CN107850603A - 分离器官评估和处理 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在分离器官灌注期间评估和/或处理器官的方法，以及用于执行该评估的试剂盒。

Description

分离器官评估和处理
技术领域
本发明涉及在分离器官灌注期间评估和处理器官的方法，以及用于执行该分析的试剂盒。
背景技术
可以从一个人或动物移植到另一个人或动物的器官包括心脏、肾、肝、肺、胰腺和肠。肾移植最常进行。心脏、肝和肺移植也经常进行。但是，需要器官移植的人比可获得的器官多的多，可悲的是，许多人在等待合适的器官时死亡。
非常重要的是在收获和移植之间将器官保持在最佳的可用状态。为了将器官维持在最佳的可用状态，可以将器官从供体的血液循环分离，并用灌注液(Perfusate)灌注。例如，现在认为离体肺灌注(EVLP)是一个安全的过程，其能够增加可用于移植的肺的数量。在EVLP之后已经进行了超过350次移植。但是，在全世界范围内该过程仅在几个肺移植中心进行。
为了有更多的可用肺以挽救更多的晚期肺病患者，该技术需要被更多的中心采用。但是，目前困难之一是评估器官以确定其是否适合移植的方法不是很先进。如果可获得客观数据以确定是否使用所述器官进行移植，则将更可能更广泛地采用这种技术。
现在的分离器官灌注过程包括从供体取出诸如肺等器官，并将其连接至灌注回路，所述灌注回路包括泵、贮存器、加热器冷却器、氧合器和呼吸机。如果该器官是除肺之外的另一器官，则不使用呼吸机。对器官的脉管系统泵送灌注液。灌注液可以是例如STEEN溶液(参见WO2002/035929)或另一种适合于器官灌注的溶液。该溶液可以含有红细胞，并且可以使其氧合。EVLP仅是分离器官灌注的一种形式。在离体器官灌注模型(EVOP)中也可以对像心脏、肾、肝、胰腺和小肠这样的其它实体器官进行灌注。此外，在体内分离灌注(IVIP)中器官可以在保持在体内的同时与循环分离。分离灌注也可以扩展到包括手、臂、腿或能够暂时与循环分离的任何其它身体部分。
灌注期间可以评估不同的器官特异性参数，但是迄今为止这些参数主要是物理参数。例如，如果所述器官是肺，则已经监视诸如肺血管阻力(PVR)、顺应性和氧合能力等参数。虽然这些参数为用户提供了一些信息，但是它们没有提供关于是否应该选择器官以用于移植的确定信息，因此仍然主要基于主观评估决定是否进行移植。所以，迫切需要可用于在器官灌注评估期间确定器官的品质的另外的客观参数。
文献中关注的分子生物标志物与白细胞介素信号传导有关，特别是IL-1β、IL.6、IL-8，IL-10和TNFα。但是虽然存在数篇出版物，但是尚未显示这些标志物可用于临床环境。一个原因是，它们通常不用现场(point-of-care，PoC)方法进行分析，因此当必须做出是否进行移植的决定时，临床医师不能获得这些信息(即使临床上有价值)。EVLP过程通常持续2至6小时，在这个时间范围内不能获得的信息对于决定是否移植该器官是无用的。
此外，缺血再灌注损伤(IRI)是器官移植的众所周知的并发症。其发生在以氧合血使器官再循环时。虽然是急性期反应，但是认为这种早期损伤的影响是器官受体之后发病和死亡的重要原因。更好的选择和取消选择移植器官的能力可以减轻IRI，改善受体的短期和长期生存和健康。
发明内容
根据第一方面，本发明涉及一种在分离器官灌注期间评估器官的方法，所述方法包括以下步骤：用灌注液灌注所述分离器官；和测定所述灌注液中一种或多种生物标志物的浓度，所述一种或多种生物标志物包括选自由TF、tPA、SpA、SpD或细胞破裂标志物组成的组中的至少一种生物标志物。
根据第二方面，本发明涉及一种在分离器官灌注期间处理器官的方法，所述方法包括用灌注液灌注所述分离器官的步骤，其中所述灌注液包含TF阻遏剂分子。
根据第三方面，本发明涉及TF阻遏剂分子在下调分离器官灌注期间的TF表达中的用途。
根据第四方面，本发明涉及一种用于在分离器官灌注期间分析灌注液的试剂盒，所述试剂盒包含针对TF、tPA、dsDNA、SpA或SpD的免疫学分析或者针对TF或tPA的显色分析或者针对dsDNA的Picogreen分析。
因此，本发明通过测定灌注液中可指示器官健康的一种或多种关键生物标志物的浓度，而提供了一种以客观方式评估器官的非常需要的方法。关于每一种生物标志物的进一步信息在下面给出。
分离器官可以来自动物或人类，并且通常是肺、肾、肝、心脏、胰腺或肠。提及分离，我们是指器官从循环系统中分离。其可以是体内分离或离体分离，如器官灌注中已经了解的。然后对其用灌注液灌注，并且可以分析灌注液。具体而言，测定灌注液中一种或多种生物标志物的浓度。本发明具体涉及测定至少一种以下生物标志物：TF、tPA、SpA、SpD或者诸如双链DNA(dsDNA)、线粒体DNA或核糖体等细胞破裂标志物。
可以对生物标志物的浓度进行单次测定，但是优选的是在预定时间段连续地测定或者以预定间隔重复地测定(优选贯穿灌注期，其通常为1～6小时)所述一种或多种生物标志物的浓度。
为了在实践中利用该评估器官的方法，将灌注液中一种或多种生物标志物的测定浓度与参考值进行比较，然后基于测定浓度与参考值的比较结果如何来选择或取消选择所述器官。这为临床医师提供了用于确定器官是否适合移植的客观参数。虽然仅一种所选择的生物标志物的浓度能够在评估器官时提供有价值的信息，但是当测定至少两种生物标志物的浓度时，该方法是特别有价值的。组合分析可以导致特别好的预测哪些器官会移植成功和不会成功，并且因此可以用于改善患者结果。
另外，根据生物标志物的测定浓度与参考值的比较结果如何，可以实际上处理分离器官。如果满足特定条件，则可以通过向灌注液添加成分来处理分离器官。有利的是，可以通过进一步评估而监视所述成分对分离器官的处理效果。其实例是当TF的测定浓度超过参考值时向灌注液添加TF阻遏剂分子以下调TF表达。不同的特异性生物标志物的其它实例如下讨论。
本发明还涉及在分离器官灌注期间处理器官的方法。如下所讨论的，器官很可能遭受胁迫，其仅仅由脑死亡的负面影响导致或心脏停搏供体的循环停止导致。因此，处理器官可以与评估独立地进行，例如通过向灌注液添加TF阻遏剂分子以下调TF表达而进行。这具有可以立即开始处理的优点，并且通常与评估结合使用，即在评估之前或在评估期间进行处理。
本发明的首要目的是提高移植的成功率，从而改善患者的生活品质。另一个首要目标是处理器官，以使更多的器官能够成功移植，以及更多的人可以从器官移植中受益。器官通常移植到另一个人中，而不是移植回供体中。
具体实施方式
分离器官灌注的独特性在于不存在其它器官系统，使用确定的溶液(例如STEEN溶液)作为灌注液进行的分离器官灌注更是如此。这为调查器官系统提供了独特的机会，但同时，生理是突然的。对于分离器官如何对其非生理环境响应，实际上所知甚少。可以预期的是，器官启动其对例如炎症和凝血的正常生理反应，但是当器官不接收在体内情况下预期的外部响应时会发生什么呢？这是一个很大程度上尚未探索的研究领域。
灌注液是本领域技术人员已知的，例如STEEN溶液。在本发明中可以使用任何合适的灌注液。通常不用全血灌注液进行分离器官灌注。其一个主要原因是血液含有几种酶系统，当其激活时可能会损害器官。这些系统的实例是凝血和补体激活。器官在供体中已经处于胁迫下，并且或多或少受到脑死亡或循环停止的全身性效应带来的损害。该存在的损害可能激活这些酶系统，并进一步损伤器官。存在于全血中的免疫细胞在这些情况下也是特别有害的。因此，认为像STEEN溶液这样包含生理盐、葡聚糖和白蛋白的溶液对器官更安全。由于不存在任何酶系统，也不存在任何血液来源的免疫细胞(除驻留在器官内的那些之外)，所以为器官提供了在最佳条件下痊愈和恢复功能的机会。
该相对纯的系统，允许调查由器官本身和器官接纳的免疫细胞所完成的分子信号传导，而不受来自其它部位的信号传导干扰。
该系统不仅为评估器官功能提供了机会，还为处理器官提供了机会。在分离灌注期间，器官可以用正常或升高剂量的药物或生物制剂处理，因为不会发生全身副作用。
组织因子-背景
组织因子(TF)是跨膜蛋白，当全长时为46KDa。在正常情况下，TF不暴露于血液。当血管内皮发生损伤时，其表达和/或暴露于血液。在如脑和肺组织这样具有高血管含量的器官中TF的表达较高。暴露于血液的TF结合VII(FVII)并将因子VII(FVII)激活成FVIIa。FVIIa仍然与TF结合，该相互作用将FVIIa的活性增强2x 107倍。然后TF和FVIIa将酶原因子IX(FIX)和因子X(FX)激活成FIXa和FXa。FXa和FIXa与其各自的辅因子因子Va和因子FVIIIa结合。FXa将凝血酶原(FII)激活成凝血酶，并且凝血酶将纤维蛋白原切割为纤维蛋白单体，纤维蛋白单体聚合而形成血凝块。因此TF是血凝的有力引发者。
内皮细胞在刺激时被激活产生TF，所述刺激用诸如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL-1β)和CD40配体等促炎细胞因子和也用诸如组胺或血清素等生物胺激活并且通过氧化LDL和VEGF进行(参见Steffel等，2006)。单核细胞和巨噬细胞也被促炎细胞因子和内毒素激活而产生TF。在从内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞释放的微粒中发现循环的TF。这提供了被血小板吸收的TF因子的来源，血小板自身不产生TF。TF的不同剪接形式产生以游离形式释放到循环中的促凝性TF。该形式的TF受细胞因子刺激。
TF也是促炎性的并在凝血-炎症-血栓形成回路中起关键作用。该回路已经涉及许多病症，例如癌症、糖尿病、肥胖症、败血症、DIC、心血管功能障碍或动脉粥样硬化(artheroscheloris)等。
认为TF由单核细胞、巨噬细胞和粒细胞在刺激时表达，并且可溶性组织因子(sTF)由内皮细胞在经促炎细胞因子刺激时释放。已知TF的上调或暴露受LPS、ILs、TNFα、IFN等刺激。也已知其在缺氧期间上调。
来自包含TF的受损组织的膜片段是循环TF的另一来源。
已知TF的下调发生在暴露于以下物质时：HMG-CoA还原酶抑制剂、环氧合酶(COX)抑制剂、紫杉醇、溶血磷脂酰胆碱、胰岛素、烟酰胺、一氧化氮(NO)/或可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、羟基脲、丙酮酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、脂联素、视黄酸、全反式视黄酸、维生素D3、PGJ2、PPARα激动剂激活剂(WY14643和二十碳四烯酸)、肝X受体激动剂、己酮可可碱、酚/白藜芦醇衍生物、吲哚布芬、胺碘酮、二甲双胍、升高的细胞内cAMP和PI3K/Akt/PKB信号传导等。下调TF的其它已知方式是利用miR-19、短发夹RNA、发夹核酶或反义ODN。
已经提出TF参与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的肺损伤。已经显示人源化抗TF抗体在人TF敲入小鼠ARDS模型中改善肺损伤(参见He等，2008)。还已经提到，TF在IRI后上调(参见Yamane等，2005)，尽管数据未示出。已经显示TF在发展心脏同种异体移植血管病的心脏移植受体中上调，(参见Yes等，2002)。显示Pentoxifylin防止肾移植受体中单核细胞TF的上调，并且改善移植物功能(参见Susen等，2000)。然而，所提及的参考文献都不涉及分离器官灌注。在分离灌注期间对器官进行评估或处理之前没有与TF相关联。
组织因子-在本发明中
本发明人指出在EVLP期间TF存在于灌注液中。其随时间增加，并且在被认为不可移植的肺中更是如此。这表明在EVLP期间TF是肺功能的重要生物标志物。由于TF由脉管系统、组织和免疫细胞释放，预期对于其它要移植的实体器官(例如心脏、肝、胰腺、肠和肾)而言同样的情况也是相关的。因此，在分离器官灌注期间对灌注液中来自器官的TF进行分析是器官功能和健康的生物标志物。分离器官灌注可以是体内过程，其中器官仍然在体内，但已与循环分离。此类过程可以例如用于癌症疗法，或用于其中应该避免其它器官中或全身性的不良反应的其它疗法。此外，TF分析可以用作决定在分离灌注期间如何处理器官的参数，无论是体内还是离体。
TF可以通过免疫学或活性检测进行分析。利用当今可获得的技术，活性检测将是优选的，因为灌注液中TF的浓度在皮克至纳克量级内。这样低的浓度良好地适用于基于活性的检测。然而，随着基于免疫的检测技术可能进一步发展，可以考虑PoC免疫检测法。在任何情况下，所使用的检测应在约1小时内或更优选在30分钟内递送结果，以在实际过程期间有用。
活性检测利用由所分析的因子驱动的酶促放大系统。在TF的情况下，此类检测可以基于FVII、FIX、FX或FII激活和底物切割的测定。例如TF活性可以通过添加FVII(其将由TF活化为FVIIa)和FVIIa的底物来测定。FVIIa底物的酶促切割可以动态监视或在停止反应后监视。所述底物可以是显色底物。更放大的检测除了FVII之外还包含FX。在该情况下，TF/FVIIa复合物将FX激活为FXa，并且用FXa底物监视FXa活性。FXa底物的酶促切割可以动态监视或在停止反应后监视。所述底物可以是显色底物。在虽然更复杂但更进一步放大的检测中，也可以使用FII激活，然后在动态反应或停止反应中用FII底物进行监视。
在分离器官灌注期间TF可以测定一次或重复测定。分离器官灌注可以是EVOP、EVLP、体内分离器官灌注(IVIOP)或体内分离肺灌注(IVILP)。对于EVOP、VIOP或者更具体而言EVLP或IVILP而言，可以例如每1/2小时或每小时或每2小时进行测定。
在灌注液中测定的TF可以具有任何来源。例如，其可以作为从濒死细胞或从处于剪应力下的细胞释放的膜胶束存在。其可以是由膜释放的可溶性TF(sTF)，或通过选择性剪接模式直接产生，或者其可以与灌注液内的循环免疫细胞(例如单核细胞或粒细胞)结合，或任何其它来源。
由于TF是高凝状态和促炎状态两者的标志物，TF的增加是移植后受不良影响的器官功能的标志物，并且该水平可以用作器官是否应该进行移植的指标。此外，关于升高的TF水平的信息可用于在IVIOP期间或具体而言IVILP期间监视器官的状态。TF可以用作诱导降低TF活性和/或表达的疗法的信号，从而改善器官。由于TF在分离灌注期间通常稍微增加，所以可以独立于分析而开启该疗法，但是随着灌注液中的TF浓度降低，然后可以在分离器官灌注期间跟踪疗法的效果。
TF疗法可以包括用TF抗体消耗以去除已经形成的TF。更优选的是，该疗法可以包括使用下调TF表达的物质。在本发明的该实施方式中，当TF的测定浓度超过参考值时向灌注液添加TF阻遏剂分子。此类TF阻遏剂分子是现有技术已知的，并且可以例如选自：HMG-CoA还原酶抑制剂、环氧合酶(COX)抑制剂、紫杉醇、溶血磷脂酰胆碱、胰岛素、烟酰胺、一氧化氮(NO)/或可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、羟基脲、丙酮酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、脂联素、视黄酸、全反式视黄酸、维生素D3、PGJ2、PPARα激动剂激活剂(WY14643和二十碳四烯酸)、肝X受体激动剂、己酮可可碱、酚/白藜芦醇衍生物、吲哚布芬、胺碘酮、二甲双胍、升高的细胞内cAMP和PI3K/Akt/PKB信号传导等，或任何这些分子的等效物。下调TF的其它已知方式是利用miR-19、短发夹RNA、发夹核酶或反义ODN。
可以使用生理学接受剂量的一种或多种上述分子单独或组合进行TF的下调。当器官与循环分离时，可以使用一种或多种上述分子的升高浓度而不引起全身性不良事件。
优选的是，TF的下调分子选自：COX抑制剂、紫杉醇、视黄酸、维生素D3、白藜芦醇衍生物、吲哚布芬、胺碘酮或二甲双胍或其组合或任何这些物质的等效物。
对于诸如阿司匹林、萘普生和布洛芬或其等效物等非选择性COX抑制剂而言，COX抑制剂的浓度可以以1mg/l灌注液至10g/l灌注液，更优选10mg/l灌注液至2g/l灌注液，进一步优选150mg/l灌注液至1000mg/l灌注液的浓度使用。
诸如塞来考昔、罗非考昔和其它COX-2选择性NSAID等选择性COX-2抑制剂，可以以1mg/l灌注液至10g/l灌注液，更优选10mg/l灌注液至2g/l灌注液，进一步优选50mg/l灌注液至500mg/l灌注液的浓度使用。
紫杉醇或其等效物的浓度可以为1mg/l灌注液至10g/l灌注液，更优选10mg/l灌注液至2g/l灌注液，进一步优选15mg/l灌注液至500mg/l灌注液。
视黄酸的浓度可以为0.1mg/l灌注液至1g/l灌注液，更优选0.5mg/l灌注液至500mg/l灌注液，进一步优选1mg/l灌注液至100mg/l灌注液。
维生素D3的浓度可以为0.1μg/l灌注液至100mg/l灌注液，更优选1μg/l灌注液至100mg/l灌注液，进一步优选1μg/l灌注液至1mg/l灌注液。
吲哚布芬或其等效物的浓度可以为1mg/l灌注液至10g/l灌注液，更优选10mg/l灌注液至2g/l灌注液，进一步优选15mg/l灌注液至1,000mg/l灌注液。
胺碘酮或其等效物的浓度可以为1mg/l灌注液至10g/l灌注液，更优选10mg/l灌注液至2g/l灌洗液，进一步优选15mg/l灌注液至1.2g/l灌注液。
二甲双胍或其等效物的浓度可以为1mg/l灌注液至50g/l灌注液，更优选10mg/l灌注液至10g/l灌注液，进一步优选100mg/l灌注液至5g/l灌注液。
依赖于TF缩短恶性凝血-炎症周期，在分离器官灌注期间中使用TF抑制疗法，不仅可以改善器官的即时功能，还可以改善随后阶段的功能。在器官移植中，再灌注IRI后的初始损伤是受体未来生存和健康的决定因素。对于肺移植而言，认为IRI是移植数年后发展闭塞性支气管炎综合征(BOS)、排斥和其它形式的器官功能障碍的决定因素。因此通过TF疗法实现的较少的IRI在受体中具有持久效果。
可以使用TF的可接受浓度的特定截止参考值，或者可以在分离器官灌注期间随时间跟踪浓度，并且可以使用所述变化来决定器官是否功能良好或者其是否响应于治疗或处理。分析可以单独使用或与其它分析组合使用。随着测试更多的器官功能，组合方法可以改善分析的灵敏度和/或特异性。
例如，灌注液中TF浓度的截止参考值可以高于50pg/ml或高于75pg/ml或高于100pg/ml或高于130pg/ml或高于150pg/ml或高于175pg/ml或高于200pg/ml。高于这些值的话，器官可以被取消选择用于移植，或者可以做出决定来通过向灌注液中加入诸如TF阻遏剂分子等分子而处理器官。
组织纤溶酶原激活剂-背景
组织纤溶酶原激活剂(tPA)是丝氨酸蛋白酶纤溶酶原的激活剂。激活的纤溶酶原，即纤溶酶，通过纤维蛋白降解来溶解血凝块。因此TPA是纤维蛋白溶解系统的一部分。血凝块和微血栓经常在肺中收集，因为在血液进入全身循环之前，肺起着凝块过滤器的作用。由于肺从空气和血液循环氧合，因此肺对此相对有抵抗力。尽管如此，仍需要不断清除凝块和微血栓。该清除涉及tPA激活纤溶酶原。因此，tPA响应于凝块或微血栓而从肺的内皮释放。其它处的内皮也释放tPA以激活纤溶酶原，并且在所有组织和器官中需要清除血凝块和微血栓。
在Inci等人2007年的研究中，在EVLP期间使用了尿激酶，一种替代性纤溶酶原激活剂。这样做与灌注液中tPA的水平无关。该研究表明，在EVLP期间使用尿激酶改善了来自心脏停搏供体(NHBDs)的肺中的肺功能。已知来自NHBD的器官含有更多的凝块和微血栓，因为供体中的循环已经停止。另一方面，Zhao等人2010年表明tPA耗竭减轻了小鼠模型中的缺血再灌注损伤。之前未在分离器官灌注期间的灌注液中测定过TPA。
组织纤溶酶原激活剂-在本发明中
本发明人理解灌注液中的tPA可以被认为是灌注器官中纤维蛋白溶解状态的标志物。所有器官都可能具有一定程度的凝块或微血栓，因此伴随着tPA释放的内皮响应可被认为是正常的功能性器官反应。如果tPA响应不足，则可能意味着内皮不够健康来响应。然而，如果响应过度升高，则可能暗示器官循环上严重受到血凝块的限制。因此，建议在分离器官灌注期间，健康的器官应该伴随着适度提高的tPA进行响应。由于肺充当用于来自循环中的血凝块和微血栓的过滤器，因此其通常含有比其它器官更多的凝块和微血栓，所以特别依赖于纤维蛋白溶解。
尽管本发明人已经在肺中指出了该效果，但是由于所有的器官都含有脉管系统，因此将tPA释放到灌注液中，并且预期相同的关系。
tPA的分析可以用免疫学方法或作为活性检测来完成。在任何情况下，所使用的检测应在约1小时内或更优选在30分钟内递送结果，以在实际过程期间有用。如果使用活性检测，则可以直接使用tPA底物或通过添加纤溶酶原并用纤溶酶底物测定所得的纤溶酶活性来测量活性。tPA或纤溶酶底物可以是显色底物。
如果分析后认为器官中的tPA活性不足，则可在灌注液中包含纤维蛋白溶解剂。该纤维蛋白溶解剂可以例如是tPA、链激酶或尿激酶。纤维蛋白溶解剂的浓度可以为0.1μg/l灌注液至100mg/l灌注液，更优选1μg/l灌注液至800μg/l灌注液。
已经定义了tPA的参考值，并且可以使用tPA的可接受浓度的特定截止值，或者可以在分离器官灌注期间随时间跟踪浓度，并且可以使用所述变化来决定器官是否功能良好。分析可以单独使用或与其它分析组合使用。随着测试更多的器官功能，组合方法可以改善分析的灵敏度和/或特异性。
例如，截止参考值可以为>4000pg/ml且<7400pg/ml，或者>3500pg/ml且<7400pg/ml，或者>4500pg/ml且<7400pg/ml，或者>4500pg/ml且<8000pg/ml，或者>4000pg/ml且<8000pg/ml，或者>3500pg/ml且<8000pg/ml。作为选择，可以使用单一截止水平。只有当灌注液中tPA的浓度在这些参考值内时，才可以使用这些来确定是否选择该器官以用于移植或用于进一步处理或分析。
TF/tPA比率
促凝和纤维蛋白溶解之间的平衡对于器官功能而言是重要的。因此，TF和tPA之比也可以作为促凝/抗凝比率而提供有价值的信息。尽管我们已经仅在肺中指出了该效果，但是由于所有的器官都含有脉管系统，因此将两种物质释放到灌注液中，并且预期相同的关系。
可以使用与血栓形成/抗血栓形成或血栓形成/纤维蛋白溶解状态有关的其它生物标志物来确定分离器官灌注期间器官的功能。此类生物标志物可以包括分析D-二聚体、血管性血友病因子(vWF)、纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)等。可以分析这些生物标志物以单独或与其它生物标志物相关或与其它生物标志物组合来确定器官功能。
细胞破裂标志物-背景
双链DNA(dsDNA)通常包含在细胞核中。其释放到循环中是异常事件。还存在不释放到健康组织中的循环的其它细胞内成分，如线粒体DNA、核糖体等。
细胞破裂标志物-在本发明中
双链DNA(dsDNA)是细胞破裂标志物，其在灌注液中的存在可被看作是器官内细胞死亡的征兆。细胞死亡可归因于坏死或凋亡，并且可能是对缺氧的响应，当离子泵不再有能量工作时，这导致细胞肿胀。所产生的细胞爆裂使得细胞内产物释放到灌注液中。在分离器官灌注期间测定灌注液中的dsDNA可产生关于器官功能的信息，其中高水平的dsDNA代表器官内更严重的细胞死亡。器官可以例如是肺、心脏、肾、肝、胰腺或肠。作为选择，可以使用线粒体DNA或核糖体代替dsDNA以用于分析。
可以使用免疫学方法或使用dsDNA特异性核酸染色(例如)来分析dsDNA。在任何情况下，所使用的检测应在约1小时内或更优选在30分钟内递送结果，以在实际过程期间有用。
可以定义参考值，并且可以使用dsDNA的可接受浓度的特定截止值，或者可以在分离器官灌注期间随时间跟踪浓度，并且可以使用所述变化来决定器官是否功能良好。分析可以单独使用或与其它分析组合使用。随着测试更多的器官功能，组合方法可以改善分析的灵敏度和/或特异性。
例如可以使用的参考值为2000ng/ml或3000ng/ml或3500ng/ml或4000ng/ml的截止值。优选的是，应该使用3000ng/ml的截止值。这意味着如果检测到细胞破裂标志物、尤其是dsDNA的浓度高于参考值截止，则取消选择所述器官用于移植。作为选择，当超过参考值时可以处理器官。具体而言，可以将抗凋亡剂添加到灌注液中。合适的抗凋亡剂的实例包括c-Myc、Bax、p53、tBid、BCL和半胱天冬酶的抑制剂。
表面活性剂蛋白A和D-背景
表面活性剂蛋白质A和D(SpA和SpD)是具有免疫活性的水溶性蛋白质，并且在肺的上皮/肺泡侧起调理素的作用。SpA是重要的免疫调节剂。SpA和SpD都是大的多聚体蛋白。表面活性剂蛋白A还参与控制经由板层体的胞吐作用从II型上皮细胞(以及在一定程度上小气道中的Clara细胞)释放表面活性剂。SpA对表面活性剂释放的影响是抑制性的，其效果与SpD相反。
已经显示，在来自COPD患者的支气管-肺泡灌洗(BAL)样品中SpD减少，但其在血液样品中增加，表明泄漏(参见Stockley 2014)。之前未在分离器官灌注期间的灌注液中测定过它。
表面活性剂蛋白A和D-在本发明中
表面活性剂蛋白A和D(SpA和SpD)从肺泡侧泄漏到脉管系统可被看作是肺中气液屏障破坏的征兆。该破坏越明显，肺功能越差。因此，测定分离的肺的灌注液中的SpA和/或SpD将产生关于肺功能的信息。
可以使用例如免疫学检测分析SpA和SpD。在任何情况下，所使用的检测应在约1小时内或更优选在30分钟内递送结果，以在实际过程期间有用。
可以定义参考值，其中可以使用SpA和/或SpD的可接受浓度的特定截止值，或者可以在分离器官灌注期间随时间跟踪浓度，并且可以使用所述变化来决定器官是否功能良好以及因此是否应该选择其以用于移植和/或处理和/或进一步评估。分析可以单独使用或与其它分析组合使用。随着测试更多的器官功能，组合方法可以改善分析的灵敏度和/或特异性。
例如，参考值可以是灌注液中SpA的截止水平高于10μg/ml或高于30μg/ml或高于40μg/ml或高于60μg/ml或高于80μg/ml。
例如，参考值可以是灌注液中SpD的截止水平高于50ng/ml，或者高于80ng/ml，或者高于100ng/ml或120ng/ml，或者高于130ng/ml或约140ng/ml或约150ng/ml，或者高于160ng/ml，或者高于180ng/ml，或者高于200ng/ml。
高于所述参考值的话可以取消选择器官用于移植。等于或小于参考值的话可以选择器官以用于移植、处理和/或进一步监视。
组合分析
包括TF、tPA、dsDNA、SpA、SpD在内的生物标志物和任何其它潜在有用的生物标志物可以用作单独的生物标志物，或者它们可以以任何组合的形式使用以提供关于器官功能或健康的信息。组合可以包括选择TF、tPA、dsDNA、SpA和SpD中的至少两种生物标志物，或者TF、tPA、dsDNA、SpA和SpD中的至少三种生物标志物，或者TF、tPA、dsDNA、SpA和SpD中的至少四种生物标志物。这些分析也可以与其它器官相关生物标志物或功能性测试组合使用。
SpA和SpD分析是肺特异性的，与其它器官无关。在体内或离体分离的器官灌注期间，TF、tPA和dsDNA单独或以任何组合都与任何器官相关。
分析可以使用基于正常范围的参考值、截止值或随时间变化的浓度。分析也可以用于监视器官的处理。处理可以包括一种或多种抗炎物质和/或一种或多种抗血栓形成物质和/或一种或多种抗凋亡物质。
实施例
灌注液中的TF
使用STEEN溶液作为灌注液，对45组人肺离体灌注。灌注进行至多7小时，尽管在大多数情况下在三或四小时后停止灌注，以移植肺或放弃认为不适合移植的肺。收集灌注液并冷冻以用于随后TF的免疫学分析。通常在开始时和然后每小时收集样品。然而，并不是所有的情况下都有在每个时间点收集的样品。这是由于进行样品收集时的临床情况导致的。照顾器官是首要任务，样品收集必然排在第二位。
当汇总数据时，可以显示放弃的肺具有比移植肺高的TF增加。对于每一个体肺而言，情况并非总是如此，一些移植的肺具有建议截止值之外的值。要是当时可获得本发明，并且如果在EVLP期间已经进行了分析，则这些肺可能已经被取消选择或者优选地被处理以变得相对于该参数可移植。此类操作可以降低患者中的IRI。可以分析患者结果数据以确保用于器官选择、取消选择和处理的参考值得到优化。
表1-灌注液中的TF测定，以pg/ml计
由于值通常随时间增加，因此增加速率或变化可能是器官功能或健康的替代量度。这种持续的增加也可以被看作是处理和/或监视处理效果的机会。
灌注液中的t-PA
使用STEEN溶液作为灌注液，对45组人肺离体灌注。灌注进行至多7小时，尽管在大多数情况下在三或四小时后停止灌注，以移植肺或放弃认为不适合移植的肺。收集灌注液并冷冻以用于随后tPA的免疫学分析。通常在开始时和然后每小时收集样品。然而，并不是所有的情况下都有在每个时间点收集的样品。这是由于进行样品收集时的临床情况导致的。照顾器官是首要任务，样品收集必然排在第二位。
当汇总数据时，可以显示放弃的肺具有比移植肺高的tPA增加。对于每一个体肺而言，情况并非总是如此，一些移植的肺具有建议截止值之外的值。要是当时可获得本发明，并且如果在EVLP期间已经进行了分析，则这些肺可能已经被取消选择或者优选地被处理以变得相对于该参数可移植。此类操作可以降低患者中的IRI。可以分析患者结果数据以确保用于器官选择、取消选择和处理的参考值得到优化。
表2-灌注液中的tPA测定，以pg/ml计
由于值通常随时间增加，因此增加速率或变化可能是器官功能或健康的替代量度。这种持续的增加也可以被看作是处理和/或监视处理效果的机会。
灌注液中的dsDNA
使用STEEN溶液作为灌注液，对45组人肺离体灌注。灌注进行至多7小时，尽管在大多数情况下在三或四小时后停止灌注，以移植肺或放弃认为不适合移植的肺。收集灌注液并冷冻以用于随后dsDNA的分析。通常在开始时和然后每小时收集样品。然而，并不是所有的情况下都有在每个时间点收集的样品。这是由于进行样品收集时的临床情况导致的。照顾器官是首要任务，样品收集必然排在第二位。
当汇总数据时，可以显示放弃的肺具有比移植肺高的dsDNA增加。对于每一个体肺而言，情况并非总是如此，一些移植的肺具有建议截止值之外的值。要是当时可获得本发明，并且如果在EVLP期间已经进行了分析，则这些肺可能已经被取消选择或者优选地被处理以变得相对于该参数可移植。此类操作可以降低患者中的IRI。可以分析患者结果数据以确保用于器官选择、取消选择和处理的参考值得到优化。
表3-灌注液中的dsDNA测定，以ng/ml计
由于值通常随时间增加，因此增加速率或变化可能是器官功能或健康的替代量度。这种持续的增加也可以被看作是处理和/或监视处理效果的机会。
灌注液中的SpA
使用STEEN溶液作为灌注液，对45组人肺离体灌注。灌注进行至多7小时，尽管在大多数情况下在三或四小时后停止灌注，以移植肺或放弃认为不适合移植的肺。收集灌注液并冷冻以用于随后SpA的免疫学分析。通常在开始时和然后每小时收集样品。然而，并不是所有的情况下都有在每个时间点收集的样品。这是由于进行样品收集时的临床情况导致的。照顾器官是首要任务，样品收集必然排在第二位。
在该数据组中，比较移植肺和非移植肺的汇总数据没有差异。这表明，所使用的评估(仅身体检查)还未复杂或精细到足以考虑肺中气液屏障的破坏水平(这可以通过SpA浓度来指示)。要是当时可获得本发明，并且如果在EVLP期间已经进行了分析，则这些肺可能已经被取消选择或者优选地被处理以变得相对于该参数可移植。此类操作可以降低患者中的IRI。可以分析患者结果数据以确保用于器官选择、取消选择和处理的参考值得到优化。
表4-灌注液中的SpA测定，以ng/ml计
由于值通常随时间增加，因此增加速率或变化可能是器官功能或健康的替代量度。这种持续的增加也可以被看作是处理和/或监视处理效果的机会。
灌注液中的SpD
使用STEEN溶液作为灌注液，对45组人肺离体灌注。灌注进行至多7小时，尽管在大多数情况下在三或四小时后停止灌注，以移植肺或放弃认为不适合移植的肺。收集灌注液并冷冻以用于随后SpD的免疫学分析。通常在开始时和然后每小时收集样品。然而，并不是所有的情况下都有在每个时间点收集的样品。这是由于进行样品收集时的临床情况导致的。照顾器官是首要任务，样品收集必然排在第二位。
当汇总数据时，可以显示放弃的肺具有比移植肺高的SpD增加。对于每一个体肺而言，情况并非总是如此，一些移植的肺具有建议截止值之外的值。要是当时可获得本发明，并且如果在EVLP期间已经进行了分析，则这些肺可能已经被取消选择或者优选地被处理以变得相对于该参数可移植。此类操作可以降低患者中的IRI。可以分析患者结果数据以确保用于器官选择、取消选择和处理的参考值得到优化。
表5-灌注液中的SpD测定，以ng/ml计
由于值通常随时间增加，因此增加速率或变化可能是器官功能或健康的替代量度。这种持续的增加也可以被看作是处理和/或监视处理效果的机会。
汇总分析
使用以下建议的截止值一起分析不同的分析：
TF>120pg/ml
tPA>4000且<7400pg/ml
dsDNA>3000ng/ml
SpA>40 000ng/ml
SpD>130ng/ml
表6-汇总分析，其中所述值是灌注肺的order(编号)
利用这些截止参考值，在具有截止值之外的0个、至少1个或至少3个值的肺的百分比之间存在差异。还可以看出，在许多情况下，这些生物标志物共存，表明它们是器官窘迫或功能障碍的生物标志物。
表7-汇总分析结果的总结
截止值之外 拒绝 接受
0个值 0％ 19％
最大1个值 14％ 31％
至少3个值 64％ 50％
随着进一步优化截止参考值，假阳性和假阴性的数量将改变。但是实施例表明，使用本发明从选择用于评估的生物标志物可获得的指征与目前基于器官外观作出的决定相关。汇总的数据清楚地显示，根据本发明的评估与被拒绝用于移植的肺和被接受用于移植的肺相关。预期在本发明的帮助下，临床医师将能够做出关于任何特定移植器官的前景的更好的决定。
与临床数据的进一步相关性将用于优化截止水平。预期接受多个值在范围或者截止值之外的肺的患者不如接受所有值都在范围或截止值内的肺的患者那样好。

Claims (18)

1.一种在分离器官灌注期间评估器官的方法，所述方法包括以下步骤：
用灌注液灌注所述分离器官；和
测定所述灌注液中两种或更多生物标志物的浓度，所述两种或更多生物标志物包括选自由TF、tPA、SpA、SpD或细胞破裂标志物组成的组中的至少两种生物标志物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞破裂标志物是dsDNA、线粒体DNA或核糖体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分离器官来自动物或人类，并且是肺、肾、肝、心脏、胰腺或肠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离器官是体内与循环分离的，或者是离体与循环分离的。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述灌注液中所述两种或更多生物标志物的浓度的测定在预定时间段连续进行或者以预定间隔重复地进行。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法另外包括以下步骤：比较所述灌注液中所述两种或更多生物标志物的测定浓度与参考值，和基于所述比较确定是否选择所述器官以用于移植。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法另外包括以下步骤：比较所述灌注液中所述两种或更多生物标志物的测定浓度与参考值，和通过基于所述比较向所述灌注液添加成分而处理所述分离器官。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法另外包括以下步骤：通过继续测定所述灌注液中所述两种或更多生物标志物的浓度而监视所述成分对所述分离器官的处理效果。
9.根据权利要求7所述的方法，其中当TF的测定浓度超过参考值时向所述灌注液添加TF阻遏剂分子。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述TF阻遏剂分子选自由以下组成的组：HMG-CoA还原酶抑制剂、环氧合酶(COX)抑制剂、紫杉醇、溶血磷脂酰胆碱、胰岛素、烟酰胺、一氧化氮(NO)/或可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、羟基脲、丙酮酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、脂联素、视黄酸、全反式视黄酸、维生素D3、PGJ2、PPARα激动剂激活剂(WY14643和二十碳四烯酸)、肝X受体激动剂、己酮可可碱、酚/白藜芦醇衍生物、吲哚布芬、胺碘酮、二甲双胍、升高的细胞内cAMP和PI3K/Akt/PKB信号传导、miR-19、短发夹RNA、发夹核酶或反义ODN。
11.根据权利要求7所述的方法，其中当一种或多种细胞破裂标志物的测定浓度超过参考值时向所述灌注液添加抗凋亡剂。
12.根据权利要求7所述的方法，其中当tPA的测定浓度低于参考值时向所述灌注液添加纤维蛋白溶解剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述纤维蛋白溶解剂是链激酶或tPA。
14.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中如果在评估后移植所述器官，则不将所述器官移植到其所来自的身体。
15.一种在分离器官灌注期间处理器官的方法，所述方法包括用灌注液灌注所述分离器官的步骤，其中所述灌注液包含TF阻遏剂分子。
16.TF阻遏剂分子在下调分离器官灌注期间的TF表达中的用途。
17.根据权利要求15或16所述的方法或用途，其中所述TF阻遏剂分子选自由以下组成的组：HMG-CoA还原酶抑制剂、环氧合酶(COX)抑制剂、紫杉醇、溶血磷脂酰胆碱、胰岛素、烟酰胺、一氧化氮(NO)/或可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、羟基脲、丙酮酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、脂联素、视黄酸、全反式视黄酸、维生素D3、PGJ2、PPARα激动剂激活剂(WY14643和二十碳四烯酸)、肝X受体激动剂、己酮可可碱、酚/白藜芦醇衍生物、吲哚布芬、胺碘酮、二甲双胍、升高的细胞内cAMP和PI3K/Akt/PKB信号传导、miR-19、短发夹RNA、发夹核酶或反义ODN。
18.一种用于在分离器官灌注期间分析灌注液的试剂盒，所述试剂盒包含至少两个检测的组合，所述至少两个检测包括针对TF、tPA、dsDNA、SpA或SpD的免疫学分析或者针对TF或tPA的显色分析或者针对dsDNA的Picogreen分析。
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