CN107881134A

CN107881134A - 一种箭筈豌豆根瘤菌株系vs5‑1及其应用

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Publication number: CN107881134A
Application number: CN201711435445.2A
Authority: CN
Inventors: 徐开未; 陈远学; 彭丹; 周元; 徐祯; 蒋帆; 刘士山
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN107881134B

Abstract

一种箭筈豌豆根瘤菌株系VS5‑1及其应用，该菌株是从新鲜的箭筈豌豆根瘤中分离纯化得到的，属于根瘤菌属Rhizobium anhuiense株系。该菌株系于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2017605。本发明所述的箭筈豌豆根瘤菌VS5‑1应用于四川箭筈豌豆的生产，是一种共生固氮能力强，对箭筈豌豆增产效果明显，兼具有分泌IAA能力、溶磷能力、溶钾能力、抗逆性强的优良箭筈豌豆根瘤菌株，在不施氮肥和其他肥料只接种根瘤菌VS5‑1的情况下，使箭筈豌豆鲜草增产85.2％以上，鲜根产量增产119.3％。

Description

一种箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1及其应用。

背景技术

箭筈豌豆(Vicia sativa L.)，又名大巢菜，属于豆科(Leguminosae)野豌豆属的一个栽培品种，它主根肥大，入土浅，根瘤多，叶呈箭筈状，因此命名为箭筈豌豆，其原产地在欧洲南部和亚洲西部，20世纪40年代开始引入我国种植栽培，我国种植范围达青海、江苏、湖南、台湾等29个省(区)(洪汝兴等，1985)。箭筈豌豆作为一种优良的饲料和绿肥兼用作物，营养价值高、茎枝柔嫩、叶量多、适口性好，是生产中使用较为普遍的绿肥种质资源(卢秉林等，2015；赵贺靖，2015)。箭筈豌豆还具有耐旱、耐贫瘠、抗逆性强的特点，其可通过生物固氮作用抑制土壤退化和节约氮肥使用量，是各种作物的良好前作。在豆科植物生产过程中可以不施用化肥仅用高效根瘤菌接种以达到作物增产的目的。例如巴西种植大豆不施氮肥只接种有效根瘤菌，产量与每公顷施400kg化肥的相当，每年节约的氮肥价值达25亿美元。美国通过接种根瘤菌，每年生物固氮量约为620万t，占美国当年消耗氮肥总量的55％以上。因此，人工接种根瘤菌是促进豆科植物生长、提高豆科作物产量，改善生态环境的一项重要农业措施。

目前关于箭筈豌豆根瘤菌筛选研究报道多集中青海、甘肃等西北地区。王雪翠(2016)从青海主产区采集箭筈豌豆分离筛选到61株根瘤菌进行水培回接试验和离体耐盐性评价，发现其中5株结瘤效果好，但耐盐性能不一，这5株根瘤菌耐盐极限在0.9％-1.2％之间，最后再通过盆栽试验得到两株兼顾固氮效果和耐盐性好的根瘤菌J3-12-1和J5-5-3。付萍(2015)选择3株箭筈豌豆根瘤菌对3个箭筈豌豆品种进行盆栽试验研究其结瘤固氮效果，发现与不接菌处理相比，接种根瘤菌可以显著提高箭筈豌豆株高、根瘤鲜重、植株全氮含量及固氮酶活性。在甘肃甘南州夏河县进行大田验证实验，发现接种根瘤菌显著促进箭筈豌豆生长，干草产量与CK比增加21.2％-28％，说明选用的菌株能促进甘肃箭筈豌豆的生长。但根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在高效根瘤菌的筛选中，需要注意根瘤菌对应用地区环境的适应能力(陈文新等，2004)。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株(Jia et al，2008；陈文新等，2011)。目前适合四川生态环境箭筈豌豆高效根瘤菌的研究几乎是空白。

现有研究表明，极少数根瘤菌还具有溶磷、分泌生长激素(IAA)等促生特性。师尚礼(2007)等对730余株苜蓿根瘤菌进行研究初筛到29株具有较好促生能力的根瘤菌，仅从这29株根瘤菌筛选到10株分泌IAA能力强的根瘤菌，对这29株菌进行溶解有机磷和无机磷能力的测定，发现全部菌株没有溶解无机磷的能力，这29个苜蓿根瘤菌都能够溶解有机磷，但溶磷能力差异较大，仅8个菌株有较强的溶解有机磷的能力，其余菌株有弱或微弱的溶有机磷的能力。本课题组从四川分离筛选到200余株大豆根瘤菌，发现其中4株高效固氮根瘤菌还兼具较好的溶磷、溶钾、分泌IAA等促生能力、且抗逆性较强的多功能菌株，于是这4个菌株申请了4个发明专利，现已获授权。因此筛选优质高效多功能促生根瘤菌株尤为重要，使根瘤菌由固氮促生拓展到固氮、溶磷、分泌IAA多功能促生。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种与四川主栽品种---川北箭筈豌豆匹配的高效固氮根瘤菌株系VS5-1，具有分泌IAA、一定溶磷、溶钾能力，并有较好的田间生产应用前景。

本发明的技术方案如下：

一种箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1，其分类命名为Rhizobium anhuiense VS5-1，于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2017605。

所述的箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1应用于四川箭筈豌豆的生产。

本发明的有益效果：

本发明所述的箭筈豌豆根瘤菌VS5-1是一种共生固氮能力强，对四川箭筈豌豆亲和性好、增产明显，兼具有分泌IAA能力、具有溶磷、解钾能力、抗逆性强的优良箭筈豌豆根瘤菌菌株，并且在不施氮肥、仅接种VS5-1时，使箭筈豌豆鲜草产量增产85.2％以上，鲜根产量增产119.3％。

附图说明

图1为箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1在YMA培养基上的菌落形态；

图2为箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1的16S rRNA基因序列的系统发育图；

图3为箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1的recA、atpD、glnII三个持家基因联合构建的系统发育图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的分离、纯化和保存

从四川省德阳市中江县新拱桥村采集的野生箭筈豌豆中，选择健壮植株主根上大且饱满红色根瘤，根瘤洗净，带部分根皮采下，进行表面消毒：用95％乙醇浸泡5min消除表面张力，再用升汞(0.1％m/v)表面消毒5min，最后用无菌水冲洗6-8次。在无菌环境下将根瘤放入灭菌后的白瓷板上，用竹签夹破根瘤涂抹在YMA培养基的平板上，进行划线纯化，在28℃的恒温箱中培养。YMA培养基配方：KH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，钼酸铵(1％)2mL，硼酸(1％)2mL，刚果红(1％)2.5mL，甘露醇10g，酵母粉0.8g，琼脂18～20g，水1000mL，pH6.8-7.0。

待长出菌落后，从平板上挑选形态上像根瘤菌的不吸红单菌落在平板上进行稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到7d左右，因慢生根瘤菌需6～15d出现菌落。稀释划线平板分离法进行纯化。从以下两方面初步判定菌落是否为根瘤菌：(1)YMA培养基上的菌落形态：乳白色、不吸红、菌落圆形、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较湿润、较粘稠。培养3～5d长出菌落的为快生根瘤菌，培养6～10d长出菌落的为慢生根瘤菌。(2)细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G^-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。

本实施例的分离纯化得到的菌株VS5-1为快生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度较高、稍透明，2～3d长出菌落，经革兰氏染色镜检为G^-，呈小杆状。

实施例2根瘤菌的回接试验

根瘤菌的回接试验用砂培法，试验中用的箭筈豌豆品种是川北箭筈豌豆，来源于四川资阳市雁江区雁江镇响水村。在光照室(控温22～24℃，光照强度2800勒克斯左右，日照时间14h)进行，种植46d收获。定期补充灭菌无氮营养液，将箭筈豌豆根瘤菌VS5-1接种到砂培器中，砂培器采用300mL的塑料杯，基质选用蛭石，以不接种箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的同品种植株为对照CK，各处理均重复三次。收获后用箭筈豌豆植株的根瘤数及植株干重来评价箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的接种效果。

(1)菌液培养：将箭筈豌豆根瘤菌VS5-1接种于YMA液体培养基中，放置摇床上用120rpm/min转速，28℃培养至对数生长期(约3d左右)。

(2)种子的催芽：选择粒大、饱满的无损伤的箭筈豌豆种子，用95％酒精浸5min，倒去酒精，加入升汞(0.1％m/v)浸泡表面消毒5min，再用无菌水清洗6～8次，每次5min。最后将种子撒在灭菌后的木屑里进行催芽，催芽温度28℃，待主根长到2～3cm左右，须根未长出时播种。

(3)砂培器的制作：选用300mL的塑料杯作砂培器，先将灭菌后的蛭石加入灭菌过的塑料杯中体积占整个杯子的3/4，再加入无菌无氮营养液保持蛭石湿润即可，塑料杯和蛭石分别灭菌，选择粒径为2-4mm的石英砂铺面用来隔断霉菌污染，石英砂也需灭菌。

(4)无氮营养液配方：0.46g硫酸钙，0.136g磷酸氢二钾，0.075g氯化钾，0.075g柠檬酸铁，0.06g硫酸镁，0.03g硝酸钙，1000mL蒸馏水，1mL微量元素溶液

(5)微量元素溶液配方：2.86g硼酸，1.81g硫酸锰，，0.8g硫酸铜，0.22g硫酸锌，0.02g钼酸加蒸馏水至1000mL。

(6)种植及测定指标：将催芽种子栽入装好蛭石的塑料杯中，用移液枪吸取菌液2mL轻轻打在箭筈豌豆根部附近。另设不接种处理的同品种植株为对照(CK)。种植时先种CK避免接菌污染，各处理重复3次。砂培试验结果列于表1。

表1结果表明，所述箭筈豌豆根瘤菌VS5-1与供试川北箭筈豌豆表现出较好的结瘤能力和共生固氮能力；与不接种箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的对照相比，VS5-1能显著提高川北箭筈豌豆的植株干重，比不接种根瘤菌的对照提高66.68％。可见，所述箭筈豌豆根瘤菌VS5-1是与川北箭筈豌豆匹配好的优良高效菌株。

表1箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的砂培试验结果

注：数据为三次重复的平均值；

实施例3箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的抗逆能力

对箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的抗逆能力主要进行了耐盐、耐酸碱的测定。以YMA培养基为基础培养基，均以pH7、28℃培养7d的YMA平板为阳性对照(CK)。将上述的箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的YMA斜面培养物用无菌水刮洗制作为菌悬液待用。采用点接种方法，每个处理重复3次。耐酸碱、耐盐试验的平板均在28℃培养3d后观察记载结果。

(1)耐酸碱测定用培养基配方：以YMA培养基为基础培养基，用HC1和NaOH调节pH值，使培养基的pH值依次为4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

(2)耐盐性测定用培养基配方：以除去NaCl的YMA培养基为基础培养基，设定NaCl的浓度，使培养基的NaCl浓度依次为0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％和4％(质量体积分数)。

试验结果表明，箭筈豌豆根瘤菌VS5-1耐酸碱能力较强，能在pH值从4～11的平板上生长，但过酸或过碱的平板上菌落直径小于pH7的阳性对照，说明过酸过碱对其生长有一定的抑制作用；耐盐能力也较强，在NaCl浓度0.2％-0.5％的YMA平板能生长。

实施例4箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的促生能力

所述的箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的促生能力主要考察了分泌植物生长素(IAA)、溶磷能力和溶钾能力。

(1)分泌植物生长素能力的测定

采用比色法测定根瘤菌分泌植物生长素(IAA)的能力，测定培养基采用改良的刚果红液体培养基，培养基组成：10g甘露醇、1g酵母膏、1g NH₄NO₃、0.5gK₂HPO₄·3H₂O、0.2gMgSO₄·7H₂O、0.1gNaCl、10mL刚果红(0.25％)、100mg L-色氨酸、1000mL蒸馏水、pH＝7.0。比色液配方：0.5M FeCl₃1mL、浓H₂SO₄30mL、蒸馏水50mL。

将菌株接种于盛有50mL培养基的三角瓶中，置于转速160rpm/min，温度28℃的摇床培养，3次重复，培养7d后，8000rpm/min离心10min，取菌液10mL，加入10mL比色液，避光30min后在紫外分光光度计上选择波长530nm测定OD值。根据标曲换算IAA含量。标曲的制作：用IAA储备液配成0、5、10、20、40mg/L的系列标准液作工作液。比色结果测定，根瘤菌VS5-1分泌IAA 9.28mg/L，表明根瘤菌VS5-1具有分泌IAA的能力。

(2)溶有机磷和无机磷的能力

选用溶磷圈法测定菌株溶有机磷和无机磷的能力。有机磷源为卵磷脂，无机磷源为Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄·2H₂O、FePO₄·2H₂O，以上试剂均为市售分析纯试剂。将蒙金娜培养基和PKO培养基制好平板，菌种制备及点接种方法同实施例3抗逆性试验，各处理重复3次。在28℃培养箱里培养7d后观察菌株是否生长及是否有溶磷圈出现。

1)溶解有机磷能力的养基用蒙金娜培养基配方(g/L)：10g葡萄糖，5g CaCO₃，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.4g酵母粉，0.3g KCl，0.2g卵磷脂，0.3gNaCl，0.03g MnSO₄·4H₂O，0.03gFeSO₄·7H₂O，20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH值6.8～7.0。其中卵磷脂用75％酒精加热溶解，单独灭菌，与灭菌冷却至60℃左右的培养基混合后倒平板。

2)溶解无机磷能力的培养基用PKO培养基配方(g/L)：10g葡萄糖，3.0g上述无机磷源物质(Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄·2H₂O、FePO₄·2H₂O)，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.2g KCl，0.2g NaCl，0.03gMnSO₄，0.03g MgSO₄·7H₂O，0.003g FeSO₄·7H₂O，0.5g酵母粉，20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH值6.8～7.0，其中磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁用研钵碾碎过300目筛并单独干热灭菌后，与灭菌温度降至60℃左右的培养基混合倒平板。

结果表明，箭筈豌豆根瘤菌VS5-1对有机磷源物质和磷酸钙具有一定的溶解能力，在磷酸铝与磷酸铁培养基上不生长。卵磷脂、磷酸钙平板上测定的溶磷圈直径与菌落直径比值分别为1.57、1.26，表明根瘤菌VS5-1具有一定溶有机磷和溶磷酸钙的能力。

(3)溶钾的能力

用火焰光度法测定溶钾能力。钾源选择水洗钾长石矿粉(800目)。无钾培养液(1L)：蔗糖10g，MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，pH7.2～7.4。

使用250mL三角瓶做摇瓶，装入无钾基础液体培养基100mL，添加钾长石矿粉(800目)0.5g，接种5mLVS5-1的菌悬液，对照接等量无菌水，设置3个重复，28℃160rpm/min培养7d，取10mL培养液，8000rpm/min离心10min，取上清液，用火焰光度计法测上清液中可溶性钾的含量。标曲的制作：用钾标液配成0、5、10、20、30、40、50mg/L的系列标准液作工作液。通过上机结果测定，根瘤菌VS5-1溶解钾2.48mg/L，表明根瘤菌VS5-1具有溶钾的能力。

实施例5箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的16S rRNA基因及其他持家基因recA、glnII、atpD的扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，用表2所示引物分别对上述4个基因进行PCR扩增，PCR反应用Bio-RAD MyCyclerTM仪器，PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到成都擎科梓熙生物技术有限公司进行序列的测定，用软件DNAman 6.0进行基因序列相似度的计算。

表2本试验中所用PCR引物

注：Y＝C or T,H＝A,C or T,R＝A or G,S＝C or G,K＝G or T,N＝A,C,G or T,I＝inosine,M＝A or C,N＝anybase..

(1)16S rRNA基因的扩增及系统发育树的构建

以总DNA为模板，用表2通用引物P1和P6扩增16S rRNA基因。PCR反应体系(50μl)：2×PCRMix 25μl，引物P1和P6(10μM)各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后成都擎科梓熙生物技术有限公司测序的结果如SEQIDNo1。

SEQID No116S rRNA基因序列：

ACTGGCGGCTGCTTACCATGCAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCTTGACTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGGTCAAGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCT-CTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGATCAGTCAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGTCGATCTGGAGTATGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGCCCGGCTACTTGCAGAGATGCAAGGTTCCCTTCGGGGACCGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTAGTAGCG

将所得的序列结果在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对，选择相似度高的模式菌株作为参比菌株，构建系统发育树。发现与根瘤菌VS5-1的16S rRNA基因序列相似度最高的模式菌株是Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T，相似度为99.31％。运用序列在EzTaxon上比对的结果，用Mega7软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行16S rRNA基因系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，其系统发育树见图2。

(2)多位点基因序列的联合系统发育树的构建

为进一步更准确地确定箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的分类地位，另选择3个位点的持家基因recA、glnII和atpD序列进行联合系统发育树的构建。

扩增recA用引物recAF2、recAR2，atpD用引物atpDF1和atpDR，glnII用引物GSII-5和GSII-6，引物序列如表2所示。反应体系为30μl，反应液组成如下：反应体系(30μl)为：2×PCR Mix 15μl；10mM的正向引物和反向引物各0.5μl；DNA模板1μl；ddH₂O13μl。

1)recA扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸2min。

2)glnII扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸7min。

3)atpD扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，57.5℃退火1min，74℃延伸1.5min，循环30次；74℃最终延伸5min。

扩增产物按上述方法检测后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，对每个基因进行两向测序(正、反引物的序列)，然后将正、反引物序列用DNAman 6.0软件拼接，去掉正、反引物的序列后分别获得atpD序列大小为496nt、序列结果如SEQID No2，glnII序列大小为637nt、序列结果如SEQID No3，recA序列大小为493nt、序列结果如SEQIDNo4。

atpD基因序列SEQID No2：

CATCGGCGAGCCGGTCGACGAAGCCGGTCCGCTGGTCACCGCTCACAAGCGCGCCATCCACCAGGATGCGCCGTCCTATGTCGAGCAGTCGACGGAATCGCAGATTCTCGTCACCGGCATCAAGGTCGTTGACCTTCTCGCTCCCTATGCACGCGGCGGCAAGATCGGCCTGTTCGGCGGCGCTGGCGTCGGCAAGACCGTTTTGATCATGGAACTGATCAACAACGTCGCCAAGGCGCATGGTGGTTATTCGGTTTTTGCGGGCGTCGGTGAACGTACCCGCGAAGGCAACGACCTCTACCACGAAATGATCGAATCTAACGTCAACAAGCATGGCGGCGGTGAAGGTTCGAAGGCCGCGCTGGTTTACGGCCAGATGAACGAACCGCCGGGCGCCCGCGCCCGTGTCGCCCTGACCGGCCTGACGGTCGCTGAACATTTCCGCGACCAGGGCCAGGACGTTCTGTTCTTCGTCGACAACATCTTCCGCTTCACGglnII基因序列SEQID No3：

CGATGGGTACACTCCGGTACCGAACCTGCGTGGCAAGACGCAGATCAAGGAATTCGACGCATTCCCGACGCTGGAACAGCTTCCGCTCTGGGGCTTTGACGGCTCCTCGACGCAGCAGGCTGAAGGCCGCAGCTCCGATTGCGTGCTGAAGCCGGTCGCCATCTATCCCGACCCGGCCCGCACCAACGGCGCTCTCGTCATGTGCGAAGTCATGATGCCGGATGGCGTCACGCCGCACGCATCGAATGCCCGCGCCACCATCCTCGACGACGAAGATGCCTGGTTCGGCTTCGAGCAGGAATATTTCTTCTACCAGAACGGCCGTCCGCTCGGCTTCCCCGAGCAGGGCTACCCGGCTCCGCAGGGTCCCTACTACACCGGCGTCGGCTATTCGAATGTAGGCGACGTCGCCCGCGAAATCGTCGAAGAACATCTCGACCTCTGCCTCGCTGCCGGCATCAATCACGAAGGCATCAATGCCGAAGTGGCCAAGGGCCAGTGGGAATTCCAGATTTTCGGCAAGGGCTCCAAGAAGGCCGCCGACCAAATCTGGATGGCACGCTACCTCTTGCAGCGCCTGACCGAAAAGTACGGCATCGACATCGAGTATCACTGCAAGCCGCTCGGTGACACCGAC

recA基因序列SEQID No4：

CTCGATTATGAAACTCGGCTCCAACGAGAACGTTGTCGAGATCGAGACGATCTCGACCGGCTCGCTTGGCCTCGATATCGCACTTGGCGTCGGCGGCCTGCCGAGGGGCCGCATCATCGAAATTTACGGGCCGGAAAGCTCCGGTAAAACGACGCTTGCGCTGCAGACCATTGCCGAAGCGCAGAAAAAGGGCGGTATCTGCGCCTTCGTCGATGCCGAGCATGCGCTCGATCCTGTCTATGCCCGCAAGCTTGGCGTCGATCTGCAGAACCTTCTGATCTCGCAGCCCGATACCGGCGAGCAGGCGCTTGAAATCACCGATACGCTGGTGCGCTCCGGCGCCGTCGACGTCCTCGTCGTCGACTCGGTCGCCGCACTGACACCACGCGCCGAAATCGAAGGCGAGATGGGCGACAGCCTTCCCGGCCTGCAGGCGCGCCTGATGAGCCAGGCGCTGCGCAAGCTAACCGCTTCGATCTCGAAGTCGAACACC

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，应用每个基因序列在NCBI上比对结果，选择与3个基因相似度高的6株模式菌株作为建树的参比菌株。3个基因(recA、glnII和atpD)联合系统发育树的构建：先将recA、atpD、glnII3个持家基因的序列分别与参比菌株的相应基因序列，用MEGA7比对，以最小长度为标准剪齐，将剪齐后的序列保存为FASTA格式，剪齐后三个基因序列长度分别为342nt、350nt、438nt，用WORD打开将3个序列拼接在一起，用MEGA7软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行联合系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，recA、atpD、glnII联合系统发育树如图3所示。

发现与箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的recA、glnII和atpD三个位点持家基因的序列相似度最高的模式菌株均是Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T，与该模式菌株的相似度分别为100％、99.09％、98.86％。

图2和图3显示，VS5-1的16S rRNA基因以及recA、atpD、glnII3个持家基因联合序列与模式菌株Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T在同一分支节点上。又如前分析，所述菌株与该模式菌株Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T的这4个基因的相似度很高，16SrRNA、recA、glnII和atpD的相似度分别为99.31％、100％、99.09％、98.86％，表明菌株VS5-1属Rhizobium anhuiense。

实施例6田间接种效果

所述菌株的田间接种效果试验选择四川崇州市桤泉镇四川农业大学现代农业基地进行。

本试验共设两个处理，接种箭筈豌豆根瘤菌VS5-1和不接种对照处理(CK)，豆种选择四川箭筈豌豆主栽品种“川北箭筈豌豆”，未施用任何化学肥料和有机肥。采用田间随机区组排列。试验于2016年9月30日～2017年4月15日进行。将制备好的箭筈豌豆根瘤菌VS5-1菌剂(活菌数2.4×10⁸CFU/g菌剂)与箭筈豌豆拌种，阴干后撒播。小区面积7m²，播种时先播CK，以避免CK处理受接种根瘤菌的影响。在植株盛花期(生育期197d)采样，测定植株有效瘤数、总根瘤数、地上部分植株鲜重、地下部分根鲜重、鲜草产量。期间的管理按农户种植箭筈豌豆的常规管理执行。

表3箭筈豌豆接种根瘤菌VS5-1的田间接种效果

注：数据为三次重复的平均值

接种箭筈豌豆根瘤菌VS5-1的处理，在盛花期的有效瘤数、总根瘤数、鲜草产量均比不接种对照高，鲜草产量增产85.2％，鲜根产量比CK增加119.3％。目前有关箭筈豌豆根瘤菌筛选及田间应用的报道较少，仅发现甘肃地区接种根瘤菌对箭筈豌豆生长影响的研究(付萍，2015)，其接种根瘤菌处理比不接种根瘤菌(对照CK)增产21.2％-28％。尚无四川箭筈豌豆根瘤菌对箭筈豌豆生长及产量影响的相关报道。因此箭筈豌豆根瘤菌VS5-1是适合四川箭筈豌豆生产中大面积推广应用的优良高效根瘤菌。

在四川崇州市桤泉镇的田间接种试验研究发现，接种箭筈豌豆根瘤菌VS5-1后，植株有效瘤数、总根瘤数和鲜草产量均高于不接种对照，鲜草产量增产85.2％，鲜根产量比CK增加119.3％，地上地下部分生物量的增加说明根瘤菌VS5-1促进了箭筈豌豆的生长。可见，本发明分离获得的箭筈豌豆根瘤菌VS5-1可以用于四川箭筈豌豆生产中大面积的推广应用。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1及其应用

<141> 2017-12-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 根瘤菌(rhizobium anhuiense)

<400> 1

actggcggct gcttaccatg cagtcgagcg ccccgcaagg ggagcggcag acgggtgagt 60

aacgcgtggg aatctaccct tgactacgga ataacgcagg gaaacttgtg ctaataccgt 120

atgtgtcctt cgggagaaag atttatcggt caaggatgag cccgcgttgg attagctagt 180

tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tccatagctg gtctgagagg atgatcagcc 240

acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 300

aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg cgtgagtgat gaaggcccta gggttgtaaa 360

gctctttcac cggagaagat aatgacggta tccggagaag aagccccggc taacttcgtg 420

ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta gcgttgttcg gaattactgg gcgtaaagcg 480

cacgtaggcg gatcgatcag tcaggggtga aatcccaggg ctcaaccctg gaactgcctt 540

tgatactgtc gatctggagt atggaagagg tgagtggaat tccgagtgta gaggtgaaat 600

tcgtagatat tcggaggaac accagtggcg aaggcggctc actggtccat tactgacgct 660

gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 720

gatgaatgtt agccgtcggg cagtatactg ttcggtggcg cagctaacgc attaaacatt 780

ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 840

gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa ccttaccagc ccttgacatg 900

cccggctact tgcagagatg caaggttccc ttcggggacc gggacacagg tgctgcatgg 960

ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc 1020

ccttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggggact gccggtgata agccgagagg 1080

aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgggc tgggctacac acgtgctaca 1140

atggtggtga cagtgggcag cgagcacgcg agtgtgagct aatctccaaa agccatctca 1200

gttcggattg cactctgcaa ctcgagtgca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1260

agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1320

ttggttttac ccgaaggtag tgcgctaacc gcaaggaggc agctaaccac ggtagtagcg 1380

<210> 2

<211> 496

<212> DNA

<213> 持家基因(atpd)

<400> 2

catcggcgag ccggtcgacg aagccggtcc gctggtcacc gctcacaagc gcgccatcca 60

ccaggatgcg ccgtcctatg tcgagcagtc gacggaatcg cagattctcg tcaccggcat 120

caaggtcgtt gaccttctcg ctccctatgc acgcggcggc aagatcggcc tgttcggcgg 180

cgctggcgtc ggcaagaccg ttttgatcat ggaactgatc aacaacgtcg ccaaggcgca 240

tggtggttat tcggtttttg cgggcgtcgg tgaacgtacc cgcgaaggca acgacctcta 300

ccacgaaatg atcgaatcta acgtcaacaa gcatggcggc ggtgaaggtt cgaaggccgc 360

gctggtttac ggccagatga acgaaccgcc gggcgcccgc gcccgtgtcg ccctgaccgg 420

cctgacggtc gctgaacatt tccgcgacca gggccaggac gttctgttct tcgtcgacaa 480

catcttccgc ttcacg 496

<210> 3

<211> 637

<212> DNA

<213> 持家基因(glnii)

<400> 3

cgatgggtac actccggtac cgaacctgcg tggcaagacg cagatcaagg aattcgacgc 60

attcccgacg ctggaacagc ttccgctctg gggctttgac ggctcctcga cgcagcaggc 120

tgaaggccgc agctccgatt gcgtgctgaa gccggtcgcc atctatcccg acccggcccg 180

caccaacggc gctctcgtca tgtgcgaagt catgatgccg gatggcgtca cgccgcacgc 240

atcgaatgcc cgcgccacca tcctcgacga cgaagatgcc tggttcggct tcgagcagga 300

atatttcttc taccagaacg gccgtccgct cggcttcccc gagcagggct acccggctcc 360

gcagggtccc tactacaccg gcgtcggcta ttcgaatgta ggcgacgtcg cccgcgaaat 420

cgtcgaagaa catctcgacc tctgcctcgc tgccggcatc aatcacgaag gcatcaatgc 480

cgaagtggcc aagggccagt gggaattcca gattttcggc aagggctcca agaaggccgc 540

cgaccaaatc tggatggcac gctacctctt gcagcgcctg accgaaaagt acggcatcga 600

catcgagtat cactgcaagc cgctcggtga caccgac 637

<210> 4

<211> 493

<212> DNA

<213> 持家基因(reca)

<400> 4

ctcgattatg aaactcggct ccaacgagaa cgttgtcgag atcgagacga tctcgaccgg 60

ctcgcttggc ctcgatatcg cacttggcgt cggcggcctg ccgaggggcc gcatcatcga 120

aatttacggg ccggaaagct ccggtaaaac gacgcttgcg ctgcagacca ttgccgaagc 180

gcagaaaaag ggcggtatct gcgccttcgt cgatgccgag catgcgctcg atcctgtcta 240

tgcccgcaag cttggcgtcg atctgcagaa ccttctgatc tcgcagcccg ataccggcga 300

gcaggcgctt gaaatcaccg atacgctggt gcgctccggc gccgtcgacg tcctcgtcgt 360

cgactcggtc gccgcactga caccacgcgc cgaaatcgaa ggcgagatgg gcgacagcct 420

tcccggcctg caggcgcgcc tgatgagcca ggcgctgcgc aagctaaccg cttcgatctc 480

gaagtcgaac acc 493

Claims

1.一种箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1，其特征在于：于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017605。

2.根据权利要求1所述的箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1的应用，其特征在于：该根瘤菌株系应用于四川箭筈豌豆的生产。

3.根据权利要求2所述的箭筈豌豆根瘤菌株系VS5-1的应用，其特征在于：将含有活菌数2.4×10⁸CFU/g的箭筈豌豆根瘤菌VS5-1菌剂与箭筈豌豆拌种，阴干后撒播。