CN107849578A - 生物质的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于操纵植物的生长和/或结构以用于提高生物质的方法。本发明的方法通过提高植物的维管组织中的PXY和/或CLE的表达和/或活性实现。

Description

生物质的产生
本发明涉及用于操纵植物的生长和/或结构的方法。本发明还涉及用于操纵植物的生长和/或结构中使用的表达盒，和包括表达盒的转基因植物，植物部分，植物细胞或种子。本发明还涉及生产植物衍生产品的方法，和植物衍生产品自身。本发明还涉及维管组织特异性调控元件在操纵植物的生长和/或结构的方法中的用途。本发明还涉及包括本发明的表达盒的宿主细胞或生物体。
背景技术
树的木材组织由来自形成层分生组织中的干细胞的分裂产生的木质部细胞构成。木质部细胞形成速率取决于形成层中细胞分裂速率并且受控于遗传和环境因素(Miyashima等(2013)EMBO J.32，178-193；Ursache等(2013)Physiol.Plant.147，36-45)。在一年生植物拟南芥(Arabidopsis)中，肽配体CLE41和受体激酶PXY之间的信号传导控制形成层细胞分裂(Etchells and Turner(2010)Development 137，767-774；Fisher andTurner(2007)Current Biology 17，1061-1066；以及Hirakawa等(2008)PNAS，USA 105，15208-15213)。
国际专利申请号WO2010/029357涉及用于改变植物的生长和/或结构的方法，以便最大化其作为生物质(biaomass，生物量)来源的潜力，特别是用于造纸业原料来源的潜力。该专利申请描述了CLE41、CLE42和/或PXY的过表达以便取得植物的维管组织的生长和结构的期望增加。
然而，仍需要能够改进植物(特别是树)生长的操纵，例如以提高来自树的生物质的产率。
发明概述
在本发明的第一方面，提供用于操纵植物的生长和/或结构的方法，包括与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的维管组织中的PXY和/或CLE的天然表达和/或活性相比，修饰植物以特异性地提高植物的维管组织中的PXY和/或CLE的表达和/或活性。
修饰植物优选包括特异性地提高植物的维管组织中的PXY和/或CLE的表达和/或活性，其中经修饰的植物的非维管组织中的PXY和/或CLE的表达和/或活性基本保持不变。换句话说，经修饰的植物的非维管组织的表达和/或活性可与保持在相同的条件下的野生型植物的非维管组织中的基本相同。
CLE可为CLE41和/或CLE42。替代地，CLE可为CLE41、CLE42和CLE44的一种或多种。
修饰植物优选包括特异性地提高植物的形成层中的PXY的表达和/或活性，使得经修饰的植物的非形成层组织(包括韧皮部和木质部)中的PXY的表达和/或活性基本保持不变。换句话说，经修饰的植物的非形成层组织中的表达和/或活性可与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的非形成层组织基本相同。
修饰植物优选包括特异性地提高植物的维管组织中的CLE的表达和/或活性，使得经修饰的植物的非维管组织中的CLE的表达和/或活性基本保持不变。换句话说，经修饰的植物的非维管组织的CLE的表达和/或活性可与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的非维管组织中的基本相同。
修饰植物优选包括特异性地提高植物的韧皮部中的CLE的表达和/或活性，使得经修饰的植物非韧皮部组织(包括形成层和木质部)中的CLE的表达和/或活性基本保持不变。换句话说，经修饰的植物的非韧皮部组织中的表达和/或活性可与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的非韧皮部组织中的基本相同。
修饰植物以特异性地提高维管组织特异性表达和/或活性可包括向植物引入特异性地指导植物的维管组织中的、更优选植物的形成层中的PXY的表达的调控元件。
修饰植物以特异性地提高维管组织特异性表达和/或活性可包括向植物引入特异性地指导植物的维管组织中的、更优选植物的韧皮部中的CLE的表达的调控元件。
本文所述的操纵植物的生长和/或结构的方法，可包括与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的维管组织中的PXY和CLE的表达和/或活性相比，修饰植物以特异性地提高植物的维管组织中的CLE和PXY的表达和/或活性。与野生型植物中的天然表达相比，提高了PXY和CLE两者的表达和/或活性。
因此，如本文所述的操纵植物的生长和/或结构的方法可包括：i)修饰植物以特异性地提高植物的形成层中的PXY的表达和/或活性，与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的维管组织中的PXY的表达和/或活性相比；和ii)修饰植物以特异性地提高植物的韧皮部中的CLE的表达和/或活性，与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的维管组织中的CLE的表达和/或活性相比。
修饰植物的方法可包括通过将PXY置于维管组织特异性启动子的控制下，使PXY的表达和/或活性指向植物的维管组织。启动子可对韧皮部、木质部或形成层为特异性的。优选地，启动子为形成层特异性的。启动子可为ANTEGUMENTA植物(本文称为“ANT”)基因的启动子，或其功能片段或变体。ANT启动可优选衍生自杂交白杨(PttANT)。
修饰植物的方法可包括通过将CLE置于维管组织特异性启动子的控制下，使CLE的表达和/或活性指向植物的维管组织。启动子可为韧皮部，木质部或形成层特异性的。优选地，启动子可为韧皮部特异性的。启动子可为韧皮部特异性凝集素基因韧皮部蛋白质(PHLOEM PROTEIN)2(本文称作“PP2”)的启动子，或其功能片段或变体。PP2启动子可以优选衍生自杂交白杨(PttPP2)。
在第二方面，本发明还提供用于提高植物生长速率的方法，方法包括如本文所述的那样操纵植物的生长和/或结构。
在第三方面，本发明还提供用于提高植物的径向生长的方法，方法包括如本文所述的那样操纵植物的生长和/或结构。
在第四方面，本发明还提供用于提高植物中叶组织的量的方法，方法包括如本文所述的那样操纵植物的生长和/或结构。
在第五方面，本发明提供用于提高植物的生物质的方法，方法包括如本文所述的那样操纵植物的生长和/或结构。
在第六方面，本发明提供生产植物衍生产品的方法；包括如本文所述的那样操纵植物的生长和/或结构，并且从植物收获植物产品。
在第七方面，本发明提供表达盒，其包括编码特异性地指导植物的维管组织中的表达的调控元件的核酸序列。调控元件可以特异性地指导韧皮部、木质部或形成层中的表达。优选地，调控元件会特异性地指导形成层中的表达。调控元件可为ANT基因的启动子，或其功能片段或变体。调控元件可为PP2基因的启动子，或其功能片段或变体。表达盒的调控元件可以可操作地连接至基因，比如PXY和/或CLE。表达盒可包括可操作地连接至编码PXY的核酸分子的第一调控元件和可操作地连接至编码CLE的核酸分子的第二调控元件。
在第八方面，本发明提供转基因植物细胞，其包括如本文所述的表达盒。因此，根据第一方面的方法操纵植物细胞。
在第九方面，本发明提供包括如上述的植物细胞的转基因植物、植物部分或转基因种子。因此，根据第一方面的方法操纵植物、植物部分或转基因种子。
在第十方面，本发明提供根据第六方面的方法生产的植物衍生产品。
在第十一方面，本发明提供维管特异性调控元件的用途，用于操纵植物的生长和/或结构。调控元件可以为例如ANT基因的启动子或其功能片段或变体和/或PP2基因的启动子或其功能片段或变体。可在根据本发明的第七方面的表达盒中提供调控元件。优选地，该用途为根据本发明的第一至第六方面中的任一种的方法。
在第十二方面，本发明提供包括根据第七方面的表达构建体的宿主细胞或生物体。
附图说明
将参照附图以举例的方式进一步描述本发明，其中：
图1显示异位过表达PttCLE41和/或PttPXY基因的杂交白杨的表型。(A)：来自生根三周后组织培养生长的小植物的切片。在上部图中显示两幅照片时，它们选择为显示观察到的表型的范围。比例尺表明200μM(上部)和50μM(下部)。标示了木质部(x)和韧皮部(ph)。星号显示有组织的细胞列的实例。(B)：转移至土壤后三个月代表性的温室种植的植物。(C)：具有靶向性过表达PttCLE41和PttPXY的杂交白杨的表型。左部图显示来自生根三周后组织培养生长的小植物的切片，而转移至土壤后三个月温室种植的植物显示在右侧。比例尺表明200μM。也标示木质部(x)和韧皮部(ph)。箭头突出了受破坏的木质部。
图2显示衍生自PttANT和PtPP2启动子的表达模式。GUS染色并清洁的(cleared)对照(A)、PttANT：：GUS(B)和PtPP2：：GUS(C)植物。上部图显示叶，下部图为横向茎切片。比例尺表明200μm(上部图)100μm(下部图)。
图3显示具有靶向性PttCLE41/PttPXY过表达的树的生长特性。显示来自土壤中生长的杂交白杨的平均茎直径(A)和植物高度(B)测量。在15周(七月)、26周(八月)和33周(十月)测量四月生根的树。进一步分析6个月大的植物：节间的数量(C)，第50个节间的长度(D)，从来自第50个节间附近的5片叶的测量计算的叶面积(E)和具有40℃的圆心角的茎横截段中的木质部细胞数(F)。(G)显示10cm树苗茎块的干重的图。从底部(base)、中部(第50个节间)和顶部取样，除了35S：：PttCLE41外，35S：：PttCLE41具有少于50个的节间并且取而代之使用了顶部和底部之间的中点处的切片。所有的p值用ANOVA和LSD事后检验计算，n＝15(A-E)或8(F，G)。
图4显示衍生自PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY的独立转化体(transformants)的克隆繁殖的植物的生长。在从组织培养转移到土壤之后4周，开始每周测量植物的直径(顶部)和高度(底部)。星号表明与对照相比小于0.005的p值。所有的p值都使用ANOVA和LSD事后检验计算，对于对照n＝6；对于PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY品系1、3和9，n＝5；对于品系2和4，n＝4。
图5显示PXY和CLE的氨基酸序列比对。(A)来自拟南芥(AtPXY，AT5G61480)，毛果杨(P.trichocarpa)(PtPXY，Potri.003G107600)和杂交白杨(PttPXY，本研究)的PXY序列的比对。(B)来自拟南芥(AtCLE41，AT3G24770)、毛果杨(PtCLE41，Potri.012G019400)和杂交白杨(PttCLE41，本研究)的CLE41序列的比对。通过黑色矩形表明CLE41序列中的TDIF肽。从含有PttPXY的质粒翻译ORF获得Ptt序列，并且补充数据克隆的PttCLE41基因作为本发明一部分。从phytozome(http：//www.phytozome.net/)获得其他蛋白质序列。
图6显示杨树(Poplar)CLE41和PXY基因在拟南芥中是起作用的。来自典型野生型(A)、35S：：PttCLE41(B)、pxy突变体(C)、和以35S：：PttPXY补充的pxy突变体(D)的拟南芥下胚轴(LHS)和花序茎维管束(RHS)的切片。标尺表明50μM。
图7显示过表达杨树PXY基因的拟南芥品系的生长特性。拟南芥35S：：PttCLE41品系的每维管束的细胞数(A)和植物高度(B)与野生型对照物比较。拟南芥pxy，pxy35S：：PttPXY，SUC2：：AtCLE41，SUC2：：AtCLE41-35S：：PttPXY品系的每维管束的细胞数(C)，植物高度(D)和干重(E)与野生型对照物比较。使用ANOVA和LSD事后检验计算P值，其中N＝10(A,C)或40(B,D,E)。
图8显示过表达PttCLE41/PttPXY的杂交白杨品系的生长特性。从土壤中生长的杂交白杨测量高度(A)和直径(B)。在15周(7月)、26周(八月)和33周(10月)测量四月生根的树，N＝15。
图9显示木质部细胞数量和转基因树的生物质。(A)图显示生根后三周组织培养中的对照和35S：：PttCLE41，35S：：PttPXY，35S：：PttCLE41rolD：：PttPXY，PtPP2：：PttCLE41，PttANT：：PttPXY和PtPP2：：PttCLE41PttANT：：PttPXY杂交白杨品系的维管细胞的数量。(B)取自底部、中部(第50个节间)和顶部的10cm树苗茎块的湿重，除了35S：：PttCLE41外，35S：：PttCLE41具有小于50个的节间且取而代之从顶部和底部之间的中部取切片。图像显示图3G中的茎块的湿重。*显著地大于野生型p<0.05；**显著地大于所有其他品系p<0.001；使用ANOVA和LSD事后检验计算数值，N＝7。
图10显示使用Cellprofiler的表型表征。(A)：来自第50个节间的横向茎切片，显示了在具有40℃的圆心角的段中的木质部(顶部)和通过Cellprofiler识别细胞腔(下方)。以大于95％的准确率识别细胞，但是不识别没有清楚的腔的细胞，比如射线细胞(raycell)或非常小的纤维细胞。(B)：基于在(a)中列出的矩形(顶部)测量细胞尺寸和细胞壁面积。一级对象(细胞腔)得到识别(上中部)并且向外扩散以识别二级对象(下中部)。通过从二级对象减去一级对象获得三级对象(tertiary objects)(细胞壁)(底部)。(C)：基于识别一级对象(中部)和然后通过尺寸和形状过滤识别脉管(vessels)(底部)。
图11显示PttCLE41和PttPXY在PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY品系中的表达分析。(A)：RT-PCR显示在8个独立的转基因品系的表达。邻近第50个节间取茎材料。(B)：使用Image Lab 5.1软件(Bio-rad)确定(A)中PCR产物的相对强度。(C)：细胞数量和PttPXY表达之间的关系。(D)：细胞数量和PttCLE41表达之间的关系。
图12是本发明的效果的图形表示。
图13(A)显示PXY与来自拟南芥的相似基因(PXL1和PXL2)，与来自稻(Os02g02140.1和Os03g05140.1)和杨树(PttPXY)的同源基因一起比对。还显示了PXY的共有序列；(B)显示PttPXY的氨基酸和编码该蛋白质的核酸序列；(C)显示编码拟南芥PXY的核酸序列。
图14A显示CLE41和CLE42与来自其他植物物种的同源序列，包括CLE41共有序列的比对；(B)显示拟南芥氨基酸和核酸序列；(C)显示PttCLE41的核酸序列。
图15显示CLE42蛋白质的氨基酸序列(A)和CLE42基因的核苷酸序列(B)。
发明详述
本发明人已表明PttPXY及其肽配体PttCLE41为功能性直向同系物且作用为控制多官能途径，其调节树中的形成层细胞分裂速率和木材组织构造两者。本发明基于这样的发现：表现出木形成速率增加的PXY维管组织特异性过表达生成的植物与野生型对照植物相比更高并且拥有更大的叶。该结果表明PXY-CLE通路已经发展到调节二次(secondary)生长并且操纵此通路可导致极大提高的树生长和生产率。
定义
如本文所使用的，术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及DNA或RNA产生的类似物，例如，通过使用核苷酸类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选双链DNA。核酸分子可为重组体。
“天然存在的”核酸分子是指具有天然核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。天然核酸分子还可称为天然的。
术语蛋白质和多肽是指氨基酸的任意长度的聚合形式，其可包括编码和非编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有修饰的肽骨架的多肽。术语蛋白质和多肽在本文可互换使用。
"外源"是指对于植物而言，核酸分子或多肽用来表明该核酸序列或多肽不天然地存在于该植物中，或不天然存在于该植物的遗传基因座中。
对于基因组DNA，术语“分离的”包括从与该基因组DNA天然相关的染色体分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不含这样的的序列，该序列天然地位于衍生该核酸的生物体的基因组DNA中的核酸侧翼(即，位于核酸的5’-和/或3’-的末端的序列)。此外，“分离的”核酸分子，比如cDNA分子,当通过重组体技术生产时，可基本上不含其他细胞材料，或当以化学方式合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。
术语“重组核酸分子”是指具有非天然的序列或者具有由人工组合的两个原本分开的序列的核酸分子。此人工组合可为伴随化学合成或通过人工操纵核酸分子，例如通过基因工程技术，比如通过限制酶、连接酶、重组酶、和/或聚合酶操纵至少一种核酸。
如本文所使用的，术语“基因”和“重组基因”是指包括编码蛋白质的开放阅读框架，和可进一步包括非编码调节序列和内含子的核酸分子。
术语"核酸的互补序列"是下述核苷酸序列，其能够与所表示的核苷酸序列形成双链DNA分子，并且可通过以根据Chargaff's规则(A<>T；G<>C)将核苷酸替换为其互补核苷酸并以5’至3’的顺序读取，即与所表示的核苷酸序列相反的方向从所述的核苷酸序列衍生出来。
“调控元件”是调节基因转录的基因的非编码区。
“表达盒”是遗传媒介物，包括用于表达基因的调控元件或编码序列，和任选的其可操作连接的编码序列。表达盒可促进引入其的细胞中的基因表达。
"可操作地连接"是指作为同一核酸分子的一部分而连接，适当地定位和定向以用于由启动子引发的转录。可操作地连接至启动子的DNA是启动子的“转录启动调节下的”。
已经引入了外源核酸分子的细胞可在本文成为重组细胞，或转基因或转化细胞。可将向细胞中插入核酸分子界定为引入。一旦引入至宿主细胞，通过宿主细胞复制重组核酸，然而一旦重组核酸在细胞中被复制，该重组核酸仍然是出于本发明的目的的重组核酸。
本文的“重组蛋白”是指采用重组核酸的方法生产的蛋白质。术语蛋白质可与术语多肽互换使用。上述“重组核酸分子”和“重组蛋白”也如上所述是“分离的”。引入重组核酸分子的细胞可被描述为重组细胞，或转化或转基因细胞。
转基因植物，植物部分或种子可包括一种或多种转基因植物细胞，即包括通常不见于此类植物或树的且已经通过人为操纵引入到目标植物中的(或进入到植物的祖先(progenitor)中)重体基因材料的细胞。
本文中，“表达”是指基因产物的生物合成，即在结构基因比如PXY或CLE的情况中，表达涉及结构基因向mRNA的转录和mRNA向一种或多种多肽的翻译。
“提高的表达”是指与保持在相同的条件下相同物种的野生型植物中的相同基因的水平相比，转录和转译翻译的水平的提高。
“活性”是指蛋白质的表型性质，例如其与结合配偶体的结合能力，其在通路中产生信号的能力，和对生长和发育的介导下游作用。
包括在本发明范围内的是本文限定的多肽和核酸分子的功能等价物。术语“功能等价物”意在包括如本文所述的核酸分子或蛋白质的片段，突变体，杂交体，变体，类似物，或化学衍生物，其享有至少一种天然核酸分子的结构特性或蛋白质的功能特性。
如本文所述的核酸分子或多肽的功能片段可包括享有基本类似于主题多肽或核酸分子的至少一种功能或结构特性的氨基酸或核酸序列的任意部分。结构或功能特性可包括天然核酸或多肽的结合特性、调节下游信号传导通路以介导一种或多种表型效应的能力。
如本文所使用的，术语“在严格的条件下杂交”描述了条件用于杂交和洗涤的条件。严格的条件对所属领域技术人员是已知的且可在可用的参考文献中找到(例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6)。该参考文献中描述了水性和非水性的方法且每种都可使用。
可使用任意同源性对比软件确测序列同一性(例如，百分比同源性)，包括例如，比如通过使用默认参数的National Center of Biotechnology Information(NCBI)的BlastN软件。
本文限定的多肽或蛋白质的变体可改变了一个或多个氨基酸。变体可具有“保守的”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如，以异亮氨酸取代亮氨酸。更罕见地，变体可具有“非保守的”改变，例如，以色氨酸取代甘氨酸。类比的小变化可还包括删除或插入氨基酸或两者皆有。可使用所属领域中已知的电脑程序发现确定哪些氨基酸残体(残基)可被取代、插入或删除的指导，例如，软件。本文想定的多肽的功能变体会优选保留非变体多肽的至少一种结构或功能特性。
“维管组织”是指植物中的传导和支撑组织。
“特异性地”或“特异性表达或活性”是指在一种细胞类型、组织或发育期比在另一种细胞类型、组织或发育期，更优先表达核酸分子，或者蛋白质是优先有活性的。
本文中，植物的“生长”是指植物的尺寸，优选二次生长，且优选维管和/或维管束间的组织的量，更优选木质部细胞(其还称为植物的木材组织或生物质)的量。
“径向直径”衡量植物的周长，且表明维管组织的生长和分裂。
“生物质”是指由植物生产的组织的量，例如在一个生长季中。“叶组织”是叶的量，以重量表达.
“活力(Vigour)”是指在给定时间内由植物生产的组织按重量计的量。
“生长速率”衡量在特定的时间间隔内生长的量，例如重量或径向的生长。
“种子产率”是例如在给定的生长季中从植物收获的例如按重量计的种子量。
植物的“结构”是指植物中的组织，优选维管组织，最优选韧皮部和木质部细胞的极性的机构形成。
“相同的条件”是指温度、光照和营养物和水的可得性基本相同。基本是指条件可轻微变化，但没有到影响到植物的生长的程度。术语“相同的条件”还包括比较相同物种，预选的相同发育阶段的植物。
PXY
本文中，PXY是指本质上与CLE41或CLE42结合的受体样激酶。优选地，术语PXY是指包括细胞外域的受体样激酶，所述细胞外域包括富含亮氨酸的重复序列(LRR)。通过CLE41和/或CLE42的结合，其介导信号传导通路的激活，这导致未分化的形成层细胞的分裂。本文中，术语PXY优选地是指拟南芥(Arabidopsis thaliana)RLK蛋白质的XI家族的一员。PXY在本领域中还称为TDR。
本文中，PXY多肽包括i)多肽，其包括激酶域中的保守区，其中保守区包括图13A的共有序列，且能够结合CLE41和/或CLE42和介导导致未分化的形成层细胞分裂的信号传导通路的激活；ii)多肽，具有如图5A，13B，13C中所示的氨基酸序列。替代地，如本文所述的PXY多肽可为衍生自另一种植物，比如木本植物的该多肽的功能性直向同系物(orthologue)。该直向同系物优选能够结合至CLE41或CLE42和介导导致未分化的形成层细胞的分裂的信号传导通路的激活。该直向同系物优选包括图13A的PXY多肽共有序列。
本文所指的PXY包括多肽的功能等价物。等价物包括如本文所述的PXY多肽片段和变体(包括直向同系物)。本发明中使用的PXY的功能等价物具有部分或全部的期望的天然多肽的生物活性，优选结合至CLE41和/或CLE42和调节维管组织的生长和/或分化的能力。功能等价物可呈现与天然PXY多肽相比对CLE41和/或CLE42改变的结合特性。优选的功能等价物可表现出与天然蛋白质相比降低的不理想的生物活性。功能等价物优选包括对图5A，13B,或13C的PXY多肽的至少70％的序列同一性，更优选与图5A，13B,或13C的PXY多肽的至少75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。功能等价物优选包括具有与图13A的PXY共有序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。
PXY多肽的功能片段是如本文所述的多肽序列或变体的一部分。功能片段优选保留了全长度的PXY多肽的部分或全部的生物活性。优选地，PXY的功能片段保留了结合CLE41或CLE42和调节植物的维管组织的生长和/或分化的能力。优选地，片段包括至少一部分激酶域，优选其生物活性部分，直至全长度的激酶域。最优选地，片段进一步包括细胞外域的至少一部分，且优选包括LLR区的至少一部分。片段可为全长度的PXY多肽的长度的40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
编码PXY的核酸可包括编码图5A的多肽的序列。编码PXY的核酸序列可如图13B或图13C所示。编码PXY的核酸序列可得自Genbank，参考PXY＝At5g61480(TAIR)，PXL1＝At1g08590(TAIR)，和PXL2＝At4g28650(TAIR)；和Genbank登录号KP682331版本1(PttPXY)。
还包括本文限定的核酸分子的功能等价物，其编码如本文所述的多肽或其功能等价物。功能等价物可为序列的变体和/或如本文所述的PXY核酸序列的功能片段。变体会优选编码具有结合CLE41或CLE42和调节植物的维管组织的生长和/或分化的能力的多肽，且优选享有与图13B或13C的核酸序列的至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，或编码具有与图5A或13B或图13C的多肽的至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽，或编码包括图13A的共有序列的多肽。替代地，变体可被定义为在严格的条件下与图13B或13C的核酸序列互补物杂交的序列。片段可编码如上述的PXY多肽的功能片段。核酸分子的片段可为图13B或13C的PXY核酸序列全长度的40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％的长度。
CLE
本文中，CLE是指能够激活激酶受体，并且导致自身或其目标磷酸化的配体。优选地，术语CLE是指信号传导蛋白质，优选小于15kDa的质量，且优选包括在氨基末端的疏水性的区。与PXY结合时，其介导导致未分化的形成层细胞的分裂的信号传导通路的激活。术语CLE包括CLE41，CLE42和CLE44，且本发明的方面可涉及提高CLE41，CLE42或CLE44的表达和/或活性。CLE41在本领域中还称作TDIF。
本文中，CLE41或CLE42多肽包括i)多肽，所述多肽包括激酶域中的保守区，其具有包括图14A的共有序列的序列，且能够结合PXY以介导导致未分化的形成层细胞的分裂的信号传导通路的激活；ii)多肽，其具有如图5B，14B或14C,或15A中所示的氨基酸序列。替代地，如本文所述的CLE41或CLE42多肽可为衍生自另一种植物，比如木本植物的多肽的直向同系物。该直向同系物优选能够结合至PXY并且介导导致未分化的形成层细胞的分裂的信号传导通路的激活。该直向同系物优选包括图14A的CLE多肽的共有序列。
本文的CLE41，CLE42和CLE44包括多肽的功能等价物。等价物包括如本文所述的CLE41或CLE42多肽的片段和变体(包括直向同系物)。本发明中使用的CLE的功能等价物具有天然多肽的部分或全部的期望的生物活性，优选结合至PXY和调节维管组织的生长和/或分化的能力。功能等价物与天然CLE多肽相比可呈现对PXY改变的结合特性。优选的功能等价物可表现出与天然蛋白质相比降低的不理想的生物活性。功能等价物优选包括与图5B，图14B或图14C的CLE41多肽的至少70％的序列同一性，更优选与图5B，图14B或图14C的CLE41多肽的至少75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。功能等价物优选包括序列具有与图14A的CLE41共有序列的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。功能等价物优选包括与图14A、图14B或图15A的CLE42多肽的至少70％的序列同一性，更优选与图14A，图14B或图15A的CLE42多肽的至少75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。功能等价物优选包括具有与图14A的CLE42共有序列的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。
CLE多肽的功能片段是如本文所述的CLE41或CLE42多肽序列或其变体的一部分。功能片段优选保留了全长度的CLE多肽的部分或全部的生物活性。优选地，CLE的功能片段保留了结合PXY和调节植物的维管组织的生长和/或分化的能力。片段可为全长度的CLE41或CLE42多肽的40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％的长度。优选地，片段长度可为至少7个氨基酸，长度优选至少8、9、或10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸，直至全长度的CLE41或CLE42多肽。最优选地，片段包括由图14A的共有序列的124-137个氨基酸组成的保守区。
核酸编码CLE41可包括编码图5B，图14B或图14C的多肽的序列。编码CLE41的核酸序列可如表图14B或14C所示。PttCLE41的核酸和氨基酸序列可在Genbank登录号KP682332，版本1获得。
编码CLE42的核酸可包括编码图5B或图15A的多肽的序列。编码CLE42的核酸序列可如图15B中所示。
还包括本文限定的核酸序列的功能等价物，其编码如本文所述的多肽或如本文所述的上述多肽的直向同系物和功能等价物。功能等价物可为如本文所述的CLE41或CLE42核酸序列的序列的变体和/或功能片段。变体优选编码具有结合PXY和调节植物的维管组织的生长和/或分化的能力的CLE41或CLE42多肽或其功能等价物，且优选享有与图14B或14C,或15B的核酸序列的至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。替代地，变体可被定义为在严格的条件下与图14B或14C，或15B的核酸序列的互补序列杂交的序列。片段可编码如上述的CLE41或CLE42多肽的功能片段。核酸分子的片段可为全长度的CLE41或CLE42核酸序列的40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％的长度。编码CLE41或CLE42的核酸分子的片段优选包括至少21个核苷酸的长度，更优选至少24，27，30或33个核苷酸，直至图14B或14C,或15B的全长度的序列中的核苷酸残基的总数量。
功能等价物
如本文所述的核酸分子的变体可包括在严格的条件下与参照序列互补的序列杂交的序列，或与参照序列具有特定程度的序列同一性的序列。如果两种核酸或氨基酸序列享有共同的祖先序列并且当带有祖先序列的物种分成两个物种、亚种、或品种时趋异，它们就互相为直向同系物。直向同源的序列也是同源的序列。直向同源的序列在高度严格的条件下相互杂交。
高度严格的杂交条件的优选的实例为在约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在50℃在0.2×SSC、0.1％(w/v)SDS中清洗一次或多次。另一个严格的杂交条件的实例为杂交在约45℃在6×SSC中，接着在55℃在0.2×SSC、0.1％(w/v)SDS中清洗一次或多次。严格的杂交条件的进一步实例为在约45℃在6×SSC杂交，接着在60℃在0.2×SSC，0.1％(w/v)SDS中清洗一次或多次。优选地，严格的杂交条件为在约45℃在6×SSC中杂交，接着在65℃在0.2×SSC，0.1％(w/v)SDS中清洗一次或多次。特别优选的严格的条件(且如果实施者不确定应当采用的用来确定分子是否在本发明的杂交限制内的条件，应当使用该条件)为0.5M(molar)磷酸钠，7％(w/v)SDS在65℃，接着在65℃在0.2×SSC，1％(w/v)SDS中清洗一次或多次。
可如本文所述地那样确测序列同一性，经过预定义的比较窗口。比较窗口可为全长度的参照序列的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
操纵植物生长/结构
“操纵”是指改变植物的天然生长模式，使得根据本发明的方面操纵的植物与保持在相同的条件下的相同物种的野生型(非操纵)植物相比，呈现改变的生长模式和/或结构。所述操纵优选通过如本文所述的第一方面的方法实现。
所述操纵优选包括提高植物中PXY和/或CLE的表达和/或活性。
提高的表达一般会导致提高的细胞或组织中的蛋白质的量，与相应的细胞或保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物中的组织中的量相比。提高的表达可通过测量提取自经修饰的植物的细胞或组织中的基因产物的相对量并使用以下本领域中存在的技术使其与来自野生型植物的相应的细胞或组织中的水平比较，比如活性测定、使用能够特异性结合多肽的抗体的蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、Northern blot分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析(包括定量，半定量或实时RT-PCR)和RNA原位杂交。提高的表达可还通过测量蛋白质的表型效应确定，和确定与保持在相同的条件下的野生型植物中的相应的表型相比表型效应是否存在提高。
提高的蛋白质活性可通过为测量经修饰的植物的表型效应并且使该表型效应与保持在相同的条件下野生型植物的相同的表型比较而确定。经修饰的植物与野生型植物相比在表型效应上的统计学上显著的改进表明蛋白质的表达和/或活性的提高。
在植物天然表达PXY或CLE的情况下，它们的调节可通过改变一种或多种天然基因的表达模式和/或多肽的生产实现。这可通过任意合适的方法实现，包括改变基因的转录，和/或mRNA向多肽的翻译，和多肽的翻译后的修饰。
组织特异性表达或活性是指与相同的植物的另一组织相比，核酸分子在特定的组织中优先被表达，或与另一种组织相比，蛋白质在一种组织中优先是有活性的。可使用特异性调控元件控制核酸分子的表达实现特异性表达。
改变天然基因的表达模式可通过将其置于异源性的调节序列的控制之下实现，所述异源性的调节序列能够指导如本文所述的天然基因的期望的表达模式。合适的调节序列描述于本文中。
替代地，可通过改变介导基因的表达的转录因子的模式而改变对天然基因表达的调节。这可需要使用修饰的转录因子，其结合模式被改变以获得期望的基因的表达模式。
替代地，可提高或降低天然基因的拷贝数量，以便改变基因的表达的量，例如通过向植物细胞中引入包括该基因的表达盒。基因可受到合适的调控元件的控制以实现如本文所述的期望的组织特异性表达。
用于实施本发明的这些实施方式合适的方法对所属领域技术人员是已知的，并且可采用根据本发明的表达构建体的用途。
此外，调节由CLE和/或PXY介导的活性可通过改变它们的结合模式以便上调下游信号传导通路而实现。可以任意合适的改变结合模式，例如通过改变结构，结合亲和性，暂时的(temporal)结合模式，选择性和可在细胞表面上结合CLE和/或PXY的量。可通过对配体多肽进行恰当的改变而改变结合模式，例如改变它对受体的结合位点，使用已知的方法用于诱变。替代地，可使用非蛋白质类似物。本发明中使用的用于操纵多肽的方法在本领域是已知的，且包括例如改变编码多肽的核酸序列。用于诱变的方法是已知的。优选地，使用编码序列的核酸的诱变生产变体，其是以不影响序列的阅读框架并且以不影响多肽的方式实现，其中不影响多肽的方式影响了期望的生物活性。
在本发明中使用的合适的变体的选择中，可使用常规测定筛选具有具有期望的性质的那些。这可通过目视观察植物和植物材料、或测量植物或植物材料的生物质。
所述操纵可稳定的或瞬时的。
PXY和/或CLE在植物的维管组织中的过表达可被用来提高植物的维管组织中的细胞数量，但不提高植物的实际生物质(即可提高细胞数量，但是这些细胞的尺寸较小)。这具有提高维管组织的密度的效果，且因此生产更硬的木材。因此，本发明包括用于生产具有特定密度的木材产品的方法，其包括如本文所述的第一方面的步骤。此外，据设想通过操纵植物细胞来分化它们的维管组织，并因此生长，环境生长信号可被绕过(bypassed)并且可使用本发明可延长植物的生长季，超过天然植物中的可能的生长季。
调控元件
调控元件控制与其可操纵地连接的基因的表达，例如空间和/或时间表达。
调控元件不受限制地包括启动子、5’和3’UTR’s，增强子，转录因子或蛋白质结合序列，起始位点和终止序列，核酶结合位点，重组位点，多聚腺苷酸化序列，和正义或反义序列。如本文所使用的，术语“启动子”是指位于与RNA聚合酶结合的基因的转录起始位点的上游的DNA的区，以引发RNA的转录。调控元件可为DNA，RNA或蛋白质。优选地，调控元件是能够使指向(指导)与其可操纵的连接的编码序列的组织的特异性表达的核酸序列。
调控元件因此优选为组织特异性的，维管组织特异性的。其对指导植物的形成层，木质部和/或韧皮部组织中的表达可为特异性的。优选的调控元件是对形成层或韧皮部特异性的。
组织特异性的调控元件不需要仅在相关的组织中指导表达，而是可在非维管组织中(或非形成层或非韧皮部)指导表达，但在非维管(例如非形成层或非韧皮部)组织中指导表达可为受限的或不存在的。
调控元件可优选为植物衍生的，以便提供期望的组织特异性。优选地，调控元件可为衍生自与被调节的植物的相同的植物物种。然而，据设想能够提供组织特异性表达的非植物调节序列在本发明中使用可为合适的，例如当与另一种组织特异性的调控元件结合使用时。该启动子包括病毒，真菌，细菌，动物和植物-衍生的能够在植物细胞中运行的启动子。
调控元件可为可诱导的且可指导响应环境或发育诱因的表达，比如温度，化学物质，干旱等。其可为发育阶段特异性的。调控元件可为组成性的(constitutive)，其由此在大多数环境或发育条件下指导表达。在优选的方面，启动子是可诱导的启动子或发育调节的启动子。
韧皮部特异性的启动子包括SUC2，APL，KAN1，KAN2，At4g33660，At3g61380，和At1g79380，以及PP2。优选地，启动子是毛果杨(populus trichocarpa)的PP2基因的上游区中存在的序列，优选在PP2基因的起始密码子的上游的1999bp内。启动子可通过使用引物获得：
(pPtPP2-FatccctaggcctgcaggTAAGCTATGTACGTTTTGG和
pPttANT-R atcactagtGACAAGCTGAGAGACTG)。
木质部特异性的启动子包括REV，IRX1COBL4，KOR，At2g38080，和At1g2744.
形成层组织特异性的启动子包括ANT。优选地，启动子是从起始密码子的上游1156bp至起始密码子的上游906bp的杂交白杨的ANT基因的上游区中存在的序列。启动子可通过使用引物获得：
pPttANT-F：atcgggcccCCGAAGTTGCTCACTTC和
pPttANT-R：atcactagtGACAAGCTGAGAGACTG)。
还包括如本文所述的调控元件的功能等价物(片段和变体)，其中该等价物能够指导与其可操纵的连接的编码区的维管组织特异性表达，优选形成层或韧皮部的特异性表达。优选的功能等价物可表现出与天然调控元件相比降低的不理想的活性。功能变体优选包括对本文限定的PttANT或PttPP2启动子序列的至少70％的序列同一性，更优选对本文限定的PttANT或PttPP2启动子序列的至少75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。
功能片段是如本文所述的调控元件或其变体的一部分，优选地其保留了全长度的调控元件的部分或全部的生物活性。优选地，如本文所述的调控元件的功能片段能够指导与其可操纵的连接的编码区的维管组织特异性表达，优选形成层或韧皮部特异性表达。片段可为全长度的调控元件的长度的40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。片段可为本文限定的全长度的PttANT或PttPP2启动子序列的长度的40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。优选地，片段长度可为至少30个氨基酸、优选长度为至少50、70、90、100、200、300、400或500个碱基对。
生长和结构
优选地，改变的生长为改进的或提高的生长，优选维管的生长。受操纵的植物的生长可与保持在相同的条件下的野生型植物的生长相比。使用的生长的指标为径向直径，活力，生长速率，叶组织的量，生物质的量，和种子产率。
对于树苗和成熟的树，可在胸高度测量径向直径。径向直径可被用作生物质体积的指征。可作为长度的单位表达。可通过每个指定时间段的生长参数(比如叶面积，纤维长度，莲座直径，植物鲜重等)的提高计算活力。活力的提高可被用来确定植物产率,或可影响植物产率(每个植物每个生长季产生的组织的量)。可例如使用正在生长的植物的数据分析测量生长速率。可定期捕获植物的图像并且通过数据分析计算莲座面积。使用取样日期之间面积上的差别除以取样之间日期的差别计算莲座面积生长。替代地，生产的生物质、叶尺寸、根长度等可被用作生长速率的指标。可通过从一些植物(例如8-16)收集全部种子、对它们称重并且将总重量除以植物的数量获得种子产率。优选在叶落下之前，在夏天收获并测量叶组织。
改变的结构可为改变的生长的结果，或可作为维管组织的顺序呈现。可通过限定的行中的细胞的有序排列识别野生型结构，与无序的结构相反，其中维管组织细胞以随机地没有任何可识别的模式存在。通过本发明修饰的植物优选表现出有序的维管组织结构。
维管组织包括木质部、韧皮部、和形成层细胞。韧皮部包括活细胞，负责植物中的运输。韧皮部组织可包括传导细胞，薄壁细胞和支撑细胞。形成层在韧皮部和木质部之间，并且是韧皮部和木质部细胞的来源。木质部细胞还负责运输。木质部细胞典型地为死的，并且在植物中运输水。
可通过以组织特异性的方式在植物的维管组织中提高PXY和/或CLE的水平实现改变的生长。与处于相同的发育阶段且在相同的条件下生长的相同物种的野生型植物的相同的组织中的水平/活性相比，受操纵的植物在维管组织中且在预选的发育阶段可具有提高的PXY和/或CLE(或其功能等价物)的水平/活性。
优选地，与保持在相同的条件下野生型植物中的PXY的水平相比，PXY的水平提高了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。与保持在相同的条件下的野生型植物中的CLE的水平相比，优选的CLE的水平提高了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
PXY的水平的提高可直接地提高组织中PXY的活性，或活性可独立于存在的PXY的量而提高，例如通过调节PXY及其配体配体，CLE之间的相互作用。优选地，与保持在相同的条件下的野生型植物中的PXY的活性相比，PXY的活性提高了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。与保持在相同的条件下的野生型植物中的CLE的活性相比，优选的CLE的活性提高了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
与保持在相同的条件下的野生型植物相比，提高的生长可限定为在径向直径，活力，生长速率，的量叶组织，的量生物质,和/或种子产率上提高至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更高。
可在植物寿命期间定期评估生长和/或结构的变化，且特别是在早期发育。例如，可对PXY和/或CLE的表达水平在3或6个月的间隙或每年取样。
植物中生物质的来源是它们的木材组织，衍生自植物的维管分生组织，比如形成层和原形成层，其分裂以形成植物茎和根中的维管组织的韧皮部和木质部细胞。形成层和原形成层(统称为维管分生组织)为使植物能够横向生长的生长区，因此产生大部分生物质。在植物的维管组织中提高PXY和/或CLE的水平已经表现出增强横向的生长，由此导致植物生物质的提高。这可对许多依赖植物衍生的产品的行业提供额外的生物质来源，比如生物燃料或造纸。
表达盒
可在如本文所述的表达盒中提供指导组织特异性表达的调控元件。除了如本文所述的用于在维管组织指导PXY或CLE的表达的调控元件之外，表达盒可包括终止子片段，多聚腺苷酸化序列，增强子序列，内含子，和其他序列。这些盒必须与表达盒的其余部分相容。这些盒对基因的表达或功能可为不必要的，但可通过影响转录改进基因的表达或运行、mRNA的稳定性等。因此，该盒可包括在表达构建体中以获得PXY和CLE在植物中的最佳表达和功能。
表达盒可进一步包括允许蛋白质靶向，稳定化、和/或纯化的额外的一个或多个区。开放阅读框架可定向为正义或反义方向。表达盒可作为载体或表达构建体的一部分提供。
表达盒可进一步包括指导第二基因的组织特异性表达的第二调控元件，例如PXY或CLE。第二调节序列可操纵地与第二基因连接，如本文所述的。
当两个或多个编码序列可操纵的连接至相同的调控元件时，编码序列可经由内部核糖体进入位点(IRES)序列相互连接，这促进了位于IRES序列下游的多核苷酸序列的翻译。
载体
本文中，载体是被用来向细胞内运输表达盒的载具(vehicle)，以生产转化的或转基因细胞。因此载体可包括表达盒之外的遗传物质，例如允许其在一种或多种宿主细胞复制的一个或多个核酸序列，比如一个或多个复制起点，选择标志物基因和本领域中已知的其他遗传因素(例如，用于向宿主细胞的基因组中整合遗传物质的序列等)。所述载体可为表达载体。
载体包括病毒衍生的载体，细菌衍生的载体，植物衍生的载体和昆虫衍生的载体。载体优选能够细菌宿主细胞，比如大肠杆菌(E.coli)中增殖，且与植物细胞中的增殖相容。载体可为噬菌粒，质粒，噬菌体，病毒，或人工染色体。
典型的载体可包括一种或多种启动子，选择标记，信号序列，调控元件(例如多聚腺苷酸化序列，未翻译的区，3’未翻译的区，终止位点和增强子)。该伴随序列可为质粒或病毒来源的，且可提供必要的特性以使得载体能够在细菌中产生并且被引入到植物细胞中。细菌/植物载体可优选包括广泛的宿主范围原核生物复制起点；原核生物选择性标志物；和，对于土壤杆菌(Agrobacterium)转化，用于土壤杆菌介导的植物染色体转移的T-DNA序列。
设计克隆载体使得编码序列(例如PXY或CLE)在特定的位点插入并且会被转录和翻译。基本的细菌/植物载体构建提可优选包括广泛的宿主范围原核生物复制起点；原核生物选择性标志物；和，对于土壤杆菌转化，用于土壤杆菌介导的植物染色体转移的T-DNA序列。载体可还包括用于允许将表达盒整合至植物基因组中合适的序列。这些可包括转座子序列，用于同源的重组宿主基因组片段的和Cre/lox序列，以及允许项植物基因组中随机插入表达盒的Ti序列。
本发明的载体可包括在转录起始调节区的基因的相对端的转录终止区。转录终止区可正常地与转录起始区缔合或衍生自不同的基因。特别地对于mRNA的稳定性，可选择待使用的转录终止区以强化表达。终止区的实例包括来自土壤杆菌Ti质粒的NOS终止子和稻α-淀粉酶终止子。
选择性标志物编码容易测定的标记蛋白质在本领域中是已知的。一般来说，选择性标志物是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且其编码这样的蛋白质，所述蛋白质的表达由一些容易检测的性质所表现，例如表型变化或酶活性。合适的选择性标志物可被用来促进转化细胞的识别和选择。这些会在植物或植物细胞上赋予选择性表型以使得能够选择那些包括表达盒细胞。优选的基因包括来自大肠杆菌(E.coli)的Tn9的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因，大肠杆菌的uidA基因座的beta-葡萄糖醛酸酶(gus，gluronidase)基因，来自Aequoria victoria的绿色荧光蛋白质(GFP)基因、和来自萤火虫Photinus pyralis的荧光素酶(luc)基因。如需要，可在载体中包括选择性的遗传标记，比如赋予选择性的表型的那些，比如对抗体或除草剂(例如卡那霉素，潮霉素，草丁膦，氯磺隆，氨甲蝶呤，庆大霉素，奇霉素，咪唑啉酮类和草甘膦)的耐受性。选择性标志物可在与组织特异性的调控元件相同的表达盒或载体上提供,或可在分开的表达盒上提供或用本发明的表达盒共转化。选择性标志物和/或报告基因可以合适的调节序列作为侧翼以使得它们在植物细胞中表达。
表达盒可被用来稳定地或暂时地转化植物细胞。在稳定的转化中，外源性的多核苷酸整合至植物基因组中且因此它代表了一个稳定和遗传的特征。在暂时的转化中，外源性的多核苷酸通过转化的细胞表达但其未整合至基因组中且因此它代表了暂时的特征。
对于进一步的细节，见例如，Molecular Cloning：Laboratory Manual：2ndedition，Sambrook等.1989，Cold Spring Habor Laboratory Press或CurrentProtocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubel等.Eds.，John Wiley&Sons，1992。
转化的方法
转化植物的木本物种的方法是本领域已知的。例如US4795855和WO9118094公开了杨树的转化。EP1050209和WO9725434公开了桉树的转化。
本发明的表达盒或载体可被用来稳定地或暂时地转化植物细胞。在稳定的转化中，外源性的多核苷酸被整合至植物基因组中且因此它代表了一个稳定和遗传的特征。在暂时的转化中，外源性的多核苷酸通过细胞被表达但其未被整合至基因组中且因此它代表了暂时的特征。
稳定的整合可包括i)土壤杆菌介导的基因转移(ii)直接的DNA摄取。后者可包括用于向原生质体中直接的摄取DNA的方法，通过短暂电击植物细胞引起的DNA摄取：通过使用微量移液器系统的粒子轰击向植物细胞或组织注入DNA；玻璃纤维或碳化硅晶须转化细胞培养物，胚胎或愈伤组织，或通过用萌发花粉直接温育(温育)DNA。
土壤杆菌系统包括食用含有的质粒载体整合至植物基因组DNA中的所限定的DNA片段。植物组织的接种方法随着植物物种和土壤杆菌递送系统而变化。广泛使用的方法是叶盘方案，其可用提供用于引发全株分化(whole plant differentiation)的良好源头的任意的组织外植体进行。补充的方法使用与真空过滤组合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统在产生转基因的双子叶植物中是特别可行的。
再生的转化植物然后可杂交育种并且使用传统的植物选育(breeding)技术对优良生长，生物质，产率和/或活性特征选择所得后代(后代)。
可使用常规测定筛选具有期望的性质的那些。这可通过目视观察植物和植物材料，或测量植物或植物材料的生物质实现。
植物
转基因植物包括从重组植物细胞生长的植物，和含有重组的核酸的植物的全部上代和后代。这包括有性或无性产生的后代。应理解术语转基因植物涵盖整株植物或树以及植物或树的部分，例如谷粒、种子、悬浮培养物、花、叶、根、果、花粉、愈伤组织、配子体、孢子体、茎、胚胎、小孢子等。
本发明中使用的优选的植物是那些以生物质为目标、和/或容易生长、呈现高生长速率、容易收获，且可以被容易地转化为生物燃料。优选的植物包括稻科植物、树、作物、和灌木。
根据本发明的一些实施方式，本发明的方法使用的植物是作物植物比如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、花生(peanut)、马铃薯(potato)、芝麻(sesame)、橄榄树(olive tree)、棕榈油(palm oil)、香蕉(banana)、大豆(soybean)、向日葵(sunflower)、油菜(canola)、甘蔗(sugarcane)、苜蓿(alfalfa)、小米(millet)、豆科植物(菜豆、豌豆)(leguminosae(bean、pea))、亚麻(flax)、羽扇豆(lupines)、油菜籽(rapeseed)、烟草、杨树(popular)和棉花。
本发明中使用的合适的植物为那些，在它们的天然形态产生大量的用于造纸和生产燃料的原料的那些植物。合适的植物类型的实例包括多年生快速生长的草本和木本植物，例如树，灌木(比如烟草)和禾本科植物(grasses)。本发明中使用的树包括桦木(birch)、云杉(spruce)、松树(pine)、杨树(poplar)、杂交的杨树、柳树、银槭(silvermaple)、刺槐(black locust)、悬铃木(sycamore)、枫香(sweetgum)和桉树(eucalyptus)。多年生稻科植物包括柳枝稷(switchgrass)、芦苇金丝雀草(reed canary grass)、草原索草(prairie cordgrass)、热带稻科植物、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和芒草(Miscanthus)。作物包括谷物(cereals)和豆类(pulses)、小麦、大豆、苜蓿(alphalpha)、玉米、稻(rice)、玉米、和(sugar beet)、马铃薯、木薯(tapioca)、高粱(sorghum)、小米(millet)、木薯属植物(cassava)、大麦、豌豆(pea)、和其他根、块茎或种子作物。重要的种子作物为油籽油菜(oil-seed rape)、甜菜、玉米、向日葵、大豆、和高粱。根据本发明的进一步的实施方式所述植物为木本植物，选自：杨树；桉树；黄杉(Douglas fir，花旗松，绿枞)；松树；核桃树；白蜡树(ash)；白桦树；橡树；柚木树(teak)；云杉(spruce)。可应用本发明的园艺植物可包括莴苣(lettuce)、菊苣(endive)和蔬菜芸苔属植物(vegetablebrassicas)、包括卷心菜(cabbage)、西兰花(broccoli)、和花椰菜(cauliflower)、以及康乃馨(carnations)和天竺葵(geraniums)。本发明可应用在烟草、瓜类(cucurbits)、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、辣椒、菊花中。提供感兴趣的种子的谷类植物包括油籽(Oil-seed)植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷类的种子，比如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦(rye)等。油籽植物包括棉花、大豆、红花(safflower)、向日葵、芸苔属植物(Brassica)、玉米、苜蓿、棕榈(palm)、椰子等。豆科植物(Leguminous plants)包括菜豆(beans)和豌豆。菜豆包括瓜尔豆(guar)、槐豆(locust bean)、胡芦巴(fenugreek)、大豆、四季豆(garden beans)、豇豆(cowpea)、绿豆(mungbean)、利马豆(lima bean)、蚕豆(fava bean)、扁豆(lentils)、鹰嘴豆(chickpea)等。
在本发明的进一步的实施方式中，所述植物选自：玉米(Zea mays)、油菜(Brassica napus，Brassica rapa ssp.)、苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cerale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(helianthusannuas)、小麦(Tritium aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甜马铃薯(lopmoea batatus)、木薯属植物(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Anana comosus)、柑橘树(Citrus spp.)可可树(Theobroma cacao)、茶树(Camellia senensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifer indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(macadamiaintergrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、燕麦、大麦、蔬菜和观赏植物。
植物衍生的产物
本发明在需要提高植物中的生物质的方法中是有用的，例如植物生物质被用在制造比如生物燃料和纸的产品中。本发明不限于方法制造这些特别的产品，且据设想本发明可应用在多种基于植物的产品的制造中。此外，本发明在改变植物材料的特性上也是有用的，使得植物材料可适用于特别的目的(比如WO2010029357中公开的，通过引用将该文献全文引入到本文中)。
植物-衍生的产品可包括种子、生物质、纤维、饲料、生物复合材料、生物聚合物、木材、生物燃料、板材(board)或纸。
在本发明的说明书和权利要求中，表述“包括”和“含有”和它们的变体意味着“包括但不限于”，且它们意在不排除(且没有排除)其他组分。在本发明的说明书和权利要求中，单数表述涵盖了复数表述除非上下文有明确的要求。特别地，当使用不定冠词时，应将本发明理解为考虑的是复数和单数表述，除非上下文有明确的要求。
与本发明的特别的实施方式结合描述的特征应理解为可应用于本发明描述的其他实施方式，除非为不相容的。本发明中公开的全部特征(包括任意所附的权利要求和附图)可以任意方式组合，除了这样的组合，其中至少一些特征和/或步骤是相互排斥的。本发明扩展至本发明中公开的特征(包括任意所附的权利要求和附图)的任意新颖的一个或任意新颖的组合。
参见附图进一步在以下实施例中描述本发明，以便以非限制性的方式阐述本发明：
实施例
用于植物转化的二元载体
对于杨树35S过表达载体，针对毛果杨(Populus trichocarpa)(Tuskan等(2006).Science 313，1596-1604)设计引物：
CLE41(Potri.012G019400)
PttCLE41-F：CACCTAGCTAGCCTTGGTGCTGGT
PttCLE41-R：ACCCCTTAATTCCCCCATTA
和PXY(Potri.003G107600)：
PttPXYF：CACCATGAAACTCCCTTTTCTTTT
PttPXY-R ACATTCGACTGCAGGCTTTT
并且用来从提取自杂交白杨(欧洲山杨x美洲山杨克隆T89，Populus tremula xtremuloides clone T89)的DNA扩增序列。随后经由pENTR-D-TOPO将这些克隆至pK2GW7(Karimi等(2002).Trends in Plant Science 7,193-195.2)中。对于rolD：：PttPXY35S：：CLE41构建体，使用LR克隆酶反应将PttCLE41亚克隆至与pENTR-D-TOPO-PttPXY和pK7m34GW2-8m21GW3组合的pDONRP4-P3中(Karimi等(2007)Plant Physiology 145，1183-1191)。在进入克隆或表达克隆中对克隆的PttPXY和PttCLE41测序。通过与毛果杨序列比对，对序列注释。将对PttPXY(登录号，KP682331)和PttCLE41(登录号，KP682332)注释的序列提交至NCBI。克隆期间，意外地引入了突变，这移除了在PttPXY基因末端的终止密码子并且导致由载体编码的44个氨基酸的扩展部分(extension)加入至C末端。
对于组织特异性表达，在LR克隆酶反应中，PttPXY和PttCLE41 pENTR-D/TOPO进入克隆与定制(custom)Gateway目的载体，pVX31(ApaI-pPttANT1-SpeI-R1R2GatewayCassette-t35S-SbfI)和pVX33(SbfI-pPtPP2-SpeI-R1R2Gateway Cassette-t35S-SbfI)组合使用，所述目的载体在pCambia2300骨架中使用基于限制的克隆构建。在杨树表达数据的基础上选择启动子序列。PttANT(Potri.002G114800)调节序列用于形成层特异性表达且PtPP2(Potri.015G120200)启动子用于韧皮部特异性表达。对于来自毛果杨的PtPP2启动子，使用引物(pPtPP2-FatccctaggcctgcaggTAAGCTATGTACGTTTTGG，pPttANT-RatcactagtGACAAGCTGAGAGACTG)扩增起始密码子上游1999bp的片段。对于PttANT1启动子，使用引物(pPttANT-FatcgggcccCCGAAGTTGCTCACTTC，pPttANT-RatcactagtGACAAGCTGAGAGACTG)扩增起始密码子上游1156bp至起始密码子下游904bp的序列，其驱动维管组织中的表达。为了形成双重组织特异性表达构建体，将SbfI-pPtPP2-PttCLE41-t35S-SbfI盒切出并且克隆至ApaI-pPttANT1-PttPXY-t35S-SbfI的SbfI位点。通过使用导致pPttANT：：eGFP-GUS和pPtPP2：：eGFP-GUS构建体的LR克隆酶反应在pVX31和pVX33中克隆编码eGFP-GUS的片段产生pPttANT和pPtPP2转录报道基因系。使用Rodrigues-Pousada((1993)The Plant Cell Online 5，897-911)中描述的方法的变型对手切片染色，并且在4℃在水合氯醛水溶液中过夜温育清洁之后观察(Berleth，等(1993)Development118，575-587)。
植物转化
使用Clough和Bent的方法(Clough，S.J.，and Bent，A.F.(1998).Plant Journal16，735-743)实施拟南芥转化。对于杂交白杨(克隆T89)的转化，使用基于Nilsson等((1992)Transgenic Research 1，209-220)的方法。简言之，含有二元载体的土壤杆菌株GV3101培养到0.6的OD600，通过在50ml管中离心收集并且在MS培养基，pH5.8中在室温再次悬浮，所述MS培养基补充有到终浓度25μM的乙酰丁香酮。从在无菌的条件下生长的杂交白杨切下叶和叶柄部分并且在再次悬浮的土壤杆菌中温育1小时并且置于补充有2％蔗糖、BAP(0.2mg/L)、IBA0.1mg/L和TDZ(0.1mg/L)的MS琼脂上，之后黑暗中温育48小时。接着，在MS中清洗植物的块并将其置于光照下在补充有250μg/ml头孢噻肟和100μg/ml卡那霉素的MS琼脂上。开始发芽之后，将愈伤组织转移至补充有蔗糖(2％)，BAP(0.2mg/L)，IBA(0.1mg/L)，卡那霉素(100μg/ml)的木本植物培养基(WPM)，用于枝芽生长并且随后转移至WPM用于生根。为了使植物生长同步以用于随后的分析，将要使用的每株小植物(plantlet)的顶部2cm移除并且在同一天重新生根。所有用于生长分析的植物都在相同的培养箱中并排生长并且一旦生根在同一天转移至土壤。对于长期生长，在四月将植物转移至温室并且保持直至12个月。
确定植物生长的特性
在浸润和用JB4包埋介质包埋之前使用固定在FAA中、通过乙醇系列脱水的植物材料确定维管构造。将5μM切片用0.05％水性的甲苯胺蓝染色，安装在Cytoseal上并且在Leica5500显微镜上目测。如果可以将木质部纳入到排除了韧皮部的椭圆形中，就认为维管组织是有序的。在来自生根三周后的组织培养植物的整个横截面或来自温室种植的植物的第50个节间(在此情况下只使用茎的40℃段(图S6A))的横截面上进行木质部细胞计数和细胞壁面积确定。如图S6中列出，使用Cellprofiler(Carpenter等(2006)GenomeBiol7，R100)进行细胞计数。对于温室种植的植物，转移到土壤12个月后，从植物的基部、从植物的第50个节间和从植物的顶部取样10cm段。称重前将材料在50℃干燥4周。
结果和讨论
PXY-CLE信号传导通路在树中是保守的并且作用为调节二次生长：木材由木质部细胞构成，所述木质部细胞源自存在于维管分生组织(称作形成层或原形成层)中的干细胞的分裂。一个促进拟南芥的维管分生组织中的细胞分裂的机理涉及编码称作TDIF的肽配体的CLE41的韧皮部-特异性表达。TDIF被受体激酶，PXY(还称作TDR)感知，所述PXY在原形成层的邻近的干细胞中表达(Etchells，and Turner(2010)Development 137，767-774；Fisher and Turner(2007)Current Biology 17，1061-1066；Hirakawa(2008)Proceedingsof the National Academy of Sciences，USA 105，15208-15213；Kondo等(2006)Science313，845-848)。PXY控制原形成层干细胞中细胞分裂的取向(Etchells and Turner(2010)Development 137，767-774)和速率(Etchells等，(2013)Development 140，2224-2234；Hirakawa等(2010)Plant Cell 22，2618-2629)并且抑制它们向木质部的分化(Hirakawa等(2008)Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 105，15208-15213；Kondo等(2014)Nat Commun 5)。因此，虽然在拟南芥中异位过表达CLE41提高维管束中的细胞数量，这些提高伴随着木质部分化的抑制和维管结构的损失(Etchells and Turner(2010)同上；Hirakawa，等(2008)同上；Whitford等(2008)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 105，18625-18630)。进一步地，来自通路的输出受到负反馈回路的调节，在所述负反馈回路中CLE41的表达导致PXY的下调(Etchells and Turner(2010)同上)。为了确定PXY-CLE41信号传导在杨树中是否保守，从杂交白杨(Populus tremula xP.tremuloides)克隆PXY和CLE41基因的推定直向同系物，下文分别记作PttPXY和PttCLE41(图5)。当在拟南芥中过表达时，35S：：PttCLE41系表现出维管组织构造的损失，每个维管束细胞数量提高和降低植物高度(图6A，B、图7A，B)。35S：：PttPXY构建体互补拟南芥pxy突变的表型(图6C-D，7C-E)且该互补的系还恢复了植物响应AtCLE41配体过表达的能力(图7C，D)。如此，PttCLE41和PttPXY克隆两者充当它们各自拟南芥基因的功能直向同系物。此外，PttPXY在已经工程化用于组织-特异性的AtCLE41过表达的拟南芥植物中的表达导致提高的植物生物质(图7E)。
PttCLE41或PttPXY的异位表达导致树中非正常的维管组织发育
通过使用已知在杂交白杨中提供广泛的表达的35S启动子研究在树中组成性过表达这些基因的结果(Nilsson等(1996)Plant Mol.Biol.31，887-895)。将35S：：PttPXY和35S：：PttCLE41构建体(见上文)单独地过表达或在含有35S：：PttCLE41和rolD：：PttPXY盒的单个二元质粒中一起过表达两个基因。在不同的程度上，35S：：PttCLE41杂交白杨的所有独立系(n＝15)已经插入木质部和韧皮部(图1A)。35S：：PttPXY系(n＝10)还表明在木质部的各部分中受到破坏的构造，但比35S：：PttCLE41中看到的程度低得多(图1A)。15个35S：：PttCLE41-rolD：：PttPXY系中的7个表现正常，同时剩余的8个表现出不同程度的组织破坏(图1A)。这些系均未导致树生长的显著提高，事实上35S：：PttCLE41系比野生型显著地更短，呈现多种生长异常(图1B和图8)。
PttPXY和PttCLE41的组织特异性表达提高维管细胞的分裂并且保留了正常维管组织构造。
假设PttPXY和PttCLE41两者的组织特异性表达对于组织构造和使得形成层细胞分裂最大化都可以是重要的。转录物组数据显示在杨树中，PXY主要在形成层中表达并且在木质部中处于较低的水平(Schrader等(2004)Plant Cell 16，2278-2292)。杨树微阵列数据识别出ANTEGUMENTA(ANT)基因为仅在分裂区高度表达(Schrader等(2004)同上)。使用毛果杨基因组的早期版本(Tuskan等(2006)同上)作为指导，我们从杂交白杨(PttANT)识别并且克隆推定的启动子，虽然基因组的更好的注释随后表明PttANT启动子片段含有推定的转录起始位点的上游和下游的序列。对来自PttANT：：GUS植物的叶的分析表现出清楚的维管特异性的GUS表达，同时在茎中，与我们对表达数据的初始解释相一致，GUS活性限制在分裂中的形成层区(图2B)。我们还识别并且克隆了来自韧皮部特异性凝集素基因韧皮部蛋白质2(PP2)，来自Populus trichocorpa(PtPP2)的调节序列。GUS分析确认了该启动子在叶中为维管组织特异性的并且在茎中提供了优异的韧皮部-特异性表达(图2C)。这些启动子用来生成3个设计用来在PttANT：：PttPXY，PtPP2：：PttCLE41和PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY的表达中给出组织特异性增加的构建体。与35S：：PttCLE41(图1A)相比，PtPP2：：PttCLE41系表明了在所有受到检查的14个系中高度构造的脉管系统(vasculature)(图1C；箭头)。15个PttANT：：PttPXY系中的7个在木质部形态中表现出轻微的破坏(图1C；箭头)，与35S：：PttPXY树(图1A)中观察到的相似，然而所有12个分析的独立的PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY双重过表达系呈现出高度构造的维管组织，与野生型对照(图1C)的维管组织相当。引人注目地，PtPP2：：PttCLE41，PttANT：：PttPXY和PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY双重过表达系明确地表明了早在组织培养中生根三周后就提高了维管细胞的数量(图1C和图S5A)。
PttPXY和PttCLE41的组织特异性表达导致更快速生长的树.
在转移至土壤后且在室温维持之后，进一步监测这些转基因杂交白杨树的生长。在6个月的期间，PtPP2：：PttCLE41，PttANT：：PttPXY和PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY植物正常生长(图1C)并且始终比对照植物更大，具有更大的茎直径和植物高度(图3A,B)。PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系提供了径向生长上的最大提高且在6个月后在室温与未转化的对照相比呈现35％的茎直径的提高和与PtPP2：：PttCLE41(次优表现的基因型)相比10％的提高(图3A)。PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系还表明比它们的野生型对应物提高56％的高度，和比次优表现的转基因系(PttANT：：PttPXY)提高12％的高度(图3B)。此提高是由于一般更快的生长速率，与对照植物的60的平均值相比PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY植物具有平均90个节间(图3C)，以及节间长度提高(图3D)。虽然植物在形态上看起来是正常的(图1C)，PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系还呈现叶面积的提高(图3E)，其中平均叶面积提高了几乎2倍。这些生长上的提高反映出PXY/CLE信号传导，其作用于植物发育的其他方面或是库强度(sink strength)增加的结果。它们有助于生物质的普遍提高，这有可能进一步改进这些发现的任何生物技术应用的有效性。
PttPXY和PttCLE41的组织特异性表达导致木材和生物质形成的大量提高.
为了更好地理解PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系中茎直径的提高，在33周收获来自每个系的树的一半，并且切段以得到茎材料，以便如图10描述的那样对每个系实施细胞计数。为了检查来自相似的发育阶段的材料和为了说明所检查的树的不同尺寸，对来自第50个节间的材料进行分析。观察到木质部细胞数量的急剧提高，这与茎直径的提高相关，PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系具有最大数量的木质部细胞，为对照植物的189％(图3F)。在单个系中还存在细胞数量和PttCLE41表达之间的相关性，且对PttPXY表达的相关程度较低(图11)。为了确定是否可提高木材形成而不改变木质部的形态，使Cellprofiler(Carpenter等.(2006)同上)适应于测量一些木质部的形态特性(图10)。分析显示与对照系相比，PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY中，在平均细胞尺寸，平均细胞腔尺寸，平均细胞壁面积和脉管(vessel)数量占全部木质部细胞的比例上没有显著差别(表1)，说明木材生产的提高没有改变木材形态。
表1：来自对照例和PtPP2：：CLE41-PttANT：：PXY植物的第50个节间的木质部横切面的分析。5个独立的系的平均值与标准误差一起示出。面积测量以任意单位计。使用T-检验进行统计分析，未发现显著差异。
对照例 PtPP2：：CLE41-PttANT：：PXY
平均细胞尺寸 607±13 577±19
平均腔尺寸 312±13 346±9
平均细胞壁面积 265±24 260±16
脉管每1000细胞 50±2 49±6
为了确定是否是改进的生长特性导致了木质生物质的提高，允许剩余的树进一步生长6个月的期间，之后沿着茎在不同的点确定干重(图3G)和湿重(图9)。与之前的观察一致，在茎的基部、第50个节间(中部)和顶部的测量说明了与本发明中使用的其他系相比，PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系呈现出干重的显著提高。特别是，在树的中部和基部，PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY茎段的干重平均是对照植物的重量的两倍以上。
为了确保观察到的差异是可重复的，克隆繁殖来自六个独立的PtPP2：：PttCLE41-PttANT：：PttPXY系的材料。从转移至土壤后不久，开始每周监测这些植物的生长。若干克隆的直径在所有监测阶段都显著地比野生型大(图4)。克隆之间还存在变化，使得来自系2的植物在全部5个检查时间点比来自系3的植物显著地更高且呈现出显著地更大的直径(图4)。
结论
树代表大量的用于生产纸、燃料和材料的天然资源，且是非常重要的可帮助改善大气CO2的人为提高的碳沉积(Stephenson等(2014)Nature507，90-93)。最近，树已经成为可转化为生物乙醇(Somerville等(2006)Science 312，1277)的植物生物质的可再生资源和用于快速扩展的工业生物技术的领域的其他化学物质(Raunikar等(2010).ForestPolicy and Economics 12，48-56)的焦点。树中的大部分生物质衍生自径向生长，其特征是木材中的生长轮。每个生长轮的尺寸与该年生长季期间的环境条件紧密相关。本文提供的数据显示PXY-CLE通路在树中发挥功能来调节二次生长且可能对树发展二次生长的方式是中心的。分析一起说明通过工程化改造PXY-CLE通路，我们能够在植物中极大地提高二次生长，在它们首次生根后不久(图3和图9)，即可对它们分析的最早的点，并且在生长的植物中保持木质部的提高长达1年(图4和图9)。这些结果表明该生长模式在树的寿命期间延续，由此提供了极大地提高树生产率的手段，这会帮助满足对可再生资源的提高的需求。虽然树生产率可从大气CO2的人为提高获益，气候模型和天气模式的近期改变强烈说明我们正在进入全球大部分地区经历更频繁的极端和可变天气的周期(Palmer，等(2014)Science344，803-804)，这很可能对生长具有不利影响。重要的是确定是否操纵PXY-CLE信号传导会让我们能够推翻正常地调节植物生长的环境诱因且因此使得我们能够生产能够保持高生成率的树，即便当暴露于更极端的环境条件时。
序列表表格
序列表
<110> 斯道拉恩索公司
<120> 生物质的生产
<130> 1848PC
<140> enter application number here
<141> enter date of filing here using the following format YYYY-MM-DD
<150> US 62/126,965
<151> 2015-03-02
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 99
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 1
Met Ala Thr Ser Asn Asp Gln Thr Asn Thr Lys Ser Ser His Ser Arg
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Leu Phe Ile Phe Leu Ser Leu Leu Leu Phe Ser Ser
20 25 30
Leu Thr Ile Pro Met Thr Arg His Gln Ser Thr Ser Met Val Ala Pro
35 40 45
Phe Lys Arg Val Leu Leu Glu Ser Ser Val Pro Ala Ser Ser Thr Met
50 55 60
Asp Leu Arg Pro Lys Ala Ser Thr Arg Arg Ser Arg Thr Ser Arg Arg
65 70 75 80
Arg Glu Phe Gly Asn Asp Ala His Glu Val Pro Ser Gly Pro Asn Pro
85 90 95
Ile Ser Asn
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 2
atggcaacat caaatgacca aaccaatact aaatcatcac attctcgtac tcttctcctt 60
ctcttcatct tcttatccct ccttctcttc agtagcctta caatccccat gactcgtcat 120
cagtccacat ctatggttgc tcccttcaag agggttctcc tcgaatcttc agttccagct 180
tcatcaacaa tggatctacg tccaaaggct agcacacgac gcagccgcac ttctagaagg 240
agagagtttg gaaatgatgc tcatgaggtt cctagtggtc caaaccctat ttccaactag 300
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 毛果杨
<400> 3
Met Ala Thr Pro Lys Thr Gln Ser Thr Thr Ile Ser Asp His Gln Thr
1 5 10 15
Cys Thr Lys Ala His His Phe Leu Ser Leu Leu Ala Leu Leu Phe Ile
20 25 30
Phe Ile Leu Leu Thr Thr Ser Thr Lys Pro Ile Asn Pro Thr Asn Met
35 40 45
Ala Ala Ser Ile Ser Ile Lys Arg Leu Leu Leu Glu Ser Ser Glu Pro
50 55 60
Ala Ser Thr Thr Met Asn Leu His Pro Lys Gln Thr Gln Asp Ala Arg
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Lys Ser Thr Arg
85 90 95
Thr Lys Phe Gly Ala Ala Ala His Glu Val Pro Ser Gly Pro Asn Pro
100 105 110
Ile Ser Asn Arg
115
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 4
Met Ala Thr Pro Lys Thr Gln Ser Arg Thr Ile Ser Asp His Gln Thr
1 5 10 15
Cys Thr Lys Ala His His Phe Leu Ser Leu Leu Ala Leu Leu Phe Ile
20 25 30
Phe Ile Leu Leu Thr Thr Ser Thr Lys Pro Ile Asn Pro Thr Asn Met
35 40 45
Ala Ala Ser Ile Ser Ile Lys Arg Leu Leu Leu Glu Ser Ser Glu Pro
50 55 60
Ala Ser Thr Thr Met Asn Leu His Pro Lys Gln Asn Gln Asp Ala Arg
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Lys Ser Thr Arg Thr
85 90 95
Lys Ser Gly Ala Ala Ala His Glu Val Pro Ser Gly Pro Asn Pro Ile
100 105 110
Ser Asn Arg
115
<210> 5
<211> 664
<212> DNA
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 5
tagctagcct tggtgctggt tcatggatat tgcaccctct tgggctcttg ggggtggttt 60
ctttcgtcta ttaactgcat ggcaacacca aaaacacaat caaggacaat cagtgatcat 120
caaacatgca caaaagcaca ccatttcctt tcattgcttg cacttctttt catttttatt 180
ttactcacta cctccaccaa acccataaac ccaacaaata tggcggcatc gatttccatc 240
aaaaggcttc tattagaatc ctcagagcca gcctctacta ccatgaactt gcatccaaaa 300
caaaaccaag acgcacgtac ttcttcttct tcttcttcca cctcatcatc aaaatctacg 360
cgtaccaagt ctggagctgc tgctcatgaa gttcctagcg gtccaaaccc tatttcaaac 420
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cggttgttga agatgatagc tagagagttg taacggtgaa gttaattacg agtttgtcat 540
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tgtt 664
<210> 6
<211> 1041
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 6
Met Lys Lys Lys Asn Ile Ser Pro Ser Leu Val Leu His Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Pro Phe Phe Ala Phe Asn Ser Leu Ala Leu Lys Phe
20 25 30
Ser Pro Gln Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Lys Thr Ser Leu Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ser Ala Phe Gln Asp Trp Lys Val Pro Val Asn Gly Gln Asn
50 55 60
Asp Ala Val Trp Cys Ser Trp Ser Gly Val Val Cys Asp Asn Val Thr
65 70 75 80
Ala Gln Val Ile Ser Leu Asp Leu Ser His Arg Asn Leu Ser Gly Arg
85 90 95
Ile Pro Ile Gln Ile Arg Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Tyr Leu Asn Leu
100 105 110
Ser Gly Asn Ser Leu Glu Gly Ser Phe Pro Thr Ser Ile Phe Asp Leu
115 120 125
Thr Lys Leu Thr Thr Leu Asp Ile Ser Arg Asn Ser Phe Asp Ser Ser
130 135 140
Phe Pro Pro Gly Ile Ser Lys Leu Lys Phe Leu Lys Val Phe Asn Ala
145 150 155 160
Phe Ser Asn Asn Phe Glu Gly Leu Leu Pro Ser Asp Val Ser Arg Leu
165 170 175
Arg Phe Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Gly Ser Tyr Phe Glu Gly Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Ala Tyr Gly Gly Leu Gln Arg Leu Lys Phe Ile His Leu
195 200 205
Ala Gly Asn Val Leu Gly Gly Lys Leu Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Thr Glu Leu Gln His Met Glu Ile Gly Tyr Asn His Phe Asn Gly Asn
225 230 235 240
Ile Pro Ser Glu Phe Ala Leu Leu Ser Asn Leu Lys Tyr Phe Asp Val
245 250 255
Ser Asn Cys Ser Leu Ser Gly Ser Leu Pro Gln Glu Leu Gly Asn Leu
260 265 270
Ser Asn Leu Glu Thr Leu Phe Leu Phe Gln Asn Gly Phe Thr Gly Glu
275 280 285
Ile Pro Glu Ser Tyr Ser Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu Leu Asp Phe
290 295 300
Ser Ser Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ile Pro Ser Gly Phe Ser Thr Leu
305 310 315 320
Lys Asn Leu Thr Trp Leu Ser Leu Ile Ser Asn Asn Leu Ser Gly Glu
325 330 335
Val Pro Glu Gly Ile Gly Glu Leu Pro Glu Leu Thr Thr Leu Phe Leu
340 345 350
Trp Asn Asn Asn Phe Thr Gly Val Leu Pro His Lys Leu Gly Ser Asn
355 360 365
Gly Lys Leu Glu Thr Met Asp Val Ser Asn Asn Ser Phe Thr Gly Thr
370 375 380
Ile Pro Ser Ser Leu Cys His Gly Asn Lys Leu Tyr Lys Leu Ile Leu
385 390 395 400
Phe Ser Asn Met Phe Glu Gly Glu Leu Pro Lys Ser Leu Thr Arg Cys
405 410 415
Glu Ser Leu Trp Arg Phe Arg Ser Gln Asn Asn Arg Leu Asn Gly Thr
420 425 430
Ile Pro Ile Gly Phe Gly Ser Leu Arg Asn Leu Thr Phe Val Asp Leu
435 440 445
Ser Asn Asn Arg Phe Thr Asp Gln Ile Pro Ala Asp Phe Ala Thr Ala
450 455 460
Pro Val Leu Gln Tyr Leu Asn Leu Ser Thr Asn Phe Phe His Arg Lys
465 470 475 480
Leu Pro Glu Asn Ile Trp Lys Ala Pro Asn Leu Gln Ile Phe Ser Ala
485 490 495
Ser Phe Ser Asn Leu Ile Gly Glu Ile Pro Asn Tyr Val Gly Cys Lys
500 505 510
Ser Phe Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Gly Asn Ser Leu Asn Gly Thr Ile
515 520 525
Pro Trp Asp Ile Gly His Cys Glu Lys Leu Leu Cys Leu Asn Leu Ser
530 535 540
Gln Asn His Leu Asn Gly Ile Ile Pro Trp Glu Ile Ser Thr Leu Pro
545 550 555 560
Ser Ile Ala Asp Val Asp Leu Ser His Asn Leu Leu Thr Gly Thr Ile
565 570 575
Pro Ser Asp Phe Gly Ser Ser Lys Thr Ile Thr Thr Phe Asn Val Ser
580 585 590
Tyr Asn Gln Leu Ile Gly Pro Ile Pro Ser Gly Ser Phe Ala His Leu
595 600 605
Asn Pro Ser Phe Phe Ser Ser Asn Glu Gly Leu Cys Gly Asp Leu Val
610 615 620
Gly Lys Pro Cys Asn Ser Asp Arg Phe Asn Ala Gly Asn Ala Asp Ile
625 630 635 640
Asp Gly His His Lys Glu Glu Arg Pro Lys Lys Thr Ala Gly Ala Ile
645 650 655
Val Trp Ile Leu Ala Ala Ala Ile Gly Val Gly Phe Phe Val Leu Val
660 665 670
Ala Ala Thr Arg Cys Phe Gln Lys Ser Tyr Gly Asn Arg Val Asp Gly
675 680 685
Gly Gly Arg Asn Gly Gly Asp Ile Gly Pro Trp Lys Leu Thr Ala Phe
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Gln Arg Leu Asn Phe Thr Ala Asp Asp Val Val Glu Cys Leu Ser Lys
705 710 715 720
Thr Asp Asn Ile Leu Gly Met Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr Lys Ala
725 730 735
Glu Met Pro Asn Gly Glu Ile Ile Ala Val Lys Lys Leu Trp Gly Lys
740 745 750
Asn Lys Glu Asn Gly Lys Ile Arg Arg Arg Lys Ser Gly Val Leu Ala
755 760 765
Glu Val Asp Val Leu Gly Asn Val Arg His Arg Asn Ile Val Arg Leu
770 775 780
Leu Gly Cys Cys Thr Asn Arg Asp Cys Thr Met Leu Leu Tyr Glu Tyr
785 790 795 800
Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp Asp Leu Leu His Gly Gly Asp Lys Thr
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Met Thr Ala Ala Ala Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Gln Ile Ala Ile Gly
820 825 830
Val Ala Gln Gly Ile Cys Tyr Leu His His Asp Cys Asp Pro Val Ile
835 840 845
Val His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ala Asp Phe
850 855 860
Glu Ala Arg Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Lys Leu Ile Gln Thr Asp
865 870 875 880
Glu Ser Met Ser Val Val Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu
885 890 895
Tyr Ala Tyr Thr Leu Gln Val Asp Lys Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Tyr
900 905 910
Gly Val Ile Leu Leu Glu Ile Ile Thr Gly Lys Arg Ser Val Glu Pro
915 920 925
Glu Phe Gly Glu Gly Asn Ser Ile Val Asp Trp Val Arg Ser Lys Leu
930 935 940
Lys Thr Lys Glu Asp Val Glu Glu Val Leu Asp Lys Ser Met Gly Arg
945 950 955 960
Ser Cys Ser Leu Ile Arg Glu Glu Met Lys Gln Met Leu Arg Ile Ala
965 970 975
Leu Leu Cys Thr Ser Arg Ser Pro Thr Asp Arg Pro Pro Met Arg Asp
980 985 990
Val Leu Leu Ile Leu Gln Glu Ala Lys Pro Lys Arg Lys Thr Val Gly
995 1000 1005
Asp Asn Val Ile Val Val Gly Asp Val Asn Asp Val Asn Phe Glu
1010 1015 1020
Asp Val Cys Ser Val Asp Val Gly His Asp Val Lys Cys Gln Arg
1025 1030 1035
Ile Gly Val
1040
<210> 7
<211> 3126
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 7
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cctttctttg ctttcaattc cttagctctc aagttttcac ctcaactctt gtctctcctt 120
tcccttaaaa catctctctc tggccctccc tctgcctttc aagactggaa agtccccgtt 180
aacggtcaaa acgacgccgt ttggtgttct tggtccggtg tagtctgtga taatgtaacg 240
gctcaagtca tttccctcga cctctctcac cggaacctct ctggtcgtat tcctatacag 300
attcgttact tgtcgagctt actctactta aatctcagtg ggaattcttt ggaaggttcg 360
tttccaactt ctatctttga tctcaccaag ctcactaccc tcgacatcag ccgtaactcg 420
ttcgactcga gttttcctcc cggaatctcc aagcttaagt tcttaaaagt cttcaatgcg 480
ttcagcaaca acttcgaagg tctattacct agtgacgtgt ctcgtcttcg tttcttggaa 540
gagcttaact ttggtggaag ttactttgaa ggagagattc cagcagctta cggtggttta 600
cagagattga agtttattca tttagctgga aatgtcctcg gaggtaaact acctcctaga 660
ttaggactct taacagagct ccaacacatg gaaatcggtt ataatcactt caacggaaac 720
ataccttcgg agtttgcctt actctcaaat ctcaagtact ttgacgtttc caattgcagc 780
ctctctggtt ctctgcctca agaactcggg aatctctcaa acctagagac tttatttcta 840
ttccaaaacg gtttcaccgg tgaaatccca gagagttata gcaacttgaa atccctcaag 900
cttctcgatt tttcgagtaa tcagctttct ggtagtatcc catcaggctt ctcgaccttg 960
aagaacctca catggctaag cttaatcagc aataacctct caggtgaagt acctgaagga 1020
atcggtgaac tccctgagct tactacattg tttctatgga acaataactt caccggagtt 1080
ttgccacaca agcttggatc aaacggtaaa cttgagacaa tggacgtctc taacaattca 1140
ttcaccggaa caatcccttc ttctctctgc catggaaaca agctatacaa actcatcctc 1200
ttctccaaca tgtttgaagg tgagctacca aagagcttga ctcgttgcga atctctatgg 1260
cggtttcgga gtcaaaacaa tcgattaaac ggcacaattc cgatcggatt cggctctcta 1320
cgtaacctca ctttcgttga tttaagcaac aacagattca ccgatcaaat tccggcggat 1380
ttcgccaccg ctcctgttct tcagtacttg aatctctcaa ccaatttctt ccacaggaaa 1440
ctaccggaaa acatatggaa agctccgaat ctacagatct tctcagcgag tttcagcaat 1500
ttgatcggtg aaatcccaaa ttacgttgga tgcaaaagct tctacaggat tgaactacaa 1560
ggaaactcac tcaacggaac gattccatgg gacatcggac attgcgagaa gcttctctgt 1620
ttgaatctca gccaaaatca tctcaacgga atcattccat gggagatttc aactcttccg 1680
tcaatcgccg acgtagatct ttctcataat ctcttaaccg gaacaatccc ttccgatttc 1740
ggaagctcta agacgatcac aaccttcaac gtttcgtata atcagctaat cggtccgatt 1800
ccaagtggtt ctttcgctca tctgaatccg tcgttcttct cctcaaacga aggactctgt 1860
ggagatctcg tcggaaaacc ttgcaattct gataggttta acgccggaaa tgcagatata 1920
gacggtcatc ataaagagga acgacctaag aaaacagccg gagctattgt ttggatattg 1980
gcggcggcga ttggggttgg attcttcgtc cttgtagccg ccactagatg cttccagaaa 2040
agctacggaa acagagtcga cggtggtgga agaaacggcg gagatatagg accgtggaag 2100
ctaacggctt ttcagagact aaacttcacg gcggatgatg tggttgagtg tctctcaaag 2160
actgataaca tcctcggaat gggatcaaca ggaacagtgt acaaagcaga gatgcctaat 2220
ggagaaataa tcgccgtgaa aaaactttgg ggaaaaaaca aagagaacgg caaaatccgg 2280
cggcggaaga gcggcgtatt ggcggaggtt gatgttctag ggaacgtacg tcaccggaac 2340
atcgttcgtc tccttggatg ttgcacgaat cgagattgca cgatgctttt atacgaatac 2400
atgcctaatg gaagcttaga cgatcttctt cacggtgggg ataagacgat gaccgcggcg 2460
gcggaatgga cggctttgta tcagatcgcg attggagtgg ctcaagggat ctgttatctc 2520
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gacgccgatt tcgaggcgcg tgtggcggac ttcggcgtcg cgaagcttat tcaaaccgac 2640
gaatccatgt ccgtcgtcgc cggttcgtac ggttacattg caccagaata tgcttacact 2700
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accggaaaaa gatcggtgga accggaattt ggagaaggta acagtatcgt ggattgggtt 2820
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tcgtgtagtc ttataagaga agagatgaaa caaatgttga gaattgcgtt gttgtgtaca 2940
agccggagtc cgacagacag accgccgatg agagatgtgt tgttgattct tcaagaggca 3000
aagccaaaga ggaagacagt aggggataat gtgatcgtcg ttggtgatgt taatgatgtc 3060
aatttcgaag atgtttgtag tgttgatgtt ggtcatgatg ttaaatgtca aaggattggg 3120
gtgtga 3126
<210> 8
<211> 3302
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 8
atgaaaaaga agaacatttc tccttctctt gttcttcatc cccttctcct tcttctactt 60
cctttctttg ctttcaattc cttagctctc aagttttcac ctcaactctt gtctctcctt 120
tcccttaaaa catctctctc tggccctccc tctgcctttc aagactggaa agtccccgtt 180
aacggtcaaa acgacgccgt ttggtgttct tggtccggtg tagtctgtga taatgtaacg 240
gctcaagtca tttccctcga cctctctcac cggaacctct ctggtcgtat tcctatacag 300
attcgttact tgtcgagctt actctactta aatctcagtg ggaattcttt ggaaggttcg 360
tttccaactt ctatctttga tctcaccaag ctcactaccc tcgacatcag ccgtaactcg 420
ttcgactcga gttttcctcc cggaatctcc aagcttaagt tcttaaaagt cttcaatgcg 480
ttcagcaaca acttcgaagg tctattacct agtgacgtgt ctcgtcttcg tttcttggaa 540
gagcttaact ttggtggaag ttactttgaa ggagagattc cagcagctta cggtggttta 600
cagagattga agtttattca tttagctgga aatgtcctcg gaggtaaact acctcctaga 660
ttaggactct taacagagct ccaacacatg gaaatcggtt ataatcactt caacggaaac 720
ataccttcgg agtttgcctt actctcaaat ctcaagtact ttgacgtttc caattgcagc 780
ctctctggtt ctctgcctca agaactcggg aatctctcaa acctagagac tttatttcta 840
ttccaaaacg gtttcaccgg tgaaatccca gagagttata gcaacttgaa atccctcaag 900
cttctcgatt tttcgagtaa tcagctttct ggtagtatcc catcaggctt ctcgaccttg 960
aagaacctca catggctaag cttaatcagc aataacctct caggtgaagt acctgaagga 1020
atcggtgaac tccctgagct tactacattg tttctatgga acaataactt caccggagtt 1080
ttgccacaca agcttggatc aaacggtaaa cttgagacaa tggacgtctc taacaattca 1140
ttcaccggaa caatcccttc ttctctctgc catggaaaca agctatacaa actcatcctc 1200
ttctccaaca tgtttgaagg tgagctacca aagagcttga ctcgttgcga atctctatgg 1260
cggtttcgga gtcaaaacaa tcgattaaac ggcacaattc cgatcggatt cggctctcta 1320
cgtaacctca ctttcgttga tttaagcaac aacagattca ccgatcaaat tccggcggat 1380
ttcgccaccg ctcctgttct tcagtacttg aatctctcaa ccaatttctt ccacaggaaa 1440
ctaccggaaa acatatggaa agctccgaat ctacagatct tctcagcgag tttcagcaat 1500
ttgatcggtg aaatcccaaa ttacgttgga tgcaaaagct tctacaggat tgaactacaa 1560
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ttgaatctca gccaaaatca tctcaacgga atcattccat gggagatttc aactcttccg 1680
tcaatcgccg acgtagatct ttctcataat ctcttaaccg gaacaatccc ttccgatttc 1740
ggaagctcta agacgatcac aaccttcaac gtttcgtata atcagctaat cggtccgatt 1800
ccaagtggtt ctttcgctca tctgaatccg tcgttcttct cctcaaacga aggactctgt 1860
ggagatctcg tcggaaaacc ttgcaattct gataggttta acgccggaaa tgcagatata 1920
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gcggcggcga ttggggttgg attcttcgtc cttgtagccg ccactagatg cttccagaaa 2040
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ctaacggctt ttcagagact aaacttcacg gcggatgatg tggttgagtg tctctcaaag 2160
actgataaca tcctcggaat gggatcaaca ggaacagtgt acaaagcaga gatgcctaat 2220
ggagaaataa tcgccgtgaa aaaactttgg ggaaaaaaca aagagaacgg caaaatccgg 2280
cggcggaaga gcggcgtatt ggcggaggtt gatgttctag ggaacgtacg tcaccggaac 2340
atcgttcgtc tccttggatg ttgcacgaat cgagattgca cgatgctttt atacgaatac 2400
atgcctaatg gaagcttaga cgatcttctt cacggtgggg ataagacgat gaccgcggcg 2460
gcggaatgga cggctttgta tcagatcgcg attggagtgg ctcaagggat ctgttatctc 2520
caccatgatt gtgatccggt gattgtacac cgtgacctga aacctagcaa tatcctcctc 2580
gacgccgatt tcgaggcgcg tgtggcggac ttcggcgtcg cgaagcttat tcaaaccgac 2640
gaatccatgt ccgtcgtcgc cggttcgtac ggttacattg caccaggtac ccttaacttt 2700
ttttgattat tctttacttt ccccaaattt taaattttgt acttttttgt ccctttgttt 2760
ttattattcg aattttgtcc gtttgttaaa cattcttttt gttgggatga caacatctga 2820
caaatatgac taaaatttta attttgtttg ttttggttac agaatatgct tacactttac 2880
aagtggataa aaagagtgat atctatagct atggagtgat tttattagag ataatcaccg 2940
gaaaaagatc ggtggaaccg gaatttggag aaggtaacag tatcgtggat tgggttagat 3000
caaagttgaa gacgaaagaa gatgtagaag aagttctaga caaaagcatg ggtaggtcgt 3060
gtagtcttat aagagaagag atgaaacaaa tgttgagaat tgcgttgttg tgtacaagcc 3120
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caaagaggaa gacagtaggg gataatgtga tcgtcgttgg tgatgttaat gatgtcaatt 3240
tcgaagatgt ttgtagtgtt gatgttggtc atgatgttaa atgtcaaagg attggggtgt 3300
ga 3302
<210> 9
<211> 1026
<212> PRT
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 9
Met Lys Leu Pro Phe Leu Phe Phe Pro Leu Ala Phe Phe Phe Tyr Leu
1 5 10 15
Phe Lys Pro Pro Leu Val Val Phe Ser Ala Thr Thr Leu Pro Pro Pro
20 25 30
Leu Gln Ser Leu Leu Ser Ile Lys Thr Phe Leu Lys Asp Pro Ser Asn
35 40 45
Thr Phe His Asp Trp Asn Leu Ser Asn Thr Ser Gly Leu Ile Gln Glu
50 55 60
Pro Val Trp Cys Ser Trp Ser Gly Ile Lys Cys Asn Pro Ala Thr Ala
65 70 75 80
Gln Ile Thr Ser Leu Asp Leu Ser His Arg Asn Leu Ser Gly Val Ile
85 90 95
Pro Ala Glu Ile Arg Tyr Leu Thr Ser Leu Val His Leu Asn Leu Ser
100 105 110
Gly Asn Ala Phe Asp Gly Leu Leu Gln Pro Ala Ile Phe Glu Leu Gly
115 120 125
Asp Leu Arg Ile Leu Asp Ile Ser His Asn Asn Phe Asn Ser Thr Phe
130 135 140
Pro Pro Gly Ile Ser Lys Leu Lys Phe Leu Arg Val Phe Asn Ala Tyr
145 150 155 160
Ser Asn Asn Phe Thr Gly Pro Leu Pro Lys Glu Phe Val Trp Leu Arg
165 170 175
Phe Leu Glu Glu Leu Ser Leu Gly Gly Ser Tyr Phe Thr Gly Glu Ile
180 185 190
Pro Arg Ser Tyr Gly Ser Phe Leu Arg Leu Lys Tyr Leu His Leu Ala
195 200 205
Gly Asn Glu Leu Glu Gly Pro Leu Pro Pro Asp Leu Gly Ser Leu Ser
210 215 220
Gln Leu Glu His Leu Glu Leu Gly Tyr His Pro Leu Leu Ser Gly Asn
225 230 235 240
Val Pro Glu Glu Phe Ala Leu Leu Thr Asn Leu Lys Tyr Leu Asp Ile
245 250 255
Ser Lys Cys Asn Leu Thr Gly Ser Leu Pro Pro Gln Leu Gly Asn Leu
260 265 270
Thr Lys Leu Glu Asn Leu Leu Leu Phe Met Asn Gln Phe Thr Gly Glu
275 280 285
Ile Pro Val Ser Tyr Thr Asn Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Asp Leu
290 295 300
Ser Val Asn Gln Leu Ser Gly Ala Ile Pro Glu Gly Leu Ser Ser Leu
305 310 315 320
Lys Glu Leu Asn Arg Leu Ser Leu Leu Lys Asn Gln Leu Thr Gly Glu
325 330 335
Ile Pro Pro Gly Ile Gly Glu Leu Pro Tyr Leu Asp Thr Leu Glu Leu
340 345 350
Trp Asn Asn Asn Leu Thr Gly Val Leu Pro Gln Lys Leu Gly Ser Asn
355 360 365
Gly Asn Leu Leu Trp Leu Asp Val Ser Asn Ser Ser Leu Ser Gly Pro
370 375 380
Ile Pro Pro Asn Leu Cys His Gly Asn Lys Leu Tyr Lys Leu Ile Leu
385 390 395 400
Phe Ser Asn Lys Phe Leu Gly Lys Leu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Cys
405 410 415
Thr Ser Leu Ser Arg Phe Arg Ile Gln Asp Asn Gln Leu Asn Gly Ser
420 425 430
Ile Pro Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Pro Asn Leu Ser Tyr Val Asp Leu
435 440 445
Ser Lys Asn Asn Phe Thr Gly Glu Ile Pro Asp Asp Leu Gly Tyr Ser
450 455 460
Glu Pro Leu His Tyr Leu Asn Ile Ser Gly Asn Ser Phe His Thr Ala
465 470 475 480
Leu Pro Asn Asn Ile Trp Ser Ala Pro Asn Leu Gln Ile Phe Ser Ala
485 490 495
Ser Ser Cys Lys Leu Val Ser Lys Ile Pro Asp Phe Ile Gly Cys Ser
500 505 510
Ser Leu Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Asp Asn Met Phe Asn Gly Ser Ile
515 520 525
Pro Arg Asp Ile Gly His Cys Glu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Leu Ser
530 535 540
Arg Asn Ser Leu Thr Gly Ile Ile Pro Trp Glu Ile Ser Thr Leu Pro
545 550 555 560
Ala Ile Ala Ala Val Asp Leu Ser His Asn Leu Leu Thr Gly Ser Ile
565 570 575
Pro Ser Asn Phe Gly Asn Cys Ser Thr Leu Glu Ser Phe Asn Val Ser
580 585 590
Tyr Asn Leu Leu Thr Gly Pro Ile Pro Ala Ser Gly Thr Ile Phe Pro
595 600 605
Asn Leu His Pro Ser Ser Phe Ser Gly Asn Gln Gly Leu Cys Gly Gly
610 615 620
Val Leu Pro Lys Pro Cys Ala Ala Asp Thr Leu Gly Ala Gly Glu Met
625 630 635 640
Glu Val Arg His Arg Gln Gln Pro Lys Arg Thr Ala Gly Ala Ile Val
645 650 655
Trp Ile Met Ala Ala Ala Phe Gly Ile Gly Leu Phe Val Leu Val Ala
660 665 670
Gly Thr Arg Cys Phe His Ala Asn Tyr Gly Arg Arg Phe Ser Asp Glu
675 680 685
Arg Glu Ile Gly Pro Trp Lys Leu Thr Ala Phe Gln Arg Leu Asn Phe
690 695 700
Thr Ala Asp Asp Val Leu Glu Cys Leu Ser Met Ser Asp Lys Ile Leu
705 710 715 720
Gly Met Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Glu Met Pro Gly Gly
725 730 735
Glu Ile Ile Ala Val Lys Lys Leu Trp Gly Lys His Lys Glu Asn Ile
740 745 750
Lys Arg Arg Arg Gly Val Leu Ala Glu Val Asp Val Leu Gly Asn Val
755 760 765
Arg His Arg Asn Ile Val Arg Leu Leu Gly Cys Cys Ser Asn Arg Glu
770 775 780
Cys Thr Met Leu Leu Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Asn Leu His Asp
785 790 795 800
Leu Leu His Gly Lys Asn Lys Gly Asp Asn Leu Val Gly Asp Trp Leu
805 810 815
Thr Arg Tyr Lys Ile Ala Leu Gly Val Ala Gln Gly Ile Cys Tyr Leu
820 825 830
His His Asp Cys Asp Pro Val Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Ser
835 840 845
Asn Ile Leu Leu Asp Gly Glu Met Glu Ala Arg Val Ala Asp Phe Gly
850 855 860
Val Ala Lys Leu Ile Gln Ser Asp Glu Ser Met Ser Val Ile Ala Gly
865 870 875 880
Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Gln Val Asp
885 890 895
Glu Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Tyr Gly Val Val Leu Met Glu Ile Ile
900 905 910
Ser Gly Lys Arg Ser Val Asp Ser Glu Phe Gly Asp Gly Asn Ser Ile
915 920 925
Val Asp Trp Val Arg Pro Lys Ile Lys Ala Lys Asp Gly Val Asn Asp
930 935 940
Ile Leu Asp Lys Asp Ala Gly Ala Ser Ile Ala Tyr Val Arg Glu Glu
945 950 955 960
Met Met Gln Met Leu Arg Ile Ala Leu Leu Cys Thr Ser Arg Asn Pro
965 970 975
Ala Asp Arg Pro Ser Met Arg Asp Val Val Leu Met Leu Gln Glu Ala
980 985 990
Lys Pro Lys Arg Lys Leu Pro Gly Ser Ile Val Ser Val Gly Ser Gly
995 1000 1005
Asp His Ile Val Thr Val Asp Gly Ala Ile Ala Gln Lys Pro Ala
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Val Glu Cys
1025
<210> 10
<211> 4009
<212> DNA
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 10
atgaaactcc cttttctttt ctttccactt gcgttcttct tctacctgtt caaacctcct 60
cttgtagtgt tctctgctac gactctgcct ccccccctcc aatctcttct ctccattaag 120
accttcctca aagacccttc caatacgttc catgattgga acttgtccaa cactagtggc 180
ttaatccaag aaccagtttg gtgctcgtgg tccggcatca agtgcaaccc agccactgct 240
caaatcacat cactcgatct ctctcaccgg aatctttctg gtgtaattcc agctgagatt 300
agatacttaa cgagcctggt tcacttgaat ttgagtggaa atgcttttga tgggcttctc 360
caacctgcca tttttgaact gggtgacctt aggattcttg acatcagcca caacaacttc 420
aattcaacat tcccacctgg gatttccaag ctcaagttct tgagagtctt caatgcatac 480
agcaacaact tcactggtcc attgcctaaa gaattcgtct ggctgcgctt cctggaggag 540
ctcagccttg gtgggagcta cttcacggga gagattccaa ggagttatgg aagtttcctc 600
agattgaagt acctgcactt agctgggaat gaattggaag gaccattgcc acccgactta 660
ggatccttga gtcagctcga gcacctcgag cttggctacc atccactcct atcaggcaat 720
gtaccagaag aatttgcttt gctgaccaat ctcaagtacc tagatatctc aaagtgtaat 780
ctaacaggca gtctcccacc acaacttgga aatcttacca aactcgagaa tttgctcctt 840
ttcatgaacc agtttactgg tgaaatcccg gtgagctaca caaatctgaa agctctaaaa 900
gcacttgatt tatccgttaa tcagctttca ggggcaattc cagaggggtt atcttccttg 960
aaagagctaa acaggttgag cttgctgaaa aatcagctca ccggcgaaat accaccggga 1020
attggcgagc taccatacct tgacacatta gagctctgga acaacaacct aaccggagtt 1080
ctcccgcaaa agcttggatc caatgggaat ctactatggc ttgacgtctc aaacagttcg 1140
ctctccggcc caattcctcc aaatctatgc catggaaaca agctttacaa gctgattctg 1200
ttctccaaca agtttctcgg taaattacca gattctctag caaactgcac ctctttgtcc 1260
aggttccgaa ttcaagacaa ccagctcaac ggctcaatcc cttatggatt aggtctcctg 1320
cctaatcttt cctatgtgga tttaagcaag aataacttca caggtgaaat tcctgacgat 1380
cttggctatt cagaaccact tcattacttg aacatttctg gaaactcctt ccacactgct 1440
ttaccaaaca acatatggag cgcgccaaat cttcagattt tttcagccag ctcatgcaag 1500
ctcgtgagca aaataccaga ttttatcggt tgcagcagtc tgtacaggat agaattgcaa 1560
gacaatatgt tcaatggcag cattccacgg gatatcggcc attgtgagag gctcatttcg 1620
cttaatttaa gccgcaattc tcttactggt attattccgt gggagatttc tacacttcct 1680
gctatcgctg ctgtcgattt gtcccataat ttactcaccg gttccattcc ttcaaatttt 1740
ggtaactgtt caactttgga gagttttaat gtgtcctata atttgttaac tggacccatt 1800
cctgcatcgg gtacaatatt tccaaatttg catccgtctt ccttttcggg caatcaagga 1860
ttatgcggtg gcgttttgcc aaagccttgt gctgcggata cattgggggc tggagaaatg 1920
gaggtccgcc atagacagca gcccaaaagg actgctggcg ctatagtgtg gattatggcg 1980
gctgcttttg gtattggatt atttgtgctt gttgctggga ctaggtgttt ccatgcgaac 2040
tatggccgta gatttagtga tgaacgagag atcggaccgt ggaaattaac tgcctttcaa 2100
cggttgaatt tcacggcaga cgatgtgctc gagtgtctat ctatgtcgga caagatctta 2160
gggatggggt caacggggac ggtctataag gcggaaatgc caggtggcga gatcatagcg 2220
gtgaagaaac tgtggggtaa gcataaggag aacatcaaaa ggaggagagg ggtgttagcc 2280
gaggtggatg ttttaggtaa cgtgaggcat aggaatatag tgagattgct aggatgttgc 2340
agtaacaggg agtgtacaat gttgctgtac gagtacatgc ctaatggtaa cttacatgat 2400
ttgttgcatg ggaaaaacaa gggagacaat ttggtgggtg attggcttac aaggtacaag 2460
attgcactgg gagtggcaca ggggatttgc tatttgcatc atgattgtga tcctgtgatt 2520
gtgcaccgag atcttaagcc tagtaatata ttattggacg gtgagatgga ggctagagtg 2580
gcagattttg gggtggcaaa gctgatccaa agtgacgaat ccatgtcagt cattgctggg 2640
tcttatggct acattgcgcc aggtacggtc ctggtcccat tgctgcttct cttttatttt 2700
ttttatgaga tttgtttgtg cccttcaagt gcatttcacc ttacgagtag aaaacagaaa 2760
acgtgggtaa ttttgaattg aaattcgatc gtcaacagtc gacttttgta agaatacaga 2820
gtccctgtct cgtactgcag tgaagaactg gatcaattag ttaaggtcgt gtaataaaac 2880
aaaacaaaag aggaaagaca aatgtgttac gagtaggacg gttgatttta ggacggaaag 2940
catagaaatt atatcttctt gcttggagat cctcaatgta tcttcttcgc ttgcttttct 3000
ttctttctgc cgtatttgca tacacaggac tagattgaag ctggtctcgt ttgaaattcc 3060
tggatacctt ttgtctatgt ttgcttagtt cgttttgctg gtatatctag aatatggagt 3120
gtcaaatctt gaaacaggac atgggaatta gagataatta cataccgaaa acactttctt 3180
ttattttatt tcttgattgt tttgccatga aagacatcca tccatacttg attttccaaa 3240
tgcaaaaaaa ggagcggtaa atactacagt acagagtgca gtggtggggt ggggtggacg 3300
tcatttcttc ttttgggccg cgaatttgca actgttcgag acctttgagt gcgtggcgca 3360
ctcactattg cgcgtggacg ctctccttat tattattttt tccttttaaa ttctcctttt 3420
cctctcacgc cttttttttt gggtagattt accatgtaca gttggaccca cgaataattt 3480
cttttagatc ctcgcattca ttgcagtttt tgacttctcg atgcacttgc catgatttct 3540
ttctttgttg gattgagttg ggtcactgaa atcttgcttt taccgtgcag agtatgctta 3600
cacactgcag gttgatgaga agagtgatat ttatagttat ggggtggtgt taatggagat 3660
tataagcggc aagaggtcgg tcgattctga gttcggggat ggtaacagca ttgttgactg 3720
ggtaaggccg aagataaagg ctaaggacgg tgtaaatgac attttagaca aggatgctgg 3780
ggcatcgatt gcatatgtga gggaagaaat gatgcaaatg cttagaattg ctttgctatg 3840
caccagccgg aatccggcgg accgaccgtc gatgagggat gtcgtgttga tgctgcaaga 3900
agccaagccc aagaggaaac tgccgggaag tatagttagt gttggtagtg gtgaccacat 3960
tgttactgtt gatggggcta ttgcacaaaa gcctgcagtc gaatgttaa 4009
<210> 11
<211> 1026
<212> PRT
<213> 毛果杨
<400> 11
Met Lys Leu Pro Phe Leu Phe Phe Leu Leu Ala Phe Phe Phe Tyr Leu
1 5 10 15
Phe Lys Pro Pro Leu Leu Val Phe Ser Ala Thr Thr Leu Pro Pro Pro
20 25 30
Leu Gln Ser Leu Leu Ser Ile Lys Thr Phe Leu Lys Asp Pro Ser Asn
35 40 45
Thr Phe His Asp Trp Asn Leu Ser Asn Thr Ser Gly Leu Ile Gln Glu
50 55 60
Pro Val Trp Cys Ser Trp Ser Gly Ile Lys Cys Asn Pro Ala Thr Ala
65 70 75 80
Gln Ile Thr Ser Leu Asp Leu Ser His Arg Asn Leu Ser Gly Val Ile
85 90 95
Pro Ala Glu Ile Arg Tyr Leu Thr Ser Leu Val His Leu Asn Leu Ser
100 105 110
Gly Asn Ala Phe Asp Gly Leu Leu Gln Pro Ala Ile Phe Glu Leu Gly
115 120 125
Asp Leu Arg Ile Leu Asp Ile Ser His Asn Asn Phe Asn Ser Thr Phe
130 135 140
Pro Thr Gly Ile Ser Lys Leu Lys Phe Leu Arg Val Phe Asn Ala Tyr
145 150 155 160
Ser Asn Asn Phe Thr Gly Pro Leu Pro Lys Glu Phe Val Trp Leu Arg
165 170 175
Phe Leu Glu Glu Leu Asn Leu Gly Gly Ser Tyr Phe Thr Gly Glu Ile
180 185 190
Pro Arg Ser Tyr Gly Ser Phe Leu Arg Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Ala
195 200 205
Gly Asn Glu Leu Glu Gly Pro Leu Pro Pro Asp Leu Gly Phe Leu Ser
210 215 220
Gln Leu Glu His Leu Glu Leu Gly Tyr His Pro Leu Leu Ser Gly Asn
225 230 235 240
Val Pro Glu Glu Phe Ala Leu Leu Thr Asn Leu Lys Tyr Leu Asp Ile
245 250 255
Ser Lys Cys Asn Leu Ser Gly Ser Leu Pro Pro Gln Leu Gly Asn Leu
260 265 270
Thr Lys Leu Glu Asn Leu Leu Leu Phe Met Asn Gln Phe Thr Gly Glu
275 280 285
Ile Pro Val Ser Tyr Thr Asn Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Asp Leu
290 295 300
Ser Val Asn Gln Leu Ser Gly Ala Ile Pro Glu Gly Leu Ser Ser Leu
305 310 315 320
Lys Glu Leu Asn Arg Leu Ser Phe Leu Lys Asn Gln Leu Thr Gly Glu
325 330 335
Ile Pro Pro Gly Ile Gly Glu Leu Pro Tyr Leu Asp Thr Leu Glu Leu
340 345 350
Trp Asn Asn Asn Leu Thr Gly Val Leu Pro Gln Lys Leu Gly Ser Asn
355 360 365
Gly Asn Leu Leu Trp Leu Asp Val Ser Asn Asn Ser Leu Ser Gly Pro
370 375 380
Ile Pro Pro Asn Leu Cys Gln Gly Asn Lys Leu Tyr Lys Leu Ile Leu
385 390 395 400
Phe Ser Asn Lys Phe Leu Gly Lys Leu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Cys
405 410 415
Thr Ser Leu Ser Arg Phe Arg Ile Gln Asp Asn Gln Leu Asn Gly Ser
420 425 430
Ile Pro Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Pro Asn Leu Ser Tyr Val Asp Leu
435 440 445
Ser Lys Asn Asn Phe Thr Gly Glu Ile Pro Asp Asp Leu Gly Asn Ser
450 455 460
Glu Pro Leu His Phe Leu Asn Ile Ser Gly Asn Ser Phe His Thr Ala
465 470 475 480
Leu Pro Asn Asn Ile Trp Ser Ala Pro Asn Leu Gln Ile Phe Ser Ala
485 490 495
Ser Ser Cys Lys Leu Val Ser Lys Ile Pro Asp Phe Ile Gly Cys Ser
500 505 510
Ser Leu Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Asp Asn Met Phe Asn Gly Ser Ile
515 520 525
Pro Trp Asp Ile Gly His Cys Glu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Leu Ser
530 535 540
Arg Asn Ser Leu Thr Gly Ile Ile Pro Trp Glu Ile Ser Thr Leu Pro
545 550 555 560
Ala Ile Ala Asp Val Asp Leu Ser His Asn Leu Leu Thr Gly Ser Ile
565 570 575
Pro Ser Asn Phe Gly Asn Cys Ser Thr Leu Glu Ser Phe Asn Val Ser
580 585 590
Tyr Asn Leu Leu Thr Gly Pro Ile Pro Ala Ser Gly Thr Ile Phe Pro
595 600 605
Asn Leu His Pro Ser Ser Phe Ser Gly Asn Gln Gly Leu Cys Gly Gly
610 615 620
Val Leu Pro Lys Pro Cys Ala Ala Asp Thr Leu Gly Ala Gly Glu Met
625 630 635 640
Glu Val Arg His Arg Gln Gln Pro Lys Arg Thr Ala Gly Ala Ile Val
645 650 655
Trp Ile Met Ala Ala Ala Phe Gly Ile Gly Leu Phe Val Leu Val Ala
660 665 670
Gly Thr Arg Cys Phe His Ala Asn Tyr Gly Arg Arg Phe Ser Asp Glu
675 680 685
Arg Glu Ile Gly Pro Trp Lys Leu Thr Ala Phe Gln Arg Leu Asn Phe
690 695 700
Thr Ala Asp Asp Val Leu Glu Cys Leu Ser Met Ser Asp Lys Ile Leu
705 710 715 720
Gly Met Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Glu Met Pro Gly Gly
725 730 735
Glu Ile Ile Ala Val Lys Lys Leu Trp Gly Lys His Lys Glu Asn Ile
740 745 750
Arg Arg Arg Arg Gly Val Leu Ala Glu Val Asp Val Leu Gly Asn Val
755 760 765
Arg His Arg Asn Ile Val Arg Leu Leu Gly Cys Cys Ser Asn Arg Glu
770 775 780
Cys Thr Met Leu Leu Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Asn Leu His Asp
785 790 795 800
Leu Leu His Gly Lys Asn Lys Gly Asp Asn Leu Val Gly Asp Trp Leu
805 810 815
Thr Arg Tyr Lys Ile Ala Leu Gly Val Ala Gln Gly Ile Cys Tyr Leu
820 825 830
His His Asp Cys Asp Pro Val Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Ser
835 840 845
Asn Ile Leu Leu Asp Gly Glu Met Glu Ala Arg Val Ala Asp Phe Gly
850 855 860
Val Ala Lys Leu Ile Gln Ser Asp Glu Ser Met Ser Val Ile Ala Gly
865 870 875 880
Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Gln Val Asp
885 890 895
Glu Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Tyr Gly Val Val Leu Met Glu Ile Ile
900 905 910
Ser Gly Lys Arg Ser Val Asp Ala Glu Phe Gly Asp Gly Asn Ser Ile
915 920 925
Val Asp Trp Val Arg Ser Lys Ile Lys Ala Lys Asp Gly Val Asn Asp
930 935 940
Ile Leu Asp Lys Asp Ala Gly Ala Ser Ile Ala Ser Val Arg Glu Glu
945 950 955 960
Met Met Gln Met Leu Arg Ile Ala Leu Leu Cys Thr Ser Arg Asn Pro
965 970 975
Ala Asp Arg Pro Ser Met Arg Asp Val Val Leu Met Leu Gln Glu Ala
980 985 990
Lys Pro Lys Arg Lys Leu Pro Gly Ser Ile Val Ser Val Gly Ser Gly
995 1000 1005
Asp His Ile Val Thr Val Asp Gly Ala Ile Ala Gln Lys Pro Ala
1010 1015 1020
Val Glu Cys
1025
<210> 12
<211> 313
<212> PRT
<213> 稻
<400> 12
Val Lys Glu Ala Asn Val Val Gly Met Gly Ala Thr Gly Val Val Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Glu Leu Pro Arg Ala Arg Ala Val Ile Ala Val Lys Lys Leu
20 25 30
Trp Arg Pro Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Pro Glu Leu
35 40 45
Thr Ala Glu Val Leu Lys Glu Val Gly Leu Leu Gly Arg Leu Arg His
50 55 60
Arg Asn Ile Val Arg Leu Leu Gly Tyr Met His Asn Glu Ala Asp Ala
65 70 75 80
Met Met Leu Tyr Glu Phe Met Pro Asn Gly Ser Leu Trp Glu Ala Leu
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100 105 110
Asp Val Ala Ala Gly Val Ala Gln Gly Leu Ala Tyr Leu His His Asp
115 120 125
Cys His Pro Pro Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Asn Asn Ile Leu
130 135 140
Leu Asp Ala Asn Met Glu Ala Arg Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg
145 150 155 160
Ala Leu Gly Arg Ala Gly Glu Ser Val Ser Val Val Ala Gly Ser Tyr
165 170 175
Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Tyr Thr Met Lys Val Asp Gln Lys
180 185 190
Ser Asp Thr Tyr Ser Tyr Gly Val Val Leu Met Glu Leu Ile Thr Gly
195 200 205
Arg Arg Ala Val Glu Ala Ala Phe Gly Glu Gly Gln Asp Ile Val Gly
210 215 220
Trp Val Arg Asn Lys Ile Arg Ser Asn Thr Val Glu Asp His Leu Asp
225 230 235 240
Gly Gln Leu Val Gly Ala Gly Cys Pro His Val Arg Glu Glu Met Leu
245 250 255
Leu Val Leu Arg Thr Ala Val Leu Cys Thr Ala Arg Leu Pro Arg Asp
260 265 270
Arg Pro Ser Met Arg Asp Val Ile Thr Met Leu Gly Glu Ala Lys Pro
275 280 285
Arg Arg Lys Ser Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ala Ser Ala Lys Ala Pro
290 295 300
Thr Pro Ala Pro Pro Ala Val Ala Ala
305 310
<210> 13
<211> 305
<212> PRT
<213> 稻
<400> 13
Ile Lys Glu Ala Asn Ile Val Gly Met Gly Gly Thr Gly Val Val Tyr
1 5 10 15
Arg Ala Asp Met Pro Arg His His Ala Val Val Ala Val Lys Lys Leu
20 25 30
Trp Arg Ala Ala Gly Cys Pro Glu Glu Ala Thr Thr Val Asp Gly Arg
35 40 45
Thr Asp Val Glu Ala Gly Gly Glu Phe Ala Ala Glu Val Lys Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Arg His Arg Asn Val Val Arg Met Leu Gly Tyr Val Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Trp Asp Ala Leu His Gly Gln Arg Lys Gly Lys Met Leu Met Asp
100 105 110
Trp Val Ser Arg Tyr Asn Val Ala Ala Gly Val Ala Ala Gly Leu Ala
115 120 125
Tyr Leu His His Asp Cys Arg Pro Pro Val Ile His Arg Asp Val Lys
130 135 140
Ser Ser Asn Val Leu Leu Asp Asp Asn Met Asp Ala Lys Ile Ala Asp
145 150 155 160
Phe Gly Leu Ala Arg Val Met Ala Arg Ala His Glu Thr Val Ser Val
165 170 175
Val Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Tyr Thr Leu
180 185 190
Lys Val Asp Gln Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met
195 200 205
Glu Leu Leu Thr Gly Arg Arg Pro Ile Glu Pro Glu Tyr Gly Glu Ser
210 215 220
Gln Asp Ile Val Gly Trp Ile Arg Glu Arg Leu Arg Ser Asn Thr Gly
225 230 235 240
Val Glu Glu Leu Leu Asp Ala Ser Val Gly Gly Arg Val Asp His Val
245 250 255
Arg Glu Glu Met Leu Leu Val Leu Arg Val Ala Val Leu Cys Thr Ala
260 265 270
Lys Ser Pro Lys Asp Arg Pro Thr Met Arg Asp Val Val Thr Met Leu
275 280 285
Gly Glu Ala Lys Pro Arg Arg Lys Ser Ser Ser Ala Thr Val Ala Ala
290 295 300
Thr
305
<210> 14
<211> 309
<212> PRT
<213> 稻
<400> 14
Gly Ser Asp Gly Ile Val Gly Ala Gly Ser Ser Gly Thr Val Tyr Arg
1 5 10 15
Ala Lys Met Pro Asn Gly Glu Val Ile Ala Val Lys Lys Leu Trp Gln
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Gln Lys Glu Ala Ala Ala Pro Thr Glu Gln Asn Gln
35 40 45
Lys Leu Arg Gln Asp Ser Asp Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Thr Val
50 55 60
Ala Glu Val Glu Val Leu Gly His Leu Arg His Arg Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Leu Leu Gly Trp Cys Thr Asn Gly Glu Ser Thr Met Leu Leu Tyr Glu
85 90 95
Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp Glu Leu Leu His Gly Ala Ala Ala
100 105 110
Lys Ala Arg Pro Gly Trp Asp Ala Arg Tyr Lys Ile Ala Val Gly Val
115 120 125
Ala Gln Gly Val Ser Tyr Leu His His Asp Cys Leu Pro Ala Ile Ala
130 135 140
His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Leu Leu Asp Asp Asp Met Glu
145 150 155 160
Ala Arg Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Lys Ala Leu Gln Ser Ala Ala
165 170 175
Pro Met Ser Val Val Ala Gly Ser Cys Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr
180 185 190
Thr Tyr Thr Leu Lys Val Asn Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Pro Gly
195 200 205
Val Val Leu Leu Glu Ile Leu Thr Gly Arg Arg Ser Val Glu Ala Glu
210 215 220
Tyr Gly Glu Gly Asn Asn Ile Val Asp Trp Val Arg Arg Lys Val Ala
225 230 235 240
Gly Gly Gly Val Gly Asp Val Ile Asp Ala Ala Ala Trp Ala Asp Asn
245 250 255
Asp Val Gly Gly Thr Arg Asp Glu Met Ala Leu Ala Leu Arg Val Ala
260 265 270
Leu Leu Cys Thr Ser Arg Cys Pro Gln Glu Arg Pro Ser Met Arg Glu
275 280 285
Val Leu Ser Met Leu Gln Glu Ala Arg Pro Lys Arg Lys Asn Ser Ala
290 295 300
Lys Lys Gln Val Lys
305
<210> 15
<211> 305
<212> PRT
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 15
Met Ser Asp Lys Ile Leu Gly Met Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr Lys
1 5 10 15
Ala Glu Met Pro Gly Gly Glu Ile Ile Ala Val Lys Lys Leu Trp Gly
20 25 30
Lys His Lys Glu Asn Ile Arg Arg Arg Arg Gly Val Leu Ala Glu Val
35 40 45
Asp Val Leu Gly Asn Val Arg His Arg Asn Ile Val Arg Leu Leu Gly
50 55 60
Cys Cys Ser Asn Arg Glu Cys Thr Met Leu Leu Tyr Glu Tyr Met Pro
65 70 75 80
Asn Gly Asn Leu His Asp Leu Leu His Gly Lys Asn Lys Gly Asp Asn
85 90 95
Leu Val Gly Asp Trp Leu Thr Arg Tyr Lys Ile Ala Leu Gly Val Ala
100 105 110
Gln Gly Ile Cys Tyr Leu His His Asp Cys Asp Pro Val Ile Val His
115 120 125
Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Leu Leu Asp Gly Glu Met Glu Ala
130 135 140
Arg Val Arg Asp Phe Gly Val Ala Lys Leu Ile Gln Ser Asp Glu Ser
145 150 155 160
Met Ser Val Ile Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala
165 170 175
Tyr Thr Leu Gln Val Asp Glu Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Tyr Gly Val
180 185 190
Val Leu Met Glu Ile Ile Ser Gly Lys Arg Ser Val Asp Ala Glu Phe
195 200 205
Gly Asp Gly Asn Ser Ile Val Asp Trp Val Arg Ser Lys Ile Lys Ala
210 215 220
Lys Asp Gly Val Asn Asp Ile Leu Asp Lys Asp Ala Gly Ala Ser Ile
225 230 235 240
Ala Ser Val Arg Glu Glu Met Met Gln Met Leu Arg Ile Ala Leu Leu
245 250 255
Cys Thr Ser Arg Asn Pro Ala Asp Arg Pro Ser Met Arg Asp Val Val
260 265 270
Leu Met Leu Gln Glu Ala Lys Pro Lys Arg Lys Leu Pro Gly Ser Ile
275 280 285
Val Ser Val Gly Ser Gly Asp His Ile Val Thr Val Asp Gly Ala Ile
290 295 300
Ala
305
<210> 16
<211> 251
<212> PRT
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 16
Lys Thr Asp Asn Ile Leu Gly Met Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr Lys
1 5 10 15
Ala Glu Met Pro Asn Gly Glu Ile Ile Ala Val Lys Lys Leu Trp Gly
20 25 30
Lys Asn Lys Glu Asn Gly Lys Ile Arg Arg Arg Lys Ser Gly Val Leu
35 40 45
Ala Glu Val Asp Val Leu Gly Asn Val Arg His Arg Asn Ile Val Arg
50 55 60
Leu Leu Gly Cys Cys Thr Asn Arg Asp Cys Thr Met Leu Leu Tyr Glu
65 70 75 80
Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp Asp Leu Leu His Gly Gly Asp Lys
85 90 95
Thr Met Thr Ala Ala Ala Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Gln Ile Ala Ile
100 105 110
Gly Val Ala Gln Gly Ile Cys Tyr Leu His His Asp Cys Asp Pro Val
115 120 125
Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ala Asp
130 135 140
Phe Glu Ala Arg Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Lys Leu Ile Gln Thr
145 150 155 160
Asp Glu Ser Met Ser Val Val Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro
165 170 175
Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Gln Val Asp Lys Lys Ser Asp Ile Tyr Ser
180 185 190
Tyr Gly Val Ile Leu Leu Glu Ile Ile Thr Gly Lys Arg Ser Val Glu
195 200 205
Pro Glu Phe Gly Glu Gly Asn Ser Ile Val Asp Trp Val Arg Ser Lys
210 215 220
Leu Lys Thr Lys Glu Asp Val Glu Glu Val Leu Asp Lys Ser Met Gly
225 230 235 240
Arg Ser Cys Ser Leu Ile Arg Glu Glu Met Lys
245 250
<210> 17
<211> 287
<212> PRT
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 17
Ile Lys Glu Ser Asn Ile Ile Gly Met Gly Ala Ile Gly Ile Val Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Glu Val Met Arg Arg Pro Leu Leu Thr Val Ala Val Lys Lys
20 25 30
Leu Trp Arg Ser Pro Ser Pro Gln Asn Asp Ile Glu Asp His His Gln
35 40 45
Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ile Leu Arg Glu Val Asn Leu Leu Gly
50 55 60
Gly Leu Arg His Arg Asn Ile Val Lys Ile Leu Gly Tyr Val His Asn
65 70 75 80
Glu Arg Glu Val Met Met Val Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Asn Leu
85 90 95
Gly Thr Ala Leu His Ser Lys Asp Glu Lys Phe Leu Leu Arg Asp Trp
100 105 110
Leu Ser Arg Tyr Asn Val Ala Val Gly Val Val Gln Gly Leu Asn Tyr
115 120 125
Leu His Asn Asp Cys Tyr Pro Pro Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Ser
130 135 140
Asn Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asn Leu Glu Ala Arg Ile Ala Asp Phe
145 150 155 160
Gly Leu Ala Lys Met Met Leu His Lys Asn Glu Thr Val Ser Met Val
165 170 175
Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Tyr Thr Leu Lys
180 185 190
Ile Asp Glu Lys Ser Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Val Val Leu Leu Glu
195 200 205
Leu Val Thr Gly Lys Met Pro Ile Asp Pro Ser Phe Glu Asp Ser Ile
210 215 220
Asp Val Val Glu Trp Ile Arg Arg Lys Val Lys Lys Asn Glu Ser Leu
225 230 235 240
Glu Glu Val Ile Asp Ala Ser Ile Ala Gly Asp Cys Lys His Val Ile
245 250 255
Glu Glu Met Leu Leu Ala Leu Arg Ile Ala Leu Leu Cys Thr Ala Lys
260 265 270
Leu Pro Lys Asp Arg Pro Ser Ile Arg Asp Val Ile Thr Met Leu
275 280 285
<210> 18
<211> 276
<212> PRT
<213> 欧洲山杨 x 美洲山杨
<400> 18
Lys Glu Ser Asn Met Ile Gly Met Gly Ala Thr Gly Ile Val Tyr Lys
1 5 10 15
Ala Glu Met Ser Arg Ser Ser Thr Val Leu Ala Val Lys Lys Leu Trp
20 25 30
Arg Ser Ala Ala Asp Ile Glu Asp Gly Thr Thr Gly Asp Phe Val Gly
35 40 45
Glu Val Asn Leu Leu Gly Lys Leu Arg His Arg Asn Ile Val Arg Leu
50 55 60
Leu Gly Phe Leu Tyr Asn Asp Lys Asn Met Met Ile Val Tyr Glu Phe
65 70 75 80
Met Leu Asn Gly Asn Leu Gly Asp Ala Ile His Gly Lys Asn Ala Ala
85 90 95
Gly Arg Leu Leu Val Asp Trp Val Ser Arg Tyr Asn Ile Ala Leu Gly
100 105 110
Val Ala His Gly Leu Tyr Leu His His Asp Cys His Pro Pro Val Ile
115 120 125
His Arg Asp Ile Lys Ser Asn Asn Ile Leu Leu Asp Ala Asn Leu Asp
130 135 140
Ala Arg Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Met Met Ala Arg Lys Lys
145 150 155 160
Glu Thr Val Ser Met Val Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu
165 170 175
Tyr Gly Tyr Thr Leu Lys Val Asp Glu Lys Ile Asp Ile Tyr Ser Tyr
180 185 190
Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Arg Arg Leu Glu Pro Glu
195 200 205
Phe Gly Glu Ser Val Asp Ile Val Glu Trp Val Arg Arg Lys Ile Arg
210 215 220
Asp Asn Ile Ser Leu Glu Glu Ala Leu Asp Pro Asn Val Gly Asn Cys
225 230 235 240
Arg Tyr Val Gln Glu Glu Met Leu Leu Val Leu Gln Ile Ala Leu Leu
245 250 255
Cys Thr Thr Lys Leu Pro Lys Asp Arg Pro Ser Met Arg Asp Val Ile
260 265 270
Ser Met Leu Gly
275
<210> 19
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PXY蛋白质的共有人工氨基酸序列
<220>
<221> 杂项特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (23)..(26)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (37)..(37)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (39)..(48)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (50)..(64)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (71)..(71)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (75)..(75)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (91)..(93)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (113)..(115)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (117)..(117)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (121)..(121)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (145)..(145)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (178)..(181)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (243)..(243)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (247)..(248)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (250)..(250)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (252)..(252)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (254)..(254)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (257)..(257)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (262)..(264)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (266)..(266)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (286)..(286)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 杂项特征
<222> (301)..(301)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 19
Xaa Lys Glu Ala Asn Ile Val Gly Met Gly Ala Thr Gly Ile Val Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Glu Met Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ile Ala Val Lys Lys
20 25 30
Leu Trp Arg Ala Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Asp Val Leu Ala Glu Val Xaa Leu Leu Gly Xaa Leu Arg His Arg Asn
65 70 75 80
Ile Val Arg Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Xaa Xaa Xaa Thr Met Leu
85 90 95
Leu Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Xaa Asp Ala Leu His Gly
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Lys Leu Leu Xaa Asp Trp Val Ser Arg Tyr Asn
115 120 125
Ile Ala Leu Gly Val Ala Gln Gly Leu Ala Tyr Leu His His Asp Cys
130 135 140
Xaa Pro Pro Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu
145 150 155 160
Asp Ala Asn Met Glu Ala Arg Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu
165 170 175
Met Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Val Ser Val Val Ala Gly Ser Tyr Gly
180 185 190
Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Tyr Thr Leu Lys Val Asp Glu Lys Ser
195 200 205
Asp Ile Tyr Ser Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg
210 215 220
Arg Ser Val Glu Pro Glu Phe Gly Glu Gly Asn Asp Ile Val Asp Trp
225 230 235 240
Val Arg Xaa Lys Ile Lys Xaa Xaa Asn Xaa Val Xaa Glu Xaa Leu Asp
245 250 255
Xaa Ala Ala Val Ala Xaa Xaa Xaa Cys Xaa His Val Arg Glu Glu Met
260 265 270
Leu Leu Val Leu Arg Ile Ala Leu Leu Cys Thr Ala Lys Xaa Pro Lys
275 280 285
Asp Arg Pro Ser Met Arg Asp Val Ile Thr Met Leu Xaa Glu Ala Lys
290 295 300
Pro Lys Arg Lys
305
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 pPtPP2-F
<400> 20
atccctaggc ctgcaggtaa gctatgtacg ttttgg 36
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 pPttANT-R
<400> 21
atcactagtg acaagctgag agactg 26
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 pPttANT-F
<400> 22
atcgggcccc cgaagttgct cacttc 26
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 pPttANT-R
<400> 23
atcactagtg acaagctgag agactg 26
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PttCLE41-F
<400> 24
cacctagcta gccttggtgc tggt 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PttCLE41-R
<400> 25
accccttaat tcccccatta 20
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PttPXYF
<400> 26
caccatgaaa ctcccttttc tttt 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PttPXY-R
<400> 27
acattcgact gcaggctttt 20
<210> 28
<211> 88
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 28
Met Arg Ser Pro His Ile Thr Ile Ser Leu Val Phe Leu Phe Phe Leu
1 5 10 15
Phe Leu Ile Ile Gln Thr His Gln Arg Thr Ile Asp Gln Thr His Gln
20 25 30
Ile Gly Ser Asn Val Gln His Val Ser Asp Met Ala Val Thr Ser Pro
35 40 45
Glu Gly Lys Arg Arg Glu Arg Phe Arg Val Arg Arg Pro Met Thr Thr
50 55 60
Trp Leu Lys Gly Lys Met Ile Gly Ala Asn Glu His Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Gly Pro Asn Pro Ile Ser Asn Arg
85
<210> 29
<211> 267
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 29
atgagatctc ctcacatcac catttcactt gttttcttgt tctttctttt tctaatcatc 60
caaacccatc aaagaaccat tgatcaaact caccagattg gctccaatgt tcaacatgtc 120
agtgacatgg cggtgacttc gcctgaaggg aaaagaagag agaggtttag agttcggcgg 180
ccgatgacga catggctgaa gggaaagatg atcggtgcca atgaacatgg agtcccaagt 240
ggtccaaatc ccatctccaa taggtag 267

Claims (44)

1.用于操纵植物的生长和/或结构的方法，包括修饰所述植物，以与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的维管组织中的PXY的表达和/或活性相比特异性提高所述植物的维管组织中的PXY和/或CLE的表达和/或活性，其中在所述维管组织中修饰的PXY和/或CLE的表达和/或活性在经修饰的植物的非维管组织中基本保持不变。
2.根据权利要求1的方法，包括特异性提高所述植物的形成层中的PXY的表达和/或活性。
3.根据权利要求1或2的方法，包括特异性提高所述植物的韧皮部中的CLE的表达和/或活性，优选地其中CLE为CLE41或CLE42或CLE44。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，包括向所述植物引入特异性指导所述植物的维管组织中的、优选在所述植物的形成层中的PXY表达的调控元件。
5.根据权利要求4的方法，其中所述调控元件为ANT基因的启动子，优选衍生自杂交白杨。
6.根据权利要求4或5的方法，其中在表达盒中提供所述调控元件，其可操作地连接至编码PXY的核酸分子或其功能等价物。
7.根据权利要求6的方法，其中在包括用于向植物基因组中插入所述调控元件的序列的表达盒中提供调控元件，其可操纵地连接至天然PXY基因。
8.根据前述权利要求的任一项的方法，包括修饰植物，以与保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的维管组织中的相应的CLE的表达和/或活性相比特异性提高CLE41、CLE42或CLE44中一种或多种在所述植物的维管组织中的表达和/或活性，其中在维管组织中修饰的CLE41、CLE42或CLE44中一种或多种的表达和/或活性在经修饰的植物的非维管组织中基本保持不变。
9.根据权利要求8的方法，其中所述方法包括向所述植物中引入特异性指导CLE41，CLE42或CLE44中一种或多种在植物的维管组织中，优选在植物的韧皮部中的表达的调控元件。
10.根据权利要求9的方法，其中所述调控元件为韧皮部特异性凝集素基因韧皮部蛋白质PHLOEM PROTEIN2的启动子，优选衍生自杂交白杨(PttPP2)。
11.根据权利要求9或10的方法，其中在表达盒中提供所述调控元件，其可操作地连接至编码CLE的核酸分子或其功能等价物。
12.根据权利要求9或10的方法，其中在包括用于向植物基因组中插入所述调控元件的序列的表达盒中提供所述调控元件，其可操纵地连接至天然PXY基因。
13.根据权利要求9-12中的任一项的方法，其中用于指导i)PXY和ii)CLE的维管特异性表达的所述调控元件为相同的调控元件。
14.根据权利要求9-13中的任一项的方法，其中在相同的表达盒上提供用于指导i)PXY和ii)CLE的维管特异性表达的调控元件。
15.根据权利要求9-13中的任一项的方法，其中在单独的表达盒上分别提供用于指导i)PXY和ii)CLE的维管特异性表达的调控元件。
16.根据前述权利要求的任一项的方法，其中所述调控元件选自启动子，5’和3’UTR，增强子，转录因子或蛋白质结合序列，起始位点和终止序列，核酶结合位点，重组位点，多聚腺苷酸化序列，和正义或反义序列。
17.根据权利要求5和当引用权利要求6时权利要求6-16的方法，其中在载体中提供所述表达盒。
18.根据权利要求17的方法，其中所述载体能够在细菌宿主细胞和植物细胞中增殖。
19.根据权利要求5和当引用权利要求6时权利要求6-17的方法，进一步包括向植物细胞中引入所述表达盒或载体的步骤。
20.根据权利要求17的方法，进一步包括将植物细胞保持在合适的生长条件下。
21.根据权利要求20的方法，进一步包括通过测量提取自经修饰的植物的细胞或组织中的基因产物的相对量并且将其与来自保持在相同的条件下的相同物种的野生型植物的相应的细胞或组织中的所述基因产物的水平比较来测量PXY和/或CLE表达。
22.根据前述权利要求的任一项的方法，其中与保持在相同的条件下的野生型植物中的PXY的水平相比，PXY的水平提高至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
23.根据权利要求7和当引用权利要求8时权利要求8-22中任一项的方法，其中与保持在相同的条件下的野生型植物中的CLE的水平相比，CLE的水平提高至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
24.根据前述权利要求的任一项的方法，其中与保持在相同的条件下的野生型植物中的PXY的活性相比，PXY的活性提高了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
25.根据权利要求7和当引用权利要求8时权利要求8-22中任一项的方法，其中与保持在相同的条件下的野生型植物中的CLE的活性相比，CLE的活性提高了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
26.根据权利要求21的方法，包括通过测量经修饰的植物的径向直径、活力、生长速率、叶组织的量、生物质的量、和/或种子产率，将其与来自野生型植物的相应的细胞或组织中的相应的表型比较来测量提高的生长。
27.根据权利要求26的方法，其中提高的生长为与保持在相同的条件下的野生型植物相比，在径向直径、活力、生长速率、叶组织的量、生物质的量、和/或种子产率上提高至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更高。
28.根据权利要求5和当引用权利要求6时权利要求6-28中任一项的方法，其中PXY为i)在激酶域中包括保守区的多肽，其中所述保守区包括图13A的共有序列，且能够结合CLE并且介导导致未分化的形成层细胞分裂的信号传导通路的激活；ii)具有如图5A或13B或图13C中所示的氨基酸序列的多肽。
29.根据权利要求5和当引用权利要求6时权利要求6-28中任一项的方法，其中编码PXY的核酸为图13B或图13C的核酸序列，或其功能等价物。
30.根据根据权利要求11和当引用权利要求12时权利要求12-28中任一项的方法，其中CLE为i)在激酶域中包括保守区的多肽，所述保守区具有包括图14A的共有序列的序列，且能够结合PXY以介导导致未分化的形成层细胞分裂的信号传导通路的激活；或ii)具有如图5B，图14B，图14C或15A中所示的氨基酸序列的多肽。
31.根据根据权利要求11和当引用权利要求12时权利要求12-28中任一项的方法，其中编码CLE41的核酸为图14B或图14C的核酸序列且其中编码CLE42的核酸为图15B的核酸序列。
32.根据权利要求19的方法，其中植物细胞在植物中。
33.根据前述权利要求的任一项的方法，其中植物为选自以下的树：桦木、云杉、松树、杨树、杂交的杨树、柳树、银槭、刺槐、悬铃木、核桃树、白蜡树；橡树；黄杉；柚木树；枫香和桉树；选自以下的禾本科植物：柳枝稷、芦苇金丝雀草、草原索草、热带稻科植物、二穗短柄草和芒草；选自以下的作物：谷物和豆类、小麦、大豆、苜蓿、玉米、稻、玉米、和甜菜、马铃薯、木薯、高粱、小米、木薯属植物、大麦、豌豆、和其他根、块茎或种子作物；选自以下的园艺植物：莴苣、菊苣和蔬菜芸苔、包括卷心菜、西兰花、和花椰菜、康乃馨、天竺葵、烟草、瓜类、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、辣椒、菊花；选自以下的油籽植物：棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等；和选自以下的豆科植物：瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆。
34.用于提高植物生长速率的方法，所述方法包括根据权利要求1-33的任一项操纵植物的生长和/或结构。
35.用于提高植物的径向生长的方法，所述方法包括根据权利要求1-33的任一项的方法操纵植物的生长和/或结构。
36.用于提高植物中叶组织的量的方法，所述方法包括根据权利要求1-34的任一项的方法操纵植物的生长和/或结构。
37.用于提高植物的生物质的方法，所述方法包括根据权利要求1-33的任一项的方法操纵植物的生长和/或结构。
38.生产植物衍生产品的方法，包括根据权利要求1-33的任一项的方法操纵植物的生长和/或结构，并且从植物收获植物产品。
39.转基因植物细胞，包括如权利要求14-17中任一项中限定的表达盒。
40.包括根据权利要求39的植物细胞的转基因植物，植物部分或转基因种子。
41.根据权利要求1-33的任一项的方法生产的植物衍生产品。
42.如权利要求5和当引用权利要求6时权利要求6-33中任一项中限定的表达盒的用途，用于操纵植物的生长和/或结构。
43.根据权利要求42的用途，所述用途在根据权利要求1-33的任一项的方法中。
44.宿主细胞或生物体，其包括如权利要求5和当引用权利要求6时权利要求6-33任一项中限定的表达构建体表达盒。
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