CN107858356A - 一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用 - Google Patents

一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用，能够特异性结合143B的核酸适配体序列LP4：5’‑ ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT‑3’。本发明所述核酸适配体具有高特异性、高亲和力、可体外合成及修饰、化学性质稳定、药代动力学性质佳、无免疫原性等特点，在研究骨肉瘤转移的转移性肿瘤标志物、转移性骨肉瘤的靶向诊断和治疗方面，以及在制备骨肉瘤转移的诊断试剂、治疗骨肉瘤转移的药物等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用
技术领域
本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特性之一,也是肿瘤治疗失败的最根本原因。大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移。骨肉瘤（Osteosarcoma）是青少年中最常见的原发于骨的恶性肿瘤，具有很高的全身转移倾向，大约20%的患者在初次诊断时已经发生肺转移，另外还有40%的患者晚期发生远处器官转移。目前，针对骨肉瘤的主要治疗措施是截肢以及手术前后的化疗、关键部位的放疗等，但无论是原发性骨肉瘤还是转移性骨肉瘤，对常规的化疗药物都具有耐药性，肿瘤耐药是骨肉瘤患者保肢手术治疗失败及发生转移的主要原因，而肿瘤发生转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。因此，准确地对骨肉瘤及其转移做出早期诊断和有效的抑制，并探求骨肉瘤特异性肿瘤标志物和特异性治疗靶点已经成为骨肉瘤治疗的关键。
核酸适配体是一类有20～100个碱基的单链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以其适宜的空间三维结构特异性识别靶标分子，并与之结合。近年来，核酸适配体以其尺寸小、稳定性高、成本低、易修饰、与靶标亲和力高，特异性好，以及其成产简单，不需要活体或者细胞，可以体外人工合成等优势，在生物医学、生物化学等领域取得了突飞猛进的进展，成为肿瘤研究的一个有效的手段，在未来生物研究领域将有不可估量的发展空间。因此，找到特异性识别人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体，在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
利用Cell-SELEX技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U-2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，从体外合成的随机寡聚DNA文库（5’- ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’）中，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。筛选中引物序列为F-primer：5’-FAM-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’,R-primer：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’,用来扩增。
具体方法如下：
(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：5’- ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
(2)反筛：将步骤(1)准备的文库与低转移性骨肉瘤细胞株U–2OS和正常骨细胞株hFOB1.19共同孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；
(3)正筛：将步骤(2)所得的上清与高转移性骨肉瘤细胞株143B孵育，孵育完成后，洗涤143B细胞，并将143B细胞刮下来，转移至EP管中进行加热变性，之后离心分离，收集上清；
(4)PCR富集：将步骤(3)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中，PCR扩增所用的引物为:
引物F：5’- ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’，
引物R：5’- ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；
(5)单链DNA的纯化：将PCR扩增产物与链霉亲和素包被的琼脂糖球珠孵育，再进行变性解链之后，过滤脱盐，收集到FAM标记的ssDNA，进行冻干；
(6)核酸适配体循环筛选：将步骤(5)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)-(5)的筛选过程。
本发明通过上述方法，获得一条核酸适配体LP4，序列为5’- ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或者人工合成的序列，或任何其他来源的序列；
本发明中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在检测骨肉瘤细胞转移性中的应用；
本发明中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在制备高转移性骨肉瘤细胞株143B的探针中的应用；
本发明中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在制备检测高转移性骨肉瘤的试剂盒中的应用；
本发明中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在涉及和制备治疗高转移性骨肉瘤药物中的应用。
与现代技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，目前，国内外尚没有特异性针对高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体，而本发明首次提供了高特异性、高亲和力结合高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体，而该核酸适配体可应用于生物医学检测。
(2)本发明的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，以活细胞为靶标进行筛选，最大限度的保证了靶蛋白的自然属性，所筛选的核酸适配体具有高特异性和高亲和力，无毒，分子量小，易于合成和标记，成本低，周期短，重现性好，在生物医学检测以及靶向治疗方面将有重要的潜在应用价值。
附图说明
图1为利用流式细胞术分析测定核酸适配体LP4结合高转移性骨肉瘤细胞株143B的解离常数绘制曲线。解离常数Kd=14.44±4.402nM。在图1中，横坐标为DNA浓度（nM），纵坐标为平均荧光强度。
图2为利用流式细胞术分析核酸适配体LP4对高转移性骨肉瘤细胞株143B的偏移。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞百分比，实线为LP4，虚线为未经筛选的单链DNA文库。
图3为利用流式细胞术分析核酸适配体LP4对低转移性骨肉瘤细胞株U-2OS的偏移。在图3中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞百分比，实线为LP4，虚线为未经筛选的单链DNA文库。
图4为利用流式细胞术分析核酸适配体LP4对正常骨细胞株hFOB1.19的偏移。在图4中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞百分比，实线为LP4，虚线为未经筛选的单链DNA文库。
图5为核酸适配体LP4的空间结构示意图。
具体实施方式
本发明结合具体实例参见附图进一步说明如下，然而，这些实施例不应视为对本发明范围的限制。
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，它的序列如下：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT-3’
所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，在4℃，0.137M Na+,0.005M Mg2+条件下，具有特征性的茎环结构，其空间结构如下：
。
所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，对所述的核酸适配体LP4的5’端或者3’端进行FAM、生物素修饰。
所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4的筛选方法，基于Cell-SELEX筛选技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。
利用高转移性骨肉瘤细胞株143B为筛选靶细胞，以与之相对应的低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19为反筛细胞，筛选除去DNA寡核苷酸文库中与低转移性骨肉瘤细胞和正常骨细胞非特异性结合的部分，保证筛选得到的核酸适配体可以特异性结合高转移性骨肉瘤细胞株143B。
另外，采用标准的Cell-SELEX筛选方法，保持筛选细胞的形态和活性完好，保证细胞表面的生物大分子更加接近于生物体内的分子构象。
所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4的筛选方法，它包括以下步骤：
(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：
单链DNA文库：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
(2)反筛：将步骤(1)准备的文库与低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19共同孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；
(3)正筛：将步骤(2)所得的上清与高转移性骨肉瘤细胞株143B孵育，孵育完成后，洗涤143B细胞，并将143B细胞刮下来，转移至EP管中进行加热变性，之后离心分离，收集上清；
(4)PCR富集：将步骤(3)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中PCR扩增所用的引物为：
引物F：5’-FAM-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’
引物R：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；
(5)单链DNA纯化：将PCR扩增产物与链霉亲和素包被的琼脂糖球珠孵育，之后进行变性解链之后，过滤脱盐，收集到FAM标记的ssDNA，进行冻干；
(6)核酸适配体循环筛选：将步骤(5)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)～(5)的筛选过程。
实施例一：核酸适配体LP4的筛选：
所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4的筛选方法，它包括以下步骤：
(1)筛选文库的准备：
委托生工生物工程股份有限公司合成ssDNA文库(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’)；取一管10OD的ssDNA文库，高速离心1min；在通风柜中轻轻打开管盖，加入200μL结合缓冲液（DPBS中含5mM MgCl2，4.5mg/mL葡萄糖，0.1mg/mL tRNA，1mg/mL BSA），涡旋震荡溶解；95℃金属浴5min，迅速冰水浴10min；高速离心1min，备用；
(2)反筛：将步骤(1)准备的文库与低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19共同孵育，用结合缓冲液补足到1mL；4℃旋转孵育器旋转孵育30min；孵育完成后，1000rpm离心，收集上清液；
(3)正筛：将步骤(2)所得的上清转移至高转移性骨肉瘤细胞株143B生长覆盖度到达90%左右的培养皿中；4℃摇床孵育1h；弃上清，用洗涤缓冲液（DPBS中含5mM MgCl2，4.5mg/mL葡萄糖）洗涤143B细胞三遍；用600μL灭菌水将143B细胞刮下来，转移至EP管中，95℃金属浴10min，迅速冰水浴10min；5000rpm离心3min，收集上清；
(4)PCR扩增：取300μL步骤(3)所得的上清样品，加入到1mL PCRmix中；涡旋震荡混匀后，按每管50μL分装进行PCR扩增，扩增条件为：95℃ 预变性 5min， 95℃ 变性 30s， 53℃退火 30s， 72℃延伸 30s，PCR扩增20个循环后， 72℃ 延伸 5min，最后，样品冷却到12℃；
其中1mL PCRmix中含有：H2O 515μL ; 10×PCR缓冲液100μL；引物F：5’-FAM-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’和引物R：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’各10μL；dNTP 60μL；Taq酶5μL。所述的引物F与引物R均委托生工生物工程股份有限公司合成；
(5)ssDNA纯化：将PCR产物与链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶球珠混合，4℃旋转孵育1h；DPBS洗涤变性柱两遍，加入孵育后的琼脂糖球珠，滤液洗三遍后，10mL DPBS洗涤后，加470μL NaOH(0.2M），静置3min后，收集滤液；滤液加入脱盐柱，待流净后，加1mL灭菌水洗脱，同时收集洗脱液，该洗脱液即为富集了的ssDNA文库，冻干后，即可进行下一轮筛选；
(6)核酸适配体循环筛选：将步骤(5)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复(2)-(5)的筛选过程。
实施例二：核酸适配体LP4序列的分析：
经过17轮筛选后，PCR扩增143B细胞正筛的上清，并委托上海生工生物工程有限公司利用高通量测序技术对文库序列进行分析，之后对测序结果进行对比和富集分析。
利用软件 idtdna.com网络平台分析在筛选条件下(4℃，0.137M Na+，0.005M Mg2 +)，该核酸适配体LP4序列的二级结构。分析出核酸适配体LP4序列的二级结构示意图如图5所示。
实施例三：核酸适配体LP4与高转移性骨肉瘤细胞株143B结合能力的分析：
1.将靶细胞143B接种于10cm细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养24h；
2.用结合缓冲液把FAM标记的单链DNA（包括核酸适配体LP4和未经筛选的单链DNA文库）配置成浓度为0nM、20 nM、40 nM、60 nM、80 nM、100 nM、140 nM、200 nM、250 nM、300nM、400 nM、500 nM的溶液；95℃金属浴5min，迅速冰水浴10min；
3.用0.2% EDTA消化细胞，洗涤缓冲液洗涤两遍，将细胞分成12份，每份含细胞数为2×105，加入上述梯度浓度的单链DNA溶液，4℃旋转孵育45min；
4.孵育过后，弃上清，用洗涤缓冲液洗两次，再用DPBS将细胞重悬，体积为400μL；
5.使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定；测试结果用GraphPadPrism 6软件作图，计算出所得的核酸适配体LP4的解离常数为Kd=14.44±4.402nM，如图1所示。图1的检测结果表明：核酸适配体LP4与靶细胞高转移性骨肉瘤细胞株143B的结合能力强，解离常数在纳摩尔级别。
实施例四：核酸适配体LP4与高转移性骨肉瘤细胞株143B、低转移性骨肉瘤细胞株U-2 OS以及正常骨细胞株hFOB1.19的结合特异性分析：
1.接种待测细胞于6cm的细胞培养皿，于37℃，5% CO2培养24h；
2.用0.2% EDTA消化细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，每个样品含细胞数为2×105，加入200μL FAM标记的单链DNA（包括核酸适配体LP4和未经筛选的单链DNA文库），ssDNA的终浓度为250nM，于4℃旋转孵育45min；
3.孵育过后，弃上清，用洗涤缓冲液洗涤两遍，将细胞重悬，体积为400μL；
4.使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定；
所述的待测细胞分别为高转移性骨肉瘤细胞株143B、低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS以及正常骨细胞株hFOB1.19，其中，低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS以及正常骨细胞株hFOB1.19为对照细胞，检测结果如图2～4所示。由图2～4流式细胞术的检测结果证明，本发明的核酸适配体LP4对高转移性骨肉瘤细胞株143B具有较强的特异性识别能力，而对低转移性骨肉瘤细胞株U–2 OS以及正常骨细胞株hFOB1.19无识别能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atccagagtg acgcagcaat gcgtgcgcgg ctccacgcta tgattaattg gacacggtgg 60
cttagt 66
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<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
atccagagtg acgcagcann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntg 60
gacacggtgg cttagt 76
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atccagagtg acgcagca 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actaagccac cgtgtcca 18

Claims (8)

1.一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体LP4特异性结合高转移性人骨肉瘤细胞，其序列如下：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT-3’。
2.根据权利要求1所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于：在4℃、0.137M Na+、 0.005M Mg2+条件下的空间结构如下：
。
3.根据权利要求1所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于：对所述的核酸适配体5’端进行FAM修饰。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U-2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。
5.根据权利要求4所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：5’- ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
(2)反筛：将步骤(1)准备的文库与低转移性骨肉瘤细胞株U-2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19共同孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；
(3)正筛：将步骤(2)所得的上清与高转移性骨肉瘤细胞株143B孵育，孵育完成后，洗涤143B细胞，并将143B细胞刮下来，转移至EP管中进行加热变性，之后离心分离，收集上清；
(4)PCR富集：将步骤(3)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中，PCR扩增所用的引物为:
引物F：5’- ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’，
引物R：5’- ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；
(5)单链DNA的纯化：将PCR扩增产物与链霉亲和素包被的琼脂糖球珠孵育，再进行变性解链之后，过滤脱盐，收集到FAM标记的ssDNA，进行冻干；
(6)核酸适配体循环筛选：将步骤(5)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)-(5)的筛选过程。
6.根据权利要求1～3任意一项所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体在制备治疗高转移性骨肉瘤的靶向探针中的应用。
7.根据权利要求1～3任意一项所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体在制备检测高转移性骨肉瘤的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求1～3任意一项所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体在涉及和制备治疗高转移性骨肉瘤药物中的应用。
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