KR20180027533A - 조절 t 세포를 수득하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 Treg 세포 집단을 수득하는 방법에 관한 것이다: (a) 면역억제성 대식세포 집단을 수득하기 위하여, 소정량의 인터류킨-34 (IL-34) 폴리펩티드를 포함하는 배지와 함께 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; (b) 인간 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 집단 및 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단을 공동-배양하는 단계.
Description
본 발명은 면역요법의 분야에 속한다. 보다 특히, 본 발명은 조절 T 세포 집단을 수득하는 방법에 관한 것이다.
조절 T 세포 또는 "Treg"는 CD4+ 및 CD8+ Foxp3+ Treg 세포 및 CD45RClow Treg를 포함하며, Treg는 다른 면역 세포의 활성을 신속하게 억제할 수 있기 때문에 면역 반응을 조절하는 근간이 된다. 특히, Treg는 자가 및 비-자가 항원에 대한 원치않는 면역 반응을 하향 조절함으로써 관용을 유지하는데 중요하다. 예를 들어, 다발성 경화증 (MS), 제1형 당뇨병 (T1D), 건선, 중증 근무력증 (MG) 및 다른 자가면역 질환을 앓는 환자에서 Treg 결핍이 발견되었다. 또한, 아토피 및 알레르기 질환에서도 유사한 관련성이 존재할 수 있다. 모든 이러한 질환에 대한 기록은 시험관내 환자의 Treg 세포의 감소된 면역 억제를 나타내는 것으로 나타난다. 이는 면역요법에서 Treg를 사용하여 자가면역 질환, 알레르기 및 이식-관련 합병증, 예컨대, 이식편 거부 또는 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 치료 또는 예방하는 가능성에 대한 관심을 증가시킨다.
예를 들어, 장기 이식은 급성 거부의 예방 및 치료 모두에서 매우 유의한 개선을 나타냈지만, 준임상 에피소드 및 만성 이식편 기능장애는 여전히 중기 및 장기 이식편 생존에 심각한 영향을 끼친다 (1). 치료 전략들 중에서 공여자 항원에 대한 관용성을 유도하는 치료 전략이 부상하면서, 수년간의 실험 모델 시험 후 임상 단계로 진입하고 있다 (2, 3). 자연적 메커니즘 및 내성 유도 전략 중에서, 상이한 종류의 CD4+ Treg를 비롯한 다양한 유형의 조절 세포의 사용은 가장 유망한 치료전략 중 하나이다 (4). 이식 분야뿐만 아니라 다른 병리학적 상황에서 CD8+ 조절 T 세포 (CD8+ Treg)의 사용이 최근 본 발명자들 및 다른 이들에 의해 조명되고 있다 (5-8).
따라서, 자가면역, 알레르기, 이식, 치료 단백질을 이용한 치료 및 유전자 요법 분야에서 특히 관심있는 정제된 Treg 세포 집단을 수득하여, 면역계에 의한 자가 또는 치료 분자/조직의 분해를 방지하기 위해서, 높은 순도를 갖는 Treg 세포 및 동시에 CD4+ 및 CD8+ Treg (바람직하게는 CD4+ 및 CD8+ 효과기 T 세포 없음)를 생성하고 증대시키기 위한 유용한 방법이 특히 요구된다.
인터류킨-34 (IL34)는 2008년 확인되었다 (9). 연구는, IL34가 M-CSF와 상동성을 공유하며, 이들은 일반적인 수용체인, 단핵구의 세포 표면상에 발현된 CSF-1R로도 불리는 CD115 (9), 및 새롭게 기술된 수용체인 수용체-형 단백질-티로신 포스파타제 ξ (PTP-ξ) (10)를 통해 뇌에서 전반에(통하여) 작용한다는 것을 발혔다. 그러나, 연구는 IL34 및 M-CSF가 부분적으로 이들의 상이한 시공간적 발현으로 인해 (12), 독특한 생물학적 활성 및 신호 활성을 나타낸다 (11)는 것을 입증하였다. 오늘날까지, IL34 기능은 단핵구 및 대식세포 (파골세포, 미세아교세포)의 생존 및 기능과 주로 연관되었다 (12). 휴지기 세포내의 IL34 단백질 발현이 각질형성세포, 모낭, 신경세포, 근위요세관 세포 및 세정관 생식세포 (12), 및 또한 심장, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 전립선, 결장, 소장, 적색 비수 (spleen red pulp) 및 파골세포 (9)에서도 관찰되었다. 현재까지, IL34는 DC 또는 T 세포의 면역 기능에 대한 영향(효과)와 관련되지 않았다.
보다 최근에, IL34는, 상기 IL34-분화된 대식세포가 TCR-의존적 T 세포 증식을 억제하였으므로 (13), 인간 단핵구의 면역억제성 대식세포 (IL34-Mφ로도 지칭됨)로의 분화를 유도하고, 이식 내성을 유도하고 (13), 또한 Th17 세포라 불리는 IL-17-생성 효과기 T 헬퍼 세포를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, IL34-분화된 대식세포가 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)로부터 Treg를 생성하고 증대시키는데 유용하나는 것에 대해서는 밝혀진 것이 없었다.
본 발명은 조절 T 세포 집단을 수득하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 청구 범위로 정의된다.
본 발명은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플, 예컨대, 혈액 샘플 내 함유된 Treg (보통 Foxp3+ Treg에 대해 5%)의 사전 단리 단계 없이, PBMC로부터 Treg를 생성하고 증대시키는 새로운 효과적인 방법에 관한 결과에 기반한다. 본 발명자들은, 인간 IL34-분화된 대식세포가 인간 CD4+ 및 CD8+ Foxp3+ Treg (60% 초과) 및 CD4+ 및 CD8+ CD45RClow Treg (거의 100%)를 비롯한 인간 Treg를 증대시키고 강화시킨다는 것을 실제로 밝혔다. 더욱이, 본 발명자들은, 본 발명의 방법으로 수득된 IL34-증대된 Treg가 비자극된 및 다클론성 자극된 Treg와 비교하여 최대 16:1의 효과기:억제인자 비의 매우 강력한 억제능을 나타낸다는 것을 입증하였다.
인간 조절 T 세포 집단을 수득하는 방법
따라서, 본 발명의 제1 양태는 하기의 단계를 포함하는 인간 Treg 세포 집단을 수득하는 시험관내/생체외 방법에 관한 것이다: (a) 면역억제성 대식세포 ("IL34-분화된 대식세포"로도 불림) 집단을 수득하기 위하여, 소정량의 인터류킨-34 (IL-34) 폴리펩티드를 포함하는 배지로 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; 및 (b) 인간 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 집단 및 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단을 공동-배양하는 단계.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 면역억제성 대식세포 집단을 수득하기 위하여, 소정량의 인터류킨-34 (IL-34) 폴리펩티드를 포함하는 배지로 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; (b) 인간 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 집단 및 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단을 PBMC 집단에 함유된 인간 Treg 세포 집단을 증대시키기에 적합한 배지로 공동-배양하는 단계; 및 (c) 임의로 단계 (b)에서 수득된 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단계 (b) 이전에 PBMC 집단으로부터 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계를 포함한다. 따라서, 이러한 실시형태에따라, 단계 (b)는 PBMC 집단으로부터 단리된 인간 Treg 세포 집단 및 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단을 공동-배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단계 (b)의 공동-배양 후, 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 T 세포"는 비정상 또는 과잉 면역 반응을 억제하고, 면역 관용 (immune tolerance)에 관한 역할을 하는 T 세포를 지칭한다. 조절 T 세포는 전형적으로 "포크헤드 박스 P3 (Foxp3+) 조절 T 세포" 및 "CD45RClow 세포"이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포크헤드 박스 P3 (Foxp3+) 조절 T 세포" 또는 "Foxp3+ Treg 세포"는 특징적 마커가 전사인자 Foxp3인 인간 및 설치류 (래트 또는 마우스)에서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 2-10%를 지칭한다.
단계 (a)에서, 출발 물질로서 역할을 하는 인간 단핵구 집단은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 따라 단리될 수 있다. 예를 들어, 인간 단핵구 집단은 PBMC를 함유하는 다양한 생물학적 샘풀로부터 수득될 수 있다. 전형적으로, 이들은 말초 혈액으로부터 단리된다. 이들은 상이한 리간드 (예: CD14)로 표지된 비즈와 함께 양성 선택 (positive selection)함으로써 단리될 수 있다. 이어서, 이러한 표지된 세포는 다양한 기술, 예컨대, 하기 기재된 바와 같은 세포 분류에 의해 분리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 따라서, 인간 단핵구 집단은 CD14+ 인간 단핵구 집단이다. 일부 실시형태에서, 인간 단핵구 집단은 CD14+ CD16+ 인간 단핵구 집단이다. 일부 실시형태에서, 인간 단핵구 집단은 CD14+ CD16- 인간 단핵구 집단이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "배지"는 세포 집단을 유지하거나, 또는 세포 생육력을 유지하고 증식을 지지하는 영양분을 함유하는 세포 집단 (예: "배양 배지")을 배양하기 위한 배지를 지칭한다. 배지는 다음의 적절한 조합으로 임의의 것을 함유할 수 있다: 염, 완충제, 아미노산, 글루코스 또는 다른 당, 항생제, 혈청 또는 혈청 대체물, 및 성장 인자, 시토킨과 같은 다른 성분 등. 특정 세포 유형에 일반적으로 사용되는 배지는 당업자에게 공지된다. 본 발명의 배지는 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대, RPMI 1640 (Invitrogen)에 기반할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인터류킨-34 폴리펩티드" 또는 "IL-34 폴리펩티드" (IL-34)는 당업계에 널리 공지되어있으며, 단핵구 및 대식세포의 증식, 생존 및 분화를 촉진시키는 시토킨을 지칭한다. 상기 용어는 이의 자연 발생 IL-34 이소형 (예: Q81를 갖는 및 갖지 않는 Q6ZMJ4 및 Q6ZMJ4-2), 변이체 및 변형된 형태를 포함한다. 자연 발생 인간 IL-34 단백질은 UniProt 데이터베이스 수탁 번호 Q6ZMJ4로 제공되고, 하기와 같이 도시된 (서열번호 1) 242 아미노산의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 갖는다:
MPRGFTWLRYLGIFLGVALGNEPLEMWPLTQNEECTVTGFLRDKLQYRSRLQYMKHYFPINYKISVPYEGVFRIANVTRLQRAQVSERELRYLWVLVSLSATESVQDVLLEGHPSWKYLQEVETLLLNVQQGLTDVEVSPKVESVLSLLNAPGPNLKLVRPKALLDNCFRVMELLYCSCCKQSSVLNWQDCEVPSPQSCSPEPSLQYAATQLYPPPPWSPSSPPHSTGSVRPVRAQGEGLLP
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합으로 접합된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하며, 자연적으로 또는 합성적으로 생성되는 여부에 따라 특이적인 길이를 갖지 않는다. 용어 폴리펩티드는 인산화, 아세틸화 및 글리코시화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 번역-후 변형을 배제하지 않는다. 또한, 용어는 아미노산 중합제에도 적용되며, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모사체, 및 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-34 폴리펩티드"는 자연 발생 인간 폴리펩티드 IL-34 및 폴리펩티드의 자연-발생 대립형질 변이체 (예: 변이체 rs8046424 및 rs7206509)를 포함한 것으로 정의된다. 대립형질 변이체는 종 집단에서의 자연-발생적 염기 변화이며, 폴리펩티드 또는 단백질 중 아미노산 변화가 초래되거나 초래되지 않을 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 따른 IL-34 폴리펩티드는 전장 IL-34를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드 및 이의 변이체 뿐만 아니라, 이의 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 추가적으로, 폴리펩티드 IL-34의 재조합 및 합성 버전 모두가 이러한 정의 내에 포함되며, 이는 폴리펩티드 및 이의 DNA 서열에서 유도된 변형을 함유할 수 있다. 따라서, 용어 IL-34 폴리펩티드는 서열번호 1에 의해 암호화된 IL-34 폴리펩티드의 기능적 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "기능적 등가물"은 모 폴리펩티드의 생물학적 활성 및 특이성을 보유하는 분자 (예: 재조합 폴리펩티드)이다. 따라서, 용어 "IL-34 폴리펩티드의 기능적 등가물"은, 하기에 기재된 바와 같이, 기능적 등가물이 기준 폴리펩티드의 생물학적 활성의 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 나타내는 한, 즉, IL-34 폴리펩티드의 변이체 및 단편을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 변이체"는 천연 (native) 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나, 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 보통, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성, 및 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 발명의 쿼리 (query) 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들어, 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티에 의해, 이는 대상 폴리펩티드 서열이 쿼리 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 최대 5개 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열은 쿼리 아미노산과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 쿼리 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위하여, 대상 서열 중 최대 5% (100 중 5)의 아미노산 잔기가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 또 다른 아미노산과 치환될 수 있다. 이러한 명세서 내에서, 동일성 백분율은 글로벌 정렬 (global alignment)을 사용하여 계산된다 (즉, 2개 서열이 이의 전체 길이에 대해 비교됨). 2개 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 당업계에 잘 공지된다. 예를 들어, 이들의 전체 길이를 고려한 경우 2개 서열 중 최적의 정렬을 찾기 위하여, Needleman-Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하는 "니들 (needle)" 프로그램이 사용될 수 있다. 니들 프로그램은, 예를 들어, ebi.ac.uk world wide web site 상에서 이용가능하다. 본 발명에 따른 동일성 백분율은 바람직하게는 with a "Gap Open" parameter equal to 10.0, a "Gap Extend" parameter equal to 0.5, and a Blosum62 matrix를 갖는 EMBOSS::needle (global) 프로그램을 사용하여 계산된다. 기준 서열에 대해 "적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한" 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 돌연변이, 예컨대, 기준 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 기준 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 기준 서열의 대립형질 변이체와 상응할 수 있다. 예를 들어, 기준 서열과 비교하여 단지 치환만 포함할 수 있다. 치환은 바람직하게는 하기 표에 나타난 바와 같은 보존적 치환에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 "단편"은 기준 폴리펩티드 (예: IL-34 폴리펩티드의 단편)보다 짧은 생물학적 활성 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 IL-34의 단편을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함하나, 단 단편은 생물학적으로 활성이다.
본 발명에서, 생물학적 활성 단편은, 예를 들어, IL-34 폴리펩티드의 적어도 175, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 연속된 아미노산을 포함할 수 있다.
IL-34 또는 이의 기능적 등가물의 "생물학적 활성"은 면역억제성 대식세포 (실시예 부문에 기재된 바와 같은)를 유도하는 능력을 의미한다. 당업자는 IL-34 폴리펩티드의 기능적 등가물이 생물학적 활성인지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 새롭게 생성된 폴리펩티드가 면역억제성 대식세포를 유도하는 지의 여부를 체크하기 위하여, 각 폴리펩티드에 대해 FACS 분석 또는 단일 세포 유전자 발현 프로파일링 (실시예 부문 참조)을 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 태그를 포함할 수 있다. 태그는 폴리펩티드의 정제에 유용할 수 있는 에피토프-함유 서열이다. 이는 면역표지 기술을 사용하는 세포 또는 조직 샘플 내의 상기 폴리펩티드의 위치결정 (localization), 면역블롯팅 등에 의한 상기 폴리펩티드의 검출을 위하여, 다양한 기술, 예컨대, 친화성 크로마토그래피에 의해 부착된다. 당업계에서 일반적으로 사용되는 태그의 예는 GST (글루타티온-S-트랜스퍼라제)-태그, FLAG™-태그, Strep-태그™, V5 태그, myc 태그, His 태그 (전형적으로 6개 히스티딘 잔기로 이루어짐) 등이 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)에 사용되는 IL-34 폴리펩티드는 방금 전 (15)에 기재된 바와 같은 헤테로다이머 IL-34/MCSF이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서, 인간 단핵구 집단은 IL-34 및 또 다른 시토킨, 예컨대, IL-4 또는 IL-10의 존재하에 배양된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서, 인간 단핵구 집단은 IL-34 및 성장 인자, 예컨대, MCSF (대식세포-콜로니 자극 인자)의 존재하에 배양된다.
일부 실시형태에서, IL-34는 인간 인터류킨-34 (hIL-34), 바람직하게는, 재조합 인간 인터류킨-34 (rhIL-34)이다.
전형적으로, IL-34는 1 내지 500 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 50 ng/ml의 농도 범위로 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-4는 1 내지 500 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 ng/ml의 농도 범위로 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-10은 1 내지 500 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 ng/ml의 농도 범위로 배지에 첨가된다.
전형적으로, MCSF는 1 내지 500 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 25 ng/ml의 농도 범위로 배지에 첨가된다.
소정량의 IL-34를 포함하는 배지 내에서 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계 (a)는 면역억제성 대식세포 (또는 IL34-분화된 대식세포) 집단의 획득에 요구되는 필요한 시간동안 수행되어야 한다.
전형적으로, 관심있는 배지를 사용한 인간 단핵구의 배양은 적어도 3 또는 4일 내지 최대 8일, 바람직하게는 6일 동안 수행되어야 한다. 일부 실시형태에서, 관심있는 배지를 사용한 인간 단핵구의 배양은 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 이상 동안 수행된다.
단계 (b)에서, 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 집단은 당업자에게 공지된 방법 (예: Ficoll-PaqueTM 밀도-구배 원심분리와 같은 밀도 원심분리)에 의해 단리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증대시킴 (expanding)"은 소정의 세포 집단 (예: T 세포와 같은 면역 세포)을 전환 및/또는 증폭시키는 방법을 지칭한다. T 세포의 증대는 바람직하게는 항원-특이적 자극제, 예컨대, 항원, 세포, 항체 및 렉틴 등의 존재하에서 T 세포를 포함하는 세포 집단을 배양함으로써 수행된다. 또한, 증대는 시토킨의 존재하에서의 T 세포의 배양을 요구할 수 있다.
일부 실시형태에서, Treg를 증대시키는데 적합한 배지는 소정량의 적어도 하나의 시토킨을 포함한다. Treg를 증대시키는데 적합한 배지 내 존재할 수 있는 시토킨의 예는 IL-15, IL-12, IL-4, IL-7, IL-2, IFNγ, IL-34 및 프로-염증성 시토킨 (예: IL-1 (특히, IL-1β), IL-6 및 TNFα)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, Treg를 증대시키는데 적합한 배지는 소정량의 인터류킨-2 (IL-2) 및/또는 소정량의 인터류킨-15 (IL-15)를 포함한다.
일부 실시형태에서, Treg를 증대시키는데 적합한 배지는 소정량의 인터류킨-2 (IL-2) 및 소정량의 인터류킨-15 (IL-15)를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2는 인간 인터류킨-2 (hIL-2), 바람직하게는 재조합 인간 인터류킨-2 (rhIL-2)이다. rhIL-2는 약학적 사용을 위하여 상업적으로 이용가능하다. 적절한 상업적 형태는, 예를 들어, Proleukin®, 재조합 인간 IL-2 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-15는 인간 인터류킨-15 (hIL-15), 바람직하게는 재조합 인간 인터류킨-15 (rhIL-15)이다.
전형적으로, IL-2는 1 내지 250 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 25 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, IL-2는 1 내지 1000 U/ml, 바람직하게는 10 내지 500 U/ml, 보다 바람직하게는 25 U/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-15는 1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 2.5 내지 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-12는 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 1 내지 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 5 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-4는 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 1 내지 20 ng/ml, 보다 바람직하게는 5 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-7은 1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 2.5 내지 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IFNγ는 1 내지 500 ng/ml, 바람직하게는 5 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-34는 1 내지 500 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 50 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-1은 1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 2.5 내지 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, IL-6은 1 내지 200 ng/ml, 바람직하게는 5 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, TNF는 1 내지 200 ng/ml, 바람직하게는 5 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
전형적으로, TGFβ는 0.01 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.1 내지 10 ng/ml, 보다 바람직하게는 1 ng/ml의 농도 범위로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다.
PBMC 집단에 함유된 인간 Treg 세포 집단을 증대시키는데 적합한 배지 내에서 면역억제성 대식세포 (IL34-분화된 대식세포로도 불림) 및 PBMC를 공동-배양하는 단계 (b)는 Treg 세포를 증대시키는데 요구되는 필요한 시간 동안 수행되어야 한다.
일부 실시형태에서, PBMC는 면역억제성 대식세포에 대해 동형이형이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이형"은 동일한 종에서 유래되었으나, 2개 상이한 유전적 주요 조직적합 복합체 (MHC) 단상형을 갖는다는 것을 지칭한다. 따라서, PBMC는 이식편 공여자로부터 단리될 수 있으며, 면역억제성 대식세포는 수령자로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, PBMC는 자가면역 질환 또는 알레르기를 앓는 환자, 또는 장기 이식이 필요하거나 이를 기다리는 환자, 또는 골수 이식 공여자 (예를 들어, GVHD 치료를 위하여) 또는 건강한 개체로부터 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, PBMC는 면역억제성 대식세포에 대해 동계이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동계 (syngeneic)"는 동일한 종의 유전적으로 동일한 구성원을 지칭한다.
전형적으로, 관심있는 배지를 사용한 PBMC의 배양은 적어도 12일, 예컨대, 적어도 12일 내지 20일 이상 동안, 또는 적어도 12일 내지 6 내지 8주 이상, 바람직하게는 15일 동안 수행되어야 한다. 일부 실시형태에서, 관심있는 배지를 사용한 PBMC의 배양은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 관심있는 배지를 사용한 PBMC의 배양은 1주, 2주, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 PBMC 배양 0일에 본 발명의 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 본 발명의 배양 배지에 1회, 2회 또는 3회 또는 4회 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20일 동안 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 PBMC 배양의 0일 및 5, 6, 7, 8 또는 9일에, 바람직하게는 0 및 7일에 본 발명의 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 바람직하게는 0일에 3회, 및 2회 추가로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 바람직하게는 0일에 4회 및 3회 추가로 본 발명의 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 바람직하게는 0일에, 5회 및 4회 추가로, 예를 들어, 0, 6, 13, 16 및 18일에 본 발명의 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 배양이 끝날 때까지 0일에 및 매 2, 3 또는 4일에 첨가된다.
일부 실시형태에서, Treg 풍부 집단 (enriched population)은 농축 (enrichment) 이전, PBMC 집단 내에서 인간 Treg 세포 백분율의 적어도 2배인 인간 Treg 세포 백분율을 함유한다. 일부 실시형태에서, Treg 풍부 집단은 농축 이전 PBMC 집단 내에서 인간 Treg 세포 백분율의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배인 인간 Treg 세포 백분율을 함유한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 Treg 세포 집단을 수득하는 방법에 관한 것이다: (a) 면역억제성 대식세포 집단을 수득하기 위하여, 소정량의 IL-34를 포함하는 배지로 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단 및 동종이형 PBMC 집단을, 바람직하게는, 소정량의 IL-15 및 소정량의 IL-2를 포함하는 배지로 공동-배양하는 단계; 및 (c) 임의로 단계 (b)에서 수득된 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계.
일부 실시형태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 Treg 세포 집단을 수득하는 방법에 관한 것이다: (a) 면역억제성 대식세포를 수득하기 위하여, 소정량의 IL-34를 포함하는 배지로 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단 및 동계 PBMC 집단을, 바람직하게는, 소정량의 IL-15 및 소정량의 IL-2를 포함하는 배지로 공동-배양하는 단계; 및 (c) 임의로 단계 (b)에서 수득된 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계.
일부 실시형태에서, 대식세포 및 PBMC 집단은 동계이며, 대식세포는 동종이형 항원에 존재한다.
단계 (b) 후, 인간 Foxp3+ Tregs (60% 초과) 및 CD45RClow Tregs (거의 100%)를 비롯한 인간 Treg가 증대되었다. 그러나, 이는 인간 Treg 세포 집단 또는 상기 인간 Treg 세포의 아집단 (subpopulation), 예컨대, CD4+CD25highCD127low Treg 또는 CD8+CD45RClow Treg를 고도로 정제하고 단리하는데 유용할 수 있다.
단계 (c)에서, 인간 Treg 세포 집단의 단리는 면역선택 기술, 예컨대, 유동 세포분석 방법을 사용한 고속-처리 세포 분류, 자석 비즈, 생분해성 비즈, 비-생분해성 비즈에 표시된 항체를 이용한 친화성 방법, IL34 및 CD 단백질 (예: CD4, CD8, CD25, CD127 또는 CD45RC, PD1, GITR)에 대해 특이적인 이중특이적 항체의 사용, IL34, IFNγ, TGFβ 및 IL10에 대해 특이적인 이중특이적 항체의 사용, 삼중특이적 항체의 사용 및 이러한 방법의 조합을 비롯한, 당업자에게 이용가능한 특정한 면역 세포 집단을 검출기 위한 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유동 세포분석 방법"은 관심있는 세포를 유체의 스트림 중에 현탁시키고, 전자 검출 장치를 통해 이들을 통과시킴으로써, 관심있는 세포를 계수하는 기술을 지칭한다. 유동 세포분석 방법은 초당 최대 수천개의 입자의 물리적 및/또는 화학적 파라미터, 예컨대, 형광 파라미터의 동시 다중파라미터 분석을 가능하게 한다. 최신 유동 세포분석 기기는 일반적으로 다양한 레이저 및 형광 검출기를 갖는다. 유동 세포분석 기술의 일반적인 변형은 "형광-활성 세포 분류"를 사용하여 관심있는 집단을 정제 또는 검출하도록, 이들의 특성에 기반한 입자를 물리적으로 분류하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "형광-활성 세포 분류" (FACS)는 각 세포의 특이적 광 산란 및 형광성 특성에 기반하여, 생물학적 샘플 중에서 세포의 이질적 혼합물을 2개 이상의 용기로 한번에 1셀씩 분류하는 유동 세포분석 방법을 지칭하며, 개별 세포의 형광 시그널의 빠르고 객관적이고 정량적인 기록뿐만 아니라 관심있는 특정 세포의 물리적 분리를 제공한다. 따라서, FACS는 본원에 기재된 방법을 이용하여 CD4+ Treg 및 CD8+ Treg를 단리하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 면역 세포 집단 (예: 인간 CD4+ Foxp3+ Treg 및 인간 CD8+ Foxp3+ Treg)에 대한 단리는 비즈, 예컨대, 자석 비즈-기반 분류 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 세포가 분리되고 특정 세포-표면 마커에 대해 양성 또는 음성으로 단리될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, "양성 선택"은 특이적 세포-표면 마커를 발현하는 세포의 단리 및 검출을 야기하는 기술을 지칭하나, 반면 "음성 선택"은 특이적 세포-표면 마커를 발현하지 않는 세포의 단리 및 검출을 야기하는 기술을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 비즈는 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대, 상업용 비즈 접합 키트를 사용하여 당업자에 의해 항체로 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 음성 선택 단계를 수행하여 하나 이상의 계통 마커를 발현하는 세포를 제거하고, 이어서, 형광-활성 세포 분류를 사용하여 Treg (예: CD8+CD45RClow T 세포 및 CD4+CD25highCD127low T 세포)를 양성 선택한다.
일부 실시형태에서, 인간 Foxp3+ Treg 세포를 단리하는 단계는 CD4, CD8, CD25, CD45RC 및 CD127로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 세포-표면 마커 및/또는 적어도 하나의 시토킨, 예컨대, IL10 또는 IL34 발현에 기반하여 양성 및 음성 선택함으로써 수행될 수 있다. 이러한 단리 단계는 1가 또는 다가 항체, 예컨대, 이중특이적 또는 삼중특이적 항체를 비롯한 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 추가로 다음의 단계를 포함하는 인간 Treg 세포 집단을 증대시키는 방법에 관한 것이다: (a) 면역억제성 대식세포 집단 (IL34-분화된 대식세포로도 불림)을 수득하기 위하여, 소정량의 인터류킨-34 (IL-34) 폴리펩티드를 포함하는 배지로 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; (b) 상기 인간 Treg 세포를 증대시키기에 적합한 배지로 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단 및 Treg 집단을 공동-배양하는 단계; 및 (c) 임의로 단계 (b)에서 수득된 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계.
일부 실시형태에서, Treg 세포 또는 단핵구는 iPSC (유도 만능 줄기 세포)로부터 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, Treg 집단은 면역억제성 대식세포에 대해 동종이형이다. 따라서, Treg는 이식편 공여자로부터 단리될 수 있고, 면역억제성 대식세포는 수령자로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Treg는 자가면역 질환 또는 알레르기를 앓는 환자, 또는 장기 이식이 필요하거나 이를 기다리는 환자, 또는 골수 이식 공여자 (예를 들어, GVHD 치료를 위하여) 또는 건강한 개체로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, Treg는 면역억제성 대식세포에 대해 동계이다.
일부 실시형태에서, Treg 집단은 CD4+Foxp3+ Treg 및/또는 CD8+Foxp3+ Treg의 집단이다. 일부 실시형태에서, 상기 Treg 집단은 CD4+CD45RClow Treg 및/또는 CD8+CD45RClow Treg 집단이다.
전형적으로, Treg 배양물은 적어도 12일, 예컨대, 12일 내지 6-8주 이상, 바람직하게는 15일 동안 수행되어야 한다. 일부 실시형태에서, 관심있는 배지로 PBMC를 배양하는 것은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 관심있는 배지로 PBMC를 배양하는 것은 1주, 2주, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 Treg 배양의 0일에 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 배양 배지에 1회, 2회 또는 3회 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20일에 추가로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL-15는 Treg 배양 0일 및 5, 6, 7 또는 8일에 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 시토킨, 바람직하게는 IL-2 및/또는 IL15는 배양이 끝날 때까지 0일 및 매 2, 3 또는 4일에 배양 배지에 첨가된다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 항체 항-CD3 및/또는 항체 항-CD8은 PBMC 또는 Treg 배양의 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20일에, 바람직하게는 0일 및/또는 11, 12, 13, 14 및/또는 15일에 배양 배지에 첨가된다.
일부 실시형태에서, 항-CD3 항체의 0.1 내지 10 ㎍/ml, 바람직하게는 0.25 내지 4 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 1 ㎍/ml, 및/또는 항-CD28 항체의 0.1 내지 10 ㎍/ml, 바람직하게는 0.25 내지 4 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 1 ㎍/ml가 배양 배지에 첨가된다.
본 발명에 따른 IL34의 용도
상기 기재된 바와 같은 본 발명의 방법으로 수득된 IL34-증대된 Treg는 비자극된 및 다클론성 자극된 Treg와 비교하여, 최대 16:1의 효과기:억제인자 비의 매우 강력한 억제능을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 제2 양태는 Treg 집단의 억제능을 증가시키기 위한 IL34의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PBMC 집단 중으로부터 Treg 풍부 집단을 수득하기 위한 IL34의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 Treg 집단을 생성하고 증대시키기 위한 IL34의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 면역억제성 대식세포 (IL34-분화된 대식세포로도 불림) 집단을 수득하기 위한 IL34의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 PBMC 집단 중 Treg 풍부 집단을 수득하기 위한 면역억제성 대식세포 (IL34-분화된 대식세포로도 불림)에 관한 것이다. 본 발명은 Treg 집단을 생성하고 증대시키기 위한 면역억제성 대식세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따른 Treg 세포 집단 및 이들을 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 제3 양태는 상기 정의된 방법으로 수득가능한 단리된/풍부 Treg 세포 집단에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 단리된 Treg 세포 집단 (IL34-증대된 Treg)은 하기 실시예 부문에 설명되는 바와 같이 매우 강력한 억제능을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 상기 단리된 Treg 세포 집단은 단리된 Foxp3+ 및 CD45RClow Treg 세포 집단이다.
일부 실시형태에서, 상기 단리된 인간 Treg 세포 집단은 단리된 CD4+ Foxp3+ Treg 세포 및/또는 CD8+ Foxp3+ Treg 세포 집단이다.
일부 실시형태에서, 상기 단리된 인간 Treg 세포 집단은 단리된 CD4+CD45RClow Treg 세포 및/또는 CD8+CD45RClow Treg 세포 집단이다.
본 발명의 맥락에서, 단리된/풍부 Treg 세포 집단은, 이어서 항원-특이적 Treg 세포 집단을 달성하기 위하여 관심있는 항원과 펄싱될 수 있고 (pulsed), 상기 항원은 단리된 Treg 세포 집단을 "프라이밍 (prime)"함에 따라 상기 항원에 대해 특이적인 Treg 세포 집단을 수득하도록 효과적인 양으로 제공된다.
사실, 이러한 프라이밍된 Treg 세포는, 예컨대, 자가면역 장애, 치료 단백질에 대한면역 반응, 이식편 거부, GVHD 및/또는 알레르기와 관련된 것들과 같은 원치않는 면역 반응의 예방 또는 치료에 유용하다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 치료적 치료 및 예방 또는 예방적 조치 모두를 포함하며; 여기서 목적은 목적하는 병리학적 상태 또는 장애를 예방하거나 속도를 늦추는 (경감) 것이다. 치료를 필요로하는 대상은 이미 장애를 앓는 대상뿐만 아니라, 장애를 앓을 경향이 있는 대상 또는 예방되어야 할 장애가 있는 대상을 포함한다. 대상체 또는 포유동물은, 만일 본 발명에 따른 치료적 양의 Treg 세포를 수여받은 후, 원치않는 면역 반응에 대해 성공적으로 "치료되며", 환자는 하나 이상의 하기 증상이 관찰가능한 및/또는 측정가능한 정도의 감소를 보이거나 또는 증상이 사라질 것이다: 발병 세포의 수 감소; 발병된 전체 세포 백분율의 감소; 및/또는 특정 질환 또는 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 완화; 감소된 이환율 및 사망률, 및 삶의 질 향상. 이러한 질환의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기의 파라미터는 임상의에게 익숙한 일반적 절차로 용이하게 측정가능하다.
따라서, 본 발명은 원치않는 면역 반응의 치료 또는 예방을 위한 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 방법은 단리된/풍부 Treg 세포 집단을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 Treg 세포의 치료학적 유효량이 대상체에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"은 다음의 목적하는 반응에 대해 유의한 부정적 또는 부작용을 유발하지 않는, 목적하는 Treg의 수준 또는 양을 의미한다: (1) 원치않는 면역 반응의 발병을 지연 또는 예방함; (2) 원치않는 면역 반응의 하나 이상의 증상의 진행, 악화 또는 저하의 속도를 늦추거나 중단함; (3) 원치않는 반응의 증상의 개선을 야기함; (4) 원치않는 면역 반응의 중증도 또는 발생을 감소시킴; 또는 (5) 원치않는 면역 반응을 치료함. 치료학적 유효량은 예방 또는 방지를 위하여 원치않는 면역 반응의 발병 이전에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 치료학적 유효량은 치료를 위하여 원치않는 면역 반응 개시 후에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역 및/또는 염증성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 면역 및/또는 염증성 질환 또는 병태의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 염증성 장 질환 (IBD), 궤양성 대장염, 크론병, 음식 알레르기 (예: 우유 단백질 알레르기, 암탉 달걀 (hen egg) 알레르기 또는 땅콩 알레르기) 관련된 장 염증 또는 불내성, 셀리악병, 류마티스 관절염, 다발연골염, 화농성 관절염, 척추관절병 또는 강직 척추염 관련된 장 염증, 소아 특발성 관절염 (JIA), 건선성 관절염 및 관절염 연관된 질환, 예컨대, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후집단, 피부경화증, 피부근염, 다발성근염, 류마티스성 다발성근육통, 섬유근육통, 사르코이드증, 또는 혈관염, 제I형 당뇨병 또는 자가면역 췌도염, 다발성 경화증, 근위축 측삭경화증 (ALS), 데빅병 (Devic's disease) 또는 NMO (neuromyelitis optica), 탈수 질환 (demyelinating disease), 알츠하이머병 (AD), 파킨슨병 (PD), 소아마비, 운동 신경 질환 (MND), 시신경염, 횡단성 척수염, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 갑상선염, 위염, 포도막염 (앞 포도막염 (홍채염, 홍채섬모체염 (iridiocyclitis), 및 앞 섬모체염 (anterior cylitis) 포함), 중간 포도막염 (주변 포도막염, 뒤 섬포체염 (posterior cyclitis) 및 유리체염 포함), 뒤 포도막염 (맥락막염, 맥락막망염 (chorioretinitis), 망막맥락막염, 망막염, 및 신경망막염 포함), 범포도막염, 급성 포도막염, 반복성 포도막염 및 만성 포도막염), 포도망막염 (uveoretinitis), 공막염, 망막 혈관염, 미만성 일측 아급성 신경망막염, 교감성 안염, 보크트-고야나기-하라다 (VKH) 증후집단, 사르코이드증-관련된 망막염, 베체트-관련 망막염, 급성 망막 색소 상피염, 고환염, 난소염, 건선, 전립선염, 뇌척수염, 백반증, 이식편 거부반응 및 GVHD.
이에 따라, 치료될 질환과 관련된 항원 (병원성 항원)에 특이적인 또는 이식편 특이적인 Treg 세포 집단이 수득될 수 있다. 따라서, 관심있는 항원은 자가-항원, 동종-항원 및 알레르기성 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 Treg 세포 집단 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 동물, 바람직하게는 사람에게 투여되는 경우 부작용, 알레르기반응 또는 다른 원치않는 반응을 생성하지 않는 부형제를 지칭한다. 이는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제등을 포함한다. 인간 투여의 경우, 조제물은 규제 사무소, 예컨대, FDA Office 또는 EMA과 같은 기관에 의해 요구되는 바와 같은 무균성, 발열성, 일반 안정성 및 순도 기준을 충족해야한다.
본 발명은 본 발명에 따른 Treg 세포 집단을 포함하는 약제를 추가로 제공한다.
본 발명의 제4 양태는 상기 정의된 바와 같은 방법의 단계 (a)로 수득가능한 면역억제성 대식세포 (IL34-분화된 대식세포로도 불림) 집단에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 면역억제성 대식세포는 실시예 부문에 설명된 바와 같이 Treg 세포를 유도하는 매우 강력한 능력을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 면역억제성 대식세포는, 예컨대, 자가면역 장애, 치료 단백질에 대한 면역 반응, 이식편 거부, GVHD 및/또는 알레르기가 포함되는 원치않는 면역 반응의 예방 또는 치료에 유용하다. 이론에 구애됨 없이, 본 명세서는 상기 면역억제성 대식세포를 환자에게 투여하는 것이 Treg 세포의 증대를 유도하여, 원치않는 면역 반응을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 제시한다.
따라서, 본 발명은 원치않는 면역 반응의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 방법은 면역억제성 대식세포 집단을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 치료학적 유효량의 면역억제성 대식세포가 대상체에게 투여된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제성 대식세포 집단 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제성 대식세포 집단을 포함하는 약제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 면역억제성 대식세포 및 Treg 세포를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 치료적 사용을 위하여, 본 발명의 임의의 단계 (c) (단리 단계)가 수행되지 않는다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이러한 실시예 및 도면은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도면:
도 1: IL34-분화된 대식세포의 표현형. CD14+ 단핵구의 정제 및 IL34와 함께 분화 또는 IL34없이 분화한 후, 6일에 건강한 개체로부터 이의 표현형을 평가하였다. 세포를 회수하고, LPS와 함께 자극 또는 LPS 없이 자극시키고, 수개의 마커의 발현을 위하여 염색하였다. 3개 독립적인 실험으로부터의 1개 대표적인 히스토그램.
도 2: IL34-대식세포 분화 후의 효과적인 인간 Foxp3 + Treg 증대 및 강화. CD14+ 단핵구를 IL34와 함께 또는 IL34 없이 6일동안 분화시키고, 전체 동종이형 PBMC에 15일 동안 첨가하였다. Foxp3 양성 세포의 백분율을 CD4+ 또는 CD8+ CD45RClow T 세포 중 PBMC에서 평가하였다. 3명의 건강한 개체에 대한 배양 전후의 대표적인 플롯 (A) 및 그래프 (B)를 도시한다. ( C) Foxp3+ CD4+ 또는 CD8+ Treg의 배수 증대를 평가하였다. ( D) 2 또는 3명의 건강한 개체에 대한 배양 전후의 CD4 또는 CD8 T 세포 중 평가된 CD45RClow의 백분율을 도시한다. ( E) 3명의 건강한 개체에 대한 배양 전후의 CD45RClow CD4+ 또는 CD8+ Treg의 배수 증대를 평가하였다. ( F-G) 비자극된, 자극된 또는 IL34-증대된 CD4+CD25highCD127low 및 CD8+CD45RClow Treg를 동종이형 T-결핍된 PBMC에 대한 반응으로 CFSE-표지된 CD4+CD25- T 세포 증식의 억제에 대해 시험하고, 배양 5일 후 CFSE 희석을 위하여 유동 세포분석으로 분석하였다. n=3. 동종이형 T-결핍된 PBMC를 갖는 대조집단 증식 조건 중 CD4+CD25- T 세포의 분할 백분율은 5일에서 단지 세포의 약 60%만 나타냈으며, 각 실험에서 100의 값이 주어졌다. CD4+CD25- T 세포의 상대적인 분할 백분율의 평균 ± SEM로 결과를 표시한다. 대표적인 원(raw) CFSE 프로파일을 나타낸다. Two Way RM ANOVA, *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001
도 3: IL-34 분화된 대식세포로 CD8 + Treg의 증대. A . IL34-분화된 대식세포의 존재하에서 CD8+CD45RClow Treg를 약 115배 증대시켰다. B -C. IL34-분화된 대식세포와 Treg의 공동-배양은 억제성 시토킨 IL34 및 TGFb를 분비하고 Treg-관련된 마커 Foxp3, GITR, PD1 및 HLADR을 발현하는 세포 중에서 풍부하게 되었다. B . CD8+CD45RClow 세포 중 Treg-관련된 마커를 발현하는 세포의 평균 +/- SEM.
도 4. 인간화된 마우스에서 GVHD에 대한 본 발명의 Treg의 효과. A . Treg의 공동-전달 (co-transfer)은 GVHD 발달에 의해 유도된 마우스 체중 감소를 용량 의존적 방식으로 지연시켰다. B . Treg의 공동-전달은 ≥1:1 PBMC: Treg 비에서 마우스 생존을 개선시켰다.
도 5: 인간화된 마우스에서 동종이형 피부 이식편 거부에 대한 본 발명의 Treg의 효과. A . Treg의 공동-전달은 인간화된 마우스에서 동종이형 인간 피부 이식편의 거부를 지연시켰다. B . 이식편 생존은 1:2 PBMC:Treg 비에서 Treg로 전달된 인간화된 마우스에서 연장되었다.
도 6: IL34-분화된 대식세포 및 MCSF -분화된 대식세포의 비교. 비분화된, IL34-분화된 또는 MCSF-분화된 대식세포로의 증대 후, 건강한 개체에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 중 Foxp3 및 CD45RC 양성 세포의 백분율을 평가하였다. 건강한 개체의 대표적인 플롯을 도시한다.
도 7: 단핵구의 상이한 아집단에 대한 IL-34의 효과. A . 단핵구를 FACS Aria로 CD14 및 CD16 마커 발현에 대해 분류하였다. B . 단핵구는 주로 건강한 지원자의 혈액 중에서 CD14+CD16-이다. CD14+CD16-, CD14-CD16+ 및 CD14+CD16+는 각각 PBMC의 20%, 8% 및 2.5%를 나타낸다. C . IL34 존재하에서 세포 생존은 단핵구집단에 따라 다르다. 6일에, 각각 12%, 37% 및 22%의 시딩된 CD14+CD16-, CD14-CD16+ 및 CD14+CD16+를 수거하였다. D . CD14+CD16- 및 CD14+CD16+ 단핵구 모두로부터의 IL34 분화는, CD14- 단핵구 (CD14-CD16+)로부터의 IL34 분화보다, M1-관련 마커의 더 낮은 발현을 갖는 더 높은 수의 M2-유사 대식세포를 야기하였다.
도 8: 대식세포에 대한 3일간의 IL-34 처리 효과. A . IL-34와 3일간 배양한 후, 각각의 107%, 157% 및 91%의 시딩된 CD14+CD16-, CD14-CD16+ 및 CD14+CD16+ 단핵구를 수거하였다. IL-34와 함께 배양한 4일 후, 각각의 59%, 264% 및 275%의 시딩된 CD14+CD16-, CD14-CD16+, 및 CD14+CD16+ 단핵구를 수거하였다. B. CD14+CD16- 및 CD14+CD16+ 단핵구 모두로부터의 IL34 분화는 배양 6일에서 관찰된 바와 같이, 배양 3 또는 4일 후 CD14- 단핵구 (CD14-CD16+)로부터의 IL34 분화와 같이, M2-관련 마커의 더 높은 발현 및 M1-관련 마커의 더 낮은 발현을 야기하였다.
실시예
:
재료 & 방법
건강한 지원자 혈액 수집 및 PBMC 분리: Etablissement Francais du Sang (Nantes, France)에서, 피험자 동의서를 배포한 후, 건강한 공여자로부터 혈액을 수집하였다. 혈액을 PBS로 2배 희석한 후, 제동 없이 실온에서 30분 동안 2000 rpm으로 Ficoll-Paque 밀도-구배 원심분리 (Eurobio)하여 PBMC를 단리하였다. 수집된 PBMC를 1800 rpm으로 10분 동안 50 mL PBS 중에서 세척하였다.
이식편
대
숙주병
및 피부이식 거부
건강한 지원자 (HV) 공여자로부터의 1.5x107 PBMC 또는 FACS-Aria 분류된 CD45RC- PBMC를 16시간 전에 1.5 Gy의 전신 치사량 조사 처리된 10-13 주령의 NSG SCID 마우스 내 정맥내 주사하였다. 증대된 Treg를 1:1 또는 1:2의 PBMC:Treg 비로 마우스 내의 동계 PBMC로 공동-주사하였다. GVHD를 마우스 체중 감소로 규정하고; 20% 초기 체중 감소시 마우스를 희생시켰다.
9 내지 11 주령의 NSG 마우스에 인간 피부를 이식하였다. 6주 후, 마우스를 피부에 대해 동종이형인 1,5x107 PBMC로 정맥내 주사하여 이식편 거부를 유도하였다 (0일). PBMC와 동계인 Treg를 이전에 기재된 바와 같이 IL34-분화된 대식세포로 증대시키고, 1:1 또는 1:2의 PBMC:Treg 비의 PBMC로 공동-주사하였다. 동종이식편 거부는 조직학적 평가로 1 내지 3을 기록하였다.
수용체의 체중을 매일 기록하고, 체중 감소율이 이들의 초기 체중의 ≥20%에 도달하는 경우, 이를 희생시켰다. 가능한 경우 블라인드 조건에서 추적 검사를 수행하였다. 3 내지 6마리 동물의 그룹을 처리하였다. 성별, 나이 및 초기 체중으로 마우스를 조화시키고, 이를 임의로 처리하거나 처리하지 않았다.
Treg
및 단핵구 분화 프로토콜:
Ficoll 구배로 건강한 지원자 (HV) 혈액으로부터 PBMC를 단리하고, FSC 및 SSC 형태학 파라미터에 따라 단핵구를 현탁 분리하였다 (elutriated). 이어서, CD14+ 단핵구를 FACS Aria로 분류하고, 세척하고, 50ng/ml hIL34 (ebiosciences)가 보충된 배지 (RPMI 1640, 글루타민 2mM, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 0.1mg/ml, AB 혈청 10%) 중 1x106/ml로 시딩하였다. 6일에, 세포를 수거하고, 표현형 분석을 위하여 24시간 동안 100ng/ml LPS로 자극시키거나, 또는 4x105/ml의 1 내지 5 동종이형 PBMC를 갖는 Iscove 배지 (IMDM, 글루타민 2mM, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 0.1mg/ml, AB 혈청 5%) 중에 시딩하였다. IL-2 (25U/ml) 및 IL-15 (10ng/ml)를 10, 13 및 16일에 새롭게 첨가하였다. 19 및 21일에 각각 48시간 및 2시간 동안 부유 세포에서 새로운 플레이트로 연속적으로 옮겨 대식세포를 제거하였다. 21일에, 표현형 분석을 위하여 브레펠딘 A의 존재하에 PMA 및 이오노마이신으로 세포를 자극시키거나, 또는 억제 분석을 위하여 T 세포, CD8+CD45RClow T 세포 및 CD4+CD25highCD127low T 세포를 FACS Aria로 분류하였다. CD14+ 세포와 동일한 공여자로부터 단리된 동종이형 APC로 자극된 반응자 T 세포로서 새로운 동계 CD4+CD25-T 세포를 사용하였다. 5일 후, CFSE 희석 및 dapi-표지된 사멸 세포 및 CPD405 표지된 CD4+Treg의 배제 이후 CD3+CD4+ 세포 상의 게이팅으로 증식을 평가하였다.
단클론 항체 및 유동 세포분석: CD3-PeCy7 (SKY7), CD4-PercPCy5.5 (L200), CD25-APCCy7 (M-A251), CD127-PE (HIL7-R M21, BD Bioscience), CD45RC-FITC (MT2, IQ Product), Foxp3-APC (236A/E7, ebiosciences) 및 IL34-PE (578416, R&D)에 대한 항체를 사용하여 인간 세포 표현형을 규정하였다. Canto II 세포분석기 (BD Biosciences, Mountain View, CA)로 형광을 측정하고, FLOWJO 소프트웨어 (Tree Star, Inc. USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다. DAPI 생존가능 세포를 선별함으로써 사멸 세포를 배제한 이들의 형태학으로 세포를 먼저 게이팅하였다.
건강한 지원자로부터의 CD14+ 단핵구를 세포-분류하고, 6일 동안 IL34의 존재하에서 분화시키고, CD163, CD14, HLA-DR, CD86 및 CD80 발현에 대해 표현형을 분석하였다.
결과
IL34-분화된 대식세포는 효과적으로
Foxp3
+
CD45RC
low
Treg를
유도하며, 인간 CD4
+
CD25
+
CD127
-
및 CD8
+
CD45RC
low
Treg를 강화한다.
건강한 지원자로부터의 CD14+ 단핵구를 세포-분류하고, IL34의 존재하에서 6일 동안 분화시키고, 표현형을 분석하였다 (도 1). 본 발명자들은, IL34-분화된 대식세포가 새로운 단핵구보다 높은 수준으로 CD163, CD14, HLA-DR, CD86 및 CD80을 발현한다는 것을 관찰하였다. 이어서, 분화된 대식세포를 동종이형 PBMC에 15일 동안 첨가하고, 그 후, Treg의 비율, 수 및 억제능을 분석하였다 (도 2). 흥미롭게도, 본 발명자들은 IL34-분화된 대식세포와 함께 배양한 후, Foxp3+CD45RClowCD4+ 및 Foxp3+CD45RClowCD8+ T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 백분율로 각각 5 및 8.2배 증가했다는 것을 발견하였다 (도 2a, 2b 및 2c). 또한, 이러한 증가율은 배수 증대에서 나타난 것과 같이, 각각 83.4 및 100.6배의 Foxp3+CD45RClowCD4+ 및 Foxp3+CD45RClowCD8+ T 세포 수 증가를 동반하였다 (도 2b 및 2c). 따라서, 본 발명자들은 CD4+CD45RClow 및 CD8+CD45RClow Treg의 수 및 백분율이 상당히 증가하였음을 관찰하였다 (도 2d 및 도 2e). 가장 중요하게는, 본 발명자들은, IL34-증대된 CD4+CD25highCD127low Tregs 및 CD8+CD45RClow Treg가 최대 16:1의 효과기:억제인자 비의 매우 강력한 억제능과 함께, 비자극된 및 다클론성 자극된 CD4+CD25highCD127low Tregs 및 CD8+CD45RClow Treg와 비교하여 약 50%의 억제를 나타낸다는 것을 발견하였다 (도 2f 및 도 2g).
요컨대, 이러한 결과는 IL34-분화된 단핵구가 선별적으로 증대시키는 능력 및, Foxp3+ CD45RClow Treg 억제능을 유지시킬 뿐만아니라 이를 강화하는 능력을 갖는다는 것을 입증한다.
IL34-분화된 대식세포로의 CD8+
Treg의
증대는 이들의 면역관용 (tolerogenic) 프로파일을 개선시켰다.
Ficoll 구배, CD3+, CD19+ 및 CD16+ 결핍 및 CD14 마커 발현에 대한 ACS Aria 분류에 의해 단핵구를 단리하였다. CD14+ 단핵구를 50ng/ml 인간 IL34 단백질로 보충된 완전 배지 (RPMI1640, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 10% FBS) 중 106 세포/ml로 시딩하고, 6일 동안 배양하였다. 6일에, Ficoll 구배, CD14+, CD16+ 및 CD19+ 세포 결핍 및 CD3, CD8 및 CD45RC 마커 발현에 대한 FACS Aria 분류에 의해 상이한 HV (건강한 지원자) 공여자의 혈액으로부터 CD8+ Treg를 단리하였다. 0일에 1:4의 Treg : 단핵구 비의 동종이형 IL34-분화된 대식세포 및 1 ㎍/ml 항-CD3 및 항-CD28 Ab와 함께 완전 배지 (RPMI1640, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 10% AB 혈청, 1% Hepes, 1% 비필수 아미노산, 1% 피루브산 나트륨) 중 106 세포/ml로 CD3+CD8+CD45RClow 세포를 시딩하였다. 13일에, 1 ㎍/ml 항-CD3 및 항-CD28과 함께 Treg를 다시 자극하였다. 6, 13, 16 및 18일에, 배양 배지를 1000U/ml 인간 IL-2 및 10ng/ml 인간 IL-15로 보충하였다. 20일에, 증대 수율을 위하여 Treg를 분석하고, 이전 증대와 비교한 바와 같이 Treg 관련된 마커 발현 분석을 위하여 10 ㎍/ml 브레펠딘 A의 존재하에서 이를 50ng/ml PMA 및 1 ㎍/ml 이오노마이신과 함께 자극하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, IL34-분화된 대식세포는 CD8+CD45RClow Treg의 115배 증대를 유도했다. 더욱이, IL34-분화된 대식세포와 함께 Treg의 공동-배양은 억제성 시토킨 IL34 및 TGFb를 분비하고 Treg-관련된 마커 Foxp3, GITR, PD1 및 HLADR을 발현하는 세포 중에서 풍부하게 유도한다. 따라서, IL34-분화된 대식세포는 Treg-관련된 마커의 발현을 증가시키며, 이는 CD8+CD45RClow Treg에 대한 증가된 억제 활성을 시사한다.
IL34-분화된 대식세포로 증대된 CD8
+
CD45RC
low
Treg는
인간화된 마우스에서 이식편 대
숙주병을
지연시켰다.
10 내지 13주령 NSG 마우스를 1,5x107 PBMC를 i.v. 주사하기 전 16시간에 2Gy-조사하여 이종성 GVH 반응을 유도하였다. IL34-분화된 CD14+ 단핵구의 존재하에서 CD8+CD45RClow Treg를 분류하고 증대시켰다. 증대된 Treg를 1:1 또는 1:2의 PBMC:Treg 비로 마우스 내 동계 PBCS로 공동-주사하였다. 마우스 체중 감소로 GVHD를 규정하고; 20% 초기 체중 감소에 마우스를 희생시켰다.
도 4A에 도시된 바와 같이, 본 발명의 Treg의 공동-전달은 GVHD 발달에 의해 유도된 마우스 체중 감소를 용량 의존적 방식으로 지연시켰다. 더욱이, 본 발명의 Treg의 공동-전달은 ≥1:1 PBMC:Treg 비에서 마우스 생존을 개선시켰다 (도 4B).
따라서, 이러한 결과는 IL34-분화된 대식세포와 함께 증대된 CD8+CD45RClow Treg가 효과적으로 GVHD를 지연시키며, 세포 치료법에 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
IL34-분화된 대식세포로 증대된 CD8
+
CD45RC
low
Treg는
인간화된 마우스에서
동종이형
피부
이식편
거부를 지연시켰다.
9 내지 11주령 NSG 마우스를 인간 피부와 함께로 이식하였다. 6주 후, 마우스를 피부에 대해 동종이형인 1,5x107 PBMC로 i.v. 주사하여 동종이식편 거부를 유도하였다 (0일). PBMC와 동계인 Treg를 이전에 기재된 바와 같이 IL34-분화된 대식세포로 증대시키고, 1:1 또는 1:2 PBMC:Treg 비로 PBMC와 함께 공동-주사하였다. 동종이식편 거부는 조직학적 평가시 1 내지 3을 기록하였다.
도 5A에 도시된 바와 같이, 본 발명의 Treg의 공동-전달은 인간화된 마우스에서 동종이형 인간 피부 이식편의 거부를 지연시켰다. 더욱이, 이식편 생존은 1:2 PBMC:Treg 비에서 Treg로 전달된 인간화된 마우스에서 연장되었다(도 5B).
따라서, 이러한 결과는 IL34-분화된 대식세포와 함께 증대된 Treg가 이식편에 대한 동종면역 반응을 조절할 수 있다는 것을 입증한다.
IL34-분화된 대식세포는
Foxp3
+
CD45RC
low
Treg를
증대시키는데 있어
MCSF
-분화된 대식세포보다 효율적이다.
Ficoll 구배로 혈액 중에서 단핵구를 단리하고, 이어서, CD3+ 및 CD19+ 세포를 결핍시키고, FACS Aria로 CD14 마커 발현을 분류하였다. CD14+ 단핵구를 6일 동안 50ng/ml 인간 IL34 단백질 또는 25ng/ml 인간 MCSF로 보충된 완전 배치 (RPMI1640, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 10% FBS) 중에서 106 세포/ml로 시딩하였다. 6일에, 대식세포를 5:1 PBMC : 대식세포 비로 동종이형 PBMC를 갖는 완전 배지 (IMDM, 100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5% AB 혈청) 중 4x105 세포/ml로 시딩하였다. 25U/ml 인간 IL2 및 10ng/ml 인간 IL15를 새롭게 10, 13 및 16일에 첨가하였다. 21일에, T 세포를 Foxp3 및 CD45RC 마커 발현 분슥을 위하여 10 ㎍/ml 브레펠딘 A의 존재하에서 이를 50ng/ml PMA 및 1 ㎍/ml 이오노마이신과 함께 4시간 동안 자극하였다.
Foxp3 및 CD45RC 양성 세포의 백분율을 비분화된 것, IL34-분화된 또는 MCSF-분화된 대식세포를 갖는 증대 후 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 중 건강한 개체에서 평가하였다. 건강한 개체의 대표적인 플롯을 도 6에 도시한다.
수득된 결과를 세포 치료법을 위한 Treg 증대시, IL34-분화된 대식세포가 MCSF-분화된 대식세포보다 더 효율적이라는 것을 나타낸다.
CD14
-
CD16
+
, CD14
+
CD16
-
and CD14
+
CD16
+
는
시험관내에서
IL-34의 존재하에서 다르게 행동한다.
Ficoll 구배, CD3+ 및 CD19+ 세포 결핍 및 CD16 및 CD14 마커 발현에 대한 ACS Aria 분류에 의해 혈액 중에서 단핵구를 단리하였다. CD14+CD16-, CD14+CD16+ 및 CD14-CD16+ 단핵구를 7일 동안 50ng/ml 인간 IL34 단백질로 보충된 완전 배지 (RPMI1640, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 10% FBS) 중에 106 세포/ml로 시딩하였다. 7일에, 각각 10ng/ml GMCSF 및 50ng/ml IFNg 또는 25ng/ml MCSF, 20ng/ml IL4 및 20ng/ml IL10로 발현된 M1 및 M2 대식세포와 비교한 바와 같이, 대식세포 관련된 마커 발현에 대해 세포를 분석하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, IL34의 존재하에서 세포 생존은 단핵구집단에 따라 다르다. 6일에, 각각 12%, 37% 및 22%의 시딩된 CD14+CD16-, CD14-CD16+ 및 CD14+CD16+를 수거하였다 (도 7C 참조). 더욱이, 도 7D에 도시된 바와 같이, CD14+CD16- 및 CD14+CD16+ 단핵구 모두로부터의 IL34 분화는 CD14- 단핵구 (CD14-CD16+)로부터의 IL34 분화보다 M1-관련된 마커의 더 낮은 발현을 갖는 더 높은 수의 M2-유사 대식세포를 야기하였다.
따라서, IL34는 M2-유사 세포에 대해 우선적으로 CD14+ 단핵구를 분화하였다.
3일간 IL34-분화된 대식세포의 수율 및 표현형
Ficoll 구배, CD3+ 및 CD19+ 세포 결핍 및 CD14 마커 발현에 대한 FACS Aria 분류에 의해 단핵구를 단리하였다. CD14+ 단핵구를 50ng/ml 인간 IL34 단백질로 보충된 완전 배치 (RPMI1640, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 10% FBS) 중 106 세포/ml로 시딩하고, 3일 후 M1 및 M2 관련된 마커 발현에 대해 분석하였다.
결과를 도 8에 도시한다. IL34와 3일 배양 후, 각각 107%, 157% 및 91%의 시딩된 CD14+CD16-, CD14-CD16+ 및 CD14+CD16+ 단핵구를 수거하였다. IL34와 4일 배양 후, 각각 59%, 264% 및 275%의 시딩된 CD14+CD16-, CD14-CD16+, 및 CD14+CD16+ 단핵구를 수거하였다. 6일 배양에서 관찰되는 바와 같이, CD14+CD16- 및 CD14+CD16+ 단핵구 모두로부터의 IL34 분화는, 3 또는 4일 배양 후 CD14- 단핵구 (CD14-CD16+)로부터의 IL34 분화와 비교하여, 높은 M2-관련 마커의 발현 및 낮은 M1-관련 마커의 발현을 초래하였다.
이러한 결과는 IL34와의 CD14+ 단핵구의 3일 배양이 고수율로 M2-유사 프로파일을 유도하는데 더 충분하다는 것을 입증한다.
참조 문헌:
본원 전체에 걸쳐, 다양한 참조 문헌이 본 발명이 속하는 기술 분야를 설명한다. 이러한 참조 문헌의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
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<400> 1
Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn
20 25 30
Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg
35 40 45
Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile
50 55 60
Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu
65 70 75 80
Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu
85 90 95
Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly
100 105 110
His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn
115 120 125
Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser
130 135 140
Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg
145 150 155 160
Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr
165 170 175
Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu
180 185 190
Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala
195 200 205
Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro
210 215 220
His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu
225 230 235 240
Leu Pro
Claims (13)
- 하기의 단계를 포함하는 인간 Treg 세포 집단을 수득하는 방법:
(a) 면역억제성 대식세포 집단을 수득하기 위하여, 인터류킨-34 (IL-34) 폴리펩티드의 존재하에 인간 단핵구 집단을 배양하는 단계; (b) 인간 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 집단 및 단계 (a)에서 수득된 면억억제성 대식세포 집단을 공동-배양하는 단계; 및 (c) 임의로 단계 (b)에서 수득된 인간 Treg 세포 집단을 단리하는 단계. - 제1항에 있어서,
상기 면역억제성 대식세포 집단이 인간 PBMC 집단에 대해 동종이형인, 방법. - 제1항의 방법에 의해 수득가능한 인간 Treg 세포의 단리된 집단.
- 제3항에 있어서,
상기 Treg 세포가 CD4+ Foxp3+ Treg 세포 및/또는 CD8+ Foxp3+ Treg 세포인, 단리된 집단. - 제3항에 있어서,
상기 Treg 세포가 CD4+CD45RClow Treg 세포 및/또는 CD8+CD45RClow Treg 세포인, 단리된 집단. - 제3항에 있어서,
약물로서 사용하기 위한, 단리된 집단. - 면역 및/또는 염증성 질환 또는 병증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제3항의 단리된 집단.
- 제7항에 있어서,
상기 면역/염증성 질환 또는 병증이 이식편 거부 및 GVHD를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 단리된 집단. - PBMC 집단으로부터 Treg 풍부 집단을 수득하거나, 면역억제성 대식세포 집단을 수득하기 위한 IL-34의 용도.
- 제1항의 방법의 단계 (a)에서 수득된 면역억제성 대식세포 집단.
- 약물로서 사용하기 위한 제10항의 면역억제성 대식세포 집단.
- 면역 및/또는 염증성 질환 또는 병증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제10항의 면역억제성 대식세포 집단.
- 제12항에 있어서,
상기 면역/염증성 질환 또는 병증이 이식편 거부 및 GVHD를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 면역억제성 대식세포 집단.
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