITC×CD3靶向的免疫细胞抗原为CD3，靶向的靶抗原为荧光素FITC。本发明的双特异性抗体与FITC修饰后的抗体结合后，可以将淋巴T细胞靶向到肿瘤细胞，对肿瘤细胞起到杀伤作用。与抗体单独使用相比，本发明的抗体可以增强药效，促进机体对肿瘤细胞的免疫反应。通过将本发明的抗体与不同的FITC修饰的抗体组合，得到的双特异性抗体可以靶向多种肿瘤细胞。本发明的抗体是利用细胞工程技术和基因工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种双特异性抗体FITC×CD3，所述的双特异性抗体包含人源免疫球蛋白1的Fc区段、抗体可变区1和抗体可变区2，所述的抗体可变区1为单链可变区段，该单链可变区段对荧光素FITC具有特异性结合能力；所述的抗体可变区2为单链可变区段，该单链可变区段针对的免疫细胞选自淋巴T细胞、NKT细胞或CIK细胞。

优选地，所述的抗体可变区1对FITC修饰的抗体、多肽具有特异性结合能力；所述的抗体可变区2对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。

优选地，所述的人源免疫球蛋白1的Fc区段包含人或者人源化的Fc片段；所述的抗体可变区1、抗体可变区2分别融合在Fc区段的两端，或者抗体可变区1、抗体可变区2同时融合在Fc区段的N末端或C末端。

优选地，所述的抗体可变区1和抗体可变区2都融合在Fc的N端；或者抗体可变区1融合在Fc的N端、抗体可变区2融合在Fc的C末端。

上述的双特异性抗体FITC×CD3的DNA表达片段，其基因序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示；其中抗体可变区1和抗体可变区2都融合在Fc的N端的DNA表达片段的基因序列为SEQ ID NO：5，抗体可变区1融合在Fc的N端、抗体可变区2融合在Fc的C末端的DNA表达片段的基因序列为SEQ ID NO：8。

一种构建的质粒表达载体，质粒中含有上述的DNA表达片段，所述的表达载体是pcDNA3.1(+)。

上述的双特异性抗体FITC×CD3的制备方法，其步骤为：

(1)将上述的质粒表达载体转染到细胞中，培养并取培养基上清；

(2)将培养基上清分离纯化后得到所述的双特异性抗体FITC×CD3。

优选地，步骤(1)中所述的细胞是真核细胞包括CHO细胞；步骤(2)所述的分离纯化步骤包括：使用蛋白A亲和层析柱从培养基上清中捕获带有Fc区段的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

上述的双特异性抗体FITC×CD3在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发性或继发性癌、黑色素瘤、血管瘤、白血病以及肉瘤。

传统的双特异性抗体的两个scFv空间上距离很近，其中一个scFv与抗原结合后会影响另一个scFv与抗原的结合。为了保证双特异性抗体的两个scFv都能与抗原有效的结合，本发明将两个scFv分别融合在免疫球蛋白1的Fc区段的N末端和C末端，两个scFv都可以和抗原有效的结合，并且相互之间没有影响。本发明的双特异性抗体还在scFv与Fc区段之间添加了柔性的氨基酸连接序列，scFv的空间结构有一定的自由度，可以更有效的与抗原结合。本发明的双特异性抗体的结构与正常的抗体结构类似，在体内不易被降解。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的双特异性抗体包含两个不同的抗原结合位点，该双特异性抗体的两个抗原结合区段都包含类似野生型抗体的轻链-重链对，抗体的稳定性好，与抗原的结合能力高；

(2)本发明的双特异性抗体的两个scFv分别融合在免疫球蛋白1的Fc区段的N末端和C末端，或者均在Fc的N端，两个scFv都可以和抗原有效的结合，并且相互之间没有影响；本发明的双特异性抗体还在scFv与Fc区段之间添加了柔性的氨基酸连接序列，scFv的空间结构有一定的自由度，可以更有效的与抗原结合；

(3)本发明的双特异性抗体通过抗体可变区1结合FITC修饰的抗体、多肽，通过改变FITC修饰的分子，可以将本发明的抗体靶向肿瘤细胞表面不同的抗原；

(4)本发明的双特异性抗体通过抗体可变区2结合淋巴T细胞表面的CD3抗原，在淋巴T细胞和肿瘤细胞之间建立桥梁，激活淋巴T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的双特异性抗体的结构示意图；

图2是编码本发明的双特异性抗体的DNA片段PCR产物的电泳图；

图3是本发明的双特异性抗体纯化后SDS-PAGE检测的结果图；

图4是本发明的双特异性抗体对多种肿瘤生长抑制率结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

一、双特异性抗体的设计

以FITC和CD3为靶点的双特异性抗体被命名为FITC×CD3，抗体结构见图1，其中一个单价抗原为抗FITC的重链-轻链对(SEQ ID NO：1)，另一个单价抗原为抗CD3的重链-轻链对(SEQ ID NO：2)，序列参考单克隆抗体L2K的序列(参考US20070123479序列号2)，两个单价抗原之间通过人源免疫球蛋白1的Fc段连接(SEQ ID NO：3)，在Fc段与抗CD3的重链-轻链对之间添加了柔性的连接序列(SEQ ID NO：4)。为了使FITC×CD3能在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞中表达，并能分泌到培养基中，选择了鼠源免疫球蛋白κ轻链的前导肽序列作为分泌信号肽。信号肽直接连接到抗体可变区的N端。

二、双特异性抗体表达质粒的构建

根据上述的设计方案，设计了双特异性抗体的DNA编码序列(SEQ ID NO：5)。合成引物1(SEQ ID NO：6)和引物2(SEQ ID NO：7)，按照合成的量加入去离子水稀释引物浓度至10μM。

PCR反应采用Taq Platinum DNA Polymerase(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：PR080530)。建立PCR反应体系，加入500ng DNA模板，加入1μL引物1和1μL引物2，加入5μL 10×Taq Platinum Buffer(200mM Tris-HCl(pH 8.4)；200mM KCl；100mM(NH₄)₂SO₄；15mM MgCl₂)，加入4μL dNTP Mixture(dATP、dTTP、dGTP、dCTP均为2.5mM)，加入TaqPlatinum polymerase 1μL，最后加入去离子水至反应终体积50μL。

PCR反应条件：第一步94℃保持5分钟，第二步94℃保持30秒，第三步55℃保持30秒，第四步72℃保持3分钟，第五步按照第二、三、四步的反应条件循环30次，第六步72℃保持5分钟。反应结束后将扩增的PCR产物使用EcoRI和XhoI限制性内切酶双酶切，37℃保持4小时，琼脂糖凝胶电泳分离双酶切的产物，结果如图2所示，扩增的DNA片段的大小约为2.3kb。

连接反应的过程为：在连接反应体系中加入2μg双酶切的PCR片段，200ng线性化的pcDNA3.1质粒，2μL的10×NEB T4DNA连接酶反应液，1μL的NEB T4DNA连接酶，补充去离子水至终体积20μL，16℃反应过夜。将5μL连接产物加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上冰浴30分钟；45℃保持45秒，冰浴2分钟；加入1mL无抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养45分钟；3000rpm离心5分钟，保留80μL的培养基，使用移液器将细胞沉淀吹打均匀，涂布棒涂布在含有Ampicillin抗性的LB琼脂平板上；将平板置于37℃的培养箱培养过夜。琼脂平板克隆长出后，挑选单菌落于1mL含Ampicillin抗性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，收集菌体，使用质粒柱式提取试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)提取质粒DNA，将质粒送出测序进一步确定质粒上shRNA序列完全正确，将携带目的DNA片段的表达质粒命名为pcDNA3.1-FITC×CD3。

SEQ ID NO：8的操作步骤同上。

三、双特异性抗体的表达质粒pcDNA3.1-FITC×CD3的提取

利用EZ-10柱式质粒小量抽提试剂盒(上海生工)进行表达质粒的提取，按照厂商提供的说明书进行，具体步骤如下：

(1)在含氨苄西林的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养12h。

(2)5mL菌液，于室温，8,000×g离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基。

(3)在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。

(4)加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒离心管10次混匀，室温静置2-4min。

(5)加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒离心管10次充分混匀。

(6)于离心机最大转速(≥12,000×g)离心10min，将上清全部小心移入吸附柱，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(7)在吸附柱中加入500μL去蛋白液Buffer DW1，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(9)重复步骤8一次。

(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000×g离心1min。

(11)在吸附膜中央加入100μl Elution Buffer，室温静置2min，9,000×g离心1min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

四、双特异性抗体的表达质粒的转染表达

CHO细胞培养根据厂商提供的说明书在DMEM培养基(Gibco)中添加10％的胎牛血清，置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱中进行培养,，准备好细胞后，根据制造商的说明书，使用Lipofectamin 2000(Life)转染试剂将质粒pcDNA3.1-FITC×CD3转染到CHO细胞中，具体步骤为：取一个离心管标记为A，用100μL无血清DMEM培养基稀释10μg质粒；取第二个离心管标记为B，用100μL无血清DMEM培养基稀释25μL转染试剂；将离心管A中溶液加到离心管B中，吹打混匀，室温静置30分钟，将混合液加到待转染细胞的培养皿中，培养14天后，800×g离心收获表达上清。

五、双特异性抗体的纯化

CHO表达上清用0.22μm滤膜过滤，利用亲和层析柱(GE公司)从表达上清中富集所有带Fc结构域的抗体，使用平衡缓冲液(9.5mM NaH₂PO₄、40.5mM Na₂HPO₄,pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸、100mM精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离，阳离子交换柱(GE公司)，用平衡缓冲液A(43.8mM NaH₂PO₄、6.2mM Na₂HPO₄，pH6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH₂PO₄、6.2mM Na₂HPO₄、1mM NaCl，pH 6.0)20个柱体积线性洗脱，最后浓缩置换Buffer PBS。

如图3所示，将纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE电泳检测，条带单一，分子量正确，纯度在95％以上，双特异性抗体表达纯化成功。

实施例2

双特异性抗体抗肿瘤的药效学研究

将磷酸盐缓冲液(PBS)与健康人的外周血等体积混匀，加入等体积淋巴细胞分离液，2500rpm，室温离心30分钟。取中间白膜层，加入10倍体积PBS洗去淋巴细胞分离液，重复两次后，计数并加入RPMI 1640完全培养基中重悬即得到外周血单核细胞(PBMC)。用台盼蓝染色确定细胞存活率>95％，并进行细胞计数。在培养的肿瘤细胞培养基中同时加入分离的PBMC细胞，使PBMC细胞与肿瘤细胞的数量比例为5：1，将混合培养的细胞分为6个组，组1不加药作为阴性组，组2加入FITC修饰的抗体贝伐单抗1μg，组3加入的本发明的双特异性抗体1μg和FITC修饰的贝伐单抗1μg，给药组4加入1μg FITC修饰的多肽RGD-ED(专利申请号：CN200510040378.5，多肽序列：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)，多肽RGD-ED可以结合在肿瘤细胞表面表达的整合素蛋白，给药组5加入本发明的双特异性抗体的量为1μg和1μg FITC修饰的多肽RGD-ED，给药组6加入多西他赛50ng。在37℃的细胞培养箱中共同培养36小时后，MTT法检测存活的肿瘤细胞的数，向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h。吸去培养基，每孔加入100μLDMSO溶解。用酶标仪在检测波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率，公式如下：肿瘤生长抑制率(％)＝(1-给药组吸光值/阴性组吸光值)×100％。

从表1和表2的结果可以看出，本发明的双特异性抗体可以增强FITC修饰的抗体、多肽对肿瘤细胞生长的抑制作用，并且本发明的双特异性抗体联合给药组的效果明显优于现在临床治疗使用的抗肿瘤药物多西他赛(图4)。

表1 本发明的双特异抗体对多种肿瘤的抑制作用(SEQ ID NO：5表达的抗体，抑制率％)

表2 本发明的双特异抗体对多种肿瘤的抑制作用(SEQ ID NO：8表达的抗体，抑制率％)

Claims

1.一种双特异性抗体FITC×CD3，其特征在于：所述的双特异性抗体包含人源免疫球蛋白1的Fc区段、抗体可变区1和抗体可变区2，所述的抗体可变区1为单链可变区段，该单链可变区段对荧光素FITC具有特异性结合能力；所述的抗体可变区2为单链可变区段，该单链可变区段针对的免疫细胞选自淋巴T细胞、NKT细胞或CIK细胞。

2.根据权利要求1所述的一种双特异性抗体FITC×CD3，其特征在于：所述的抗体可变区1对FITC修饰的抗体、多肽具有特异性结合能力；所述的抗体可变区2对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。

3.根据权利要求1所述的一种双特异性抗体FITC×CD3，其特征在于：所述的人源免疫球蛋白1的Fc区段包括人或者人源化的Fc片段；所述的抗体可变区1、抗体可变区2分别融合在Fc区段的两端，或者抗体可变区1、抗体可变区2同时融合在Fc区段的N末端或C末端。

4.根据权利要求3所述的一种双特异性抗体FITC×CD3，其特征在于：所述的抗体可变区1和抗体可变区2都融合在Fc的N端；或者抗体可变区1融合在Fc的N端、抗体可变区2融合在Fc的C末端。

5.权利要求4所述的双特异性抗体FITC×CD3的DNA表达片段，其基因序列分别为SEQID NO：5和SEQ ID NO：8。

6.一种构建的质粒表达载体，其特征在于：质粒中含有权利要求5中所述的DNA表达片段，所述的表达载体是pcDNA3.1(+)。

7.权利要求1-4中任意一项所述的双特异性抗体FITC×CD3的制备方法，其步骤为：

(1)将权利要求6中所述的质粒表达载体转染到细胞中，培养并取培养基上清；

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体FITC×CD3的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞是真核包括CHO细胞；步骤(2)所述的分离纯化步骤包括：使用蛋白A亲和层析柱从培养基上清中捕获带有Fc区段的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

9.权利要求1-4中任意一项所述的双特异性抗体FITC×CD3在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体FITC×CD3在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发性或继发性癌、黑色素瘤、血管瘤、白血病以及肉瘤。