CN107849536A - 用于得到调节性t细胞的方法及其用途 - Google Patents
用于得到调节性t细胞的方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107849536A CN107849536A CN201680038112.3A CN201680038112A CN107849536A CN 107849536 A CN107849536 A CN 107849536A CN 201680038112 A CN201680038112 A CN 201680038112A CN 107849536 A CN107849536 A CN 107849536A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- treg
- cell
- people
- pbmc
- macrophage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 120
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 93
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims abstract description 67
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 43
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 25
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 39
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 15
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 6
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 6
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 6
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract description 62
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 51
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 51
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 51
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 46
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 22
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 19
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 18
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 18
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 18
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 7
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 5
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 5
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 5
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 5
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 5
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 208000002691 Choroiditis Diseases 0.000 description 3
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 101000998132 Homo sapiens Interleukin-34 Proteins 0.000 description 3
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 208000003971 Posterior uveitis Diseases 0.000 description 3
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 3
- -1 amino acid Compound Chemical class 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 3
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 3
- 102000002580 human interleukin-34 Human genes 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 208000008795 neuromyelitis optica Diseases 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108010009992 CD163 antigen Proteins 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 206010022941 Iridocyclitis Diseases 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N Leu-Gln-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 208000004788 Pars Planitis Diseases 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 102100025831 Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130 Human genes 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 201000004612 anterior uveitis Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HCBKAOZYACJUEF-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Gln Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O HCBKAOZYACJUEF-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- GXCSUJQOECMKPV-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Gln Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GXCSUJQOECMKPV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SQKPKIJVWHAWNF-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SQKPKIJVWHAWNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- BKDDABUWNKGZCK-XHNCKOQMSA-N Asn-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O BKDDABUWNKGZCK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N Asn-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XMKXONRMGJXCJV-LAEOZQHASA-N Asp-Val-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XMKXONRMGJXCJV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- 208000027496 Behcet disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- GDNWBSFSHJVXKL-GUBZILKMSA-N Cys-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GDNWBSFSHJVXKL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BCWIFCLVCRAIQK-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O BCWIFCLVCRAIQK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ABLQPNMKLMFDQU-BIIVOSGPSA-N Cys-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O ABLQPNMKLMFDQU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000004739 Egg Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- KYFSMWLWHYZRNW-ACZMJKKPSA-N Gln-Asp-Cys Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KYFSMWLWHYZRNW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IXFVOPOHSRKJNG-LAEOZQHASA-N Gln-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IXFVOPOHSRKJNG-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- UGEZSPWLJABDAR-KKUMJFAQSA-N Gln-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N UGEZSPWLJABDAR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BIYNPVYAZOUVFQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYNPVYAZOUVFQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N Glu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 208000034706 Graft dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- YEKYGQZUBCRNGH-DCAQKATOSA-N His-Pro-Ser Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O YEKYGQZUBCRNGH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ILUVWFTXAUYOBW-CUJWVEQBSA-N His-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O ILUVWFTXAUYOBW-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000916644 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- LQSBBHNVAVNZSX-GHCJXIJMSA-N Ile-Ala-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N LQSBBHNVAVNZSX-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N Ile-Phe-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N Ile-Phe-Leu Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 206010022557 Intermediate uveitis Diseases 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- USTCFDAQCLDPBD-XIRDDKMYSA-N Leu-Asn-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N USTCFDAQCLDPBD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- ZTLGVASZOIKNIX-DCAQKATOSA-N Leu-Gln-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ZTLGVASZOIKNIX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PRZVBIAOPFGAQF-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PRZVBIAOPFGAQF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AXVIGSRGTMNSJU-YESZJQIVSA-N Leu-Tyr-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N AXVIGSRGTMNSJU-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIYWBDBHEGAVST-BZSNNMDCSA-N Lys-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OIYWBDBHEGAVST-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- LJADEBULDNKJNK-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LJADEBULDNKJNK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710150918 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- PHKBGZKVOJCIMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PHKBGZKVOJCIMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000008267 Peanut Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- FZBGMXYQPACKNC-HJWJTTGWSA-N Phe-Pro-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FZBGMXYQPACKNC-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 description 1
- 208000007048 Polymyalgia Rheumatica Diseases 0.000 description 1
- AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N Pro-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DIFXZGPHVCIVSQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Gln-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIFXZGPHVCIVSQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001949 Retinal Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N Ser-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N Ser-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010058141 Skin graft rejection Diseases 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010042742 Sympathetic ophthalmia Diseases 0.000 description 1
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 1
- GCXFWAZRHBRYEM-NUMRIWBASA-N Thr-Gln-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O GCXFWAZRHBRYEM-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N Thr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N Trp-Leu-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- KWTRGSQOQHZKIA-PMVMPFDFSA-N Trp-Lys-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)CCCCN)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KWTRGSQOQHZKIA-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- XOLLWQIBBLBAHQ-WDSOQIARSA-N Trp-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XOLLWQIBBLBAHQ-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- GEGYPBOPIGNZIF-CWRNSKLLSA-N Trp-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O GEGYPBOPIGNZIF-CWRNSKLLSA-N 0.000 description 1
- HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N Tyr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 108010064997 VPY tripeptide Proteins 0.000 description 1
- CVUDMNSZAIZFAE-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Pro Natural products NC(N)=NCCCC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CVUDMNSZAIZFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HURRXSNHCCSJHA-AUTRQRHGSA-N Val-Gln-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N HURRXSNHCCSJHA-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VNGKMNPAENRGDC-JYJNAYRXSA-N Val-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 VNGKMNPAENRGDC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N Val-Ser-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 206010047663 Vitritis Diseases 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000919 anti-host Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 210000004240 ciliary body Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 206010061811 demyelinating polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000010860 egg allergy Diseases 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 208000013653 hyalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 201000004614 iritis Diseases 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 201000002165 neuroretinitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000005737 orchitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 201000007407 panuveitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 201000010853 peanut allergy Diseases 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 210000005234 proximal tubule cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 description 1
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005671 spondyloarthropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000009174 transverse myelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2334—Interleukin-34 (IL-34)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于得到人Treg细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤:(a)用包含一定量的白介素‑34(IL‑34)多肽的培养基培养人单核细胞群体，以便得到免疫抑制性巨噬细胞群体；(b)共培养人外周血单核细胞(PBMC)群体和在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体。
Description
技术领域
本发明属于免疫疗法领域。更具体地，本发明涉及得到调节性T细胞群体的方法。
背景技术
调节性T细胞或“Treg”(其包括CD4+和CD8+Foxp3+Treg细胞和CD45RC低Treg)在控制各种免疫应答中是基本的，因为Treg可以迅速地抑制其它免疫细胞的活性。具体地，通过下调对自身和非自身抗原的不希望免疫应答，Treg对于维持耐受性而言是关键性的。例如，已经在具有多发性硬化(MS)、I型糖尿病(TlD)、银屑病、重症肌无力(MG)和其它自身免疫疾病的患者中发现了Treg缺陷。对于特应性和变态反应性疾病也可能存在类似的关联。对于所有这些疾病，有报告指向患者的Treg细胞的减少的体外免疫抑制。这已经导致越来越多的在用于治疗或预防自身免疫疾病、变态反应和移植相关并发症诸如移植物排斥或移植物抗宿主病(GvHD)的免疫疗法中使用Treg的可能性的兴趣。
例如，器官移植在急性排斥反应的预防和治疗中已经观察到非常显著的改善，但是亚临床发作和慢性移植物功能障碍仍然严重地影响中期和长期移植物存活(1)。新出现的治疗策略(在它们中存在对供体抗原的耐受性诱导)在数年的实验模型工作以后正在移向临床阶段(2,3)。在天然机制和耐受性诱导策略中，不同类型的调节性细胞(包括不同类型的CD4+Treg)的应用属于最有前途的应用(4)。近年来我们和其他人已经在移植领域中、但是也在其它病理学情况下强调了CD8+调节性T细胞(CD8+Treg)的应用(5-8)。
因此，特别需要可用于制备和扩增高纯度的、同时CD4+和CD8+Treg、优选地没有CD4+和CD8+效应T细胞的Treg细胞的方法，以便得到这样的经纯化的Treg细胞群体，其在自身免疫、变态反应、移植、使用治疗性蛋白和基因疗法的治疗领域中是特别重要的，以避免免疫系统对自身或治疗分子/组织的降解。
在2008年鉴别出了白介素-34(IL34)(9)。研究表明，IL34与M-CSF具有同源性且它们通过共同受体CD115(也称为CSF-1R)起作用(9)，其在单核细胞的细胞表面上和在脑中通过新描述的受体-受体型蛋白-酪氨酸磷酸酶ζ(PTP-ζ)表达(10)。但是，研究已经证实，IL34和M-CSF表现出不同的生物活性和信号活化(11)，部分地由于它们的不同空间和时间表达(12)。直到现在，IL34功能已经主要与单核细胞和巨噬细胞(破骨细胞、小胶质细胞)的存活和功能相关联(12)。已经在角质形成细胞、毛囊、神经元、近侧肾小管细胞和生精小管生殖细胞中(12)，以及在心脏、脑、肺、肝、肾、脾、胸腺、睾丸、卵巢、前列腺、结肠、小肠、脾红髓和破骨细胞中(9)，观察到静止细胞中的IL34蛋白表达。到目前为止，IL34尚未与对DC或T细胞的免疫功能的影响相关联(12)。
近年来，证实了IL34会诱导人单核细胞分化成免疫抑制性巨噬细胞(也称作)，因为所述IL34分化的巨噬细胞会抑制TCR依赖性的T细胞增殖(13)，诱导移植耐受性(13)并且也诱导产生IL-17的效应物T辅助细胞(其被称作Th17细胞)(14)。但是，从未证实IL34分化的巨噬细胞可用于从外周血单核细胞(PBMC)制备和扩增Treg。
发明内容
本发明涉及用于得到调节性T细胞群体的方法。具体地，本发明由权利要求限定。
具体实施方式
本发明基于关于新的有效的没有预先分离在得自患者的生物样品(诸如血液样品)中所含的Treg(对于Foxp3+Treg，经常5％)的步骤从PBMC制备和扩增Treg的方法的结果。发明人实际上已经证实，人IL34分化的巨噬细胞会扩增和增强人Treg，包括人CD4+和CD8+Foxp3+Treg(超过60％)和CD4+和CD8+CD45RC低Treg(接近100％)。此外，发明人已经证实，通过本发明的方法得到的IL34扩增的Treg直到16:1的效应物:抑制物比率都表现出高度有效的抑制能力，是与未刺激的和多克隆地刺激的Treg可比较的。
用于得到人调节性T细胞群体的方法
因此，本发明的第一方面涉及用于得到人Treg细胞群体的体外/离体方法，所述方法包括下述步骤：a)用包含一定量的白介素-34(IL-34)多肽的培养基培养人单核细胞群体，以便得到免疫抑制性巨噬细胞(也称作“IL34分化的巨噬细胞”)群体；和b)共培养人外周血单核细胞(PBMC)群体和在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体。
在某些实施方案中，方法包括以下步骤：a)用包含一定量的白介素-34(IL-34)多肽的培养基培养人单核细胞群体，以便得到免疫抑制性巨噬细胞群体；b)用适合用于扩增在所述PBMC群体中所含的人Treg细胞群体的培养基共培养人外周血单核细胞(PBMC)群体和在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体；和c)任选地分离在步骤(b)得到的人Treg细胞群体。
在某些实施方案中，本发明的方法包括在步骤(b)之前从所述PBMC群体分离人Treg细胞群体的步骤。因此，根据该实施方案，步骤(b)包括共培养从所述PBMC群体分离的人Treg细胞群体和在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体。
在某些实施方案中，本发明的方法包括在步骤(b)的共培养以后分离人Treg细胞群体的步骤。
本文中使用的术语“调节性T细胞”表示抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。调节性T细胞通常是“叉头盒P3(Foxp3+)调节性T细胞”和“CD45RC低细胞”。本文中使用的术语“叉头盒P3(Foxp3+)调节性T细胞”或“Foxp3+Treg细胞”表示其特征标志物是转录因子Foxp3的人类和啮齿类动物(大鼠或小鼠)中的2-10％的CD4+和CD8+T细胞。
在步骤(a)，可以根据本领域已知的任何技术分离充当起始材料的人单核细胞群体。例如，所述人单核细胞群体可以得自含有PBMC的多种生物样品。通常，它们分离自外周血。可以使用用不同配体(例如，CD14)标记的珠子通过正选择来分离它们。然后可以通过多种技术(诸如如下所述的细胞分选)分离这样的经标记的细胞。
在某些实施方案中，所述人单核细胞群体因而是CD14+人单核细胞群体。在某些实施方案中，所述人单核细胞群体是CD14+CD16+人单核细胞群体。在某些实施方案中，所述人单核细胞群体是CD14+CD16-人单核细胞群体。
本文中使用的术语“培养基”表示用于维持细胞群体或培养细胞群体的培养基(例如“培养用培养基”)，其含有维持细胞活力和支持增殖的营养物。所述培养基可以含有适当组合的以下物质中的任意种：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其它糖、抗生素、血清或血清替代物、和其它组分诸如生长因子、细胞因子等。通常用于特定细胞类型的培养基是本领域技术人员已知的。本发明的培养基可以基于商购可得的培养基诸如来自Invitrogen的RPMI1640。
本文中使用的术语“白介素-34多肽”或“IL-34多肽”(Il-34)是本领域众所周知的，且表示促进单核细胞和巨噬细胞的增殖、存活和分化的细胞因子。该术语包括天然存在的IL-34同种型(例如具有和没有Q81的Q6ZMJ4和Q6ZMJ4-2)、其变体和修饰形式。天然存在的人IL-34蛋白具有在登录号Q6ZMJ4下在UniProt数据库中提供的242个氨基酸的氨基酸序列且显示如下(SEQ ID NO:1)或含有与序列SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的多肽：
MPRGFTWLRYLGIFLGVALGNEPLEMWPLTQNEECTVTGFLRDKLQYRSRLQYMKHYFPINYKISVPYEGVFRIANVTRLQRAQVSERELRYLWVLVSLSATESVQDVLLEGHPSWKYLQEVETLLLNVQQGLTDVEVSPKVESVLSLLNAPGPNLKLVRPKALLDNCFRVMELLYCSCCKQSSVLNWQDCEVPSPQSCSPEPSLQYAATQLYPPPPWSPSSPPHSTGSVRPVRAQGEGLLP
本文中使用的术语“多肽”表示不具有特定长度的、通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然地还是合成地产生。术语多肽不排除翻译后修饰，所述翻译后修饰包括、但不限于磷酸化、乙酰化、糖基化等。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
本文中使用的术语“IL-34多肽”被定义为包括天然存在的人多肽IL-34和所述多肽的天然存在的等位基因变异(例如变体rs8046424和rs7206509)。等位基因变异是物种群体中天然存在的碱基变化，其可能或不可能导致多肽或蛋白中的氨基酸变化。另外，根据本发明的IL-34多肽不仅包括包含全长IL-34及其变体或者由全长IL-34及其变体组成的多肽，而且包括由其片段组成的多肽，前提条件是所述片段是生物学上有活性的。在该定义中另外包括多肽IL-34的重组和合成形式，其可能含有在所述多肽及其DNA序列中的经诱导的修饰。因此，术语IL-34多肽意图包括由序列SEQ ID NO:1编码的IL-34多肽的功能等同物。
本文中使用的“功能等同物”表示保留亲本多肽的生物活性和特异性的分子(例如重组多肽)。因此，术语“IL-34多肽的功能等同物”包括它所指的多肽(即IL-34多肽)的变体和片段，前提条件是，所述功能等同物表现出如下所述的参比多肽的至少一种、优选全部生物活性。
本文中使用的术语“多肽变体”表示与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这样的变体包括，例如，这样的多肽：其中在所述多肽的N-或C-端添加或删除一个或多个氨基酸残基。通常，变体将与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，更优选地至少约90％氨基酸序列同一性，且甚至更优选地至少约95％氨基酸序列同一性。
含有与本发明的查询氨基酸序列具有至少例如95％“同一性”的氨基酸序列的多肽意指，除了主题多肽序列可能包括每100个查询氨基酸序列氨基酸至多5个氨基酸改变以外，主题多肽的氨基酸序列与所述查询序列相同。换而言之，为了得到含有与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，可以将主题序列中的至多5％(5/100)的氨基酸残基插入、删除或用其它氨基酸置换。在本申请的范围内，使用总体比对(即，在它们的整个长度上对比两个序列)计算同一性的百分比。用于对比2个或多个序列的同一性和同源性的方法是本领域众所周知的。例如可以使用“针”(needle)程序，其使用Needleman-Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)来发现当考虑它们的整个长度时两个序列的最适比对(包括缺口)。针程序例如可在ebi.ac.uk环球网站点上得到。优选地，使用EMBOSS::针(总体)程序计算根据本发明的同一性的百分比，其中“缺口开放(GapOpen)”参数等于10.0，“缺口延伸(Gap Extend)”参数等于0.5，和Blosum62矩阵。由与参照序列具有“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性”的氨基酸序列组成的多肽可以包含相对于参照序列的突变，诸如缺失、插入和/或置换。由与参照序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成的多肽可以对应于参照序列的等位基因变体。它可能例如仅包含相对于参照序列的置换。所述置换优选地对应于如在下表中指出的保守置换。
本文中使用的多肽“片段”表示比参比多肽更短的生物活性多肽(即IL-34多肽的片段)。因而，根据本发明的多肽包括包含IL-34的片段或由其组成的多肽，前提条件是，所述片段是生物学上有活性的。
在本发明的范围内，所述生物活性片段可以例如包含IL-34多肽的至少175、200、205、210、215、220、225、230、235、240个连续氨基酸。
IL-34或其功能等同物的“生物活性”是指诱导免疫抑制性巨噬细胞的能力(如在实施例部分中所述)。本领域技术人员可以容易地确定IL-34多肽的功能等同物是否是生物学上有活性的。为了检查新制备的多肽是否诱导免疫抑制性巨噬细胞，可以为每种多肽执行FACS分析或单细胞基因表达绘图(参见实施例部分)。
在某些实施方案中，本发明的多肽可以包含标签。标签是可以用于纯化多肽的含有表位的序列。它通过多种技术诸如亲和色谱法连接，用于使用免疫标记技术将所述多肽定位在细胞或组织样品内，通过免疫印迹法等检测所述多肽等。在本领域中通常采用的标签的例子是GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-标签、FLAGTM-标签、Strep-tagTM、V5标签、myc标签、His标签(它通常由6个组氨酸残基组成)等。
在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤(a)中使用的IL-34多肽是如最近描述的异源二聚体IL-34/MCSF(15)。
在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤(a)中，在有IL-34和另一种细胞因子(诸如例如，IL-4或IL-10)存在下培养人单核细胞群体。在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤(a)中，在有IL-34和生长因子(诸如例如，MCSF(巨噬细胞集落刺激因子))存在下培养人单核细胞群体。
在某些实施方案中，IL-34是人白介素-34(hIL-34)，优选地重组人白介素-34(rhIL-34)。
通常，在1-500ng/ml、优选10-100ng/ml、更优选50ng/ml的浓度将IL-34加入培养基中。
通常，在1-500ng/ml、优选10-100ng/ml、更优选20ng/ml的浓度将IL-4加入培养基中。
通常，在1-500ng/ml、优选10-100ng/ml、更优选20ng/ml的浓度将IL-10加入培养基中。
通常，在1-500ng/ml、优选10-100ng/ml、更优选25ng/ml的浓度将MCSF加入培养基中。
在包含一定量的IL-34的培养基中培养人单核细胞群体的步骤(a)应当进行得到免疫抑制性巨噬细胞(或IL34分化的巨噬细胞)群体所需的必要时间。
通常，用目标培养基对人单核细胞的培养应当进行至少3或4天且不超过8天，优选6天。在某些实施方案中，用目标培养基对人单核细胞的培养进行3、4、5、6、7或8天或更多。
在步骤(b)，通过本领域技术人员众所周知的方法(例如通过密度离心诸如Ficoll-PaqueTM密度-梯度离心)，可以分离外周血单核细胞(PBMC)群体。
本文中使用的术语“扩增”表示转化和/或扩大给定的细胞群体(例如免疫细胞诸如T细胞)的过程。T细胞的扩增优选地通过在有抗原特异性的刺激剂(诸如例如，抗原、细胞、抗体、凝集素等)存在下培养包含T细胞的细胞群体来执行。扩增也可能需要在有细胞因子存在下培养T细胞。
在某些实施方案中，适合用于扩增Treg的培养基包含一定量的至少一种细胞因子。可能存在于适合用于扩增Treg的培养基中的细胞因子的例子包括但不限于：IL-15、IL-12、IL-4、IL-7、IL-2、IFNγ、IL-34和促炎性细胞因子(诸如例如，IL-1(尤其是IL-1β)、IL-6和TNFα)。
在某些实施方案中，适合用于扩增Treg的培养基包含一定量的白介素-2(IL-2)和/或一定量的白介素-15(IL-15)。
在某些实施方案中，适合用于扩增Treg的培养基包含一定量的白介素-2(IL-2)和一定量的白介素-15(IL-15)。
在某些实施方案中，IL-2是人白介素-2(hIL-2)，优选重组人白介素-2(rhIL-2)。rhIL-2可商业得到用于药物用途。合适的商业形式包括，例如一种重组人IL-2组合物。
在某些实施方案中，IL-15是人白介素-15(hIL-15)，优选重组人白介素-15(rhIL-15)。
通常，在1-250ng/ml、优选10-100ng/ml、更优选25ng/ml的浓度将IL-2加入本发明的培养用培养基中。在某些实施方案中，在1-1000U/ml、优选10-500U/ml、更优选25U/ml的浓度将IL-2加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-100ng/ml、优选2.5-50ng/ml、更优选10ng/ml的浓度将IL-15加入本发明的培养用培养基中。
通常，在0.1-100ng/ml、优选1-50ng/ml、更优选5ng/ml的浓度将IL-12加入本发明的培养用培养基中。
通常，在0.1-100ng/ml、优选1-20ng/ml、更优选5ng/ml的浓度将IL-4加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-100ng/ml、优选2.5-50ng/ml、更优选10ng/ml的浓度将IL-7加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-500ng/ml、优选5-100ng/ml、更优选20ng/ml的浓度将IFNγ加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-500ng/ml、优选10-100ng/ml、更优选50ng/ml的浓度将IL-34加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-100ng/ml、优选2.5-50ng/ml、更优选10ng/ml的浓度将IL-1加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-200ng/ml、优选5-100ng/ml、更优选20ng/ml的浓度将IL-6加入本发明的培养用培养基中。
通常，在1-200ng/ml、优选5-100ng/ml、更优选20ng/ml的浓度将TNF加入本发明的培养用培养基中。
通常，在0.01-100ng/ml、优选0.1-10ng/ml、更优选1ng/ml的浓度将TGFβ加入本发明的培养用培养基中。
在适合用于扩增在所述PBMC群体中所含的人Treg细胞群体的培养基中共培养免疫抑制性巨噬细胞(也称为IL34分化的巨噬细胞)和PBMC的步骤(b)应当进行Treg细胞的扩增所需的必要时间。
在某些实施方案中，PBMC与免疫抑制性巨噬细胞是同种异体的。本文中使用的术语“同种异体的”表示来自相同物种，但是具有两种不同的遗传主要组织相容性复合物(MHC)单元型的不同个体。因而，PBMC可以分离自移植物供体，且免疫抑制性巨噬细胞可以分离自接受者。可替换地，所述PBMC可以分离自遭受自身免疫病或变态反应的患者，或分离自需要或等待器官移植的患者，或分离自骨髓供体(诸如例如，用于治疗GVHD)或健康个体。
在某些实施方案中，PMBC与免疫抑制性巨噬细胞是同基因的。本文中使用的术语“同基因的”表示相同物种的遗传上相等的成员。
通常，用目标培养基对PBMC的培养应当进行至少12天，诸如例如，至少12天且不超过20天，或至少12天且不超过6-8周，优选15天。在某些实施方案中，用目标培养基对PBMC的培养进行12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。在某些实施方案中，用目标培养基对PBMC的培养进行1周、2周、3、4、5、6、7、8、9或10周或更多。
在某些实施方案中，在PBMC的培养的第0天将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入本发明的培养用培养基中。在某些实施方案中，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)另外加入本发明的培养用培养基中1次、2次或3次或4次或更多次，例如在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20天。在某些实施方案中，在PBMC的培养的第0天和在第5、6、7、8或9天，优选地在第0和7天，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入本发明的培养用培养基中。在某些实施方案中，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入本发明的培养用培养基中3次(优选地在第0天和另外2次)。在某些实施方案中，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入本发明的培养用培养基中4次(优选地在第0天和另外3次)。在某些实施方案中，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入本发明的培养用培养基中5次(优选地在第0天和另外4次)，诸如例如，在第0、6、13、16和18天。在某些实施方案中，在第0天和在培养结束前每2、3或4天，加入细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)。
在某些实施方案中，富集的Treg群体含有的人Treg细胞的百分比是富集之前在所述PBMC群体内的人Treg细胞的百分比的至少2倍。在某些实施方案中，富集的Treg群体含有的人Treg细胞的百分比是富集之前在所述PBMC群体内的人Treg细胞的百分比的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在某些实施方案中，本发明涉及一种用于得到人Treg细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤：a)用包含一定量的IL-34的培养基培养人单核细胞群体以便得到免疫抑制性巨噬细胞群体；b)共培养在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体和同种异体PBMC群体，优选地使用包含一定量的IL15和一定量的IL2的培养基；和c)任选地分离在步骤(b)得到的人Treg细胞群体。
在某些实施方案中，本发明涉及一种用于得到人Treg细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤：a)用包含一定量的IL-34的培养基培养人单核细胞群体以便得到免疫抑制性巨噬细胞群体；b)共培养在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体和同基因PBMC群体，优选地使用包含一定量的IL15和一定量的IL2的培养基；和c)任选地分离在步骤(b)得到的人Treg细胞群体。
在某些实施方案中，所述巨噬细胞和所述PBMC群体是同基因的，且所述巨噬细胞呈递同种异体抗原。
在步骤(b)以后，已经扩增人Treg，包括人Foxp3+Treg(超过60％)和CD45RC低Treg(接近100％)。但是，它可用于高度纯化和分离人Treg细胞群体或所述人Treg细胞亚群，诸如例如CD4+CD25高CD127低Treg或CD8+CD45RC低Treg。
在步骤(c)，通过熟练的技术人员可得到的多种用于检测特定免疫细胞群体的方法可以进行人Treg细胞群体的分离，所述方法包括免疫选择技术，诸如使用流式细胞法的高通量细胞分选，使用标记至磁珠、可生物降解的珠子、不可生物降解的珠子的抗体的亲和方法，使用对IL34和CD蛋白(诸如例如，CD4、CD8、CD25、CD127或CD45RC、PD1、GITR)特异性的双特异性抗体，使用对IL34、IFNγ、TGFβ和IL10特异性的双特异性抗体，使用三特异性抗体和这类方法的组合。
本文中使用的术语“流式细胞法”表示通过将细胞悬浮在流体流中并使它们穿过电子检测设备来计数目标细胞的技术。流式细胞法允许高达每秒数千颗粒的物理和/或化学参数(诸如荧光参数)的同时多参数分析。现代的流式细胞仪通常具有多个激光器和荧光检测器。流式细胞技术的一种常见变体是，基于颗粒的性质对颗粒进行物理分选，以便使用“荧光活化的细胞分选”纯化或检测目标群体。本文中使用的“荧光活化的细胞分选”(FACS)表示这样的流式细胞法：其用于将来自生物样品的异质细胞混合物分选至两个或更多个容器中，其基于每个细胞的特定光散射和荧光特征一次分选一个细胞，并提供来自各个细胞的荧光信号的快速、客观且定量记录，以及提供特别感兴趣的细胞的物理分离。因此，FACS可以与本文所述的方法一起用于分离CD4+Treg和CD8+Treg。
可替换地，使用基于珠子的分选方法诸如磁珠，可以执行免疫细胞群体(例如人CD4+Foxp3+Treg和人CD8+Foxp3+Treg)的分离。通过使用这样的方法，可以关于特定细胞表面标志物对细胞进行正或负地分隔和分离。
如本文中定义的，“正选择”表示导致表达特定细胞表面标志物的细胞的分离和检测的技术，而“负选择”表示导致不表达特定细胞表面标志物的细胞的分离和检测的技术。在某些实施方案中，熟练的技术人员通过使用本领域已知的标准技术，诸如商业珠子缀合试剂盒，可以用抗体来包被珠子。在某些实施方案中，执行负选择步骤以除去表达一种或更多种谱系标志物的细胞，接着执行荧光活化细胞分选来正选择Treg(即CD8+CD45RC低T细胞和CD4+CD25高CD127低T细胞)。
在某些实施方案中，通过基于选自CD4、CD8、CD25、CD45RC和CD127的细胞表面标志物中的至少一种和/或基于至少一种细胞因子表达(诸如例如，IL10或IL34)的正和负选择，可以进行分离人Foxp3+Treg细胞的步骤。通过使用抗体，包括单价或多价抗体，例如，双特异性或三特异性抗体，可以完成该分离步骤。
本发明还涉及一种用于扩增人Treg细胞的方法，所述方法包括下述步骤：a)用包含一定量的白介素-34(IL-34)多肽的培养基培养人单核细胞群体，以便得到免疫抑制性巨噬细胞群体(也称为IL34分化的巨噬细胞)；b)用适合用于扩增所述人Treg细胞群体的培养基共培养Treg群体和在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体；和c)任选地分离在步骤(b)得到的人Treg细胞群体。
在某些实施方案中，Treg细胞或单核细胞可以得自iPSC(经诱导的多能干细胞)。
在某些实施方案中，所述Treg群体与免疫抑制性巨噬细胞是同种异体的。因而，Treg可以分离自移植物供体，且免疫抑制性巨噬细胞可以分离自接受者。可替换地，Treg可以分离自遭受自身免疫病或变态反应的患者，或分离自需要或等待器官移植的患者，或分离自骨髓供体(诸如例如，用于治疗GVHD)或健康个体。在某些实施方案中，Treg与免疫抑制性巨噬细胞是同基因的。
在某些实施方案中，所述Treg群体是CD4+Foxp3+Treg群体和/或CD8+Foxp3+Treg群体。在某些实施方案中，所述Treg群体是CD4+CD45RC低Treg群体和/或CD8+CD45RC低Treg群体。
通常，Treg的培养应当进行至少12天，诸如例如，12天且不超过6-8周，优选15天。在某些实施方案中，用目标培养基对PBMC的培养进行12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。在某些实施方案中，用目标培养基对PBMC的培养进行1周、2周、3、4、5、6、7、8、9或10周或更多。
在某些实施方案中，在Treg的培养的第0天将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入培养用培养基中。在某些实施方案中，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)另外加入培养用培养基中1次、2次或3次或更多次，例如在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20天。在某些实施方案中，在Treg的培养的第0天和在第5、6、7或8天，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入培养用培养基中。在某些实施方案中，在第0天和在培养结束前每2、3或4天，将细胞因子(优选IL-2和/或IL-15)加入培养用培养基中。
在本发明的方法的某些实施方案中，在PBMC或Treg的培养的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20天，优选地在第0天和/或在第11、12、13、14和/或15天，将抗体抗-CD3和/或抗体抗-CD8加入培养用培养基中。
在某些实施方案中，将0.1-10μg/ml、优选地0.25-4μg/ml、更优选地1μg/ml抗-CD3抗体和/或0.1-10μg/ml、优选地0.25-4μg/ml、更优选地1μg/ml抗-CD28抗体加入培养用培养基中。
根据本发明的IL34的用途
通过如上所述的本发明的方法得到的IL34扩增的Treg直到16:1的效应物:抑制物比率都表现出高度有效的抑制能力，是与未刺激的和多克隆地刺激的Treg相比较的。
因此，本发明的第二方面涉及IL34用于增加Treg群体的抑制能力的用途。
本发明也涉及IL34用于从PBMC群体得到富集的Treg群体的用途。本发明涉及IL34用于制备和扩增Treg群体的用途。
本发明还涉及IL34用于得到免疫抑制性巨噬细胞(也称为IL34分化的巨噬细胞)群体的用途。
本发明也涉及用于从PBMC群体得到富集的Treg群体的免疫抑制性巨噬细胞(也称为IL34分化的巨噬细胞)。本发明涉及免疫抑制性巨噬细胞用于制备和扩增Treg群体的用途。
根据本发明的方法的Treg细胞群体和包含它们的药物组合物
本发明的第三方面涉及可通过如上定义的方法得到的分离的/富集的Treg细胞群体。
在某些实施方案中；所述分离的Treg细胞(IL34扩增的Treg)群体表现出如在下面实施例部分中详述的高度有效的抑制能力。
在某些实施方案中；所述分离的Treg细胞群体是分离的Foxp3+和CD45RC低Treg细胞群体。
在某些实施方案中，所述分离的人Treg细胞群体是分离的CD4+Foxp3+Treg细胞和/或CD8+Foxp3+Treg细胞群体。
在某些实施方案中，所述分离的人Treg细胞群体是分离的CD4+CD45RC低Treg细胞和/或CD8+CD45RC低Treg细胞群体。
在本发明的上下文中，然后可以用目标抗原脉冲处理所述分离的/富集的Treg细胞群体以便得到抗原特异性的Treg细胞群体，所述抗原以有效地“激发”分离的Treg细胞群体并从而得到对所述抗原特异性的Treg细胞群体的量提供。
实际上，这样的经激发的Treg细胞可用在不希望的免疫应答(诸如在自身免疫障碍、对治疗性蛋白的免疫反应、移植物排斥、GVHD和/或变态反应中涉及的那些)的预防或治疗中。
本文中使用的术语“治疗”表示治疗性处理和预防性或防止性措施；其中目的是阻止或减慢(减轻)靶向的病理性病症或障碍。需要治疗的对象包括已经具有所述障碍的那些以及易于罹患所述障碍的那些或要在其中预防所述障碍的那些。如果在接受治疗量的根据本发明的Treg细胞以后，患者显示出可观察的和/或可测量的以下一种或多种的减少或缺失，那么受试者或哺乳动物被成功地“治疗”不希望的免疫应答：病原性细胞的数目的减少；总病原性细胞的百分比的减少；和/或在某种程度上缓解与特定疾病或病症有关的一种或多种征状；降低的发病率和死亡率，和生活质量问题的改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的以上参数可通过医师熟知的常规操作容易地测量。
本发明因而还涉及一种用于治疗或预防不希望的免疫应答的方法，其中所述方法包括将分离的/富集的Treg细胞群体施用给有此需要的受试者。优选地，将治疗有效量的本发明的Treg细胞施用给所述受试者。
本文中使用的术语“治疗有效量”是指这样的Treg的水平或量：其目的在于，在不对靶标造成显著的负面或不利副作用的情况下，(1)延迟或阻止不希望的免疫应答的开始；(2)减慢或停止不希望的免疫应答的一种或多种征状的进展、加重或劣化；(3)实现不希望的免疫应答的征状的改善；(4)降低不希望的免疫应答的严重程度或发生率；或(5)治愈不希望的免疫应答。可以为了预防性或阻止性作用在不希望的免疫应答的开始之前施用治疗有效量。可替换地或额外地，可以为了治疗性作用在不希望的免疫应答的开始之后施用治疗有效量。
在某些实施方案中，本发明的方法是用于治疗或预防免疫和/或炎性疾病或病症。免疫和/或炎性疾病或病症的例子包括但不限于：炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、与食品变态反应(例如乳蛋白变态反应、鸡蛋变态反应或花生变态反应)或不耐受性有关的肠炎、与乳糜泻有关的肠炎、类风湿性关节炎、多软骨炎、脓毒性关节炎、脊椎关节病或强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎和与关节炎有关的疾病诸如系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、皮肌炎、多肌炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、结节病或血管炎、I型糖尿病或自身免疫胰岛炎、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、德维克病或NMO(视神经脊髓炎)、脱髓鞘疾病、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、骨髓灰质炎、运动神经元病、(MND)视神经炎、横贯性脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘多神经病、甲状腺炎、胃炎、葡萄膜炎(包括前葡萄膜炎(包含虹膜炎、虹膜睫状体炎和后睫状体炎)、中间葡萄膜炎(包含睫状体扁平部炎、后睫状体炎和玻璃体炎)、后葡萄膜炎(包含脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜脉络膜炎、视网膜炎和视神经视网膜炎)、全葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、复发性葡萄膜炎和慢性葡萄膜炎)、葡萄膜视网膜炎、巩膜炎、视网膜血管炎、弥散性单侧亚急性视神经视网膜炎、交感性眼炎、Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)综合征、结节病相关的视网膜炎、贝赫切特病相关的视网膜炎、急性视网膜色素上皮炎、睾丸炎、卵巢炎、银屑病、前列腺炎、脑脊髓炎、白癫风、移植物排斥和GVHD。
因此，可以得到对与要治疗的疾病有关的抗原(病原性抗原)特异性的或对移植物特异性的Treg细胞群体。因此，目标抗原选自自身抗原、同种异体抗原和变应原。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的Treg细胞群体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本文中使用的术语“药学上可接受的赋形剂”表示，当施用给动物、优选人时，不会产生不利的变应反应或其它不良反应的赋形剂。它包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人施用，制剂应当满足管理机关(诸如例如，FDA Office或EMA)要求的无菌度、致热原性、一般安全性和纯度标准。
本发明还提供了包含根据本发明的Treg细胞群体的药物。
本发明的第四方面涉及通过如上定义的方法的步骤(a)可得到的免疫抑制性巨噬细胞(也称为IL34分化的巨噬细胞)群体。
在某些实施方案中，所述免疫抑制性巨噬细胞表现出如在下面实施例部分中详述的高度有效的诱导Treg细胞的能力。
因此，在本发明的某些实施方案中，所述免疫抑制性巨噬细胞可用于预防或治疗不希望的免疫应答，诸如在自身免疫障碍、对治疗性蛋白的免疫反应、移植物排斥、GVHD和/或变态反应中涉及的那些。不希望受理论约束，申请人提示，将所述免疫抑制性巨噬细胞施用给患者可以诱导Treg细胞的扩增，由此预防或治疗不希望的免疫应答。
本发明因而还涉及一种用于治疗或预防不希望的免疫应答的方法，其中所述方法包括将免疫抑制性巨噬细胞群体施用给有此需要的受试者。优选地，将治疗有效量的免疫抑制性巨噬细胞施用给所述受试者。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的免疫抑制性巨噬细胞群体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了包含根据本发明的免疫抑制性巨噬细胞群体的药物。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物或药物包含免疫抑制性巨噬细胞和Treg细胞。因此，在某些实施方案中，对于治疗用途，不进行本发明的方法的任选步骤(c)(分离步骤)。
下述附图和实施例将进一步例证本发明。但是，这些实施例和附图不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1:IL34分化的巨噬细胞的表型。在纯化和分化以后6天或不用IL34，评价来自健康个体的CD14+单核细胞的表型。将细胞回收，并用LPS刺激24h或不刺激，并针对几种标志物的表达进行染色。来自三个独立实验的一个代表性直方图。
图2:IL34-巨噬细胞分化以后有效的人Foxp3+Treg扩增和增强。将CD14+单核细胞用或不用IL34分化6天，且加给所有同种异体PBMC保持15天。在CD4+或CD8+CD45RC低T细胞内的PBMC中评价Foxp3阳性细胞的百分比。针对3个健康个体培养之前和之后显示了代表性的图(A)和图(B)。(C)针对Foxp3+CD4+或CD8+Treg评价了扩增倍数。(D)针对2或3个健康个体的培养之前和之后显示了在CD4或CD8T细胞中评价的CD45RC低的百分比。(E)针对3个健康个体的培养之前和之后，针对CD45RC低CD4+或CD8+Treg评价了扩增倍数。(F-G)针对响应于同种异体的T-除去的PBMC的、CFSE标记的CD4+CD25-T细胞增殖的抑制，试验了未刺激的、刺激的或IL34扩增的CD4+CD25高CD127低和CD8+CD45RC低Treg，并在培养5天以后针对CFSE稀释通过流式细胞术进行分析。n＝3。使用同种异体的T-除去的PBMC在对照增殖条件中的分裂的CD4+CD25-T细胞的比例仅占在第5天的细胞的大约60％，并且在每个实验中给出100的值。将结果表达为分裂的CD4+CD25-T细胞的相对比例的平均值±SEM。显示了一种代表性的原始CFSE图。TwoWay RM ANOVA，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001
图3:用IL-34分化的巨噬细胞扩增CD8+Treg。A.在有IL34分化的巨噬细胞存在下将CD8+CD45RC低Treg扩增约115倍。B-C.Treg与IL34分化的巨噬细胞一起的共培养导致分泌抑制性细胞因子IL34和TGFb且表达Treg-相关标志物Foxp3、GITR、PD1和HLADR的细胞的富集。B.在CD8+CD45RC低细胞中表达Treg-相关标志物的细胞的平均值±SEM。
图4:本发明的Treg对人源化小鼠中的GVHD的影响。A.Treg的共转移以剂量依赖性的方式延迟了由GVHD产生诱导的小鼠重量减轻。B.Treg的共转移在≥1:1PBMC:Treg比率改善了小鼠存活。
图5:本发明的Treg对人源化小鼠中的同种异体皮肤移植物排斥的影响。A.Treg的共转移延迟了人源化小鼠中的同种异体人皮肤移植物的排斥。B.在以1:2的PBMC:Treg比率用Treg转移的人源化小鼠中延长了移植物存活。
图6:IL34分化的巨噬细胞和MCSF分化的巨噬细胞的对比。在用未分化的、IL34分化的或MCSF分化的巨噬细胞扩增以后，在CD4+或CD8+T细胞之间在健康个体中评价Foxp3和CD45RC阳性细胞的百分比。显示了健康个体的一种代表图。
图7:IL-34对不同单核细胞亚群的影响。A.通过FACS Aria在CD14和CD16标志物表达方面分选单核细胞。B.单核细胞在健康志愿者的血液中主要是CD14+CD16-。CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+分别占PBMC的20％、8％和2.5％。C.在有IL34存在下的细胞存活依赖于单核细胞群体。在第6天，收获分别12％、37％和22％的接种的CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+。D.来自CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞的IL34分化导致与来自CD14-单核细胞(CD14-CD16+)的IL34分化相比更高数目的具有M1相关标志物的低表达的M2样巨噬细胞。
图8:3天IL-34处理对巨噬细胞的影响。A.与IL-34一起培养3天以后，收获分别107％、157％和91％的接种的CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+单核细胞。与IL34一起培养4天以后，收获分别59％、264％和275％的接种的CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+单核细胞。B.在培养3或4天以后，来自CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞的IL34分化导致与来自CD14-单核细胞(CD14-CD16+)的IL34分化相比M2相关标志物的高表达和M1相关标志物的低表达，如在6天培养中观察到的。
实施例
材料和方法
健康志愿者血液收集和PBMC分离：在给出知情同意书以后，在Etablissementdu Sang(Nantes,法国)从健康供体收集血液。将血液用PBS稀释2倍，然后通过在2000rpm室温30min的Ficoll-Paque密度-梯度离心(Eurobio)在没有制动下分离PBMC。将收集的PBMC在50mL PBS中在1800rpm洗涤10min。
移植物抗宿主病和皮肤移植排斥
将来自健康志愿者(HV)供体的1.5x107PBMC或FACS-Aria分选的CD45RC-PBMC静脉内注射进预先用1.5Gy的全身亚致命辐照处理16小时的10-13周龄NSG SCID小鼠中。以1:1或1:2的PBMC:Treg比率将扩增的Treg与同基因PBMC一起共注射进小鼠中。通过小鼠重量减轻来表征GVHD；在20％最初重量减轻处死小鼠。
给9-11周龄NSG小鼠移植人皮肤。6周以后，给小鼠静脉内注射1,5x107个与所述皮肤同种异体的PBMC以诱导同种异体移植物排斥(第0天)。将与PBMC同基因的Treg用如前面描述的IL34分化的巨噬细胞扩增，并以1:1或1:2的PBMC:Treg比率与PBMC一起共注射。通过组织学评估在1-3之间对同种异体移植物排斥评分。
将接受者每天称重，并在重量减轻百分比≥它们的最初重量的20％时处死。当可能时，在不知情条件下执行随访。治疗3-6只动物的组。小鼠在性别、年龄和最初重量方面匹配，并随机化治疗或不治疗。
Treg和单核细胞分化方案：将来自健康志愿者(HV)血液的PBMC通过Ficoll梯度分离，并根据FSC和SSC形态学参数淘选单核细胞。然后将CD14+单核细胞通过FACS Aria分选，洗涤，并以1x106/ml接种进补充了50ng/mlhIL34(ebiosciences)的培养基(RPMI 1640,谷氨酰胺2mM,青霉素100U/ml,链霉素0.1mg/ml,AB血清10％)中。在第6天，将细胞收获，用100ng/ml LPS刺激24h进行表型分析，或与1-5种同种异体PBMC一起在Iscove培养基(IMDM,谷氨酰胺2mM,青霉素100U/ml,链霉素0.1mg/ml,AB血清5％)中以4x105/ml接种。在第10、13和16天新鲜加入IL-2(25U/ml)和IL-15(10ng/ml)。通过在第19和21天将漂浮细胞连续转移至新平板分别48h和2h，除去巨噬细胞。在第21天，将细胞在有布雷菲德菌素A存在下用PMA和离子霉素刺激进行表型分析，或者将T细胞、CD8+CD45RC低T细胞和CD4+CD25高CD127低T细胞通过FACS Aria分选用于抑制测定。将新鲜同基因CD4+CD25-T细胞用作用同种异体APC刺激的应答者T细胞，所述同种异体APC分离自与CD14+细胞相同的供体。在5天以后通过CFSE稀释、通过排除dapi-标记的死细胞和CPD405标记的CD4+Treg以后在CD3+CD4+细胞上门控，评估增殖。
单克隆抗体和流式细胞术:使用针对CD3-PeCy7(SKY7)、CD4-PercPCy5.5(L200)、CD25-APCCy7(M-A251)、CD127-PE(HIL7-R M21,BD Bioscience)、CD45RC-FITC(MT2,IQProduct)、Foxp3-APC(236A/E7,ebiosciences)和IL34-PE(578416,R&D)的抗体表征人细胞表型。用Canto II细胞计数器(BD Biosciences,Mountain View,CA)测量荧光，并使用FLOWJO软件(Tree Star,Inc.美国)分析数据。首先通过选择DAPI活细胞通过它们的形态学排除死细胞来门控细胞。
将来自健康志愿者的CD14+单核细胞进行细胞分选，并在有IL34存在下分化6天，并针对CD163、CD14、HLA-DR、CD86和CD80的表达分析表型。
结果
IL34分化的巨噬细胞有效地诱导Foxp3+CD45RC低Treg并增强人CD4+CD25+CD127-和CD8+CD45RC低Treg。
将来自健康志愿者的CD14+单核细胞进行细胞分选，并在有IL34存在下分化6天，并分析表型(图1)。我们观察到，IL34分化的巨噬细胞表达比新鲜单核细胞更高水平的CD163、CD14、HLA-DR、CD86和CD80。然后将分化的巨噬细胞加给同种异体PBMC 15天，然后分析Treg的比例、数目和抑制能力(图2)。令人感兴趣的是，我们观察到，在与IL34分化的巨噬细胞一起培养后，Foxp3+CD45RC低CD4+和Foxp3+CD45RC低CD8+T细胞作为CD4+或CD8+T细胞的百分比分别增加了5和8.2倍(图2A、2B和2D)。该百分比增加也伴随着Foxp3+CD45RC低CD4+和Foxp3+CD45RC低CD8+T细胞的数目分别增加了83.4和100.6倍，如在扩增倍数中所见(图2B和2C)。因此，我们观察到了CD4+CD45RC低和CD8+CD45RC低Treg的百分比和数目的显著增加(图2D和2E)。最重要的是，我们观察到，IL34扩增的CD4+CD25高CD127低Treg和CD8+CD45RC低Treg直到16:1的效应物:抑制物比率都表现出高度有效的抑制能力，相对于未刺激的和多克隆地刺激的CD4+CD25高CD127低Treg和CD8+CD45RC低Treg具有约50％的抑制(图2F和2G)。
总之，这些结果证实，IL34分化的单核细胞具有选择性地扩增的能力，并且不仅维持而且增强Foxp3+CD45RC低Treg抑制能力。
CD8+Treg与IL-34分化的巨噬细胞一起的扩增改善了它们的致耐受性谱
通过Ficoll梯度、CD3+、CD19+和CD16+除去和在CD14标志物表达上的FACS Aria分选，分离单核细胞。将CD14+单核细胞以106个细胞/ml接种在补充了50ng/ml人IL34蛋白的完全培养基(RPMI1640,1％青霉素-链霉素,1％谷氨酰胺,10％FBS)中并培养6天。在第6天，通过Ficoll梯度、CD14+、CD16+和CD19+细胞除去和在CD3、CD8和CD45RC标志物表达上的FACSAria分选，从不同HV(健康志愿者)供体的血液分离CD8+Treg。将CD3+CD8+CD45RC低细胞以106个细胞/ml与同种异体IL34分化的巨噬细胞(以1:4的Treg:单核细胞比率，在第0天)和1μg/ml抗-CD3和抗-CD28Ab一起接种在完全培养基(RPMI1640,1％青霉素-链霉素,1％谷氨酰胺,10％AB血清,1％Hepes,1％非必需氨基酸,1％丙酮酸钠)中。在第13天，将Treg再次用1μg/ml抗-CD3和抗-CD28刺激。在第6、13、16和18天，给培养用培养基补充1000U/ml人IL-2和10ng/ml人IL-15。在第20天，针对扩增收率分析Treg，并在有10μg/ml布雷菲德菌素A存在下用50ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素刺激4h用于相对于扩增之前的Treg有关的标志物表达分析。
如在图3中所示，IL-34分化的巨噬细胞诱导CD8+CD45RC低Treg的115倍扩增。此外，Treg与IL-34分化的巨噬细胞一起的共培养诱导分泌抑制细胞因子IL34和TGFβ且表达Treg相关标志物Foxp3、GITR、PD1和HLADR的细胞的富集。因此，IL34分化的巨噬细胞增加了Treg相关标志物的表达，从而提示CD8+CD45RC低Treg的增加的抑制活性。
用IL34分化的巨噬细胞扩增的CD8+CD45RC低Treg延迟了人源化小鼠中的移植物抗宿主病
在1,5x107PBMC的静脉内注射之前将10-13周龄NSG小鼠用2Gy-照射16h以诱导异种GVH反应。将CD8+CD45RC低Treg分选并在有IL34分化的CD14+单核细胞存在下扩增。将扩增的Treg与同基因PBMC一起以1:1或1:2的PBMC:Treg比率共注射在小鼠中。通过小鼠重量减轻来表征GVHD；在20％最初重量减轻时处死小鼠。
如在图4A中所示，本发明的Treg的共转移以剂量依赖性方式延迟了由GVHD产生诱导的小鼠重量减轻。此外，本发明的Treg的共转移以≥1:1的PBMC:Treg比率改善了小鼠存活(图4B)。
该结果因而证实，用IL34分化的巨噬细胞扩增的CD8+CD45RC低Treg有效地延迟了GVHD，且可以用在细胞疗法中。
用IL34分化的巨噬细胞扩增的CD8+CD45RC低Treg延迟了人源化小鼠中的同种异体皮肤移植物排斥
给9-11周龄NSG小鼠移植人皮肤。6周以后，给小鼠静脉内注射1,5x107个与所述皮肤同种异体的PBMC以诱导同种异体移植物排斥(第0天)。将与PBMC同基因的Treg用如前面描述的IL34分化的巨噬细胞扩增，并以1:1或1:2的PBMC:Treg比率与PBMC一起共注射。通过组织学评估在1-3之间对同种异体移植物排斥评分。
如在图5A中所示，本发明的Treg的共转移延迟了人源化小鼠中的同种异体人皮肤移植物的排斥。此外，在以1:2的PBMC:Treg比率用Treg转移的人源化小鼠中延长了移植物存活(图5B)。
该结果因而证实，用IL34分化的巨噬细胞扩增的Treg可以控制针对移植物的同种免疫应答。
IL34分化的巨噬细胞比MCSF分化的巨噬细胞更有效地扩增Foxp3+CD45RC低Treg
通过Ficoll梯度、然后CD3+和CD19+细胞除去和在CD14标志物表达上的FACS Aria分选，从血液分离单核细胞。将CD14+单核细胞以106个细胞/ml接种在补充了50ng/ml人IL34蛋白或25ng/ml人MCSF蛋白的完全培养基(RPMI1640,1％青霉素-链霉素,1％谷氨酰胺,10％FBS)中6天。在第6天，将巨噬细胞以4x105个细胞/ml与同种异体PBMC一起以5:1的PBMC:巨噬细胞比率接种在完全培养基(IMDM,100U/ml青霉素,0.1mg/ml链霉素,2mM谷氨酰胺,5％AB血清)中。在第10、13和16天新鲜加入25U/ml人IL2和10ng/ml人IL15。在第21天，将T细胞在有10μg/ml布雷菲德菌素A存在下用50ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素刺激4h用于Foxp3和CD45RC标志物表达分析。
在用未分化的、IL34分化的或MCSF分化的巨噬细胞扩增以后，在CD4+或CD8+T细胞之间在健康个体中评价Foxp3和CD45RC阳性细胞的百分比。健康个体的一个代表图显示在图6中。
得到的结果表明，IL34分化的巨噬细胞比MCSF分化的巨噬细胞更有效地扩增用于细胞疗法的Treg。
CD14-CD16+、CD14+CD16-和CD14+CD16+在有IL-34存在下在体外不同地表现
通过Ficoll梯度、CD3+和CD19+细胞除去和在CD16和CD14标志物表达上的FACSAria分选，从血液分离单核细胞。将CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+单核细胞以106个细胞/ml接种在补充了50ng/ml人IL34蛋白的完全培养基(RPMI1640,1％青霉素-链霉素,1％谷氨酰胺,10％FBS)中7天。在第7天，相对于分别用10ng/ml GMCSF和50ng/ml IFNg或25ng/mlMCSF、20ng/ml IL4和20ng/ml IL10分化的M1和M2巨噬细胞，针对巨噬细胞有关的标志物表达分析细胞。
如在图7中所示，在有IL34存在下的细胞存活取决于单核细胞群体。在第6天，收获分别12％、37％和22％的接种的CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+(参见图7C)。此外，如在图7D中所示，来自CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞的IL34分化导致与来自CD14-单核细胞(CD14-CD16+)的IL34分化相比更高数目的具有M1相关标志物的低表达的M2样巨噬细胞。
因此，IL34优先向M2样细胞分化CD14+单核细胞。
3天IL34分化的巨噬细胞的收率和表型
通过Ficoll梯度、CD3+和CD19+细胞除去和在CD14标志物表达上的FACS Aria分选，从血液分离单核细胞。将CD14+单核细胞以106个细胞/ml接种在补充了50ng/ml人IL34蛋白的完全培养基(RPMI1640,1％青霉素-链霉素,1％谷氨酰胺,10％FBS)中，并在3天以后分析M1和M2有关的标志物表达。
结果显示在图8中。用IL34培养3天以后，收获分别107％、157％和91％的接种的CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+单核细胞。用IL34培养4天以后，收获分别59％、264％和275％的接种的CD14+CD16-、CD14-CD16+和CD14+CD16+单核细胞。培养3或4天以后，与来自CD14-单核细胞(CD14-CD16+)的IL34分化相比，来自CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞的IL34分化导致M2相关标志物的高表达和M1相关标志物的低表达，如在6天培养中观察到的。
这些结果证实，CD14+单核细胞与IL34一起培养3天足以以更高的收率诱导M2样谱。
参考文献
在本申请中，各参考文献描述了本发明所属领域的技术状态。这些参考文献的公开内容特此通过引用并入本公开内容中。
1.Nankivell,B.J.,Borrows,R.J.,Fung,C.L.,O'Connell,P.J.,Allen,R.D.,andChapman,J.R.2003.The natural history of chronic allograft nephropathy.N EnglJ Med 349:2326-2333.
2.Srinivas,T.R.,and Kaplan,B.2012.Transplantation in 2011:New agents,new ideas and new hope.Nat Rev Nephrol 8:74-75.
3.Londono,M.C.,Danger,R.,Giral,M.,Soulillou,J.P.,Sanchez-Fueyo,A.,andBrouard,S.2012.A need for biomarkers of operational tolerance in liver andkidney transplantation.Am J Transplant 12:1370-1377.
4.Wood,K.J.,Bushell,A.,and Hester,J.2012.Regulatory immune cells intransplantation.Nat Rev Immunol 12:417-430.
5.Niederkorn,J.Y.2008.Emerging concepts in CD8(+)T regulatorycells.Curr Opin Immunol 20:327-331.
6.Picarda,E.,Anegon,I.,and Guillonneau,C.2011.T-cell receptorspecificity of CD8(+)Tregs in allotransplantation.Immunotherapy 3:35-37.
7.Guillonneau,C.,Picarda,E.,and Anegon,I.2010.CD8+regulatory T cellsin solid organ transplantation.Curr Opin Organ Transplant 15:751-756.
8.Menoret,S.,Guillonneau,C.,Bezie,S.,Caron,L.,Anegon,I.,and Li,X.L.2011.Phenotypic and functional characterization of CD8(+)T regulatorycells.Methods Mol Biol 677:63-83.
9.Wei,S.,Nandi,S.,Chitu,V.,Yeung,Y.G.,Yu,W.,Huang,M.,Williams,L.T.,Lin,H.,and Stanley,E.R.2010.Functional overlap but differential expression ofCSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloidcells.J Leukoc Biol 88:495-505.
10.Nandi,S.,Cioce,M.,Yeung,Y.G.,Nieves,E.,Tesfa,L.,Lin,H.,Hsu,A.W.,Halenbeck,R.,Cheng,H.Y.,Gokhan,S.,et al.2013.Receptor-type protein-tyrosinephosphatase zeta is a functional receptor for interleukin-34.J Biol Chem 288:21972-21986.
11.Chihara,T.,Suzu,S.,Hassan,R.,Chutiwitoonchai,N.,Hiyoshi,M.,Motoyoshi,K.,Kimura,F.,and Okada,S.2010.IL-34 and M-CSF share the receptorFms but are not identical in biological activity and signal activation.CellDeath Differ 17:1917-1927.
12.Wang,Y.,Szretter,K.J.,Vermi,W.,Gilfillan,S.,Rossini,C.,Cella,M.,Barrow,A.D.,Diamond,M.S.,and Colonna,M.2012.IL-34 is a tissue-restrictedligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells andmicroglia.Nat Immunol 13:753-760.
13.Bezie,S.,Picarda,E.,Ossart,J.,Tesson,L.,Usal,C.,Renaudin,K.,Anegon,I.,and Guillonneau,C.2015.IL-34 is a Treg-specific cytokine andmediates transplant tolerance.J Clin Invest 125:3952-3964.
14.Foucher,E.D.,Blanchard,S.,Preisser,L.,Descamps,P.,Ifrah,N.,Delneste,Y.,and Jeannin,P.2015.IL-34-and M-CSF-induced macrophages switchmemory T cells into Th17 cells via membrane IL-1alpha.Eur J Immunol 45:1092-1102.
15.Segaliny,A.I.,Brion,R.,Brulin,B.,Maillasson,M.,Charrier,C.,Teletchea,S.,and Heymann,D.2015.IL-34 and M-CSF form a novel heteromericcytokine and regulate the M-CSF receptor activation andlocalization.Cytokine.
序列表
<110> INSERM
南特大学（UNIVERSITE DE NANTES）
<120> 用于得到调节性T细胞的方法及其用途
<130> BIO15202GUILLONNEAU/AS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn
20 25 30
Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg
35 40 45
Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile
50 55 60
Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu
65 70 75 80
Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu
85 90 95
Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly
100 105 110
His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn
115 120 125
Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser
130 135 140
Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg
145 150 155 160
Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr
165 170 175
Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu
180 185 190
Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala
195 200 205
Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro
210 215 220
His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu
225 230 235 240
Leu Pro
Claims (13)
1.一种用于得到人Treg细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤:(a)在有白介素-34(IL-34)多肽存在下培养人单核细胞群体以得到免疫抑制性巨噬细胞群体；(b)共培养人外周血单核细胞(PBMC)群体和在步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体；和(c)任选地分离在步骤(b)得到的人Treg细胞群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫抑制性巨噬细胞群体与人PBMC群体是同种异体的。
3.通过根据权利要求1所述的方法得到的分离的人Treg细胞群体。
4.根据权利要求3所述的分离的人Treg细胞群体，其中所述Treg细胞是CD4+Foxp3+Treg细胞和/或CD8+Foxp3+Treg细胞。
5.根据权利要求3所述的分离的人Treg细胞群体，其中所述Treg细胞是CD4+CD45RC低Treg细胞和/或CD8+CD45RC低Treg细胞。
6.根据权利要求3所述的分离的人Treg细胞群体，其用作药物。
7.根据权利要求3所述的分离的人Treg细胞群体，其用于预防或治疗免疫和/或炎性疾病或病症。
8.根据权利要求7所述的分离的人Treg细胞群体，其中所述免疫/炎性疾病或病症选自移植物排斥和GVHD。
9.IL-34用于从PBMC群体得到富集的Treg群体或用于得到免疫抑制性巨噬细胞群体的用途。
10.一种在根据权利要求1所述的方法的步骤(a)得到的免疫抑制性巨噬细胞群体。
11.根据权利要求10所述的免疫抑制性巨噬细胞群体，其用作药物。
12.根据权利要求10所述的免疫抑制性巨噬细胞群体，其用于预防或治疗免疫和/或炎性疾病或病症。
13.根据权利要求12所述的免疫抑制性巨噬细胞群体，其中所述免疫/炎性疾病或病症选自移植物排斥和GVHD。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15306092.6 | 2015-07-03 | ||
| EP15306092 | 2015-07-03 | ||
| PCT/EP2016/065572 WO2017005647A1 (en) | 2015-07-03 | 2016-07-01 | Methods for obtaining regulatory t cells and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107849536A true CN107849536A (zh) | 2018-03-27 |
| CN107849536B CN107849536B (zh) | 2022-05-03 |
Family
ID=53758144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680038112.3A Active CN107849536B (zh) | 2015-07-03 | 2016-07-01 | 用于得到调节性t细胞的方法及其用途 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10724001B2 (zh) |
| EP (1) | EP3317398A1 (zh) |
| JP (1) | JP6916746B2 (zh) |
| KR (1) | KR20180027533A (zh) |
| CN (1) | CN107849536B (zh) |
| AU (1) | AU2016290513B2 (zh) |
| CA (1) | CA2991077A1 (zh) |
| HK (1) | HK1255101A1 (zh) |
| WO (1) | WO2017005647A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109913415A (zh) * | 2019-03-26 | 2019-06-21 | 广东先康达生物科技有限公司 | 通用性Treg细胞的培养液及其培养方法与应用 |
| CN114736852A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-07-12 | 南京艾尔普再生医学科技有限公司 | 一种心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6892079B2 (ja) * | 2017-06-29 | 2021-06-18 | 京都府公立大学法人 | 制御性ｔ細胞誘導剤、アジュバント及び食品組成物 |
| EP3652306A1 (en) * | 2017-07-13 | 2020-05-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for increasing expansion and immunosuppressive capacity of a population of cd8+cd45rclow/-tregs |
| US11273179B2 (en) | 2018-03-12 | 2022-03-15 | Medeor Therapeutics, Inc. | Methods for treating non-cancerous disorders using hematopoietic cells |
| US10881692B2 (en) | 2018-04-05 | 2021-01-05 | Medeor Therapeutics, Inc. | Compositions for establishing mixed chimerism and methods of manufacture thereof |
| US10842821B2 (en) | 2018-04-05 | 2020-11-24 | Medeor Therapeutics, Inc. | Cellular compositions derived from prior organ donors and methods of manufacture and use thereof |
| US11813376B2 (en) | 2018-09-18 | 2023-11-14 | Medeor Therapeutics, Inc. | Cellular compositions derived from deceased donors to promote graft tolerance and manufacture and uses thereof |
| US11435350B2 (en) | 2018-09-18 | 2022-09-06 | Medeor Therapeutics, Inc. | Methods of analysis of blood from deceased donors |
| US20220143083A1 (en) * | 2019-02-12 | 2022-05-12 | Therycell Gmbh | Reverse immunosuppression |
| KR102081418B1 (ko) * | 2019-09-24 | 2020-05-26 | 주식회사 이뮤니스바이오 | 말초혈액단핵구 유래 조절 t 세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 조절 t 세포 배양방법 |
| PL241050B1 (pl) * | 2019-12-12 | 2022-07-25 | Gdanski Univ Medyczny | Zastosowanie limfocytów T regulatorowych jako leku w leczeniu stwardnienia rozsianego |
| CN113252904A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-13 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种was蛋白的检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101970643A (zh) * | 2007-11-30 | 2011-02-09 | 特拉科斯有限公司 | 用活体外扩增的cd4+cd25+调节性t细胞降低移植物抗宿主病效应的方法 |
| WO2011056972A2 (en) * | 2009-11-04 | 2011-05-12 | Case Western Reserve University | Compositions and methods of treating a t cell mediated disorder |
| WO2013181438A2 (en) * | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Compositions and methods for modulating pro-inflammatory immune response |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10231655A1 (de) * | 2002-07-12 | 2004-02-26 | Blasticon Biotechnologische Forschung Gmbh | Transplantat-Akzeptanz induzierende Zellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung |
| AU2005302425A1 (en) * | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Benaroya Research Institute At Virginia Mason | Methods of generating antigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells, compositions and methods of use |
| WO2013036297A1 (en) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | Selecta Biosciences, Inc. | Therapeutic protein-specific induced tolerogenic dendritic cells and methods of use |
| EP3126374B1 (en) | 2014-04-01 | 2018-11-07 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | An isolated donor mhc-derived peptide and uses thereof |
| JP6769948B2 (ja) | 2014-07-17 | 2020-10-14 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 移植拒絶の予防及び自己免疫疾患の治療に使用するための単離されたインターロイキン−３４ポリペプチド |
-
2016
- 2016-07-01 WO PCT/EP2016/065572 patent/WO2017005647A1/en active Application Filing
- 2016-07-01 JP JP2017567244A patent/JP6916746B2/ja active Active
- 2016-07-01 KR KR1020187003129A patent/KR20180027533A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-07-01 CN CN201680038112.3A patent/CN107849536B/zh active Active
- 2016-07-01 US US15/740,997 patent/US10724001B2/en active Active
- 2016-07-01 EP EP16734644.4A patent/EP3317398A1/en active Pending
- 2016-07-01 CA CA2991077A patent/CA2991077A1/en active Pending
- 2016-07-01 AU AU2016290513A patent/AU2016290513B2/en active Active
-
2018
- 2018-11-08 HK HK18114255.1A patent/HK1255101A1/zh unknown
-
2020
- 2020-06-11 US US16/899,142 patent/US20200308543A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101970643A (zh) * | 2007-11-30 | 2011-02-09 | 特拉科斯有限公司 | 用活体外扩增的cd4+cd25+调节性t细胞降低移植物抗宿主病效应的方法 |
| WO2011056972A2 (en) * | 2009-11-04 | 2011-05-12 | Case Western Reserve University | Compositions and methods of treating a t cell mediated disorder |
| WO2013181438A2 (en) * | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Compositions and methods for modulating pro-inflammatory immune response |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| FOUCHER ET AL.: "IL-34- and M-CSF-induced macrophages switch memory T cells into Th17 cells via membrane IL-1α", 《EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 * |
| FOUCHER ET AL.: "IL-34 induces the differentiation of human monocytes into immunosuppressive macrophages. antagonistic effects of GM-CSF and IFNγ", 《PLOS ONE》 * |
| FUJIMURA ET AL.: "A possible mechanism in the recruitment of eosinophils and Th2 cells through CD163(+) M2 macrophages in the lesional skin of eosinophilic cellulitis", 《EUROPEAN JOURNAL OF DERMATOLOGY》 * |
| MELIEF ET AL.: "Multipotent Stromal Cells Induce Human Regulatory T Cells Through a Novel Pathway Involving Skewing", 《STEM CELLS》 * |
| 葛绳德等: "《临床烧伤外科学》", 30 November 2006, 金盾出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109913415A (zh) * | 2019-03-26 | 2019-06-21 | 广东先康达生物科技有限公司 | 通用性Treg细胞的培养液及其培养方法与应用 |
| CN114736852A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-07-12 | 南京艾尔普再生医学科技有限公司 | 一种心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6916746B2 (ja) | 2021-08-11 |
| WO2017005647A1 (en) | 2017-01-12 |
| US20200308543A1 (en) | 2020-10-01 |
| CN107849536B (zh) | 2022-05-03 |
| EP3317398A1 (en) | 2018-05-09 |
| US20180187151A1 (en) | 2018-07-05 |
| AU2016290513B2 (en) | 2022-08-11 |
| CA2991077A1 (en) | 2017-01-12 |
| AU2016290513A1 (en) | 2018-01-18 |
| KR20180027533A (ko) | 2018-03-14 |
| JP2018518975A (ja) | 2018-07-19 |
| HK1255101A1 (zh) | 2019-08-02 |
| US10724001B2 (en) | 2020-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107849536A (zh) | 用于得到调节性t细胞的方法及其用途 | |
| JP2018518975A5 (zh) | ||
| JP7254128B2 (ja) | ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの新しい亜集団およびその使用 | |
| US20120122207A1 (en) | Method for Expanding Monocytes | |
| BR112019023076A2 (pt) | expansão de células t gama delta, composições e métodos de uso das mesmas | |
| Alamri et al. | Semaphorin-3E produced by immature dendritic cells regulates activated natural killer cells migration | |
| Bendersky et al. | Vγ9+ γδ T cells in systemic sclerosis patients are numerically and functionally preserved and induce fibroblast apoptosis | |
| US20150353897A1 (en) | Method of generating multilineage potential cells | |
| WO2013076181A1 (en) | Methods of enrichment and isolation of regulatory t-cells and use of the same | |
| Lei et al. | A genetic model reveals biological features of neonatal CD4 helper cells undergone homeostasis in mice | |
| Hausding et al. | Lung CD11c+ cells from mice deficient in Epstein‐Barr virus‐induced gene 3 (EBI‐3) prevent airway hyper‐responsiveness in experimental asthma | |
| Descalzi-Montoya et al. | Cord Blood-Derived Multipotent Stem Cells Ameliorate in Vitro/in Vivo Alloreactive Responses, and This Effect Is Associated with Exosomal Microvesicles in Vitro | |
| Streeter et al. | CD25 expression distinguishes functionally distinct alloreactive CD4+ CD134+ (OX40+) T-cell subsets in acute graft-versus-host disease | |
| Vonarbourg et al. | Progressive loss of RORγt expression confers distinct functional fates to natural killer cell receptor-expressing RORγt+ innate lymphocytes | |
| Ihantola | T-cell dysfunction and autoantigen recognition in type 1 diabetes | |
| Wang | MECHANISMS UNDERLYING NEONATAL CD8+ T CELL DEVELOPMENT AND RESPONSES | |
| RU2766691C9 (ru) | НОВАЯ СУБПОПУЛЯЦИЯ CD8+CD45RClow КЛЕТОК TREG И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ | |
| KR20180000977A (ko) | 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 FoxP3+ 조절 T 세포 생산 증대 기술 | |
| Cornel et al. | Best of two worlds: Engineering NKT-cells to generate an alternative adaptive cell therapy strategy against neuroblastoma | |
| RU2784566C2 (ru) | РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ Т-КЛЕТОК | |
| 최윤정 | Functional characteristics of peripheral CD4/CD8 double positive T cells as a specific biomarker for graft rejection in nonhuman primate transplantation model | |
| Lepez et al. | Long-term T cell fitness and proliferation is driven by AMPK-dependent regulation of oxygen reactive species | |
| Chen | Roles of Transcription Factor T-Bet in Memory CD4+ T Cell Generation, Function, Homeostasis and Tissue | |
| Ribeiro | Unveiling thymic epithelial cell ontogeny: A roadmap to study the microenvironment for T-cell generation and tolerance | |
| Hughes | The stage-specific effects of IL-1β on human natural killer cell development |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |