CN107850588B - 抗病毒剂耐受性病毒的检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明的奥司他韦类似物和已与所述类似物结合的纳米颗粒，与奥司他韦耐受性流感病毒强烈结合，因此，其使用可以允许用肉眼快速且方便地检测奥司他韦耐受性流感病毒。因此，本发明可以有利地用于迅速确立感染流感病毒的患者的治疗方案。

Description

抗病毒剂耐受性病毒的检测系统
技术领域
本发明涉及一种检测抗病毒剂耐受性病毒的系统。
背景技术
流感(influenza)是由流感病毒(Influenza virus)通过人和动物(鸟、猪、狗、马等)的呼吸系统传播的呼吸系统疾病。人流感(Human influenza)每年发生于世界人口的10-20％，并且由于其高度的接触传染性，每年在世界范围内流行。流感的症状包括高热、头痛、肌肉痛、喉咙发炎、疼痛、呼吸系统疾病如咳嗽等。重症病例中，流感可导致老年人、慢性病患者等死亡。
如果怀疑流感感染，应及时治疗以防止危险情况发生，并防止流感传播给他人。目前，磷酸奥司他韦(特敏福)主要用于治疗流感感染，近年来对奥司他韦显示耐受的病毒突变体也在增加。
在许多出版物中已经报道了区分病毒的方法。例如，Marin MJ等人公开了一种区分人流感病毒和禽流感病毒的方法。然而，尚未开发出一种有效的方法来确定疑似患有流感感染的患者是否会感染奥司他韦耐受性病毒。
现有技术文献
非专利文献
(非专利文献1)Marin MJ等人(Glyconanoparticles for the plasmonicdetection and discrimination between human and avian influenza,Org BiomolChem.2013年11月7日；11(41):7101-7)。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种新的奥司他韦衍生物化合物，优选奥司他韦己硫醇或奥司他韦己胺，其可用于检测奥司他韦耐受性病毒。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测奥司他韦耐受性病毒的纳米颗粒，所述纳米颗粒已与奥司他韦衍生物化合物，优选奥司他韦己硫醇或奥司他韦己胺结合。
本发明的另一个目的是提供一种通过使用所述纳米颗粒检测奥司他韦耐受性病毒的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测奥司他韦耐受性病毒的试剂盒，所述试剂盒包含所述纳米颗粒。
本发明的另一个目的是提供一种治疗流感的方法，所述方法包括：通过使用所述纳米颗粒检测奥司他韦耐受性病毒；和向没患有奥司他韦耐受性病毒的受试者施用治疗有效量的磷酸奥司他韦。
技术方案
本发明提供下式1表示的奥司他韦衍生物化合物：
[式1]
Figure GDA0001563520850000021
在式1中，
其中R1为硫醇
Figure GDA0001563520850000022
或胺
Figure GDA0001563520850000023
优选地，奥司他韦衍生物化合物为下式2表示的奥司他韦己硫醇(oseltamivirhexylthiol)或下式3表示的奥司他韦己胺(oseltamivir hexylamine)：
[式2]
Figure GDA0001563520850000024
[式3]
Figure GDA0001563520850000031
本发明提供了一种用于检测奥司他韦耐受性病毒的纳米颗粒，所述纳米颗粒已与式1所示的奥司他韦衍生物化合物结合。优选地，本发明提供了一种用于检测奥司他韦耐受性病毒的纳米颗粒，所述纳米颗粒已与式2表示的奥司他韦己硫醇(oseltamivirhexylthiol)或式3表示的奥司他韦己胺(oseltamivir hexylamine)结合。
本发明的纳米颗粒可以是直径为1至100nm并且可以通过目视或通过吸收/荧光分光光度计观察的任何纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以为金纳米颗粒、银纳米颗粒、荧光纳米颗粒、荧光染料等。金纳米颗粒和银纳米颗粒是指具有100nm或更小的直径和各种形状(球形、多边形等)的颗粒。荧光纳米颗粒是显示荧光特性并且具有100nm或更小直径的纳米颗粒。即使使用相同的材料，其荧光波长可以根据其粒径而变化，从而可以获得不同波长的荧光。荧光纳米颗粒的示例包括含有荧光染料和量子点的各种纳米颗粒，并且可以由具有约2至10nm的尺寸的核心(core)和主要由ZnS等制成的壳(shell)组成。形成量子点的II-VI族或III-V族化合物可以选自，例如CdSe、CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdTe、ZnSe/ZnS、ZnTe/ZnSe、PbSe、PbS InAs、InP、InGaP、InGaP/ZnS和HgTe(单核(core)或核(core)/壳(shell)型)。荧光染料包括，例如荧光有机分子(例如芘(Pyrene)或其衍生物)、花青(Cyanine，Cy)系列、Alexa Fluor系列、BODIPY系列、DY系列、若丹明(rhodamine)或其衍生物、荧光素(Fluorescein)或其衍生物、香豆素(coumarin)或其衍生物、吖啶同源二聚体(Acridinehomodimer)或其衍生物、吖啶橙(Acridine Orange)或其衍生物、7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)或其衍生物、放线菌素D(Actinomycin D)或其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA，9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)或其衍生物、DAPI或其衍生物、二氢乙锭(Dihydroethidium)或其衍生物、溴化乙锭(Ethidium bromide)或其衍生物、乙锭同源二聚体-1(EthD-1)或其衍生物、乙锭同源二聚体-2(EthD-2)或其衍生物、单叠氮乙锭(Ethidium monoazide)或其衍生物、碘化己锭(Hexidium iodide)或其衍生物、双苯甲酰亚胺(bisbenzimide，Hoechst 33258)或其衍生物、Hoechst33342或其衍生物、Hoechst 34580或其衍生物、羟芪巴脒(hydroxystilbamidine)或其衍生物、LDS 751或其衍生物、碘化丙锭(Propidium Iodide，PI)或其衍生物、钙黄绿素(Calcein)或其衍生物、俄勒冈绿(Oregon Green)或其衍生物、镁绿(Magnesium Green)或其衍生物、钙绿(CalciumGreen)或其衍生物、JOE或其衍生物、四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine)或其衍生物、TRITC或其衍生物、TAMRA或其衍生物、派洛宁Y(Pyronin Y)或其衍生物、丽丝胺(Lissamine)或其衍生物、ROX或其衍生物、深红钙(Calcium Crimson)或其衍生物、德克萨斯红(Texas Red)或其衍生物、尼罗红(Nile Red)或其衍生物、硫代二羰花青(Thiadicarbocyanine)或其衍生物、丹酰胺(dansylamide)或其衍生物、级联蓝(cascadeblue)、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole(4',6-二脒基-2-苯基吲哚))、FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7等。然而，纳米颗粒的种类不限于此。每种类型的纳米颗粒可以通过已知的方法合成。
在本发明的一个实施方案中，所述纳米颗粒可以是金纳米颗粒，但不限于此。
已知奥司他韦耐受性流感病毒通常具有H275Y突变。在本领域中，H275Y也可以表示为H274Y，并且H274Y突变和H275Y突变被认为基本相同。在说明书中，H275Y突变与H274Y突变具有相同的含义。奥司他韦与流感病毒结合以降低神经氨酸酶(neuraminidase，NA)活性，从而杀死病毒。当发生H275Y突变时，奥司他韦几乎不与病毒结合。
与本发明的纳米颗粒结合的奥司他韦己胺或奥司他韦己硫醇与由于H275Y突变而显示奥司他韦耐受性的病毒结合，其亲和力比奥司他韦敏感性病毒强约1000倍。在现有技术中报道了使用与奥司他韦敏感性病毒结合而不与奥司他韦耐受性病毒结合的化合物的检测方法。然而，该方法只能检测样品中奥司他韦耐受性病毒的存在，其缺点在于不能将样品中奥司他韦耐受性病毒的存在与流感病毒以外的病原体的存在或其他血清型或突变的流感病毒的存在或病原体的缺乏区别开来。因此，该方法的缺点在于需要通过使用其他手段如特异性抗体、遗传分析等来进一步进行确认样品中奥司他韦耐受性病毒的存在的步骤。然而，本发明的使用使得能够立即检测奥司他韦耐受性病毒的存在，这表明与常规的方法相比，本发明使得能够以更准确且便利的方式检测奥司他韦耐受性病毒。
本发明还提供了一种通过使用纳米颗粒检测奥司他韦耐受性病毒的方法。
本发明的纳米颗粒是否会与病毒结合，可通过目视比色(比色法)或吸光度测定来确认。本领域技术人员可以容易地区分样品中是否存在奥司他韦耐受性流感病毒，即使结果可以根据所使用的纳米颗粒的种类和浓度以及样品中所含的病毒的量而变化。例如，如图5的右上部分所示，当用本发明的纳米颗粒处理奥司他韦耐受性流感病毒时，随着用于处理的纳米颗粒浓度增加，颜色变得更强烈(由于病毒与纳米颗粒之间增加的结合)。然而，可以看出，当用本发明的纳米颗粒处理奥司他韦敏感性流感病毒时，即使当处理中使用的纳米颗粒的浓度增加时，也会出现浅色。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：1)将从受试者中分离的样品与纳米颗粒接触，所述纳米颗粒已与式2表示的奥司他韦己硫醇或式3表示的奥司他韦己胺结合；和2)当样品显示与当纳米颗粒与存在奥司他韦耐受性流感病毒的另一样品接触时出现的颜色相同的颜色时，确定样品中存在奥司他韦耐受性流感病毒。
在该方法中，术语“相同的颜色”是指即使反应条件、样品的色度(chroma)、亮度(brightness)或色调(hue)等稍有不同，也可以认为基本相同的颜色。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：1)将从受试者中分离的样品与纳米颗粒接触，所述纳米颗粒已与式2表示的奥司他韦己硫醇或式3表示的奥司他韦己胺结合；和2)当样品显示与当纳米颗粒与不存在奥司他韦耐受性流感病毒的另一样品接触时出现的颜色不同的颜色时，确定样品中存在奥司他韦耐受性流感病毒。
受试者的示例包括人或其他动物，例如鸟类或哺乳动物。
样品可以是全血、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、活检组织、淋巴液、腹水、组织液、骨髓、脑脊液(CSF)、精液、唾液、粘液、痰、汗或尿。
本发明还提供了一种用于检测奥司他韦耐受性流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含纳米颗粒。本发明的试剂盒可以进一步包含检测所需的其它物品和使用说明(instruction)。
根据本发明的检测试剂盒可以以各种形式实施。例如，其可以以检测溶液试剂盒、快速试剂盒(rapid kit)(使用芯片实验室，将少量样品滴落到试剂盒上后，由于试剂盒上样品的移动而能够快速检查结果的试剂盒)或纸棒的形式实施。
在一个实施方案中，根据本发明的检测试剂盒可以是用作诊断条带(strip)的快速诊断试剂盒。
例如，根据本发明的检测试剂盒可以包含样品垫(sample pad)、结合垫(conjugate pad)、硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)和吸附垫(adsorptionpad)，
其中将奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒或奥司他韦己胺-金纳米颗粒负载在结合垫上，
当样品移动通过样品垫时，负载在结合垫上的奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒或奥司他韦己胺-金纳米颗粒与样品一起移动到硝酸纤维素膜和吸附垫上，和
硝酸纤维素膜具有相互隔离的对照线(control line)和测试线(test line)，
其中对照线上固定有包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒或包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的神经氨酸酶，并且测试线上固定有式2表示的奥司他韦己硫醇或式3表示的奥司他韦己胺。
本发明还提供了一种通过使用检测试剂盒检测奥司他韦耐受性流感病毒的方法。
在一个实施方案中，所述检测方法可以包括以下步骤：
1)将样品加入检测试剂盒的结合垫中并移动样品；和
2)检查检测试剂盒的硝酸纤维素膜的对照线和测试线的颜色变化。
在本发明的方法中，当样品中不存在奥司他韦耐受性流感病毒时，仅在对照线中出现颜色变化，但是当样品中存在奥司他韦耐受性流感病毒时，在控制线和测试线上都出现颜色变化。
在本发明的方法中，测试线的颜色变化程度很大，可以确定样品中含有的奥司他韦耐受性流感病毒的量很大。
本发明还提供了一种治疗流感的方法，其包括以下步骤：
用于检测奥司他韦耐受性流感病毒的纳米颗粒处理从受试者中得到的样品，所述纳米颗粒已与式1表示的奥司他韦衍生物化合物结合；
确认样品中是否存在包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒；和
当在样品中未检测到奥司他韦耐受性流感病毒时或当样品含有非常少量的奥司他韦耐受性流感病毒时，向受试者施用治疗有效量的磷酸奥司他韦。
如本文所用，表述“当在样品中未检测到奥司他韦耐受性流感病毒或当样品含有非常少量的奥司他韦耐受性流感病毒时”是指在样品中不存在奥司他韦耐受性流感病毒或样品中含有非常少量的奥司他韦耐受性流感病毒的状态，这使得磷酸奥司他韦可以在受试者中显示治疗效果。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指适用于任何医学治疗的合理的磷酸奥司他韦剂量，其是当施用于目标群体时统计学上与特定治疗效果相关的治疗剂的量。
本发明的检测试剂盒，使用其的检测方法以及使用其的治疗方法不限于上述示例性实施方案。
在常规开发方法的情况下，特定抗体的分布和使用由于其对热和pH的敏感性而受到限制，并且基因分析需要检测仪器。然而，本发明的优点在于，根据本发明的化合物即使在高温区也可以使用，可以长时间储存，并且可以以各种形式商业化。
有益效果
根据本发明的奥司他韦类似物或已与所述类似物结合的纳米颗粒与奥司他韦耐受性流感病毒强烈结合，由此可用于以快速和便利的方式目视检测奥司他韦耐受性流感病毒。因此，本发明可以有利地用于为感染流感病毒的患者快速建立治疗计划。
附图说明
图1显示了测量奥司他韦己胺和奥司他韦己硫醇在病毒水平抑制奥司他韦敏感性病毒和奥司他韦耐受性病毒的神经氨酸酶活性的程度的结果。
图2是显示通过用奥司他韦类似物-金纳米颗粒处理每个奥司他韦敏感性病毒和奥司他韦耐受性病毒并测量吸光度而获得的结果的图。
图3是显示本发明的奥司他韦己胺和奥司他韦己硫醇与奥司他韦敏感性病毒和奥司他韦耐受性病毒的结合模式的示意图。奥司他韦己硫醇(其式示于图3左下部分)显示出与奥司他韦耐受性病毒约250倍更高的△G结合。
图4显示当奥司他韦己硫醇结合的金纳米颗粒与每个奥司他韦敏感性病毒和奥司他韦耐受性病毒反应时产生的吸光度图(左)、目测色差(右上)和显示色差的图(右下)。
图5是显示通过用奥司他韦己硫醇结合的纳米颗粒处理每个奥司他韦敏感性病毒和奥司他韦耐受性病毒并测量吸光度而获得的结果的图。
图6是显示使用本发明的奥司他韦类似物-金纳米颗粒制备的用于检测抗病毒剂耐受性病毒的快速试剂盒的构造的示意图。
图7显示了在本发明诊断快速试剂盒条带上检测抗病毒剂敏感性/耐受性病毒的结果。
具体实施方式
在下文中，将描述本发明的优选实施例以便于理解本发明。然而，提供这些实施例仅是为了便于理解本发明，而本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：纳米颗粒的制备
1-1：奥司他韦己硫醇(Oseltamivir Hexylthiol)的合成
奥司他韦己硫醇根据以下方案合成。在下面的描述中，化合物名称后面的括号中的数字是指以下方案中化合物式底部所示的数字。
Figure GDA0001563520850000091
S-6-羟己基硫代乙酸酯的合成(2)
于室温，将硫代乙酸钾(6.31g，55.2mmol)缓慢滴加到1-溴己醇(1)(5.00g，27.6mmol)的DMF(50mL)溶液中，同时搅拌溶液。将反应混合物搅拌12小时，然后用蒸馏水(30mL)稀释。将混合物用Et2O(3×30mL)萃取，将有机层合并，用无水MgSO4干燥，过滤，然后浓缩。通过柱色谱法(己烷:EtOAc＝2:1-1:1)分离浓缩物，得到浅黄色液体状的化合物2(4.20g，86％)。
(3R,5S)-乙基-4-乙酰氨基-5-(-叔丁氧基羰基氨基-)-3-(戊-3-基氧基)环己-1-烯羧酸酯(4)的合成
于室温，将二碳酸二叔丁酯(7.84mL，34.1mmol)和三乙胺(6.80mL，48.8mmol)滴加到奥司他韦磷酸盐(3)(10.0g，24.4mmol)的MeOH(50mL)溶液中，同时搅拌溶液。将反应混合物于室温搅拌12小时。将蒸馏水(100mL)加入到混合物中，然后搅拌1小时。接下来，将生成的白色固体过滤并用蒸馏水洗涤。滤液在真空烘箱中干燥，得到白色固体状的化合物4(5.71g，56％)。
(3R,5S)-4-乙酰氨基-5-(-叔丁氧基羰基氨基-)-3-(戊-3-基氧基)环己-1-烯羧酸(5)的合成
于室温，将NaOH(663mg，16.6mmol)加入到化合物4(5.70g，13.8mmol)的THF/H2O(10:1，v/v，30mL)溶液中，同时搅拌溶液。将反应混合物搅拌24小时，然后浓缩以除去反应溶剂。浓缩物用蒸馏水(20mL)稀释，将反应器冷却至0℃。通过加入1M HCl水溶液将混合物酸化至pH 5，然后搅拌1小时。将生成的白色固体过滤并用蒸馏水洗涤。滤液在真空烘箱中干燥，得到白色固体状的化合物5(4.0g，75％)。
(3R,5S)-6-(乙酰硫基)己基-4-乙酰氨基-5-(-叔丁氧基羰基氨基-)-3-(戊-3-基氧基)环己-1-烯羧酸酯(6)的合成
于室温，将化合物2(2.20g，12.5mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.79g，14.6mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(1.52g，12.5mmol)和三乙胺(2.90mL，20.8mmol)依次加入到化合物5(4.00g，10.4mmol)的CH2Cl2(30mL)溶液中，同时搅拌溶液。于室温搅拌24小时后，将蒸馏水加入到反应混合物中以停止反应。用CH2Cl2(3×30mL)萃取混合物，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，然后浓缩。通过柱色谱法(己烷:EtOAc＝2:1-1:1)分离浓缩物，得到无色液体状的化合物6(3.51g，62％)。
奥司他韦己硫醇(7)的合成
于室温，将浓盐酸(2.15mL，25.8mmol)缓慢滴加到化合物6(3.50g，6.45mmol)的MeOH(30mL)溶液中，同时搅拌溶液。将反应器在50℃加热72小时。将反应混合物冷却至室温，然后浓缩以除去反应溶剂。浓缩物用MeOH(5mL)稀释，并在搅拌下向其中缓慢滴加Et2O。将生成的白色固体过滤并用Et2O洗涤。将滤液在真空烘箱中干燥，得到白色固体状的化合物7(奥司他韦己硫醇)(560mg，20％)。
奥司他韦己硫醇由下式2表示：
[式2]
Figure GDA0001563520850000101
1-2：奥司他韦己胺(Oseltamivir Hexylamine)的合成
奥司他韦己胺根据以下方案合成。在下面的描述中，化合物名称后面的括号中的数字是指以下方案中化合物式底部所示的数字。
Figure GDA0001563520850000111
6-羟己基氨基甲酸叔丁酯(9)的合成
于室温，将二碳酸二叔丁酯(6.47mL，28.2mmol)滴加到化合物8(3.00g，25.6mmol)的MeOH(30mL)溶液中，同时搅拌溶液。将反应混合物于室温搅拌6小时，然后浓缩。通过柱色谱法(己烷:EtOAc＝2:1-1:1)分离浓缩物，得到浅黄色液体状的化合物9(4.10g，74％)。
(3R,5S)-6-(-叔丁氧基羰基氨基-)己基-4-乙酰氨基-5-(-叔丁氧基羰基氨基-)-3-(戊-3-基氧基)环己-1-烯羧酸酯(10)的合成
于室温，将化合物9(2.18g，10.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.44g，12.7mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(1.33g，10.9mmol)和三乙胺(2.54mL，18.2mmol)依次加入到化合物5(3.50g，9.10mmol)的DMF(20mL)溶液中。于室温搅拌24小时后，将蒸馏水加入到反应混合物中以停止反应。用EtOAc(3×20mL)萃取化合物，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，然后浓缩。通过柱色谱法(己烷:EtOAc＝2:1-1:1)分离浓缩物，得到黄色液体状的化合物10(2.41g，45％)。
奥司他韦己胺(11)的合成
于室温，将浓盐酸(1.75mL，21.0mmol)缓慢滴加到化合物10(2.45g，4.20mmol)的MeOH(20mL)溶液中，同时搅拌溶液。于室温搅拌24小时后，浓缩反应混合物以除去反应溶剂。浓缩物用MeOH(5mL)稀释，并在搅拌下向其中缓慢滴加Et2O。将生成的白色固体过滤并用Et2O洗涤。将滤液在真空烘箱中干燥，得到白色固体状的化合物11(奥司他韦己胺)(1.15g，65％)。
奥司他韦己胺由下式3表示：
[式3]
Figure GDA0001563520850000121
1-3：金纳米颗粒的合成
将1重量％HAuCl4溶液(1mL)加入到100mL蒸馏水中，并在95℃剧烈搅拌该溶液。在该状态下，立即将1重量％柠檬酸钠(5mL)缓慢加入到该溶液中，并在相同条件下反应30分钟。
1-4：纳米颗粒-奥司他韦类似物的结合
将5mL上述1-3中合成的金纳米颗粒溶液以15000rpm离心10分钟以除去过量的柠檬酸钠。弃去上清液，将残余物重新悬浮于1mL蒸馏水中，然后以15000rpm离心10分钟。这个过程重复两次以上。在最后的步骤中，弃去上清液，将1mL悬浮于蒸馏水中的奥司他韦己胺或奥司他韦己硫醇(6mg/mL)加入到残余物中。接下来，将溶液涡旋12小时以上，以使奥司他韦己胺或奥司他韦己硫醇与金纳米颗粒结合。然后，将溶液以15000rpm离心20分钟，除去上清液，并将残余物重新悬浮于100μL蒸馏水中。
实施例2：病毒的神经氨酸酶活性的比较
2-1：奥司他韦己硫醇和奥司他韦己胺对病毒神经氨酸酶活性的作用比较
使用NA-FluorTM流感病毒神经氨酸酶测定试剂盒(AB Applied biosystem，产品编号4457091)测定NA酶活性。
具体而言，通过将NA-Fluor(480μL)溶解在试剂盒中的工作溶液(5.52mL)中制备溶液A。制备病毒溶液，使得每孔中含有100或1000个病毒。作为野生型(抗病毒剂敏感性病毒)，使用流行性H1N1病毒(A/04/2009/加利福尼亚)(流行性H1N1)，作为突变型(抗病毒剂耐受性病毒)，使用甲型流感/韩国/2785/2009(H275Y突变)。在2mL蒸馏水(溶液C)中制备19.3mg奥司他韦己胺或奥司他韦己硫醇。将50μL溶液A加入到96孔板的每孔中，并将每个病毒样品溶液加入到每孔中。将50μL溶液C以各种浓度加入每孔(仅在对照组中加入蒸馏水)。即，每孔加入溶液A +各病毒液(野生型或突变型)+溶液C。在37℃孵育1小时后，向每孔中加入50μL的NA-Fluor终止缓冲液。通过在360nm的激发波长(EX)和450nm的发射波长(EM)下测量荧光来测量蛋白水平的NA活性。更高的NA活性表明更高的荧光强度(intensity)。
测量结果显示在图1中。从图1的左侧(奥司他韦己胺)和右侧(奥司他韦己硫醇)可以看出，相比于野生型病毒的NA活性，高浓度的奥司他韦己胺和奥司他韦己硫醇更显着地抑制突变型病毒(H275Y突变)的NA活性。
2-2：用奥司他韦类似物-金纳米颗粒处理病毒神经氨酸酶蛋白后的吸光度变化的测量
将从野生型或突变型病毒中分离的神经氨酸酶蛋白以0.1mg(100μg)/孔的量添加到96孔板的每孔中，并且将在上述实施例1-4中合成的奥司他韦己硫醇结合的金纳米颗粒以100μL(以金离子浓度计为1.22mg)的量添加到每孔中，然后在波长400至750nm处测量每孔的吸光度。
测量结果显示在图2中。从图2中可以看出，突变型(虚线)的吸收波长比野生型(实线)的吸收波长更长，表明奥司他韦己硫醇结合的金纳米颗粒对于野生型和突变型的神经氨酸酶蛋白显示不同的吸收波长。
实施例3：奥司他韦类似物对奥司他韦耐受性病毒的结合亲和力的分析
计算本发明的奥司他韦己硫醇对奥司他韦敏感性病毒(野生型)和奥司他韦耐受性病毒(突变型)的神经氨酸酶位点的结合能(binding energy，△G结合)。
结果表明，奥司他韦己硫醇对野生型的结合能是-24.33kcal/mol，而奥司他韦己硫醇对突变型的结合能是-27.62kcal/mol(参见图3)。这表明奥司他韦己硫醇与突变型结合，其亲和力比野生型高约250倍。
实施例4：使用奥司他韦类似物-金纳米颗粒开发抗病毒剂耐受性病毒检测系统并评价其性能
本发明的奥司他韦类似物-金纳米颗粒以高亲和力与奥司他韦耐受性病毒结合。因此，当将纳米颗粒加入到奥司他韦耐受性病毒中时，发生颜色变化，从而可以肉眼检测病毒。
制备病毒以使96-孔板的每孔含有0、10、100或1000个病毒。作为野生型(抗病毒剂敏感性病毒)，使用流行性H1N1病毒(A/04/2009/加利福尼亚)(流行性H1N1)，作为突变型(抗病毒剂耐受性病毒)，使用甲型流感/韩国/2785/2009(H275Y突变)。在每孔中加入100μL(以金离子浓度计为1.22mg)的实施例1中合成的奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒，然后在400至750nm的波长处测量每孔的吸光度以通过颜色变化检测抗病毒剂敏感性/耐受性病毒。
测量结果显示在图4中。从图4的左侧可以看出，即使当奥司他韦敏感性病毒(野生型)的数量增加时，奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒的吸收波长变化很小或没有变化，但是当奥司他韦耐受性病毒(突变型)的数量增加时，奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒的吸收波长发生移动。这是由于与奥司他韦耐受性病毒结合的奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒的数量增加而由于原始颜色的颜色变化所引起的现象，并且该现象也可以被目视检测到(图4的右上部分)。该现象在图4的右下侧以图形显示。从图中可以清楚地看到吸收波长发生移动。
另外，图5显示了在上述实验中每孔加入1000个野生型病毒和突变型病毒的情况下测量吸光度的结果。从图5的左下方，可以目视看到出现的颜色变化(图5中的颜色与图4中的颜色不同，因为板的背景光更亮)。
实施例5：基于奥司他韦类似物-金纳米颗粒的抗病毒剂耐受性病毒检测的快速(Rapid)诊断试剂盒的开发
使用实施例1中制备的奥司他韦类似物-金纳米颗粒，制备用于奥司他韦耐受性流感病毒检测的快速试剂盒(图6)。具体而言，将奥司他韦结合的牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)(测试线)和3.3mg/mL包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的神经氨酸酶蛋白(对照线)滴加到硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上，由此制备具有尺寸为4mm×50mm的条带。接下来，将奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒分配到条带的结合垫上，然后干燥。本发明的快速试剂盒被配置使得当样品移动通过样品垫(sample pad)时，结合垫上的奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒与样品一起移动并且通过硝酸纤维素膜吸附到吸附垫上。
实施例6：通过使用基于奥司他韦类似物-金纳米颗粒的快速(Rapid)诊断试剂盒来检测奥司他韦耐受性流感病毒
评估快速试剂盒(实施例5中制备)检测奥司他韦敏感性/耐受性流感病毒的能力。当将不含流感病毒的缓冲液样品加入到快速试剂盒中时，仅在对照线中出现一条线，而不出现在测试线中。此外，当将含有奥司他韦敏感性病毒(野生型)的缓冲液加入到快速试剂盒时，也仅在对照线中出现一条线。然而，当将含有奥司他韦耐受性病毒(突变型)的缓冲液加入到快速试剂盒中时，在对照线和测试线中都出现一条线(图7)。这样的结果表明，使用包含本发明的奥司他韦类似物-金纳米颗粒的快速试剂盒可以有效地检测奥司他韦耐受性流感病毒。

Claims (11)

1.下式1表示的奥司他韦衍生物化合物：
[式1]
Figure FDA0002195853300000011
在式1中，
其中R1为硫醇或胺。
2.根据权利要求1所述的奥司他韦衍生物化合物，其中所述奥司他韦衍生物为下式2表示的奥司他韦己硫醇或下式3表示的奥司他韦己胺：
[式2]
Figure FDA0002195853300000012
[式3]
Figure FDA0002195853300000013
3.一种用于检测包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的纳米颗粒，所述纳米颗粒已与下式1表示的奥司他韦衍生物化合物结合：
[式1]
Figure FDA0002195853300000021
在式1中，
其中R1为硫醇或胺。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述奥司他韦衍生物化合物为下式2表示的奥司他韦己硫醇或下式3表示的奥司他韦己胺，其用于检测包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒：
[式2]
Figure FDA0002195853300000022
[式3]
Figure FDA0002195853300000023
5.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒或荧光纳米颗粒。
6.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒对包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的结合亲和力高于对奥司他韦敏感性流感病毒的结合亲和力。
7.根据权利要求3所述的纳米颗粒在制备用于检测包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的试剂盒中的用途，其包含使用根据权利要求3所述的纳米颗粒处理从受试者中得到的样品的步骤。
8.根据权利要求7所述的用途，其中使用比色法进行检测。
9.根据权利要求7所述的用途，其中目视进行检测。
10.一种用于检测包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1所述的奥司他韦衍生物化合物或根据权利要求3所述的纳米颗粒。
11.一种用于检测包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸附垫，
其中将奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒或奥司他韦己胺-金纳米颗粒负载在结合垫上，
当样品移动通过样品垫时，负载在结合垫上的奥司他韦己硫醇-金纳米颗粒或奥司他韦己胺-金纳米颗粒与样品一起移动到硝酸纤维素膜和吸附垫上，和
所述硝酸纤维素膜具有相互隔离的对照线和测试线，
其中所述奥司他韦己硫醇由下式2所示，所述奥司他韦己胺由下式3所示：
[式2]
Figure FDA0002195853300000041
[式3]
Figure FDA0002195853300000042
其中所述对照线上固定有包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒或包含H275Y突变的奥司他韦耐受性流感病毒的神经氨酸酶，并且所述测试线上固定有下式1表示的奥司他韦衍生物化合物：
[式1]
Figure FDA0002195853300000043
在式1中，
其中R1为硫醇或胺。
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